生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公表特許公報(A)_異常ヘモグロビン症の治療のための組成物および方法 |
| 出願番号： | 2014558896 |
| 年次： | 2015 |
| IPC分類： | C12N 15/09,C12N 5/10,A61K 38/43,A61K 48/00,A61P 7/00,C12N 9/16 |
特許情報キャッシュ
ベンダー，マイケル・エイ グラウディン，マーク・ティー ストッダード，バリー・エル タケウチ，リョウ JP 2015516146 公表特許公報(A) 20150611 2014558896 20130222 異常ヘモグロビン症の治療のための組成物および方法 フレッド ハッチンソン キャンサー リサーチ センター 506139369 小野 新次郎 100140109 小林 泰 100075270 竹内 茂雄 100101373 山本 修 100118902 中濱 明子 100135415 ベンダー，マイケル・エイ グラウディン，マーク・ティー ストッダード，バリー・エル タケウチ，リョウ US 61/603,231 20120224 C12N 15/09 20060101AFI20150515BHJP C12N 5/10 20060101ALI20150515BHJP A61K 38/43 20060101ALI20150515BHJP A61K 48/00 20060101ALI20150515BHJP A61P 7/00 20060101ALI20150515BHJP C12N 9/16 20060101ALI20150515BHJP JPC12N15/00 AC12N5/00 102A61K37/48A61K48/00A61P7/00C12N9/16 A AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KM,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC US2013027459 20130222 WO2013126794 20130829 69 20141021 4B024 4B050 4B065 4C084 4B024AA01 4B024BA11 4B024DA02 4B024EA04 4B024FA02 4B024GA11 4B024HA17 4B050CC04 4B050CC07 4B050DD07 4B050EE10 4B050LL01 4B065AA90X 4B065AA90Y 4B065AB01 4B065AC20 4B065BA02 4B065CA44 4C084AA02 4C084AA07 4C084AA13 4C084BA02 4C084BA44 4C084DC01 4C084NA14 4C084ZA512 関連出願に対するクロスリファレンス [0001]本出願は、ＰＣＴ国際特許出願として２０１３年２月２２日に出願され、そしてその開示が、全体として本明細書に援用される、２０１２年２月２４日出願の米国仮特許出願第６１／６０３，２３１号に優先権を請求する。 配列表 [0002]本出願には、「配列表５４４２８．０００６ＷＯＵ１＿ＳＴ２５」と題され、そして２０１３年２月２２日に作成され、そして１７４キロバイト（ＫＢ）のサイズを有するｔｘｔファイルとしての電子形式の配列表が含まれる。ｔｘｔファイル「配列表５４４２８．０００６ＷＯＵ１＿ＳＴ２５」の内容は、本明細書に援用される。 開示の技術分野[0003]本開示は、一般的に、遺伝病の治療に関する。より具体的には、本開示は、グロビン遺伝子の発現を改変するための、ホーミングエンドヌクレアーゼに、そしてＣａｓ９エンドヌクレアーゼに基づく組成物および方法を含む、エンドヌクレアーゼに基づく組成物および方法を提供し、該組成物および方法は、サラセミア、鎌状赤血球症、および他の異常ヘモグロビン症の治療に有用である。 関連技術の説明[0004]異常ヘモグロビン症、例えばサラセミアおよび鎌状赤血球症は、非常に蔓延している遺伝的赤血球障害であり、世界中で、重大な健康上の負荷を引き起こしている。重度のヘモグロビン障害を有する人々が、毎年、１３０万人を超えて生まれる。世界中で５％の人々がキャリアーであるが、サラセミアおよび鎌状赤血球症（ＳＣＤ）の臨床的に重度の型に関しては、出生率は、それぞれ、千人あたり０．４４人および１．９６人である。 [0005]正常状態では、哺乳動物赤血球細胞に見られるヘモグロビンは、主に、２つのα様鎖（ポリペプチド）および２つのβ様鎖のヘテロ四量体からなる。β−グロビン遺伝子座の５つの遺伝子は、染色体１１上のクラスターにある。該遺伝子は、赤血球において、そして発生段階特異的方式（ｍａｎｏｒ）で発現され；ε、ＡγおよびＧγ、ならびにδおよびβ遺伝子は、主に、それぞれ胚性期、胎性期および生後期に発現される。出生時、９５％のβ様鎖はγであり、残りはβである。この比は、生後１年の間に次第に逆転し、鎌状赤血球および大部分のβ−サラセミアなどのβ−グロビン遺伝子に限定された表現型が、数ヶ月齢になるまで顕在化しないのはなぜかを説明する。染色体１６にあるα様遺伝子の発現は異なり；胚性ζ遺伝子は、εの発現と平行するが、対のα遺伝子は、胎性期以降に発現される。したがって、α異常は、子宮において顕在化され、潜在的に、壊滅的な結果（例えば胎児水腫）を伴う。生じるα−、β−ヘテロ四量体は、発生的に発現され；胚性：Ｈｂガウワー１（ζ２、ε２）、Ｈｂガウワー２（α２、ε２）およびＨｂポートランド（ζ２、γ２）；胎性：ＨｂＦ（胎性）（α２、γ２）ならびに成体：ＨｂＡ２（α２、δ２）およびＨｂＡ（成体）（α２、β２）である。 [0006]β−サラセミアは、成体β−グロビン遺伝子座における異常によって引き起こされ、これは、β様グロビン鎖対α様鎖の異常な化学量論を生じ、非対α様鎖の沈降を生じる。サラセミアの重症度は、このグロビン鎖不均衡の度合いに直接関連する。細胞および膜タンパク質の酸化を含むいくつかの経路を通じて仲介される次の損傷は、結果的に、無効な赤血球形成、アポトーシス、および赤血球生存減少を生じる。β−サラセミアの原因となる２００を超える突然変異が記載されてきている。 [0007]鎌状赤血球症は、ペプチドの６位のアミノ酸で、グルタミン酸のバリンによる置換を生じ、βＳを生じる、β−グロビン遺伝子内の単一のヌクレオチド置換によって引き起こされる。ヘモグロビンＳ（α２、βＳ２）はこの突然変異を所持し、正常成体ヘモグロビン（ＨｂＡ）と対照的に、ＨｂＳと称される。低酸素濃度の条件下で、ＨｂＳは、重合可能な点でアロステリック変化を経る。ヘモグロビンのデオキシ型は、ＥおよびＦらせん間で、タンパク質上に疎水性パッチを曝露する。ヘモグロビンβ−鎖の６位の疎水性バリンは、他のヘモグロビンＳ分子の疎水性パッチと会合可能な疎水性パッチを形成し、ヘモグロビンＳ分子を凝集させ、そして線維性沈降物を形成し、これが次いで、赤血球細胞に鎌形を採用させ、そして血管閉塞および溶血を通じた組織損傷を生じる、多くの経路における改変を導く。 [0008]β−サラセミアおよび鎌状赤血球症（ＳＣＤ）は、β−グロビン遺伝子座のそれぞれ定量的および定性的障害であるが、正常β様グロビン遺伝子の発現は、どちらの疾患も寛解させうる。サラセミアにおいて、グロビン鎖不均衡のいかなる改善も各細胞に関する選択的利点を提供し、そして臨床的利益を生じる。鎌状赤血球症において、正常または特定の突然変異β様鎖は、突然変異鎌状赤血球鎖よりもより有効にα様鎖に関して競合し、したがってＨｂＳの量を減少させることによって、ＨｂＳの重合を遮断するヘモグロビン（例えばＨｂＦ）を形成し、そして細胞あたりの非鎌状ヘモグロビンの量を増加させることによって、臨床表現型を寛解させうる。例えば、鎌状赤血球症において、わずか８％のレベルの胎性ヘモグロビン（ＨｂＦ）が、ＨｂＳ重合を阻害し、これが生存増加を生じる一方、２０％のＨｂＦレベルは、ほぼ完全な表現型修正を提供する。決定的なことに、正常ＨｂＡを含有するドナー赤血球細胞の子孫は、ＨｂＳを含有する内因性由来細胞よりも、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）後、強い選択的優位性を有する。骨髄において１１％ドナー細胞を持つ患者は、３５％ドナーＢＦＵｅおよび７３％ドナー赤血球を有し、これは輸血非依存を生じた。したがって、比較的わずかな移植ＨＳＣにおける修正でも、臨床的利益を提供する。 [0009]サラセミアの重症型は、長期輸血を必要とし、鉄過負荷を生じる。生存は、キレート化の有効性と相関するが、コスト、副作用、およびコンプライアンスは、有効性をひどく限定する。ＳＣＤに対する唯一のＦＤＡ認可薬剤はヒドロキシ尿素であり、これは罹患率および死亡率を減弱させうる。しかしこの治療は十分に処方されず、コンプライアンスが劣っており、そして適切に健康状態を保護しない。 [0010]造血細胞移植（ＨＣＴ）は、血液学的悪性腫瘍および関連障害を持つ毎年数千人の患者にとって、重要な療法的オプションである。国際血液骨髄移植研究センター（ＣＩＢＭＴＲ）によれば、２００９年におよそ６万の移植が行われ、これは１０年前に比較して、年間１万５千例を超える移植の増加であった。移植の有効性もまた増加し、より最近の結果は、再発リスク、非再発死亡率、および全体の死亡率の有意な減少を立証している。Ｇｏｏｌｅｙら， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３６３：２０９１−１０１（２０１１）。 [0011]ＨＬＡマッチした兄弟または関連しないドナーからの同種造血細胞移植（ＨＣＴ）は、異常ヘモグロビン症患者のための治療法を提供するが、適切にマッチした関連または非関連ドナーを得る必要性によって限定され、そして移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）および感染によって悪化する。さらに、大きな障壁は、移植失敗が高率であることであり、悪性腫瘍に対するＨＣＴに関して観察されるよりも高い。代替アプローチには、ドナー臍帯血を用いたＨＣＴ実行が含まれ、これは、臍帯血ドナーがほぼすべての患者に対して同定可能であるためである。さらなる実験アプローチでは、患者自身の造血幹細胞（ＨＳＣ）を用いて、そして内因性グロビン遺伝子の発現を誘導するか、または外因性β様グロビン遺伝子を付加することに重点が置かれる。 [0012]ドナーを見つけることが出来ない多くの患者、特に少数民族または人種が混じったバックグラウンドを持つドナーに関しては、臍帯血（ＣＢ）移植は、治癒のための最高の希望を提供しうる。ドナー幹細胞の供給源（母親または乳児へのリスクなしに、誕生時に容易に収集される）であり、ＣＢはまた、ＧＶＨＤのリスクを増加させることなく、ＨＬＡミスマッチ設定においても、容易に入手可能であり、そして安全に用いられる利点を有する。 [0013]不運なことに、多くの臍帯血単位において利用可能な細胞用量が低いことを含む、いくつかの要因が、成人およびより成長した小児において、緩慢な生着および移植関連死亡率の増加につながっている。好中球および血小板両方の造血回復の有意な遅延は、臍帯血移植（ＣＢＴ）レシピエントの既知のリスク要因であり、そして単一または二重ＣＢ移植で提供される低い総有核細胞（ＴＮＣ）およびＣＤ３４＋細胞用量と関連する。同様に、これらの低細胞数は、高率の移植失敗と相関し、したがってすでに移植失敗の高いリスクがある異常ヘモグロビン症では特に懸念される。実際、成体単一ＣＢＴレシピエントの最近の分析によって、注入されたＣＤ３４＋細胞用量は、骨髄生着の最も重要な予測因子であることが立証された。 [0014]非再発死亡率（ＮＲＭ）は、マッチおよびミスマッチ非関連ドナーレシピエントに比較した際、二重ＣＢＴ（ｄＣＢＴ）レシピエントで最高である。Ｂｒｕｎｓｔｅｉｎら， Ｂｌｏｏｄ １１６：４６９３−９（２０１０）。ＮＲＭの大部分は、移植後、最初の１００日以内に起こり、感染が最も一般的な死因である。重要なことに、ｄＣＢＴレシピエント間のＮＲＭに関するリスク要因の分析によって、骨髄回復（絶対好中球数（ＡＮＣ）＞５００／ｍｌまでの時間）が、ｄＣＢＴレシピエントにおける生着までの時間中央値である２６日間と等しいかまたはそれより大きい場合の、骨髄回復遅延患者では、リスクがより高いことが明らかになった。しかし、ＮＲＭに関するリスク要因の分析を、第２６日の前に生着したｄＣＢＴレシピエントのみを含めるように限定すると、ドナー供給源間で相違はまったく見られなかった。 [0015]さらに、幹細胞移植の任意の所定の日数後の＞１００のＡＮＣは、以前、移植後１００日までの死亡リスク減少に関する決定的な閾値であることが示されてきている（Ｏｆｆｉｎｅｒら， Ｂｌｏｏｄ ８８：４０５８−６２（１９９６））。したがって、ＣＢＴレシピエントで観察される骨髄回復における有意な遅延は、ＣＢＴセッティングにおいて、成功転帰に対する決定的な障壁のままである。移植に利用可能なＣＢ前駆細胞の絶対数だけでなく、移植後のより迅速な骨髄回復を信頼可能に生じうる細胞を増加させる能力は、ＣＢＴを経る患者の全体の生存を改善するはずである。臍帯血幹細胞／前駆細胞のｅｘ ｖｉｖｏ拡大を利用する戦略を開発して、ＣＢＴにおける造血回復および全体の生存を増進させる目的で、臍帯血移植において利用可能な細胞用量が低いことを克服する。 [0016]臍帯血（ＣＢ）移植後に生じる好中球回復の有意な遅延を克服する目的で、ｉｎ ｖｉｖｏの迅速な再増殖を可能にする前駆細胞数増加を生じるため、造血幹細胞／前駆細胞のｅｘ ｖｉｖｏ拡大を制御する際のＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の役割が調べられてきている。操作Ｎｏｔｃｈリガンド（Ｄｅｌｔａ１）を利用する臨床的に実行可能な方法論が開発されてきており、これは、ＣＤ３４＋細胞絶対数の多対数増加およびｉｎ ｖｉｖｏの迅速な再増殖が可能な細胞療法を生じる。 [0017]拡大され、部分的にＨＬＡマッチした細胞の注入では、５００／ｍｌの最初の絶対好中球数（ＡＮＣ）を達成するまでの時間中央値がわずか１１日であり、同一であるが、２回の非操作ＣＢ単位を用いた治療を経た２９人の患者の同時コホートにおいて、２５日の中央値であったのに比較した際、有意な減少を生じる（ｐ＜０．０００１）。治療した患者の数は少数（すなわちｎ＝１４）であったが、骨髄回復までの時間に対する有意な影響が立証され、このアプローチの安全性および臨床的実現可能性も立証された。 [0018]３０年を越える、多くの実験室による資源の多大な投資にもかかわらず、異常ヘモグロビン症に対する療法措置の開発にはほとんど進歩がなく、これは大部分、薬剤化可能な同定されたターゲットが欠如し、そして挿入突然変異誘発を導かずに、非常に高レベルで持続して発現する遺伝子療法ベクターが必要であるためである。胎性ヘモグロビン（ＨｂＦ）の発現増加が異常ヘモグロビン症の両方を軽減する一方、徹底的な研究によっても、この観察に基づく、実行可能な新規剤は得られてきていない。組込みレンチウイルスベクターを用いた造血幹細胞（ＨＳＣ）遺伝子療法が、何人かの研究者によって追求されている。しかし、ＨＳＣ遺伝子療法は、高レベルの持続性発現を必要とし、そして挿入突然変異誘発および白血病のかなりのリスクを所持する。 [0019]当該技術分野に決定的に必要であるのは、サラセミアおよび鎌状赤血球症を含む異常ヘモグロビン症の治療のために改善された有効性を示す一方、現存する療法様式の安全性の懸念を克服する、組成物および方法である。Ｇｏｏｌｅｙら， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３６３：２０９１−１０１（２０１１）Ｂｒｕｎｓｔｅｉｎら， Ｂｌｏｏｄ １１６：４６９３−９（２０１０）Ｏｆｆｉｎｅｒら， Ｂｌｏｏｄ ８８：４０５８−６２（１９９６） [0020]本開示は、とりわけ、異常ヘモグロビン症の治療のための組成物および方法を提供することによって、当該技術分野において、これらのおよび他の関連する必要性に取り組む。本明細書に開示する組成物および方法は：（ａ）Ｂｃｌ１１ａコード領域またはＢｃｌ１１ａ遺伝子制御領域を破壊し；（ｂ）Ｂｃｌ１１ａが制御するＨｂＦサイレンシング領域などのＨｂＦサイレンシングＤＮＡ制御要素または経路を破壊し；（ｃ）１またはそれより多いγ−グロビン遺伝子プロモーター（単数または複数）を突然変異させて、γ−グロビン遺伝子の発現増加を達成し；（ｄ）１またはそれより多いδ−グロビン遺伝子プロモーター（単数または複数）を突然変異させて、δ−グロビン遺伝子の発現増加を達成し；そして／または（ｅ）１またはそれより多いβ−グロビン遺伝子突然変異（単数または複数）を修正するため、１またはそれより多いホーミングエンドヌクレアーゼ（単数または複数）および／またはホーミングエンドヌクレアーゼ融合タンパク質（単数または複数）および／またはＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ（すなわち、１またはそれより多いＲＮＡガイド鎖と組み合わされたＣａｓ９エンドヌクレアーゼ）および／またはＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ融合タンパク質（単数または複数）（すなわち、１またはそれより多いＲＮＡガイド鎖と組み合わされたＣａｓ９エンドヌクレアーゼ融合タンパク質（単数または複数））を含む、１またはそれより多いエンドヌクレアーゼ（単数または複数）またはエンドヌクレアーゼ融合タンパク質（単数または複数）をコードする、１またはそれより多いポリヌクレオチドを使用する。 [0021]第一の態様内で、本開示は、Ｂｃｌ１１ａコード領域またはＢｃｌ１１ａ遺伝子制御領域内の配列のターゲティング化破壊を達成するため、１またはそれより多いエンドヌクレアーゼ（単数または複数）、例えばホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）および／またはＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ（すなわち、１またはそれより多いＲＮＡガイド鎖と組み合わされたＣａｓ９エンドヌクレアーゼ）をコードするポリヌクレオチドを含み、それによって内因性遺伝子、例えばγ−またはε−グロビン遺伝子の発現を療法レベルまで増加させる、組成物および方法を提供する。関連する側面内で、これらの態様の組成物は、１またはそれより多いＴＡＬＥＮ、１またはそれより多いＴＡＬＥ−ＨＥ融合タンパク質、ならびに／あるいは１またはそれより多いＴＲＥＸ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。 [0022]第二の態様内で、本開示は、β−グロビン遺伝子座内の重要な制御配列のターゲティング化破壊を達成するため、１またはそれより多いエンドヌクレアーゼ（単数または複数）、例えばホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）またはＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ（すなわち、１またはそれより多いＲＮＡガイド鎖と組み合わされたＣａｓ９エンドヌクレアーゼ）をコードするポリヌクレオチドを含み、それによって内因性遺伝子、例えばγ−またはβ−グロビン遺伝子の発現を療法レベルまで増加させる、組成物および方法を提供する。関連する側面内で、これらの態様の組成物は、１またはそれより多いＴＡＬＥＮ、１またはそれより多いＴＡＬＥ−ＨＥ融合タンパク質、ならびに／あるいは１またはそれより多いＴＲＥＸ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。 [0023]本態様の特定の側面内で、制御タンパク質Ｂｃｌ１１ａに対する結合部位を含有するβ−グロビン遺伝子座（ＨＧ１８におけるｃｈｒ１１：５２１２３４２−５２１５９４４）内の３．６ｋｂ領域（配列番号１）をターゲティングする、ＨＥおよびＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを提供する。 [0024]本明細書に記載するホーミングエンドヌクレアーゼおよびＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、慣用的な遺伝子ターゲティングヌクレアーゼに勝るユニークな利点を示す。これらは、遺伝子型に関わらず広く有効であるため、本明細書記載の１またはそれより多いＲＮＡガイド鎖と組み合わせたホーミングおよびＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、患者特異的ではなく、これらはヘテロ接合状態で臨床的利点を提供し、そしてベクター配列の挿入を回避する。 [0025]第三の態様内で、本開示は、ゲノム編集を通じて、患者ゲノム内の１またはそれより多い天然存在突然変異（単数または複数）を再現し（ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｉｎｇ）、それによって例えば遺伝性高胎児ヘモグロビン症（ＨＰＦＨ）の欠失型または非欠失型を含む、臨床的利点を提供するための組成物および方法を提供する。より具体的には、本開示は、ゲノム編集を通じた、サラセミアおよび／または鎌状赤血球症（ＳＣＤ）突然変異の直接修正を達成するための組成物および方法を提供する。 [0026]本態様の特定の側面内で、正常または野生型ポリヌクレオチド配列（修正テンプレート）と組み合わせて、１またはそれより多いホーミングエンドヌクレアーゼ（単数または複数）を使用して、１またはそれより多い遺伝子配列、例えばβ様グロビン遺伝子（単数または複数）の編集および／または修復を可能にする。これらのホーミングエンドヌクレアーゼは、１またはそれより多い天然存在突然変異（単数または複数）を含むポリヌクレオチドの一過性発現を通じて、本明細書においてヒトβ−グロビン遺伝子座によって例示される、遺伝子座内の重要な制御配列および／またはコード配列の修飾を可能にする。関連する側面内で、これらの態様の組成物は、１またはそれより多いＴＡＬＥＮ、１またはそれより多いＴＡＬＥ−ＨＥ融合タンパク質、および／または１またはそれより多いＴＲＥＸ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。 [0027]より具体的には、本開示は、例えば造血幹細胞（ＨＳＣ）、胚性幹（ＥＳ）細胞、および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む幹細胞内の天然存在突然変異を生成するために使用可能である、ＨＥおよび修正テンプレートを各々コードする、１またはそれより多いポリヌクレオチドを含む、ゲノム編集のための組成物および方法を提供する。自己ＨＳＣおよびｉＰＳＣを含む、ゲノム編集ＨＳＣ、ＥＳ、およびｉＰＳＣを患者内に移植して、１またはそれより多い異常ヘモグロビン症、例えばサラセミアおよび／または鎌状赤血球症を治療してもよい。 [0028]本明細書に開示する組成物および方法は、ターゲティングテンプレート、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、および／またはＲＮＡガイド鎖を伴いまたは伴わず、外因性遺伝子の持続性発現または挿入の必要性を伴わずに、ＨＥをコードするポリヌクレオチドの一過性発現を通じて、ＨＳＣ、ＥＳ、およびｉＰＳＣの効率的な修飾を可能にして、成熟赤血球細胞において、そしてｉｎ ｖｉｖｏの患者細胞において、異常ヘモグロビン症の寛解を達成する。これらの療法は、導入遺伝子の組込みおよび／または持続性発現を必要としないため、現在利用可能な遺伝子療法技術と関連する安全性の懸念は取り除かれる。 [0029]第四の態様内で、本開示は、１またはそれより多いＲＮＡガイド鎖と組み合わせた、１またはそれより多いホーミングエンドヌクレアーゼ（単数または複数）ならびに／あるいは１またはそれより多いＣａｓ９エンドヌクレアーゼ（単数または複数）の送達のための組成物および方法を提供し、これらは各々、ヒトにおいて、臨床的利益を有することが示されるターゲティング化領域において、一過性に発現されてもよい。本明細書記載のエンドヌクレアーゼコード配列は、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）コード配列と組み合わされるか、または該配列に融合されて発現されてもよい。本明細書に例示するのは、ＴＡＬエフェクター−ＨＥ（ＴＡＬＥ−ＨＥ）融合タンパク質およびこれらのＴＡＬＥ−ＨＥ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、これらは胎性ヘモグロビン産生に影響を及ぼす決定的なゲノム領域をターゲティングする。 [0030]これらの態様の特定の側面内で、ターゲティングテンプレートを伴うまたは伴わない１またはそれより多いＨＥ、１またはそれより多いＣａｓ９エンドヌクレアーゼ、１またはそれより多いＲＮＡガイド鎖、１またはそれより多いＴＡＬＥＮ、１またはそれより多いＴＡＬＥ−ＨＥ融合タンパク質、ならびに／あるいは１またはそれより多いＴＲＥＸ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、ウイルスベクター内で、プロモーター配列に機能可能であるように連結して、ＨＥ、Ｃａｓ９、ＲＮＡガイド鎖、ＴＡＬＥＮ、ＴＡＬＥ−ＨＥ融合タンパク質、および／またはＴＲＥＸ２タンパク質の送達および一過性発現を達成する。ＨＥ、ＴＡＬＥＮ、ＴＡＬＥ−ＨＥ融合タンパク質、および／またはＴＲＥＸ２タンパク質の送達に満足できるように使用可能な適切なウイルスベクターを、球菌（ｃｏｃａｌ）偽型レンチウイルスベクター、泡沫ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターからなる群より選択されてもよい。 [0031]第五の態様内で、本開示は、修正細胞の効率的な生着、ならびにスクリーニングおよび臨床適用のための人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の使用を可能にする、ｅｘ ｖｉｖｏ拡大修飾造血幹細胞（ＨＳＣ）を含む組成物および方法を提供する。これらの態様の特定の側面内で、自己ＨＳＣ、自己遺伝子修飾ＨＳＣ、ｉＰＳＣ由来ＨＳＣ、およびＥＳ細胞の効率的な拡大のための組成物および方法を提供する。臍帯血拡大方法論を使用してもよく、この方法論は、正常ドナーから得た動員末梢血ＣＤ３４＋細胞を用い、造血増殖因子を補った血清不含培地中で、Ｄｅｌｔａ１を利用する。これらの組成物および方法は、造血幹細胞／前駆細胞の生存および増殖を増進する１またはそれより多いさらなる試薬と組み合わせて使用可能である。他の側面内で、これらの組成物および方法は、修正ｉＰＳＣ由来ＨＳＣを含む長期再増殖細胞の拡大増進のための内皮細胞共培養を使用してもよい。 [0032]第六の態様内で、本開示は、対症療法を提供するための組成物および方法であって、移植後好中球減少症を抑止し、そして遺伝子修正自己ＨＳＣの移植後の転帰を改善する、オフザシェルフ（ｏｆｆ−ｔｈｅ−ｓｈｅｌｆ）細胞療法を含む。ｅｘ ｖｉｖｏ拡大され、凍結保存された臍帯血（ＣＢ）幹細胞／前駆細胞は、例えば、自己ＣＤ３４＋遺伝子修正細胞を用いた、骨髄破壊的ＨＣＴを経ている、サラセミアおよび／または鎌状赤血球症患者に、対症療法の手段として、投与可能である。 図面の簡単な説明[0033]本開示の特定の側面は、以下の図を考慮するとよりよく理解されるであろう：[0034]図１は、成体赤血球組織におけるβ−グロビン様遺伝子の発現を増加させるターゲットを示す。胎性発現パターン（２つのγ遺伝子）から成体プログラム（δおよびβ）へのスイッチを制御する際に関与する因子を示す（Ｗｉｌｂｅｒら， Ｂｌｏｏｄ １１７（１５）：３９４５−３９５３（２０１１）から適合）。[0035]図２は、３つの例示的なまれな切断ヌクレアーゼ技術を示す。[0036]図３は、非再発死亡リスクが、二重ＣＢＴレシピエントで最高であることを示すグラフである。二重ＣＢＴ（ＤＵＣＢ）、マッチした非関連ドナー（ＭＵＤ）、ミスマッチした非関連ドナー（ＭＭＵＤ）、およびマッチした関連ドナー（ＳＩＢ）移植後の非再発死亡率。[0037]図４は、Ｄｅｌｔａ１ｅｘｔ−ＩｇＧとＣＢ前駆細胞の培養が、骨髄破壊的二重ＣＢＴセッティングにおけるより迅速な好中球回復を生じることを示す。２回の非操作単位（「慣用的」）対１回のｅｘ ｖｉｖｏ拡大単位および１回の非操作単位（「拡大」）での二重単位ＣＢＴを受けた患者に関する≧５００／μｌのＡＮＣまでの時間の個々の値および中央値（実線）を提示する。[0038]図５は、疾患徴候によって毎年行われた臍帯血移植の数を示す棒グラフである。[0039]図６（配列番号１）は、ＨＧ１８におけるｃｈｒ１１：５２１２３４２−５２１５９４４に渡る、ＨｂＦサイレンシング領域が属する３．６ｋｂ領域の配列である。図６続き。図６続き。[0040]図７（配列番号２）は、リピート要素（ＨＧ１８におけるｃｈｒ１１：５，２３１，９１２−５，２１４，２６１）から、ＨｂＦサイレンシング領域内のＢｃｌ１１ａ占有領域を破壊することが知られる上流フレンチＨＰＦＨ破壊点に渡り、そしてＧＡＴＡ−１結合モチーフを含み、そしてそこから本開示の例示的なホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）が設計された、３５０塩基対領域である。[0041]図８（配列番号１３）は、キャップの１ｋｂ上流からポリＡ部位までのヒト・ベータ−グロビン遺伝子であり、ＨＧ１８におけるｃｈｒ１１：５２０３２７２−５２０５８７７に渡る（リバース鎖）。図８続き。[0042]図９（配列番号１４）は、プロモーターからイントロン２内に渡る、ヒト・ベータ−グロビンの６０６ｂｐ領域である（ＨＧ１８におけるｃｈｒ１１：５２０４３８０−５２０４９８５）。この比較的小さい領域は、重症サラセミアを導く突然変異の大部分、ならびに鎌状赤血球症を引き起こす突然変異を含有する。この小さい領域は、相同組換えを容易に受け入れて、遺伝子修正を生じる。[0043]図１０（配列番号２４）は、ヒトＢｃｌ１１ａ ｃＤＮＡ（ＣＣＤＳ１８６２．１）のｃＤＮＡ配列である。図１０続き。[0044]図１１は、プラスミドｐＥＴ−２１ａ（＋）の制限マップである。[0045]図１２は、プラスミドｐＥｎｄｏの制限マップである（Ｄｏｙｏｎら， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２８（７）：２４７７−２４８４（２００６））。[0046]図１３は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子ターゲティングエンドヌクレアーゼを生成するための指向進化の模式図である。構築したライブラリーを、ターゲット部位に対するＩＶＣにおける選択に供し、この部分をＢＣＬ１１Ａ遺伝子ターゲットで置き換えた。[0047]図１４（配列番号２８）は、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）における発現のためにコドン最適化された、Ｉ−ＨｊｅＭＩ（ＢＣＬ１１Ａ遺伝子ターゲティングヌクレアーゼの親酵素）のヌクレオチド配列である。[0048]図１５（配列番号２９）は、哺乳動物発現のためにコドン最適化された、Ｉ−ＨｊｅＭＩ（ＢＣＬ１１Ａ遺伝子ターゲティングヌクレアーゼの親酵素）のヌクレオチド配列である。[0049]図１６（配列番号３０）は、ホーミングエンドヌクレアーゼＩ−ＨｊｅＭＩのアミノ酸配列である。[0050]図１７（配列番号３１）は、大腸菌における発現のためにコドン最適化された、ホーミングエンドヌクレアーゼＩ−ＨｊｅＭＩ（ＩＶＣにおいて、および細菌において、指向進化を通じて得られた）に基づく、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子ターゲティングヌクレアーゼ（Ｂｃｌ１１Ａｈｊｅ）のヌクレオチド配列である。[0051]図１８（配列番号３２）は、哺乳動物発現のためにコドン最適化された、ホーミングエンドヌクレアーゼＩ−ＨｊｅＭＩ（ＩＶＣにおいて、および細菌において、指向進化を通じて得られた）に基づく、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子ターゲティングヌクレアーゼのヌクレオチド配列である。[0052]図１９（配列番号３３）は、ホーミングエンドヌクレアーゼＩ−ＨｊｅＭＩ（ＩＶＣにおいて、および細菌において、指向進化を通じて得られる）に基づく、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子ターゲティングヌクレアーゼのアミノ酸配列である。[0053]図２０は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子ターゲティングエンドヌクレアーゼおよびその親ＬＨＥ Ｉ−ＨｊｅＭＩの間で異なるアミノ酸残基の分布を示すタンパク質モデルである。ＢＣＬ１１Ａ遺伝子ターゲティングエンドヌクレアーゼの置換残基を、そのターゲット部位に結合したＩ−ＨｊｅＭＩの結晶構造上にマッピングする（ＰＤＢ ＩＤ：３ＵＶＦ）。Ｄ１６１は、変異体エンドヌクレアーゼにおいては欠失されている。[0054]図２１は、２プラスミド切断アッセイにおけるＢＣＬ１１Ａ遺伝子ターゲティングエンドヌクレアーゼの活性を示す棒グラフである。[0055]図２２Ａ（配列番号３４）は、大腸菌における発現のためにコドン最適化された、Ｉ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨｂＦサイレンシング領域をターゲティングするホーミングエンドヌクレアーゼのための親酵素）のヌクレオチド配列である。[0056]図２２Ｂ（配列番号１５）は、Ｉ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列である。[0057]図２３は、ＨｂＦサイレンシング領域をターゲティングするＩ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼの活性を示すアガロースゲルである。[0058]図２４（配列番号３５）は、ＭｅｇａＴＡＬ：５．５ＲＶＤ＋Ｙ２ Ｉ−ＡｎｉＩのヌクレオチド配列である。図２４続き。[0059]図２５（配列番号３６）は、ＭｅｇａＴＡＬ：５．５ＲＶＤ＋Ｙ２ Ｉ−ＡｎｉＩのアミノ酸配列である。[0060]図２６（配列番号３７）は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼのヌクレオチド配列である（Ｍａｌｉら， Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３）より）。図２６続き。図２６続き。[0061]図２７（配列番号３８）は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼとともに使用するためのＲＮＡガイド鎖のヌクレオチド配列である（Ｍａｌｉら， Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３）より）。[0062]図２８（配列番号６２）は、Ｉ−ＣｐａＭＩホーミングエンドヌクレアーゼのヌクレオチド配列（ＯＲＦ、哺乳動物発現のためにコドン最適化）である。[0063]図２９（配列番号６３）は、Ｉ−ＣｐａＭＩホーミングエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列である。[0064]図３０は、実施例４に記載するような内因性ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子にターゲティングされた突然変異誘発の検出を示すアガロースゲルである。[0065]図３１は、プラスミドｐＣｃｄＢ ｗｔ６の制限マップである（Ｄｏｙｏｎら， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２８（７）：２４７７−２４８４（２００６））。[0066]図３２（配列番号６４）は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子ターゲティングヌクレアーゼをコードするプラスミド（ｐＥｘｏｄｕｓＢＣＬ１１Ａｈｊｅ）のヌクレオチド配列である。図３２続き。[0067]図３３（配列番号６５）は、ＴＲＥＸ２をコードするプラスミド（ｐＥｘｏｄｕｓ ＣＭＶ．Ｔｒｅｘ２）のヌクレオチド配列である。図３３続き。図３３続き。[0068]図３４は、プラスミドｐＥｘｏｄｕｓＢＣＬ１１Ａｈｊｅの制限マップである。[0069]図３５は、プラスミドｐＥｘｏｄｕｓ ＣＭＶ．Ｔｒｅｘ２の制限マップである。 [0070]本開示は、一般的に、異常ヘモグロビン症などの遺伝病の治療のための組成物および方法に向けられ、それは、１またはそれより多いホーミングエンドヌクレアーゼ（単数または複数）および／またはホーミングエンドヌクレアーゼ融合タンパク質（単数または複数）、ならびに／あるいは１またはそれより多いＣａｓ９エンドヌクレアーゼ（単数または複数）および／またはＣａｓ９エンドヌクレアーゼ融合タンパク質（単数または複数）を１またはそれより多いＲＮＡガイド鎖と組み合わせたものを含む、１またはそれより多いエンドヌクレアーゼ（単数または複数）またはエンドヌクレアーゼ融合タンパク質（単数または複数）をコードするポリヌクレオチドの一過性または持続性発現によって：（ａ）Ｂｃｌ１１ａコード領域を破壊し；（ｂ）ＨｂＦサイレンシングＤＮＡ制御要素または経路、例えばＢｃｌ１１ａ制御ＨｂＦサイレンシング領域を破壊し；（ｃ）１またはそれより多いγ−グロビン遺伝子プロモーター（単数または複数）を突然変異させて、γ−グロビン遺伝子の発現増加を達成し；（ｄ）１またはそれより多いδ−グロビン遺伝子プロモーター（単数または複数）を突然変異させて、δ−グロビン遺伝子の発現増加を達成し；そして／または（ｅ）１またはそれより多いβ−グロビン遺伝子突然変異（単数または複数）を修正する。本明細書開示の組成物および方法は、β−サラセミアおよび鎌状赤血球症を含む異常ヘモグロビン症の治療に有用性を見出す。本明細書記載の組成物および方法は、場合によって、１またはそれより多いＴＡＬＥＮ、１またはそれより多いＴＡＬＥ−ＨＥ融合タンパク質、および／または１またはそれより多いＴＲＥＸ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。 [0071]本開示は、以下の定義を考慮するとよりよく理解されるであろう。 定義[0072]本明細書において、用語「異常ヘモグロビン症」は、異常構造、異常機能またはヘモグロビン分子の１またはそれより多いグロビン鎖の発現改変を生じる、遺伝的欠陥のクラスを指す。異常ヘモグロビン症は、遺伝性単一遺伝子障害である。一般的な異常ヘモグロビン症には、サラセミアおよび鎌状赤血球症が含まれる。 [0073]本明細書において、用語「サラセミア」は、α様対β様グロビンポリペプチド鎖の比の改変から生じ、正常なヘモグロビン四量体タンパク質の過少産生および未結合または不対αまたはβ鎖の自然増加を生じる。 [0074]本明細書において、用語「鎌状赤血球症」は、常染色体劣性遺伝子血液障害の群を指し、これはグロビン遺伝子における突然変異から生じ、そして異常で強固な鎌形をとる赤血球細胞によって特徴付けられる。これらは、ペプチドのアミノ酸６位でグルタミン酸がバリンによって置換されているβ−グロビン鎖変異体をコードするβＳ−遺伝子、および臨床的表現型を導くＨｂＳの結晶化を可能にする突然変異を有する第二のβ遺伝子の存在によって定義される。用語「鎌状赤血球貧血」は、ＨｂＳを引き起こす突然変異に関してホモ接合体である患者における鎌状赤血球症の特定の型を指す。他の一般的な型の鎌状赤血球症には、ＨｂＳ／β−サラセミア、ＨｂＳ／ＨｂＣおよびＨｂＳ／ＨｂＤが含まれる。表１は、野生型および鎌状赤血球β−グロビン鎖の最初のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を開示する。 表１ [0075]本明細書において、用語「遺伝性高胎児ヘモグロビン症」または「ＨＰＦＨ」は、有意な胎性ヘモグロビン（ヘモグロビンＦ）産生が、通常の遮断点に関わらず、成体になっても十分に続く、良性状態を指す。 [0076]本明細書において、用語「グロビン」は、酸素の結合および輸送に関与するヘム含有タンパク質のファミリーを指す。 [0077]本明細書において、用語「ホーミングエンドヌクレアーゼ」または「ＨＥ」は、ゲノムにおいて１回しか生じないために十分に長く、そしてランダムであり、非常に低い確率（例えば７ｘ１０１０ｂｐごとに１回）である認識配列によって特徴付けられる、制限エンドヌクレアーゼのクラスを指す。 [0078]本明細書において、用語「転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ」または「ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ」または「ＴＡＬＥＮ」は、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることによって生成される人工制限エンドヌクレアーゼのクラスを指す。 [0079]本明細書において、用語「３’修復エクソヌクレアーゼ２」または「ＴＲＥＸ２」は、典型的にはＤＮＡ複製、修復、および組換えに関与する、３’エクソヌクレアーゼ活性を有するヌクレアーゼを指す。 [0080]本明細書において、用語「Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ」は、エンドヌクレアーゼ切断部位をターゲティングするため、ＲＮＡガイド鎖を用いるエンドヌクレアーゼを指す。用語「ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ」は、ＲＮＡガイド鎖と組み合わされたＣａｓ９エンドヌクレアーゼを指す。Ｊｉｎｅｋら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６−８２１（２０１３）； Ｃｏｎｇら， Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｊａｎ． ３， ２０１３）（印刷前のＥｐｕｂ）；およびＭａｌｉら， Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｊａｎ． ３， ２０１３）（印刷前のＥｐｕｂ）を参照されたい。 [0081]逆に示されない限り、用語は「オープン」であると意図される（例えば用語「含む」は、「限定されないが含む」と解釈されるべきであり、用語「有する」は、「少なくとも有する」と解釈されるべきであり、用語「含まれる」は、「限定されるわけではないが含まれる」と解釈されるべきであるなど）ことが理解されるであろう。「少なくとも１つ」および「１またはそれより多い」などの句、ならびに「１つの（ａまたはａｎ）」などの用語には、単数形および複数形の両方が含まれる。 [0082]開示の特徴または側面が、マーカッシュ群に関して記載される場合、開示はまた、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループに関して記載されるとも意図されることがさらに理解されるであろう。同様に、本明細書に開示するすべての範囲はまた、すべてのありうる下位範囲および下位範囲の組み合わせも含み、そして「の間」、「最大」、「少なくとも」、「より大きい」、「未満」等の用語には、言及される数値が範囲に含まれ、そして各個々のメンバーが含まれる。 [0083]限定されるわけではないが、米国、ＰＣＴまたは非米国の外国のいずれであってもよい、特許、特許出願、および特許公報を含む、上記または下記のいずれであってもよい、本明細書に引用するすべての参考文献、ならびにすべての技術的および／または科学的刊行物は、その全体が本明細書に援用される。 [0084]多様な態様が本明細書に開示されてきているが、当業者には他の態様が明らかであろう。本明細書に開示する多様な態様は、例示目的のためであり、そして請求項によって示される真の範囲および精神を限定することを意図しない。 高効率多重遺伝子破壊および遺伝子編集機能を達成するためのホーミングエンドヌクレアーゼ[0085]上に論じるように、そして以下に例示するように、本開示は、ヒトにおいて臨床的利益を有することが示された、ターゲティングされる細胞において一過性にまたは持続性に発現されてもよい、１またはそれより多いエンドヌクレアーゼ（単数または複数）をコードするポリヌクレオチドを含む組成物および方法であって、１またはそれより多いホーミングエンドヌクレアーゼ（単数または複数）（ＨＥ（単数または複数））、例えば１またはそれより多いＩ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼ（単数または複数）、Ｉ−ＣｐａＭＩホーミングエンドヌクレアーゼ（単数または複数）、および／またはＩ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼ（単数または複数）、ならびに／あるいは１またはそれより多いＲＮＡガイド鎖と組み合わせた１またはそれより多いＣａｓ９エンドヌクレアーゼ（単数または複数）を含む、前記エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む組成物および方法を提供する。例示的なエンドヌクレアーゼは：（ａ）Ｂｃｌ１１ａコード領域またはＢｃｌ１１ａ遺伝子制御領域を破壊し；（ｂ）ＨｂＦサイレンシングＤＮＡ制御要素または経路、例えばＢｃｌ１１ａ制御ＨｂＦサイレンシング領域を破壊し；（ｃ）１またはそれより多いγ−グロビン遺伝子プロモーター（単数または複数）を突然変異させて、γ−グロビン遺伝子の発現増加を達成し；（ｄ）１またはそれより多いδ−グロビン遺伝子プロモーター（単数または複数）を突然変異させて、δ−グロビン遺伝子の発現増加を達成し；そして／または（ｅ）１またはそれより多いβ−グロビン遺伝子突然変異（単数または複数）を修正することによって、胎性ヘモグロビン産生に影響を及ぼす決定的なゲノム領域をターゲティングする。本明細書開示の組成物および方法は、β−サラセミアおよび鎌状赤血球症を含む異常ヘモグロビン症の治療に有用性を見出す。 [0086]本明細書記載のエンドヌクレアーゼコード配列は、ＤＮＡ結合ドメインコード配列、例えばＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）コード配列またはヌクレアーゼコード配列、例えば３’修復エクソヌクレアーゼ２（ＴＲＥＸ２）コード配列と組み合わされるか、またはこうした配列に融合して発現されてもよい。本明細書に例示するのは、ＴＡＬＥ−ＨＥ融合タンパク質、および１またはそれより多いＴＡＬＥ−ＨＥ融合タンパク質（単数または複数）をコードするポリヌクレオチドである。 [0087]真核生物において、ターゲティング化遺伝子修飾および破壊を達成するために４つのタンパク質骨格が知られる：ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）、およびＲＮＡガイド鎖と組み合わせたＣａｓ９エンドヌクレアーゼ。本開示は、単独で、または組み合わせてのいずれかで、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、および／またはＣａｓ９エンドヌクレアーゼを使用する。ＴＡＬヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼよりもより単純なモジュラー設計、およびより高いＤＮＡ認識特異性を提供する一方、ホーミングエンドヌクレアーゼ、例えばＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）は、非常に特異的な切断プロファイル、コンパクトな構造、ならびにこれらがＺＦＮおよびＴＡＬＥＮのように二量体化を必要としないコンパクトな単量体タンパク質であるため、多重化組み合わせで使用可能である能力を提供する。したがって、ＨＥおよびＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ（すなわち、１またはそれより多いＲＮＡガイド鎖と組み合わされたＣａｓ９エンドヌクレアーゼ）は、遺伝子破壊を仲介する際に非常に効率的である。Ｓｔｏｄｄａｒｄ、上記およびＭａｌｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３）、上記。 [0088]本開示の一部として、ＨｂＦ機能を抑制するβ−グロビン遺伝子座内の決定的な領域が同定されてきている。この領域は、ＨＥおよびＣａｓ９仲介切断の多数のターゲットを提供する。特異的に設計されたヌクレアーゼを、同族ターゲット部位に対する活性に関して、そして任意の緊密に関連するゲノムターゲットに対するオフ−ターゲット活性に関して、特異的に設計されたヌクレアーゼを試験してもよい。１またはそれより多いＲＮＡガイド鎖と組み合わせて、これらのＨＥおよびＣａｓ９エンドヌクレアーゼを操作して、Ｓｔｏｄｄａｒｄ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １９：７−１５（２０１１）およびＭａｌｉら， Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３）に記載される方法を用い、オフターゲットゲノム切断を回避してもよい。本明細書に開示する１またはそれより多いＲＮＡガイド鎖と組み合わされたＨＥおよびＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、γ−およびδ−プロモーターを直接ターゲティングし、そしてサラセミア突然変異ならびにＨｂＳ突然変異の大部分に渡る６０６ｂｐ領域（配列番号１４）を置換することが可能である。 [0089]ＨｂＦサイレンシング領域またはそのサブセットに渡る大きな欠失の生成を容易にするため、１またはそれより多いＲＮＡガイド鎖と組み合わされた１またはそれより多いＨＥならびに／あるいは１またはそれより多いＣａｓ９エンドヌクレアーゼを、エンドヌクレアーゼ切断部位からターゲット領域末端に渡る架橋オリゴヌクレオチドと同時形質導入してもよい。Ｃｈｅｎら， Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８（９）：７５３−５（２０１１）。ターゲット領域の各側に隣接する配列に結合し、そしてこれを切断する１またはそれより多いＨＥを使用することによって、より高い頻度のゲノム編集を達成することも可能である。同様に、ＨＥおよび突然変異誘発オリゴヌクレオチドを用いて、プロモーター領域突然変異を導入してもよく、これがガンマまたはデルタ遺伝子の発現上昇を導く。 [0090]本明細書に開示するＨＥを、赤血球細胞株において、そして赤血球細胞に分化するように誘導されるヒトＣＤ３４＋細胞において、まず評価して、それによってグロビン遺伝子発現を改変する能力を確認してもよい。意図される正確な適用に応じて、１、２、３、またはそれより多いＨＥを送達して、より大きな欠失の生成を促進してもよい。個々のＨＥの適切さを、さらなる培養および動物モデルアッセイにおいて評価して、多能性および拡大潜在能力を損なうことなくＨＳＣをターゲティングする能力を確認し、そして異常ヘモグロビン症モデルにおいて臨床的利点を評価してもよい。ＨｂＦの決定的な領域におけるターゲティング化遺伝子欠失を誘導するため、１またはそれより多いＨＥおよび１またはそれより多いエクソヌクレアーゼ、例えばＴＲＥＸ２エクソヌクレアーゼまたはＴＡＬエフェクターエクソヌクレアーゼをＣＤ３４＋ ＨＳＣに送達してもよい。 [0091]リピート要素の端から始まり、そしてＨｂＦサイレンシング領域内のＢｃｌ１１ａ占有領域を破壊することが知られる上流フレンチＨＰＦＨ破壊点に渡り、そしてＧＡＴＡ−１結合モチーフを含む領域によって定義される３５０ｂｐ領域（配列番号２）中の一連のターゲットに対して、個々のヌクレアーゼを試験してもよい。最初の分析は、均一に領域全体に分布する、７つのターゲットを同定し、これらは非常に活性が高いエンドヌクレアーゼ変異体のプールが単離され、そして配列決定されているＤＮＡ配列モジュールを含む。特に、１つのターゲットは潜在的なＢｃｌ１１ａ結合モチーフと重複し、そしてＧＡＴＡ−１モチーフに隣接する。２、３、またはそれより多いＨＥを形質導入することによって、ターゲット領域の次第に大きくなる欠失を達成してもよい。あるいは、遺伝子機能の排除を確実にするため、遺伝子の５’端に、Ｂｃｌ１１ａ遺伝子を破壊するための多数のターゲットが同定されてきている。同様に、Ｃａｓ９／ＲＮＡガイドが仲介する破壊の多数の最適ターゲットが領域全体で同定されてきており、これを単独で用いるか、または組み合わせて用いて、より大きな欠失を導いてもよい。 [0092]組込みゲノムレポーターを用いて、トランスフェクションされたヒト細胞株において、個々のＨＥを試験してもよく、そしてさらなる選択工程をさらに使用して、Ｓｔｏｄｄａｒｄ、上記に記載するようなプロトコルを用い、切断および遺伝子変換活性をさらに最適化してもよい。グロビン遺伝子座におけるターゲットに対して活性である個々のターゲティング化ＨＥの検証および送達に、発現系におけるヌクレアーゼのベクター形成が続いてもよい。例えば、各ＨＥを、ヌクレアーゼ、例えばＴＡＬＥＮおよび／またはＴＲＥＸエクソヌクレアーゼの共発現に連結して、形質導入細胞において、非常に増進した遺伝子破壊効率を達成してもよい。 [0093]本開示はまた、ＴＡＬＥおよびＨＥ足場による隣接ＤＮＡターゲットの相乗認識を通じて、グロビン遺伝子座内などの望ましいターゲット部位に、操作されたＨＥの補充および活性を制限する望ましい特徴を示す、ＴＡＬＥ−ＨＥ融合タンパク質、およびＴＡＬＥ−ＨＥ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドも提供する。こうしたＴＡＬＥ−ＨＥ融合は、各足場の最も好ましい特性（すなわちＴＡＬＥのモジュラー組み立ておよびＨＥのヌクレアーゼ活性）を組み合わせる一方、伝統的なＴＡＬＥＮまたはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）に関連する非特異的ヌクレアーゼ活性を減少させる。 [0094]同族ＤＮＡターゲット部位と複合体形成した１０の別個のＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）に関して、高解像度結晶構造が決定されてきている。Ｓｔｏｄｄａｒｄ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １９：７−１５（２０１１）およびＴａｋｅｕｃｈｉら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． １０８：１３０７７−１３０８２（２０１１）。これらのＬＨＥのキメラ「ハイブリッド」が構築されてきており、集合的に、遺伝子特異的適用のため、広範囲のＬＨＥターゲティングタンパク質を提供する。Ｂａｘｔｅｒら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ４０（１６）：７９８５−８０００（２０１２）。 [0095]望ましいＤＮＡ切断特異性に関してハイスループット細胞ソーティングと組み合わせて、酵母表面ディスプレイ戦略によって、適切なターゲット配列特異性を有するＨＥを同定してもよい。全ターゲット部位に渡って広がる接触の連続ポケットに相当する一連のタンパク質−ＤＮＡ「モジュール」を、別個のライブラリーにおいて、系統的にランダム化してもよい。次いで、各モジュール内のありうるＤＮＡ変異体各々を特異的に切断可能な酵素集団に関して、各ライブラリーを系統的にソーティングして、そしてソーティングされた集団各々を、ディープ・シーケンスして、そして続く酵素組み立ておよび設計のため、アーカイブに保管してもよい。本開示の組成物および方法で適切に使用可能なＨＥが商業的に入手可能である（Ｐｒｅｇｅｎｅｎ、ワシントン州シアトル）。 [0096]特定の側面内で、本明細書に記載する組成物および方法は、例えば１またはそれより多いＬＨＥを含む１またはそれより多いＨＥと、ＴＲＥＸ２ ３’エクソヌクレアーゼの同時発現を使用してもよい。現在のバージョンのＺＦＮおよびＴＡＬＥＮによって残される５’オーバーハングとは対照的に、ＨＥは、ターゲティングした二重鎖破壊に３’オーバーハングを生じ、これが、ＨＥ切断後の末端プロセシング率の増進を生じる。ＨＥ／ＴＲＥＸ２同時発現を通じて、初代細胞における二重鎖破壊部位のほぼ完全な修飾が達成可能である。ＨＥ／ＴＲＥＸ２同時発現が破壊プロセシングに影響を及ぼす方式のため、この組み合わせは、１つの領域において、多数のターゲティング化欠失を達成し、そして破壊持続性を減少させ、そして代替端連結経路を通じて仲介される大規模転位置の潜在的可能性を減少させることによって、ヌクレアーゼ誘導性ターゲティング化遺伝子破壊の安全性を増加させる。 [0097]ＤＮＡターゲット部位に結合したＴＡＬエフェクター（ＰｔｈＸｏ１）の結晶構造が最近決定されてきている。Ｍａｋら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３５（６０６９）：７１６−９ ２０１２； ｅ−ｐｕｂ ０５Ｊａｎ１２ ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ２２２２３７３６。これらの結晶構造データは、ＤＮＡ認識領域境界の正確な定義を可能にし、そして優れた振る舞いのＴＡＬＥＮ−ＨＥ、または多様な複雑なゲノム操作を達成するために適用可能な他のＴＡＬＥＮ−ヌクレアーゼ融合構築物の生成のための戦略を容易にする。 Ｂｃｌ１１ａ遺伝子発現に対するゲノム破壊[0098]鎌状赤血球マウスモデルにおけるＢｃｌ１１ａのノックアウトは疾患を寛解させ、この経路の臨床的関連を支持する。Ｘｕら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３４：９９３−６（２０１１）。さらに、ヒトβ−グロビン遺伝子座に渡るＹＡＣ導入遺伝子を含有するマウスを用いて、ＨｂＦのＢｃｌ１１ａ仲介サイレンシングにおける混乱をモデリングする。これらのマウスにおける内因性Ｂｃｌ１１ａ遺伝子のヘテロ接合性およびホモ接合性ノックアウトは、対照における０．２４％に比較して、それぞれ、２０および７６％の総β様ｍＲＮＡを含むγ−グロビンｍＲＮＡを生じる。Ｓａｎｋａｒａｎら， Ｎａｔｕｒｅ ４６０：１０９３−７（２００９）。これは、Ｂｃｌ１１ａは可変抵抗器として作用し、ＨｂＦ抑制の度合いを調節することを示唆する。これと一致して、Ｂｃｌ１１ａ中の機能突然変異の減少は、上昇したレベルのＨｂＦならびに臨床的サラセミアおよび／または鎌状赤血球症表現型の軽減を生じる。Ｇａｌａｎｅｌｌｏら， Ｂｌｏｏｄ １１４：３９３５−７（２００９）。 [0099]特定の態様内で、本開示は、Ｂｃｌ１１ａまたはその重要な制御配列をコードする配列の破壊を達成するため、１またはそれより多いホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ（単数または複数））、例えば１またはそれより多いＩ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼ（単数または複数）、Ｉ−ＣｐａＭＩホーミングエンドヌクレアーゼ（単数または複数）、および／またはＩ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼ（単数または複数）、ならびに／あるいは１またはそれより多いＣａｓ９エンドヌクレアーゼ（単数または複数）を含む、１またはそれより多いエンドヌクレアーゼ（単数または複数）を含む組成物および方法を提供する。本明細書により詳細に記載し、そして例示するように、１またはそれより多いＣａｓ９エンドヌクレアーゼを含む組成物および方法は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼのＢｃｌ１１ａ遺伝子配列へのターゲティングを仲介するため、１またはそれより多いＢｃｌ１１ａ遺伝子特異的ＲＮＡガイド鎖をさらに含む。 [00100]Ｂｃｌ１１ａ遺伝子は、１００ｋｂに渡る多数のエクソンを有し、そしていくつかのスプライス変異体を生じ、これは異なる活性と関連するタンパク質を導く。本開示の一部として、多数のＢｃｌ１１ａスプライス変異体に転写されるいくつかのＤＮＡターゲットが同定されてきている。すべてが、最大のＨｂＦサイレンシング活性と関連する長鎖（Ｌ）型および極長鎖（ＸＬ）型を破壊し、一方、１つがＢｃｌ１１ａのすべての型を破壊する。これらのターゲットは、非常に活性が高いエンドヌクレアーゼ変異体のプールが単離され、そして配列決定されているＤＮＡ配列モジュールを含む。ヒトＢｃｌ１１ａ ｃＤＮＡ配列（ＣＣＤＳ１８６２．１）は、本明細書において、配列番号２４（図１０）として提示される。 [00101]したがって、特定の側面内で、本開示は、療法レベルのＨｂＦを達成するための組成物を提供し、該組成物は、１．３ｋｂ領域内のヌクレオチド配列の破壊を仲介し、それによってＢｃｌｌ１ａの結合、および対応する抑制性複合体の形成、およびγ−グロビン発現の抑制解除が可能である。 ＨｂＦのＢｃｌ１１ａ仲介サイレンシングを遮断するためのゲノム破壊[00102]上に要約するように、特定の態様内で、本開示は、遺伝病、例えばサラセミアおよび／または鎌状赤血球症を含む異常ヘモグロビン症を治療し、そして／または寛解させるための組成物および方法を提供する。これらの態様の特定の側面には、β−グロビン遺伝子座またはδ−グロビン遺伝子座内のＨｂＦサイレンシング要素または経路を破壊する、１またはそれより多いホーミングエンドヌクレアーゼ（単数または複数）をコードするポリヌクレオチドの一過性発現が含まれ、それによってγ−またはδ−グロビン遺伝子などの内因性遺伝子の発現を療法レベルまで増加させる。 [00103]本明細書に開示する組成物は、β−グロビン遺伝子座内の重要な制御配列のターゲティング化破壊を達成するため、１またはそれより多いホーミングエンドヌクレアーゼ（単数または複数）（ＨＥ（単数または複数））ならびにあるいは１またはそれより多いＲＮＡガイド鎖と組み合わせた１またはそれより多いＣａｓ９エンドヌクレアーゼ、ならびに場合によって１またはそれより多い転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター（単数または複数）を含む。より具体的には、本明細書開示の組成物および方法は、β−グロビン遺伝子座内のＨｂＦサイレンシング領域（単数または複数）へのＢｃｌ１１ａの結合のために必須な要素を除去することによって、γ−グロビン遺伝子発現の増加、およびその結果、ＨｂＦタンパク質産生の増加を達成する。 [00104]正常発生中、胚性β様遺伝子（ε−グロビン）の発現は、連続して、胎児においてはγ−グロビン遺伝子対、そして成体においてはδおよびβ−グロビン遺伝子に置換される。成体赤血球組織において、ジンクフィンガータンパク質Ｂｃｌ１１ａは、β−グロビン遺伝子座内のγ−グロビンおよびδ−グロビン遺伝子間の領域に結合し、それによって、ＨｂＦの産生をサイレンシングする。ＨｂＦのＢｃｌ１１ａ仲介サイレンシングの重要性は、ヒトＣＤ３４細胞におけるＢｃｌ１１ａ ｍＲＮＡのノックダウンによって裏付けられ、これはＨｂＦレベルを総β様タンパク質の２４〜３６％まで増加させる。Ｓａｎｋａｒａｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２：１８３９−４２（２００８）。ＨＰＦＨの欠失型においてこの領域を除去するとともに、Ｂｃｌ１１ａをノックダウンすると、Ｂｃｌ１１ａ仲介性ＨｂＦサイレンシングがブロックされ、そして成体赤血球組織において、γ−グロビン遺伝子発現およびＨｂＦタンパク質産生のレベル上昇を生じる（Ｓａｎｋａｒａｎら， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３６５：８０７−１４（２０１１））。 [00105]ＨｂＦタンパク質レベルの上昇には、多数の機構が寄与するが、３．６ｋｂ領域がＨｂＦサイレンシングに重要であることが示されてきている（配列番号１）。Ｓａｎｋａｒａｎら， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３６５：８０７−１４（２０１１）。β−グロビン遺伝子座にはＢｃｌ１１ａ濃縮のいくつかのピークがあるが、３．６ｋｂ ＨｂＦサイレンシング領域中の単一ピークが突出しており、これはＢｃｌ１１ａと抑制性複合体を形成することが知られるタンパク質がこの領域に結合し（ＧＡＴＡ−１およびＨＤＡＣ−１）、そしてクロマチンに、抑制性のヒストンマーク、リジン２７上のヒストンＨ３のトリメチル化が豊富であるためである。 [00106]特に、この３．６ｋｂ領域は、γ−遺伝子下流にＢｃｌ１１ａ結合の単一ピークを含有する。ヘテロ接合体として２０〜３０％のＨｂＦレベルを生じ、サラセミアおよびＳＣＤを寛解させるγ−グロビンプロモーターにおける多数の点突然変異が同定されてきている。すべてγ−キャップ部位の２００ｂｐ以内の３つの領域：（１）−２００、ＳＰ１およびステージ特異的タンパク質複合体が結合するＧＣリッチ領域；（２）−１７５、ＧＡＴＡ−１が結合；ならびに（３）いくつかのさらなる因子が結合する、−１１７のＯｃｔ１およびＣＣＡＡＴモチーフに、これらの点突然変異がクラスター形成する。Ｆｏｒｇｅｔ， Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８５０：３８−４４（１９９８）。 [00107]これらの３つの領域内の突然変異は、成体赤血球細胞において、抑制性複合体の結合を遮断する。その結果、これらの領域は、本明細書に開示する組成物および方法による、ＨＥ仲介性破壊およびターゲティング突然変異に適したターゲットである。これらの領域の破壊は、抑制性複合体の減少を導き、これは、γ−グロビン遺伝子発現レベルの上昇、ならびにβ−サラセミアおよび鎌状赤血球症を含む異常ヘモグロビン症の治療のための方法において療法的有効性を達成するのに十分なレベルへのＨｂＦタンパク質産生の対応する増加を生じる。 [00108]Ｂｃｌ１１ａ占有の単一ピークは、３．６ｋｂ ＨｂＦサイレンシング領域内に存在する（Ｓａｎｋａｒａｎら， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３６５：８０７−１４（２０１１））（配列番号１）。Ｂｃｌ１１ａ占有のこの領域は、フレンチＨＰＦＨの上流破壊点によって破壊される。Ｓａｎｋａｒａｎら， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３６５：８０７−１４（２０１１）。本明細書に記載するのは、リピート要素の端から始まり、そしてＨｂＦサイレンシング領域内のＢｃｌ１１ａ占有領域を破壊することが知られる上流フレンチＨＰＦＨ破壊点に渡り、そしてＧＡＴＡ−１結合モチーフを含む、３５０ｂｐ領域である（配列番号２）。上流フレンチＨＰＦＨ欠失前の塩基は、ＨＧ１８ ｃｈｒ１１：５，２１４，０２３である。ＧＡＴＡ−１モチーフは、ｃｈｒ１１：５，２１４，２００−５，２１４，２０６に渡る。理論によって限定されるわけではないが、ＧＡＴＡ−１およびＨＤＡＣ−１は、Ｂｃｌ１１ａがこの３５０ｂｐ領域内に結合した際にＢｃｌ１１ａと抑制性複合体を形成し、そしてこれがγ−グロビン遺伝子の発現を阻害する抑制性複合体形成を導き、これによってＨｂＦタンパク質の細胞レベルを減少させると考えられる。 [00109]本明細書開示の組成物および方法によって達成されるＨＥ仲介破壊は、高い効率で起こる。当該技術分野に知られるｓｈＲＮＡノックダウンアプローチとは異なり、本明細書に開示するホーミングエンドヌクレアーゼによって仲介されるＨｂＦサイレンシング領域の非常に配列特異的な破壊は、ゲノムにおける、そして他の細胞タイプにおける、特にＢｃｌ１１ａ結合が正常発生に必要であるＢ細胞内での、他のＢｃｌ１１ａ結合部位でのオフターゲット効果を回避する。 [00110]したがって、本明細書記載のホーミングエンドヌクレアーゼは、慣用的な遺伝子ターゲティングヌクレアーゼに勝るユニークな利点を示す。これらは遺伝子型に関わらず、広く有効であるため、本明細書記載のホーミングエンドヌクレアーゼは、患者特異的ではなく、そしてヘテロ接合状態で臨床的利益を提供する。 サラセミアまたは鎌状赤血球症突然変異を修正するための遺伝子修飾の再現[00111]他の態様内で、本開示は、臨床的利益を提供するため、ゲノム編集を通じて、患者ゲノム内の１またはそれより多い天然存在突然変異（単数または複数）を再現するための組成物および方法を提供する。より具体的には、本開示は、ゲノム編集を通じたサラセミアおよび／または鎌状赤血球症（ＳＣＤ）突然変異の直接修正を達成するための組成物および方法を提供する。 [00112]本明細書に開示する組成物および方法は、修正テンプレートおよび患者ゲノム内の対応する突然変異配列間の相同組換え（ＨＲ）率を増進させることによって、サラセミアおよび鎌状赤血球症を含む異常ヘモグロビン症を寛解させるための遺伝子編集および修正を達成するため、修正テンプレートを使用する。本明細書に例示するのは、根底にあるβ−グロビン突然変異を修正するための組成物および方法であり、これらは、ヘテロ接合状態で臨床的利益を提供する一方、ベクター配列の挿入を回避する。これらの組成物および方法を、Ｂｃｌ１１ａ仲介遺伝子サイレンシングの破壊に関して上述した組成物および方法とは独立して、またはこれらと組み合わせて用いてもよい。 [00113]本開示は、当該技術分野において利用可能な代替プラットフォームに比較した際、ＨＥの利点を利用したゲノム編集のためのロバストな技術セットを提供する。これらのＨＥをＴＡＬエフェクターモジュラーＤＮＡ結合プラットフォームと組み合わせて、さらなる療法的利益を達成することも可能である。 [00114]ゲノムを編集するための相同組換え（ＨＲ）は強力であるが、非効率的である。修飾しようとする領域に二本鎖破壊を導入すると、ＨＲ効率に非常な増加が生じる。ＨＥ、および１００ｂｐ程度の小分子の隣接相同性を含む修正テンプレートをコードするポリヌクレオチドを同時に導入すると、ＨＲ頻度の増加が可能になり、それによって修正テンプレートが導入された際にゲノム編集が可能になる。 [00115]短い合成修正テンプレートを用いた細胞の形質導入はまた、定義される単一塩基対突然変異の効率的な導入のためにも使用可能である。こうしたアプローチは、典型的には、単一ＨＥを利用する。あるいは、ＨＥは、修正のためにターゲティングされる領域に隣接して形質導入されることも可能である。本明細書に記載するような最適化法によって、修正テンプレートを形質導入してもよい。ＨＥの設計、形質導入、および評価を、Ｃｅｒｔｏら， Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ８：６７１−６（２０１１）およびＪａｒｊｏｕｒら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３７：６８７１−８０（２００９）に記載される方法論にしたがって、以下に詳細に論じるように、実行してもよい。 [00116]これらの態様の特定の側面内で、１またはそれより多いホーミングエンドヌクレアーゼ（単数または複数）を、正常または野生型ポリヌクレオチド配列と組み合わせて使用して、１またはそれより多いβ様グロビン遺伝子（単数または複数）の編集および／または修復を可能にする。例えば、本開示は、異常ヘモグロビン症の治療のための組成物および方法であって、１またはそれより多い天然存在突然変異（単数または複数）を含むポリヌクレオチドの一過性発現を通じて、ヒトβ−グロビン遺伝子座によって本明細書に例示する遺伝子座内の重要な制御配列および／またはコード配列の修飾を可能にする、前記組成物および方法を提供する。 [00117]より具体的には、本開示は、ゲノム編集のための組成物および方法であって、例えば造血幹細胞（ＨＳＣ）、胚性幹（ＥＳ）細胞、および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む幹細胞内の天然存在突然変異を再現する突然変異を生成するために使用可能である、前記組成物および方法を提供する。自己ＨＳＣおよびｉＰＳＣを含めて、ゲノム編集ＨＳＣ、ＥＳ、およびｉＰＳＣを、患者内に移植して、１またはそれより多い異常ヘモグロビン症、例えばサラセミアおよび／または鎌状赤血球症を治療することも可能である。本明細書開示の組成物および方法は、外因性遺伝子の持続性発現または挿入の必要を伴わずに、ＨＳＣ、ＥＳ、およびｉＰＳＣの効率的な修飾を可能にして、成熟赤血球細胞において、そしてｉｎ ｖｉｖｏの患者細胞において、異常ヘモグロビン症の寛解を達成する。 [00118]これらの療法は、導入遺伝子の組込みおよび／または持続性発現を必要としないため、現在利用可能な遺伝子療法技術に関連する安全性の懸念は取り除かれる。これらの態様の特定の側面内で、組成物および方法は、ＨｂＦのＢｃｌ１１ａ仲介サイレンシングのターゲティング化破壊のための１またはそれより多いポリヌクレオチドを使用する。 [00119]本明細書に例示するのは、ＨｂＦの遺伝性高胎児ヘモグロビン症（ＨＰＦＨ）の原因である１またはそれより多いＨｂＦサイレンシング領域（単数または複数）内の遺伝子修飾の再現を可能にする、組成物および方法である。こうした遺伝子修飾は、療法的に有効な遺伝子の発現増加を導くため、再現遺伝子修飾は、療法的有効性を達成するために、ヘテロ接合体として存在すればそれでよい。 [00120]本明細書に開示する、サラセミアおよび鎌状赤血球症を寛解させるための組成物および方法は、ＨｂＦおよび／またはＨｂＡ２および／またはＨｂＡタンパク質産生を生じる１またはそれより多い突然変異を導入することによって、療法的有効性を達成する。本明細書に例示するのは、γ−グロビン遺伝子発現を活性化し、それによって胎性ヘモグロビンレベルを増加させる、β−グロビン遺伝子および／または領域の１またはそれより多い天然存在欠失（単数または複数）を再現するための組成物および方法である。ＨｂＦおよび／またはＨｂＡ２タンパク質産生の中程度の増加は、これらの疾患表現型を寛解させるために十分であるため、ヘテロ接合性突然変異は、実質的な療法利益を達成するために十分である。 [00121]特定の側面内で、修正テンプレートの送達を、選択可能マーカー遺伝子の送達と組み合わせて行って、それによってｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの修正細胞の選択を可能にしてもよいが、こうしたアプローチは、選択可能マーカー遺伝子の組込みを通じた長期発現を必要とする。Ｂｅａｒｄら， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １２０：２３４５−５４（２０１０）およびＭｕｎｏｚら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３９（２）：７２９−７４３（２０１１）。 [00122]成体組織におけるβ−グロビン発現の活性化は、そのプロモーターにおけるＣＡＣＣＣボックスでのＫＬＦ−１の結合に依存する。δ−グロビンプロモーターは、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）ＣＡＣＣＣボックスを欠き、ＫＬＦ−１は結合せず、そして発現は２％のβ−グロビンに限定される。例えば損なわれていないＣＡＣＣＣボックスを導入することによって、β−グロビンプロモーターを再現するδ−プロモーターの突然変異によって、ＫＬＦ−１結合が可能になり、そしてδ−グロビン発現の療法的に有効な増加が生じる。 [00123]これらの態様の特定の側面内で、非欠失ＨＰＦＨ γ−グロビンプロモーター突然変異を生成してもよい。有効性を達成するためには単一塩基対のみを修飾すればよい。例えば、−１７５Ｔ→Ｃ突然変異（配列番号２１）を再現して、ＨｂＦレベルを最大にしてもよい。４つのγ−グロビン遺伝子のいずれかの突然変異が利益を提供し、したがって潜在的なターゲットを増加させるであろう。 ホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ、およびＴＲＥＸ２エクソヌクレアーゼの送達[00124]さらなる態様内で、本開示は、本明細書記載の１またはそれより多いＨＥ、Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、および／またはＴＲＥＸ２ヌクレアーゼを送達するための系、特に非組込みベクター系を提供する。造血幹細胞（ＨＳＣ）の療法的遺伝子編集には３つの主要な困難がある：（１）ヌクレアーゼ試薬を一過性にＨＳＣに送達しなければならない；（２）ヌクレアーゼを受け入れる細胞において、遺伝子編集効率が高くなければならない；そして（３）療法効果に十分なレベルまで、遺伝子編集ＨＳＣを生着させなければならない。これらの困難は、多様なベクター形成アプローチを使用することによって克服可能である。 [00125]本明細書に例示するのは、ＨＳＣへの効率的な遺伝子トランスファーのための、球菌偽型レンチウイルスベクターおよび泡沫ウイルスベクターである。Ｔｒｏｂｒｉｄｇｅら， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １８：７２５−３３（２００８）。あるいは、ＨＳＣへの遺伝子トランスファーに使用するために先に記載されているように、アデノウイルスベクターを修飾してもよい。Ｗａｎｇら， Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ． ３６：８２３−３１（２００８）およびＷａｎｇら， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １７：９６−１０４（２０１１）。これらの態様の他の側面内で、ＡＡＶに基づくベクター系もまた、ＨＥ、Ｃａｓ９（および／またはＲＮＡガイド鎖）、ＴＡＬＥ−ＨＥ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＴＲＥＸ２ヌクレアーゼの送達のために使用してもよい。 [00126]ＡＡＶ６血清型組換えＡＡＶベクターは、４．５ｋｂペイロードを提供し、これは、小さい組換えテンプレートに加えて、プロモーター−ＨＥ−エクソヌクレアーゼまたはプロモーター−ＴＡＬ−ＨＥ融合エクソヌクレアーゼカセットを送達するのに十分である。あるいは、小さいＣａｓ９ポリペプチドおよびガイドＲＮＡを所持することも可能である。ＡＡＶ６は、すべての既知のＡＡＶキャプシドのヒトＣＤ３４＋臍帯血細胞の効率的な形質導入を提供し、そしてＨＳＣにおける有意なレベルの一過性遺伝子発現を仲介することが可能である。ＨＳＣにおいて、細胞株において、そして初代ＣＤ３４＋細胞において、遺伝子ノックアウトおよび組換えに基づく遺伝子編集の両方のために、自己相補的および一本鎖ＡＡＶ６ベクターを使用してもよい。 [00127]ハイブリッドキャプシドを持つアデノウイルスベクターは、ＣＤ３４＋細胞を含む多くのタイプの造血細胞を効率的に形質導入することが可能である。造血細胞の効率的な形質導入のため、血清型３５ファイバー（Ａｄ５−Ｆ３５）および血清型１１ファイバー（Ａｄ５−Ｆ１１）を用い、キメラアデノウイルスベクターを用いて、形質導入改善を達成してもよい。ヘルパー依存性アデノウイルスベクターは、ＨＳＣにおける一過性遺伝子発現を伴う、最大３０ｋｂペイロードを提供し、そして該ベクターを用いて、多数のＨＥ／エクソヌクレアーゼカセット、ＨＥ−ＴＡＬ融合、ならびに非常に大きい組換えテンプレートを送達することも可能である。あるいは、小さいＣａｓ９ポリペプチドおよびガイドＲＮＡを所持してもよい。これらの修飾キメラアデノウイルスベクターは、したがって、ＨＳＣにおける遺伝子ノックアウトおよび組換えに基づく遺伝子編集の両方のために使用可能である。 [00128]組込み不全レンチウイルスおよび泡沫ウイルスベクター（ＩＤＬＶおよびＩＤＦＶ）は、６ｋｂ（ＩＤＬＶ）から９ｋｂ（ＩＤＦＶ）ペイロードを提供し、そしてヒトＨＳＣに形質導入するよく立証された能力を有する。特定の側面内で、ＨＳＣにおける遺伝子ノックアウトおよび組換えに基づく遺伝子編集のために、ＩＤＬＶおよびＩＤＦＶベクターの両方を使用してもよい。代替プロモーターＧＦＰカセットを含むＩＤＬＶは、ＣＤ３４＋ ＨＳＣにおいて、高効率でそして高レベルの発現を提供する。ＴＦＦ精製工程を用いて、高力価ストックを達成してもよい。プロモーター／ＧＦＰカセットのセットを含むベクターを用いて、ＣＤ３４＋ ＨＳＣにおいて、効率がよく、そして高レベルのＨＥ発現を提供してもよく、そしてこれを生成して、個々のＨＥ、ＨＥ／Ｔｒｅｘ２、多重ＨＥ（すなわち同時発現される２、３、または４つのＨＥ）、および多重ＨＥ／ＴＲＥＸ２組み合わせを発現させてもよい。多重ＨＥ発現は、決定的な領域における多数の切断事象を可能にし、これは正確な適用に依存して、ＨｂＦ脱抑制増加を生じるために望ましい可能性もある。こうした多重戦略は、自律性に機能するためにＬＨＥで実行可能であり、そして緊密にターゲティングされる二本鎖破壊の効率的でそして同調したプロセシングを可能にする、ＴＲＥＸ２同時発現と組み合わせて、満足できるように使用可能である。あるいは、小さいＣａｓ９ポリペプチドおよびガイドＲＮＡを所持することも可能である。 [00129]遺伝子ターゲティングの効率、個々のターゲティング細胞、ならびに細胞集団およびその子孫におけるグロビン遺伝子発現のレベル、赤血球形成に対するおよび幹細胞機能に対する、ならびに血液学的パラメータおよび臓器機能に対するターゲティングの効果は、モデル生物において、確認可能である。 [00130]形質導入後、ＲＮＡおよびタンパク質レベルでのβ様遺伝子の修飾効率および発現の単一細胞およびバルク集団評価が続いてもよい。因子結合およびクロマチン構造における改変、ならびに形態、無効な赤血球形成の度合い、およびアポトーシスを評価してもよい。最初のスクリーニングで優れてスコアリングされた候補を、ＨＳＣ多能性に対する効果に関して、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで疾患特異的表現型を寛解させる能力に関して、さらに評価してもよい。 [00131]単一の損なわれていないヒト染色体１１を含有するマウス赤白血病細胞株（Ｎ−ＭＥＬ）および臨床等級ＣＤ３４＋正常ヒトＨＳＣにおいて、ターゲティングされた突然変異効率およびグロビン遺伝子発現を評価する終点を伴い、ＨＥ候補および送達系の最初のスクリーニングを行ってもよい。どちらの細胞タイプも、赤血球経路に沿った分化を誘導可能であり、この間、β様遺伝子の発現は、高いβ対□およびδ比で非常に誘導され、単一細胞および集団レベルで、グロビン遺伝子制御の効果の定量的評価が可能になる。第二のレベル評価には、形質導入されたＣＤ３４＋細胞および赤血球形成の多能性の分析が含まれてもよい。適切なアッセイ系には、長期増殖潜在能力を評価するための培養、クローン分析のための骨髄および赤血球コロニーの分析、ならびにＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウスへの移植後の、一次および二次レシピエントの多系列生着の評価が含まれてもよい。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで、同時に臨床的有効性を評価してもよい。 [00132]ネズミＢｃｌ１１ａのノックアウトは、ヒトβ−グロビン遺伝子座を含有するマウスにおいて、γ−グロビンの劇的な用量依存性増加を導き、そしてヒト化マウスモデルにおいて、鎌状表現型を寛解させる。どちらの系も、グロビン遺伝子発現の分析を可能にする一方、鎌状マウスは、血液学的パラメータ、肝臓および肺病理、腎臓機能ならびに脾臓サイズに対して特別の注意が払われるこれらのマウスにおいて、表現型の改善の評価を可能にする。表現型改善は、ＨｂＦ含有細胞数、ＨｂＦ／ＨｂＳ比、および単一細胞アッセイにおける発現パターンに相関させることも可能である。 [00133]さらに、異常ヘモグロビン症患者由来のヒトＣＤ３４＋ ＨＳＣに形質導入することによって、赤血球寿命および形態を評価してもよい。培養サラセミア細胞は、最小限の拡大、ヘモグロビン化の欠如、赤血球形成無効の証拠、ならびに正常に比較して増加したアポトーシスを示す。これらの特徴によって、ターゲティング後の発現レベルおよび赤血球形成の度合いの定量的評価が可能になる。低酸素条件下でのＣＤ３４＋細胞の赤血球子孫の鎌状の度合いもまた評価してもよい。患者由来のＣＤ３４＋細胞をＮＳＧマウスに移植してもよく、その後、異常赤血球形成のいくつかの特徴を反復し、ターゲティング突然変異誘発の効果の評価を可能にする。 自己ＨＳＣ、ＥＳ、およびｉＰＳＣ由来ＨＳＣの拡大[00134]さらなる態様内で、本開示は、修正された細胞の効率的な生着、ならびにスクリーニングおよび臨床適用のための人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の使用を可能にするため、修飾造血幹細胞（ＨＳＣ）のｅｘ ｖｉｖｏ拡大のための組成物および方法を提供する。これらの態様の特定の側面内で、自己ＨＳＣ、自己遺伝子修飾ＨＳＣ、ＥＳ、およびｉＰＳＣ由来ＨＳＣの効率的な拡大のための組成物および方法を提供する。正常ドナーから得られた動員末梢血ＣＤ３４＋を用い、造血性増殖因子を補充した血清不含培地中でＤｅｌｔａ１を利用する臍帯血拡大方法論を使用してもよい。１またはそれより多いさらなる試薬と組み合わせてこれらの組成物および方法を用いて、造血幹細胞／前駆細胞の生存および増殖を増進してもよい。他の側面内で、これらの組成物および方法は、修正ｉＰＳＣ由来ＨＳＣを含む長期再増殖細胞の増進された拡大のため、内皮細胞共培養を使用してもよい。 [00135]現在開示される遺伝子修正戦略の有効な臨床橋渡しのため、本開示は、修正自己ＨＳＣの絶対数のｅｘ ｖｉｖｏ拡大のための方法を提供する。遺伝子修正法は、より小規模で行った場合、一般的により効率的であり、そしてしばしば、修正のために限定された数のＨＳＣしか入手可能でない。したがって、本開示によって、増大法を使用して、修正ＨＳＣ、ＥＳ、および／または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来ＨＳＣの臨床的に実行可能なｅｘ ｖｉｖｏ拡大を可能にしうることが意図される。特定の側面内で、本開示は、幹細胞の運命を決定する際のＮｏｔｃｈシグナル伝達の役割を利用することによって、療法的適用のため、造血幹細胞／前駆細胞を拡大するための方法を提供する。Ｄａｈｌｂｅｒｇら， Ｂｌｏｏｄ １１７：６０８３−９０（２０１０）； Ｄｅｌａｎｅｙら， Ｎａｔ Ｍｅｄ １６：２３２−６（２０１０）；およびＶａｒｎｕｍ−Ｆｉｎｎｅｙら， Ｎａｔ Ｍｅｄ ６：１２７８−８１（２０００）。 [00136]これらの方法は、まず、部分的にＨＬＡマッチした新鮮な産物（培養後に採取し、そして直接注入）を用いることによって、そして／またはオフザシェルフ非ＨＬＡマッチ細胞療法として先に拡大されそして凍結保存されている産物を用いることによって、臍帯血幹細胞／前駆細胞の臨床的に適切なｅｘ ｖｉｖｏ拡大、および臍帯血移植を受けている患者における骨髄抑制治療のための拡大された細胞療法を可能にする。 [00137]遺伝子修正自己ＨＳＣのｅｘ ｖｉｖｏ拡大は、より多数の適切に修正された再増殖細胞の移植を可能にして、ｉｎ ｖｉｖｏの遺伝子修正細胞の迅速な再増殖を可能にし、そしてその優勢を確実にすることによって、ＨＳＣに基づく遺伝子療法の安全性および有効性を増進させる。したがって、本開示は、第三者の非ＨＬＡマッチドナーのｅｘ ｖｉｖｏ拡大幹細胞／前駆細胞を通じた、対症療法のための組成物および方法を提供し、これは、骨髄破壊的Ｔ細胞枯渇自己移植後に観察される感染に続く早期移植関連死亡リスクを減少させるために必須である、迅速であるが一過性の骨髄回復を提供することが可能である。Ｄｅｌａｎｅｙら， Ｎａｔ Ｍｅｄ １６：２３２−６（２０１０）。 [00138]分化を阻害する剤（例えばＮｏｔｃｈリガンド）を、初期幹細胞／前駆細胞の増殖および生存を増進させる組成物および方法と組み合わせて、それによって改善されたＮｏｔｃｈ仲介性ｅｘ ｖｉｖｏ拡大を達成してもよい。Ｎｏｔｃｈリガンド、Ｄｅｌｔａ１を、アリール炭化水素受容体阻害剤（ＳＲ１）（Ｂｏｉｔａｎｏら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２９：１３４５−８（２０１１））またはＨｏｘＢ４（Ｗａｔｔｓら， Ｂｌｏｏｄ １１６：５８５９−６６（２０１０）およびＺｈａｎｇら， ＰＬｏＳ Ｍｅｄ ３：ｅ１７３（２００６））と組み合わせて、造血前駆体の増殖および自己再生を増殖させ、そしてアンギオポエチン様５と組み合わせてそれらの生存を増進させることによって、臍帯血幹細胞／前駆細胞の増殖増進を達成することも可能である。遺伝子療法の臨床適用に必須であるのは、長期再増殖細胞を拡大し、修正細胞移植片の寿命を保証する能力である。 [00139]Ａｋｔ活性化内皮細胞を共培養系において使用して、遺伝子修正細胞の拡大を確認してもよい。Ｂｕｔｌｅｒら， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ６：２５１−６４（２０１１）。遺伝子修正細胞の拡大は、造血前駆体におけるＮｏｔｃｈシグナル伝達の内皮細胞誘導性活性化に応じる。臨床適用の第二の決定的な側面は、ｉｎ ｖｉｖｏの適切な振る舞いおよび発癌潜在能力の欠如を確実にするため、その正常対応物と比較した際の派生細胞の遺伝子およびエピジェネティック的忠実度である。重要なことに、拡大臍帯血幹細胞／前駆細胞のゲノム全体の評価は、初代単離ＣＤ３４＋細胞に比較して、トランスクリプトーム、クロマチン構造、およびＤＮＡメチロームの忠実度を示す。 [00140]正常ＣＤ３４＋細胞の拡大戦略を、異常ヘモグロビン症患者由来のＣＤ３４＋細胞を利用する定義された方法と併せて使用してもよい。臍帯血拡大方法論は、正常ドナーから得た動員末梢血ＣＤ３４＋を用い、造血増殖因子を補った血清不含培地中で、Ｄｅｌｔａ１を利用してもよい。確立されたｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ（免疫表現型決定、増殖等）を用いた最適化ｅｘ ｖｉｖｏ拡大条件、およびｉｎ ｖｉｖｏ再増殖能を、ＮＳＧマウスモデルを用いて評価してもよい。初期幹細胞／前駆細胞の増殖および生存を増進させるため、ＳＲ１（アリール炭化水素受容体阻害剤）、Ｈｏｘタンパク質、またはアンギオポエチンを含む組成物と組み合わせて、最適化条件を用いてもよい。有望な組み合わせを、前駆細胞ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、および免疫不全マウスモデル（ＮＳＧマウス）において評価し、そして次いで、正常個体由来のＣＤ３４＋の拡大から拡張して、サラセミア（および他の異常ヘモグロビン症）の患者由来のＣＤ３４＋細胞の拡大のためのこれらの方法を評価してもよい。 [00141]ゲノム全体のアプローチを用いて、生成された細胞の発癌潜在能力を評価して、正常対応物ＨＳＣと拡大された細胞の転写、遺伝子、およびエピジェネティック的忠実度を評価してもよい。ｉｎ ｖｉｖｏの増殖後（注入後）、細胞を用いて、影響を受けた任意のクローン（単数または複数）のｉｎ ｖｉｖｏ増殖を増進し、それによってまれな細胞の選択的拡大および検出を可能にする、機能的に有意な異常があるかどうかを決定してもよい。 遺伝子修正自己ＨＳＣの移植後、移植後好中球減少症を抑止し、そして転帰を改善するための細胞療法[00142]別の態様内で、本開示は、対症療法を提供するための組成物および方法であって、遺伝子修正自己ＨＳＣの移植後、移植後好中球減少症を抑止し、そして転帰を改善する、オフザシェルフ細胞療法を提供する。ｅｘ ｖｉｖｏ拡大された凍結保存臍帯血（ＣＢ）幹細胞／前駆細胞を、例えば、対症療法の手段として、自己ＣＤ３４＋遺伝子修正細胞での骨髄破壊的ＨＣＴを経ている、サラセミアおよび／または鎌状赤血球症患者に投与してもよい。 [00143]迅速な好中球回復の提供を可能にする、前駆細胞の経済的に実行可能な「オフザシェルフ」供給源を開発することを目的とした研究において、あらかじめ拡大された凍結保存造血幹細胞／前駆細胞産物の一揃いを生成した。各々は、将来の臨床使用のために保持可能な単一ＣＢ単位に由来する。 [00144]成体に、この「オフザシェルフ」非ＨＬＡマッチ産物を投与する際の安全性は、再発性／難治性ＡＭＬに対する最初のサルベージ化学療法直後、ならびに血液学的悪性腫瘍の小児患者および成人患者における骨髄破壊的ＣＢＴセッティングにおいて、立証された。 [00145]Ｔ細胞を欠く、この拡大された細胞産物を、オフザシェルフ細胞療法として注入して、迅速であるが一時的な骨髄生着を提供し、そして自己遺伝子修正幹細胞移植を用いた骨髄破壊的ＨＣＴを受けている患者における自己造血回復を潜在的に促進し、それによって感染合併症および死亡リスクを減少させることも可能である。 [00146]決定的なのは、Ｔ細胞を欠く「オフザシェルフ」非ＨＬＡマッチ産物の安全な注入のために、ＨＬＡマッチングが必要であるかどうかの疑問である。ＨＬＡマッチングの必要がなければ、新鮮なＣＢ単位を即時のｅｘ ｖｉｖｏ拡大のために収集し、そして最終産物を、将来の要求に応じた使用のために凍結保存してもよい。預けられた拡大産物のすべてが、患者のＨＬＡ型、人種／民族または居住地に関わらず、任意の所定の患者に潜在的に利用可能であるため、オフザシェルフ拡大されたＣＢ産物への患者アクセスは、劇的に増大する。 [00147]さらに、オフザシェルフであり普遍的なドナーの増大細胞療法を生成可能であれば、ＨＣＴ後の重症の好中球減少症の期間を短縮するのに有望であるだけでなく、幹細胞移植以外の研究のより広い領域を増大させる可能性もあり、例えば化学療法に誘導される重症の好中球減少症、任意の後天性重症好中球減少症または偶発的放射線曝露の治療のための一時的骨髄生着を提供する方法としての可能性がある。 [00148]ｅｘ ｖｉｖｏ拡大は、造血回復遅延を克服することによって、ＣＢＴのリスクを抑止し、そして全体の生存の有意な改善が生じるであろう。二重ＣＢＴを経ている患者において、再発のリスク減少が観察されてきており、そして非常にミスマッチした移植にもかかわらず、慢性ＧＶＨＤはより低い。早期移植関連死亡リスクが、造血回復を増進するｅｘ ｖｉｖｏ拡大臍帯血前駆細胞の注入によって減少可能であるならば、全体の生存は、慣用的に関連しないドナーで見られるものを超える可能性が高い。 [00149]さらなる態様内で、本開示は、移植後好中球減少症を抑止し、そして遺伝子修正自己ＨＳＣの移植後の転帰を改善する細胞療法を提供する。自己遺伝子修正細胞を用いた骨髄破壊的ＨＣＴを経ているサラセミア患者は、注入移植におけるＣＤ３４＋細胞の限定された数に派生して、感染および死亡のリスクが増加している（これらの遺伝子修正細胞の臨床的に実行可能な数へのｅｘ ｖｉｖｏ増加が達成されるまで）。オフザシェルフ対症療法手段として、先に拡大され、そして凍結保存された臍帯血前駆細胞産物の注入を使用して、長期移植が造血回復に寄与するまでの、早期であるが一過性の骨髄回復に寄与することによって、死亡リスクを減少させることも可能である。 [00150」骨髄破壊的ＨＣＴを受けている患者は、コンディショニング措置の直接の結果として重度の汎血球減少症を経験し、そしてすべての患者で、この期間中、感染および出血のリスクが増加している。（好中球および血小板の）造血回復までの期間は、ＣＤ３４＋細胞用量によって直接影響を受け、そしてしたがって、幹細胞用量が慣用的なドナー移植の１／１０である臍帯血を用いて、または自己ＣＤ３４濃縮低細胞用量移植を用いて、骨髄破壊的ＨＣＴを受けている患者に関しては、造血回復遅延による移植関連死亡リスクはさらにより大きい。 [00151]これらのリスクを克服し、そしてこれらのＨＣＴアプローチの安全性を増加させるため、延長された汎血球減少症を抑止し、そしてより迅速な造血回復を促進することが可能な新規療法に関する大きな必要性がある。上に論じるように、こうした戦略が開発されてきており、ここで、骨髄再増殖臍帯血（ＣＢ）造血幹細胞／前駆細胞（ＨＳＰＣ）の絶対数は、ＮｏｔｃｈリガンドＤｅｌｔａ１との培養によって増加させることも可能である。これらの部分的にＨＬＡマッチしたｅｘ ｖｉｖｏ拡大ＣＢ細胞を、臍帯血移植（ＣＢＴ）を受けている小児または成人に注入することは、安全であることが立証されてきており、そして拡大された細胞に寄与される迅速な骨髄生着の結果として、好中球絶対数が最初に５００に到達するまでの時間を、２６日から１１日に有意に短縮可能である。 [00152]迅速な好中球回復を提供可能な前駆細胞の経済的に実行可能な「オフザシェルフ」供給源を開発することを目的とする、より最近の研究において，本発明者らは、あらかじめ拡大された凍結保存造血幹細胞／前駆細胞産物の一揃いを生成し、各々は、単一ＣＢ単位に由来し、将来の臨床使用のために保持可能である。本発明者らは、また、ここで、再発性／難治性ＡＭＬのための最初のサルベージ化学療法直後に成人に、ならびに血液学的悪性腫瘍を持つ小児および成人患者における骨髄破壊的ＣＢＴセッティングにおいて、この「オフザシェルフ」非ＨＬＡマッチ産物を投与する際の安全性も立証した。本発明者らは、Ｔ細胞を欠く、この拡大された細胞産物を、オフザシェルフ細胞療法として注入して、迅速であるが一時的な骨髄生着を提供し、そして自己遺伝子修正幹細胞移植を用い、骨髄破壊的ＨＣＴを受けている患者における自己造血回復を潜在的に促進し、それによって感染合併症および死亡のリスクを減少させることも可能であると仮定する。 [00153]ｅｘ ｖｉｖｏ拡大臍帯血幹細胞／前駆細胞の生成のための定義された最適な方法を用いて、一揃いの拡大されたオフザシェルフ細胞産物を使用して、自己遺伝子修正ＨＣＴにおける対症療法としてこれらの細胞を注入する際の安全性を決定してもよい。 [00154]本開示は、以下の限定されない実施例を考慮すると最適に理解されるであろう。 実施例１ ｉｎ ｖｉｔｒｏ区画化（ＩＶＣ）を用いたＩ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、およびＩ−ＯｎｕＩに基づくＢｃｌ１１ａ遺伝子ターゲティングホーミングエンドヌクレアーゼの選択 [00155]大腸菌における発現のためにコドン最適化されている、親ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）、Ｉ−ＨｊｅＭＩのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（図１４；配列番号２８； Ｊａｃｏｂｙら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ４０（１１）：４９５４−４９６４（２０１２）； Ｔａｙｌｏｒら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ４０（Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ ｉｓｓｕｅ）：Ｗ１１０−６（２０１２））を、ｐＥＴ２１−ａ（＋）（図１１； Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡのＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）部門）のＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ制限部位の間にクローニングした。部位特異的飽和突然変異誘発をＩ−ＨｊｅＭＩのＯＲＦ内に導入するため、縮重コドン５’−ＮＮＫ−３’（すべての２０アミノ酸をコードする）を含有するプライマーを用いて、両端に隣接断片と重複する領域のおよそ２０塩基対の領域を持つ、部分的ＯＲＦを含有するＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。こうしたＰＣＲプライマーを用いて突然変異されたアミノ酸残基を表２に示す。アガロースゲルからの抽出によってＰＣＲ産物を精製し、そして続く周期のＰＣＲにおいて、選択しようとする変異体エンドヌクレアーゼのターゲット部位２コピーを含有する配列と組み合わせた。組み立てが成功したＤＮＡ断片を再び、ゲル抽出によって精製し、そしてｉｎ ｖｉｔｒｏ区画化（ＩＶＣ）において、ライブラリーとして用いた。 [00156]改変された特異性を持つ変異体ヌクレアーゼ遺伝子を濃縮するため、部位特異的飽和突然変異誘発の各周期後、３周期のＩＶＣを行った。油−界面活性剤混合物（軽油中の２％ ＡＢＩＬ ＥＭ ９０（Ｅｖｏｎｉｋ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ＡＧ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｃａｒｅ、ドイツ、ノルト・ライン・ウェストファーレン州エッセン）、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）を、飽和緩衝液（１００ｍＭグルタミン酸カリウム（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ酢酸マグネシウム（ｐＨ７．５）、１ｍＭジチオスレイトールおよび５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）と徹底的に混合し、３７℃で２０分間インキュベーションし、そして４℃、１６，０００ｘｇで１５分間遠心分離した。上相の５００マイクロリットルを用いて、氷上で、１，４００ｒ．ｐ．ｍ．で３．５分間、一定して攪拌することによって、３０μｌのｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質合成混合物（２５μｌのＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）、２０単位のＲＮアーゼ阻害剤、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、および８ｎｇのＤＮＡライブラリー）を乳化した。エマルジョンを３０℃で４時間インキュベーションし、そして次いで、７５℃で１５分間加熱した。４℃、１６，０００ｘｇで１５分間遠心分離することによって、乳化小滴を収集し、そしてフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールの添加によって破壊した。エタノール沈殿によって核酸を回収し、そしてＲＮアーゼカクテル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ニューヨーク州グランドアイランド）で処理した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ・ヒルデン）を用いた精製後、ＤＮＡライブラリーを、乳化小滴中で発現されるエンドヌクレアーゼ変異体によって生成されるターゲット部位の付着端に相補的な４塩基３’オーバーハング配列を含むＤＮＡアダプターと連結し、そして切断されたターゲット部位に連結する変異体エンドヌクレアーゼの遺伝子を濃縮するため、連結されたＤＮＡアダプターに一方が特異的であるプライマー対を含有するＰＣＲ混合物に添加した。ＰＣＲアンプリコンをゲル精製して、そして変異体遺伝子のＯＲＦをさらにＰＣＲ増幅して、続く周期のＩＶＣで用いるＤＮＡライブラリーを調製した。 [00157]第二の周期のＩＶＣにおいて、１ｎｇの再構築ライブラリーを用いてエマルジョンを作製し、そして４２℃で７５分間インキュベーションした後、７５℃で加熱することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳反応を停止した。ＤＮＡライブラリーを回収し、そして上述のようなＤＮＡアダプターとの連結後のＰＣＲによって、活性エンドヌクレアーゼ遺伝子を特異的に濃縮した。 [00158]第三の周期のＩＶＣにおいて、０．５ｎｇのライブラリー断片を含有するｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質合成混合物を、４．５％ Ｓｐａｎ８０／０．５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／軽油中で乳化した。反応を４２℃で４５分間行い、そして７５℃で熱不活性化した。エマルジョンからの抽出後、切断されたターゲット部位と関連するエンドヌクレアーゼ遺伝子をＰＣＲ増幅し、そして続く周期の部位特異的突然変異誘発に供した。 [00159]ＢＣＬ１１Ａ遺伝子ターゲットの（−）および（＋）ハーフ部位を認識するＩ−ＨｊｅＭＩ変異体を再設計するため、それぞれ、４周期および２周期の部位特異的飽和突然変異誘発を行った（図１３）。前半のハーフ部位をターゲティングする変異体ヌクレアーゼのプールを、タンパク質−ＤＮＡ界面と反対の表面上の突然変異誘発のさらなる（第五の）周期に供し、その後、３周期のＩＶＣを行った（表２）。 表２ ＩＶＣにおける飽和突然変異誘発に供するアミノ酸位 ＊下線のヌクレオチドは、親ＬＨＥ Ｉ−ＨｊｅＭＩのターゲット部位のものとは異なる。ＢＣＬ１１Ａ遺伝子ターゲットの（−）および（＋）ハーフ部位に関与するＩ−ＨｊｅＭＩ変異体エンドヌクレアーゼのＮ末端およびＣ末端ハーフドメインをコードするＤＮＡ断片を組み立てて、そして全長ＢＣＬ１１Ａ遺伝子ターゲット部位を切断するヌクレアーゼのプールを、３周期のＩＶＣを通じて選択した（図１３）。 [00160]表３は、例示的なＢＣＬ１１ａターゲット配列を提示し、該配列は、該配列に対する非常に活性が高いエンドヌクレアーゼ変異体（ホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｉ−ＣｐａＭＩおよびＩ−ＯｎｕＩに基づく）のプールが単離され、そしてその配列が決定されているＤＮＡ配列モジュールを含む。 表３ 実施例２ 細菌における２プラスミド遺伝子除去切断アッセイを用いたＢＣＬ１１Ａ遺伝子ターゲティングＩ−ＨｊｅＭＩ変異体の活性の最適化 [00161]Ｄｏｙｏｎら， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２８（７）：２４７７−２４８４（２００６）の方法論にしたがって、細菌細胞における２プラスミド選択系を用いて、ＩＶＣディスプレイ選択（上記実施例１に開示する）を用いた選択において得られるＩ−ＨｊｅＭＩ変異体の活性を最適化した。エンドヌクレアーゼ遺伝子のＯＲＦを、ｐＥＮＤＯ（図１２、Ｄｏｙｏｎら， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２８（７）：２４７７−２４８４（２００６））発現プラスミドのＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ部位の間に挿入した。４コピーのＢＣＬ１１Ａ遺伝子ターゲットを含有するｐＣｃｄＢレポータープラスミド（図３１、Ｄｏｙｏｎら， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２８（７）：２４７７−２４８４（２００６）； Ｔａｋｅｕｃｈｉら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３７（３）：８７７−８９０（２００９）；およびＴａｋｅｕｃｈｉら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． １０．１０７３／ｐｎａｓ．１１０７７１９１０８（２０１１））を宿するＮｏｖａＸＧＦ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ））コンピテント細胞を、Ｉ−ＨｊｅＭＩ変異体をコードするｐＥｎｄｏプラスミドのプールで形質転換した。形質転換体を２ｘＹＴ培地（１６ｇ／Ｌトリプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、および５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）中、３７℃で３０分間増殖させ、そして次いで、１００μｇ／ｍＬカルベニシリンおよび０．０２％Ｌ−アラビノース（Ｉ−ＨｊｅＭＩ変異体の発現をあらかじめ誘導するため）を補充した２ｘＹＴ培地で１０倍希釈した。培養を３０℃で１５時間増殖させた後、細胞を採取し、滅菌水中に再懸濁し、そして非選択プレート（１ｘＭ９塩、１％グリセロール、０．８％トリプトン、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ ＣａＣｌ２、２μｇ／ｍＬチアミン、および１００μｇ／ｍＬカルベニシリン）および選択プレート（すなわち、０．０２％Ｌ−アラビノースおよび０．４ｍＭ ＩＰＴＧを補充して毒性ＣｃｄＢタンパク質の発現を誘導した非選択プレート）の両方の上にスプレッドした。３０℃で３０〜４０時間インキュベーションした後、選択プレート上の生存コロニーからｐＥｎｄｏプラスミドを抽出した。 [00162]Ｇｅｎｅ Ｍｏｒｐｈ ＩＩランダム突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州サンタクララ）を用いて、エラープローンＰＣＲを通じて、活性Ｉ−ＨｊｅＭＩ変異体をコードするＯＲＦを増幅した。ＮｃｏＩ、ＮｏｔＩ、およびＤｐｎＩでの消化後、生じた断片をｐＥｎｄｏベクター内に再クローニングした。プレーティングする前に３０℃で４時間、変異体エンドヌクレアーゼを発現させる条件下で、プラスミドを２周期の選択に供した。重複ＰＣＲを用いて、選択した遺伝子のＮ末端ハーフおよびＣ末端ハーフドメインをシャッフルし、そして再び、ｐＥｎｄｏベクター内にクローニングした。ｐＥｎｄｏプラスミドおよびｐＣｃｄＢレポーターの両方を所持する形質転換細胞を、０．０２％Ｌ−アラビノースを含有する２ｘＹＴ培地中、３７℃で１時間増殖させ、そして次いで、３７℃で１６〜２０時間、選択プレート上にスプレッドした。同じレベルのストリンジェンシーでの２周期の選択後、選択プレート上の生存コロニーから、ｐＥｎｄｏプラスミドを抽出し、そしてプラスミド上に所持される変異体遺伝子のＯＲＦを配列決定した。 実施例３２プラスミド切断アッセイにおいて試験したＢＣＬ１１Ａ遺伝子ターゲティングエンドヌクレアーゼの活性[00163]例示的なＢＣＬ１１Ａ遺伝子ターゲティングエンドヌクレアーゼ（ＢＣＬ１１Ａｈｊｅ；図１７、配列番号３１）、その触媒的に不活性である変異体（ＢＣＬ１１Ａｈｊｅ Ｄ１８Ｎ）、およびその親ＬＨＥ Ｉ−ＨｊｅＭＩ（図１４、配列番号２８）の活性を、Ｉ−ＨｊｅＭＩのターゲット部位（Ｉ−ＨｊｅＭＩターゲット）またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子ターゲット（ＴＣＣＡＡＧＴＧＡＴＧＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＧ（配列番号３９；下線ヌクレオチドは、親ＬＨＥ Ｉ−ＨｊｅＭＩのターゲット部位のものとは異なる））のいずれかの４コピーを含有するｐＣｃｄＢレポータープラスミド（Ｄｏｙｏｎら， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２８（７）：２４７７−２４８４（２００６））を宿する細菌細胞において測定した。ｐＣｃｄＢレポータープラスミドは、「細胞死制御Ｂ」（「ｃｃｄＢ」、ＩＰＴＧの添加によって誘導可能な、細菌における毒性タンパク質）をコードする。レポータープラスミド中のターゲット部位の切断は、レポータープラスミドのＲｅｃＢＣＤ仲介性分解、およびＩＰＴＧを含有する選択培地上での対応する細胞生存を導く。選択プレート上のコロニー数を非選択プレート上のコロニー数で、割ることによって、生存率を決定した。エラーバーは、３回の独立の実験の±Ｓ．Ｄ．を指す。 実施例４内因性ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子でのターゲティング化突然変異誘発の検出[00164]ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（１．６ｘ１０５）を、トランスフェクションの２４時間前に、１２ウェルプレート中に植え付け、そしてＢＣＬ１１Ａ遺伝子ターゲティングヌクレアーゼおよびＴＲＥＸ２の発現プラスミド各０．５μｇでトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後、トランスフェクションした細胞を溶解し、そしてＱｕｉｃｋ−ｇＤＮＡ ＭｉｎｉＰｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出した。ＢＣＬ１１Ａ遺伝子ターゲットに渡るおよそ５００ｂｐ断片を、以下のプライマー対を用いて、５０ｎｇの抽出ゲノムからＰＣＲ増幅した： Ｂｃｌ１１Ａ＿ｕｐ１、５’− ＧＣＴ ＧＧＡ ＡＴＧ ＧＴＴ ＧＣＡ ＧＴＡ ＡＣ −３’（配列番号６６）； Ｂｃｌ１１Ａ＿ｄｏｗｎ１、５’− ＣＡＡ ＡＣＡ ＧＣＣ ＡＴＴ ＣＡＣ ＣＡＧ ＴＧ −３’（配列番号６７）。ＰＣＲアンプリコンを、組換えタンパク質を過剰発現する大腸菌から精製した０．５μＭのＢＣＬ１１Ａ遺伝子ターゲティングヌクレアーゼを含みまたは含まず、１ｘＢＳＡ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を加えた１ｘＮＥＢ緩衝液４中で３７℃で２時間インキュベーションした。５ｘ停止溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳ、２５％グリセロール、０．１オレンジＧおよび０．５ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ）を添加することによって、反応を停止させた。室温で１５分間インキュベーションした後、各試料の半分を、ＴＡＥ中にエチジウムブロミドを含有する１．６％アガロースゲル上で分離した（上部パネル）。各試料の残りを、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて精製し、そして以下のプライマー対を用いた第二の周期のＰＣＲ中、テンプレートとして用いた： Ｂｃｌ１１Ａ＿ｕｐ２、５’− ＣＴＧ ＣＣＡ ＧＣＴ ＣＴＣ ＴＡＡ ＧＴＣ ＴＣＣ −３’（配列番号６８）； Ｂｃｌ１１Ａ＿ｄｏｗｎ２、５’− ＴＧＣ ＡＡＣ ＡＣＧ ＣＡＣ ＡＧＡ ＡＣＡ ＣＴＣ −３’（配列番号６９）。ＰＣＲ産物を再び、上述の条件下で、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子ターゲティングヌクレアーゼで消化し、そして１．６％アガロースゲル上で分析した（下部パネル）（図３０を参照されたい）。 実施例５ｉｎ ｖｉｔｒｏ区画化を用いたＩ−ＯｎｕＩに基づく胎性ヘモグロビンサイレンシング領域ターゲティングエンドヌクレアーゼの選択[00165]フレンチＨＰＦＨ欠失において破壊される、成体赤血球細胞におけるＨｂＦサイレンシング領域内のＢｃｌ１１ａ占有の領域を含む３５０ｂｐ領域（配列番号２）全体に均一に分布する例示的なホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）ターゲット配列を表４に提示する。これらのターゲット配列は、それに対する非常に活性が高いエンドヌクレアーゼ変異体のプールが単離され、そして配列決定されている、ＤＮＡ配列モジュールを含む。 表４ [00166]表５は、Ａγ−およびＧγ−グロビン遺伝子の両方に関して同一であり、そして多くの非欠失ＨＰＦＨ突然変異を含有する、グロビン遺伝子の−１００ｂｐから２１０ｂｐ上流の領域を提示する。これらの突然変異を生じる遺伝子編集は、ガンマ遺伝子の抑制減少、したがって活性化を導き、そしてＨｂＦ増加を生じる。 表５ [00167]表６は、ヒト胎性グロビンサイレンシング領域に対してターゲティングされるホーミングエンドヌクレアーゼを生成するために、ＩＶＣにおける飽和突然変異誘発に供した（実施例１、上記に記載される通り）、親ＬＨＥ Ｉ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼ（図２２Ａ、配列番号３４）内のアミノ酸位を提示する。 表６ヒト胎性グロビンサイレンシング領域に対するターゲティング化ホーミングエンドヌクレアーゼを生成するＩＶＣにおける飽和突然変異誘発に供されるアミノ酸位 ＊下線ヌクレオチドは、親ＬＨＥ Ｉ−ＯｎｕＩのターゲット部位におけるものとは異なる。 [00168]図２３は、ヒト胎性グロビンサイレンシング領域由来の「ハーフターゲット」を用いた切断アッセイの結果を提示する。増幅バンドは、切断されたハーフ部位（相補的二重鎖オリゴヌクレオチドおよび対応するオーバーハングｓｓＤＮＡとの連結によって捕捉される）および切断されたＤＮＡ産物の生成に関与する酵素変異体の配列の両方を含有する。「ハーフ部位」エンドヌクレアーゼライブラリーの濃縮の完了に際しての最終段階には、ｇグロビンサイレンシング領域ターゲットの左（Ｌ）および右（Ｒ）ハーフ部位に関与する、Ｉ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼのＮ末端およびＣ末端ハーフドメインをコードするＤＮＡ断片の集合が含まれる。全長ヒト胎性グロビンサイレンシング領域ターゲットを切断するプールから、活性Ｉ−ＯｎｕＩエンドヌクレアーゼを選択する。 実施例６遺伝子ターゲティング化エンドヌクレアーゼの特異性および活性を増加させるためのＴＡＬアンカーのＮ末端融合を伴うＭｅｇａＴＡＬホーミングエンドヌクレアーゼ[00169]ＴＡＬアンカーのＮ末端融合を使用して、１またはそれより多いホーミングエンドヌクレアーゼ、例えば１またはそれより多いＩ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、およびＩ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼを含む、遺伝子ターゲティング化エンドヌクレアーゼの特異性および活性を増加させてもよい。ＲＶＤプラスミドライブラリーおよびデスティネーションベクターを用いて、Ｃｅｒｍａｋら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３９：ｅ８２−ｅ８２（２０１１）に記載されるＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ組み立て戦略を用いて、ＭｅｇａＴＡＬを構築する（ＭｅｇａＴＡＬ：５．５ＲＶＤ＋Ｙ２１−ＡｎｉＩのヌクレオチドおよびアミノ酸配列に関しては、図２４、配列番号３５および図２５、配列番号３６を参照されたい）。 [00170]プラスミドを修飾し、１．５〜１０．５のＴＡＬリピートおよびその対応するＲＶＤ（ターゲット部位の５’領域における連続したＤＮＡ塩基と接触し、そしてそれによってその領域の同族ＤＮＡ配列を定義する「リピート可変二残基」）を含有するＴＡＬエフェクターの組み立てを可能にする。ｐｔｈＸ０１デスティネーションベクターを修飾して、ＮＬＳのすぐ下流の赤血球凝集素（ＨＡ）タグを含ませ、そして残基１５４（野生型ＰｔｈＸｏ１ ＴＡＬエフェクターに比較して）で始まり、そして最後の「ハーフＴＡＬリピート」配列を超えて６３残基で終わるＴＡＬＥＮ足場を生じた。 [00171]各々の特異的ヌクレオチドをターゲティングする以下のＲＶＤを用いて、ＴＡＬエフェクターを構築する：Ａ−ＮＩ、Ｃ−ＨＤ、Ｇ−ＮＮおよびＴ−ＮＧ。ＴＡＬエフェクターリピートをデスティネーションベクター内にクローニングした後、個々のタンパク質リンカー（「Ｚｎ４」；ＶＧＧＳ）および操作したホーミングエンドヌクレアーゼ変異体を、操作したＸｂａ−ＩおよびＳａｌ−Ｉ制限部位の間に、ＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインの代わりにクローニングする。 [00172]これは、「モデル試験ケース」ＭｅｇａＴＡＬである（元来、Ｔａｋｅｕｃｈｉら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３７（３）： ８７７−８９０（２００９）に記載された、野生型Ｙ２ Ｉ−ＡｎｉＩホーミングエンドヌクレアーゼに柔軟なリンカーを通じて融合する、単一のタンパク質鎖のＮ末端でのＴＡＬエフェクターの融合）。 実施例７Ｂｃｌ１１ａが制御する胎性ヘモグロビン（ＨｂＦ）サイレンシング領域を破壊するためのＣａｓ９に基づくエンドヌクレアーゼ系[00173]細菌が適応免疫のために使用するクラスター化された規則的間隔の短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）系の機構が最近、理解されてきたことによって、哺乳動物細胞のゲノム編集を可能にする強力なツールの開発が導かれてきており：（ａ）Ｂｃｌ１１ａコード領域を破壊し；（ｂ）ＨｂＦサイレンシングＤＮＡ制御要素または経路、例えばＢｃｌ１１ａ制御ＨｂＦサイレンシング領域を破壊し；（ｃ）１またはそれより多いγ−グロビン遺伝子プロモーター（単数または複数）を突然変異させて、γ−グロビン遺伝子の発現増加を達成し；（ｄ）１またはそれより多いδ−グロビン遺伝子プロモーター（単数または複数）を突然変異させて、δ−グロビン遺伝子の発現増加を達成し；そして／または（ｅ）１またはそれより多いβ−グロビン遺伝子突然変異（単数または複数）を修正するため、これを本明細書に開示する異常ヘモグロビン症の治療のための組成物および方法で使用することも可能である。細菌ＣＲＩＳＰＲ系は、Ｊｉｎｅｋら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６−８２１（２０１３）； Ｃｏｎｇら， Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｊａｎ． ３， ２０１３）（印刷前のＥｐｕｂ）；およびＭａｌｉら， Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｊａｎ． ３， ２０１３）（印刷前のＥｐｕｂ）に記載される。 [00174]Ｃａｓ９タンパク質は、その位置がＲＮＡガイド配列によって決定される特定の部位で、二本鎖ブレイクを生成する。すべてのガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９に結合する同じ足場配列、ならびにＣａｓ９−ＲＮＡ複合体切断特異性を提供する構造Ｇ−Ｎ２０−ＧＧを有する可変ターゲティング配列を含有する。Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡの同時発現は、配列特異的切断がガイドＲＮＡ配列によって定義される、ヒトゲノム内の配列特異的位置での効率的な切断および破壊を生じる。Ｃａｓ９および多数のターゲットに特異的なガイドＲＮＡの同時発現は、ターゲット部位間介在領域の効率的な欠失を導く。 [00175]したがって、本開示の特定の側面内で、Ｃａｓ９仲介ゲノム編集を使用して：（１）ＨｂＦサイレンシング領域内のＢｃｌ１１ａ結合部位を破壊し、（２）Ｂｃｌ１１ａ遺伝子機能を破壊し、そして（３）全ＨｂＦサイレンシング領域を欠失させる。ターゲット領域を同定し、そして最適ガイドＲＮＡターゲット配列の考慮に基づいて、ガイドＲＮＡを設計し、そして生成する。本明細書に例示するのは、ＨｂＦサイレンシング領域内のＢｃｌ１１ａ結合領域ならびに単一ＧＡＴＡ−１結合モチーフをターゲティングするガイドＲＮＡである。これらのガイドＲＮＡを単独で、または組み合わせて用いて、ＨｂＦサイレンシング領域のターゲティング化破壊を達成する。占有のＢｃｌ１１ａピークに対応するＨｂＦサイレンシング領域内のさらなる領域に対するガイドＲＮＡを伴うＣａｓ９もまた、単独で、そして組み合わせて用いる。Ｂｃｌ１１ａ結合部位およびＧＡＴＡ−１モチーフに隣接する数対のガイドＲＮＡ、ならびに全フットプリントもまた、ＨｂＦサイレンシング領域内で欠失を生成するため、Ｃａｓ９と同時発現させてもよい。 [00176]Ｍａｌｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３年１月３日）由来のヒトコドン最適化Ｃａｓ９の配列を図２６、配列番号３７に提示する。ガイドＲＮＡの一般的な配列（Ｍａｌｉら）を図２７、配列番号３８に提示し、その重要な配列要素を表７に提示する。ヒト胎性ヘモグロビン（ＨｂＦ）サイレンシング領域のターゲット特異的結合および切断の例示的なＣａｓ９ガイドＲＮＡ配列（図６、配列番号１および図７、配列番号２）を、表８に提示する。 表７一般的Ｃａｓ９ガイドＲＮＡの配列要素 表８例示的Ｃａｓ９ガイドＲＮＡに関するターゲット特異的配列 実施例８エンドヌクレアーゼを発現するためのベクター系[00177]ＮＳＧ、鎌状赤血球およびサラセミア・マウスモデルのため、移植前に、ヒトＣＤ３４細胞またはマウス骨髄有核細胞を、蛍光マーカーとともに形質導入して、フローサイトメトリーに基づく細胞の濃縮を可能にする。適切な形質導入法には、以下が含まれる： [00178]ＡＡＶ６ベクター。ＡＡＶ６血清型組換えＡＡＶベクターは、小さい組換えテンプレートに加えて、プロモーター−ＨＥ−エクソヌクレアーゼまたはプロモーター−ＴＡＬ−ＨＥ融合−エクソヌクレアーゼカセットを送達するのに十分な４．５ｋｂペイロードを提供する。あるいは、これらは、Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡを所持可能である。さらに、本発明者らは、すべての既知のＡＡＶキャプシドのヒトＣＤ３４＋臍帯血細胞の最も効率的な形質導入を提供し、そしてＨＳＣにおける一過性遺伝子発現の有意なレベルを仲介することが可能である。 [00179]修飾アデノウイルスベクター。ハイブリッドキャプシドを含むアデノウイルスベクターは、ＣＤ３４＋細胞を含む多くのタイプの造血細胞を効率的に形質導入することが可能である。血清型３５ファイバー（Ａｄ５−Ｆ３５）を用いたキメラベクターでの改善された形質導入はＲａｗｌｉｎｇｓ博士（ＳＣＨ）によって立証され、そしてより最近のデータによって、血清型１１ファイバー（Ａｄ５−Ｆ１１）が、造血細胞においてさらにより効率的でありうることが示唆されている。ヘルパー依存性アデノウイルスベクターは、ＨＳＣにおける一過性遺伝子発現とともに、最大３０ｋｂのペイロードを提供し、そしてこれを用いて、多数のＨＥ／エクソヌクレアーゼカセット、ＨＥ−ＴＡＬ融合物、ならびに非常に大きな組換えテンプレートまたはＣａｓ９発現カセットおよび多数のガイドＲＮＡを送達することが可能である。 [00180]組込み不全レンチウイルスおよび泡沫ウイルスベクター（ＩＤＬＶおよびＩＤＦＶ）。これらのベクターは、６ｋｂ（ＩＤＬＶ）から９ｋｂ（ＩＤＦＶ）ペイロードを提供し、そしてヒトＨＳＣに形質導入する、よく立証された能力を有する。ＩＤＬＶおよびＩＤＦＶベクターはどちらも、ＨＳＣにおける遺伝子ノックアウトおよび組換えに基づく遺伝子編集に使用可能である。Ｒａｗｌｉｎｇｓ博士（ＳＣＨ）およびＫｉｅｍ博士（ＦＨＣＲＣ）は、代替プロモーターＧＦＰカセットを持つ一連のＩＤＬＶを生成し、そして評価し、そしてＣＤ３４＋ ＨＳＣにおける効率的でそして高レベルの発現を提供する構築物を決定してきている。 [00181]プラスミドおよびｍＲＮＡの直接ヌクレオフェクション。Ａｍａｘａヌクレオフェクション系を用いて、Ｎ−ＭＥＬおよびＣＤ３４細胞の効率的な形質導入のための条件が定義されてきている。利点には、組込みの欠如、および多数の発現プラスミドまたはＲＮＡ種を同時に形質導入する能力が含まれる。 [00182]平行して、ソーティングされた細胞およびソーティングされない細胞が別個のマウスに移植されるであろう。後者の移植は、少数の修飾細胞を含有しうるが、移植後キメラのヒト研究によって、これらの細胞が、選択的な生存長所を有し、そして末梢において濃縮されるであろうことが示唆される。それにもかかわらず、単一網状赤血球ＲＮＡおよびＦ細胞分析は、低存在量で存在した場合であっても、細胞における遺伝子破壊の評価を可能にするであろう。 [00183]第二のレベルの評価は、形質導入ＣＤ３４＋細胞の多能性および赤血球形成に重点を置くであろう。アッセイには、長期増殖潜在能力を評価するための培養、クローン分析のための骨髄および赤血球コロニーの分析、ならびにＮＯＤ Ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）マウスへの移植後の一次および二次レシピエントの多系統生着の評価が含まれるであろう。 [00184]典型的には、全身照射（ＮＳＧマウスに関して２７５ラドまたはＣ５７マウスに関して１０００ラド）後、尾静脈注射を通じて幹細胞を注入する。これは効率的であるが、５０倍少ない細胞しか必要でないか、理想的であるか、または潜在的に限定された数のフローサイトメトリーソーティングおよび／または修飾細胞をアッセイするため、本発明者らは、マウス大腿に直接幹細胞を注射し、これは大部分の研究に関して有効である。麻酔および局所鎮痛が提供され、そして解剖学的目印を定義した後、５０万〜１００万の細胞を大腿骨髄空間内に直接注射した。 実施例９効率的な遺伝子ターゲティングのためのホーミングおよびＣａｓ９エンドヌクレアーゼの性質決定[00185]臨床的影響に関して、個々のターゲティング化細胞における、および細胞集団における、グロビン遺伝子発現レベル、赤血球形成および幹細胞機能に対するターゲティングの効果、ならびにモデル生物における血液学的パラメータおよび臓器機能に対する影響を評価することによって、効率的な遺伝子ターゲティングが立証される。 [00186]形質導入に続いて、ＲＮＡおよびタンパク質レベルで、すべてのβ様遺伝子の遺伝子ターゲティング効率および発現の単一細胞およびバルク集団評価を行う。因子結合およびクロマチン構造における改変を評価するとともに、細胞形態、ならびに無効な赤血球形成およびアポトーシスの度合いを評価する。最初のスクリーニングにおいて、よくスコアリングされる候補エンドヌクレアーゼを、ＨＳＣ多能性に対する影響に関して、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの疾患特異的表現型を寛解させる能力に関して、さらに評価する。 [00187]単一の損なわれていないヒト染色体１１を含有するマウス赤白血病細胞株（Ｎ−ＭＥＬ）および臨床等級ＣＤ３４＋正常ヒトＨＳＣにおいて、エンドヌクレアーゼ候補および送達系の最初のスクリーニングを実行し、終点は、ターゲティング化突然変異効率およびグロビン遺伝子発現の評価である。両方の細胞タイプを、β様遺伝子の発現が低□−グロビン／□−＋β−グロビンＲＮＡ比で非常に誘導される期間である赤血球経路にしたがって分化するよう誘導することも可能である。ＨｂＦ特異的抗体を用いて、「Ｆ細胞」のパーセントを定量化してもよい。これらの低い比は、系が□−グロビンｍＲＮＡのわずかな増加、ならびに単一細胞および集団レベルでのＨｂＦ発現であっても検出しそして定量化するために感受性であるため、理想的である。 [00188]Ｎ−ＭＥＬ細胞は、β−グロビン遺伝子座を含有する単一の損なわれていないヒト染色体１１を含有するネズミ赤白血病細胞の派生物である。この赤血球細胞株は、通常、低レベルのマウスおよびヒトβ様グロビン遺伝子を発現するが、グロビン発現が非常に増加している時点に分化するよう誘導することも可能である。 [00189]Ａｍａｘａヌクレオフェクション系を用いて、Ｎ−ＭＥＬ細胞に効率的に形質導入する。２μｇのプラスミドＤＮＡ、キット「Ｌ」およびプログラムＡ２０を用いて、２５％の細胞が形質導入される。Ｂｃｌ１１ａ遺伝子を破壊するよう設計されたホーミングエンドヌクレアーゼを含有する、ＲＳＣＳ−ＭＣＳ−ＰＧ−ＷＺに基づくレンチウイルスベクターの２０の感染効率（ＭＯＩ）での感染は、およそ４０％の形質導入されたＮ−ＭＥＬ細胞を生じる。 [00190]Ｃｅｌ−１アッセイを用いて、ターゲティング化破壊の効率をアッセイする。ターゲット領域をＰＣＲによって増幅し、熱変性させ、再アニーリングさせて、そして１塩基対と同程度に小さいミスマッチ領域から、バブルを効率的に切断する酵素Ｃｅｌ−１に曝露する。ターゲティングされた領域が任意の方式で突然変異されている場合、野生型および突然変異鎖のヘテロ二重鎖は切断され、そしてゲル電気泳動によって検出される。バルク集団の細胞に対してこのアッセイを用いて、突然変異効率を概算するか、またはフローサイトメトリーでソーティングした個々の細胞に対してこのアッセイを用いて、この場合、多数の細胞の分析は、突然変異頻度の正確な評価を提供する。 [00191]細胞のバルク集団由来のＲＮＡに関してルーチンの定量的Ｔａｑｍａｎ ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）アッセイを用いると、β−グロビン発現は、分化とともに、そして０．１％の□−グロビン／□−＋β−グロビン比で、１１倍誘導される。Ｂｃｌ１１ａノックダウンベクターに感染した後、この比の３０倍の増加が得られることが可能であり、したがって、この細胞培養系が、ＢＣｌ１１ａ仲介ＨｂＦサイレンシング経路の破壊の正確な読み取り値を提供することが立証される。 [00192]Ｂｃｌ１１ａ経路を改変すると、□−グロビンＲＮＡの相対的な増加を導くが、グロビン遺伝子発現の減少を導く可能性があるという懸念のため、フローサイトメトリーを用いて、溶解される細胞の１０００細胞プールをソーティングして、そして上記のｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを実行してもよい。同じ数の細胞からのＲＮＡを直接比較するため、グロビンＲＮＡ量のいかなる減少も、Ｃｔの増加に反映され、β−および□−発現レベル両方の直接の測定値、ならびに□−グロビン／□−＋β−グロビンの比を提供する。 [00193]操作後に改変された□−グロビン／□−＋β−グロビン比を示す細胞の割合を決定し、そして観察される発現の変化範囲を決定するため、単一細胞アッセイを実行する。フローサイトメトリーにソーティングされた個々の細胞を、同時に数周期、□−およびβ−グロビンＲＮＡのルーチンのＲＴ−ＰＣＲに供し、そして試料を正確に分けることを可能にするために適切な材料が存在するようになったら、□−およびβ−グロビンを上述のようなｑＲＴ−ＰＣＲによって評価する。 [00194]最終的に、療法性であるのは、ＲＮＡではなくＨｂＦタンパク質のレベルであり、したがって、単一細胞およびバルク細胞ＨｂＦアッセイを実行する。細胞溶解およびヘモグロビン専用カラム上での溶出後、ＨＰＬＣを用いて、細胞のバルク集団をアッセイし、そしてＨｂＡおよびＨｂＡ２に対するＨｂＦの比を決定する。グルタルアルデヒド固定細胞を用い、界面活性剤で透過処理して、そしてＨｂＦ特異的抗体を添加した後、フローサイトメトリーで定量化して、ＨｂＦを発現している細胞の数を、形質導入前および形質導入後に比較する。 [00195]フローサイトメトリーによる単一細胞の単離後、修飾されたクローン細胞において突然変異の影響を評価する。上記アッセイを実行する。さらに、ターゲティング化突然変異が、Ｂｃｌ１１ａ抑制性複合体の結合を破壊することを示すため、細胞をホルムアルデヒド中で固定し、クロマチンを単離し、そして超音波処理によって剪断する。Ｂｃｌ１１ａ、ＧＡＴＡ−１およびＨＤＡＣ−１に対する商業的に入手可能な抗体を用いて、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を実行する。Ｎ−ＭＥＬ細胞、ならびに赤血球分化ＣＤ３４細胞におけるターゲット領域へのこれらのタンパク質の結合を以下に記載する。ターゲティング化破壊の後、結合の欠如を評価する。 実施例１０臨床等級ＣＤ３４＋造血幹細胞[00196]正常ヒトドナー由来のＣＤ３４＋細胞を、フィブロネクチンペプチドＣＨ−２９６を含む培養プレートに接着させて、そして２０のＭＯＩで、８時間離れて２回、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＦＬＴ−３、およびＴＰＯを含有する培地中、上述のＲＳＣＳ−ＭＣＳ−ＰＧ−ＷＺに基づくレンチウイルスベクターに感染させた。これは、〜８０％の細胞感染を生じる。Ｄｏｕｙのプロトコルを用いて、形質導入細胞を赤血球細胞に分化させる。Ｇｉａｒｒａｔａｎａら， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２３（１）：６９−７４（２００５）。上記のｑＲＴ−ＰＣＲアッセイは、４％の□−グロビン／□−＋β−グロビン比を生じる。この低い比は、ゲノム編集に続く増加の高感度の検出を可能にする。 [00197]分化状態での改変を評価するため、ＣＤ３４、ＣＤ７１、およびグリコフォリンを含む多数の細胞表面マーカーを用いたフローサイトメトリー、ならびに細胞増殖およびライト−ギムザ染色後のサイトスピンの形態の評価を実行する。上述のようなバルク集団および単一細胞に対するＣｅｌ−１アッセイによって、破壊効率を評価する。グロビン遺伝子発現およびＨｂＦのさらなる評価を、１０００細胞プールおよび個々の細胞に対するｑＲＴ−ＰＣＲ、ならびにＨＰＬＣおよびＦ−細胞アッセイを用いて、上記のように実行する。ＣｈＩＰを使用して、ターゲット領域へのＢｃｌ１１ａ、ＧＡＴＡ−１およびＨＤＡＣ−１の結合を評価する。 [00198]ヒト細胞ＣＤ３４＋における臨床的有効性を評価するため、同じ方法を用いて、異常ヘモグロビン症患者由来のヒトＨＳＣに形質導入し、そして培養する。正常細胞に関するルーチンの分析に加えて、さらなる疾患特異的評価を実行する。培養サラセミア細胞は、最小限の拡大、ヘモグロビン形成欠如、無効な赤血球形成の証拠、および正常細胞に比較して増加したアポトーシスを示す。これによって、ターゲティング後の発現および赤血球形成の改善の定量的評価が可能になる。同様に、低酸素条件下でのＣＤ３４細胞の赤血球子孫の鎌状化の度合いを評価する。異常ヘモグロビン症患者由来のこれらの形質導入ＣＤ３４＋細胞をＮＳＧマウス内に移植し、その後、異常な赤血球形成のいくつかの特徴が再現され、ターゲティング化突然変異誘発の効果の評価が可能になる。 [00199]異常ヘモグロビン症のマウスモデルにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏで臨床的有効性を評価する。ネズミＢｃｌ１１ａのノックアウトは、導入遺伝子上にヒトβ−グロビン遺伝子座を含有するマウスにおいて、□−グロビンの劇的な用量非依存性増加を導き、そしてヒト化マウスモデルにおいて、鎌状表現型を寛解させる。どちらの系もグロビン遺伝子発現の分析が可能であるが、鎌状赤血球マウスでは、血液学的パラメータ、特にヘマトクリット、肝臓および肺病理、腎機能、ならびに脾臓サイズに特別に注意して、これらのマウスにおける表現型の改善の評価が可能である。これは、ＨｂＦ含有細胞の数、ＨｂＦ／Ｓ比および上記のものと類似の単一細胞アッセイにおける発現パターンに相関させることも可能である。 [00200]ＲＮＡ分析に関して、分析のための十分なＲＮＡ含有網状赤血球を含有することから、総血液を用いる。単一細胞分析に関して、血液をチアゾールオレンジで染色し、そして赤い細胞の前方および側方散乱プロファイルを持つＲＮＡ含有細胞を収集する。赤血球寿命は、鎌状赤血球マウスにおいて有意に減少し、そして１００％のＲＢＣを伴い、ＮＨＳ−ビオチンの腹腔内注射後に、寿命の改善を評価する。いくつかの時点で、１マイクロリットルの血液をストレプトアビジンＦＩＴＣで染色し、そして標識ＲＢＣの残りのパーセントをフローサイトメトリーによって評価する。これを、本発明者らのＢＥＲＫ鎌状赤血球マウス由来のマウスで行う。Ｐａｓｚｔｙら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８（５３３９）：８７６−８７８（１９９７）。さらに、Ａ２５およびＡ８５ヒトβ−グロビンＹＡＣを含有するマウスにおいて、□−グロビン／□−＋β−グロビン比を評価する。Ｐｏｒｃｕら， Ｂｌｏｏｄ ９０（１１）：４６０２−４６０９（１９９７）。 [00201]２つのサラセミアモデル、Ｔｈ−３マウスヘテロ接合体（Ｙａｎｇら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９２（２５）：１１６０８−１１６１２（１９９５））およびＬＣＲの欠失に関してヘテロ接合体であるマウス（Ｂｅｎｄｅｒら， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ． ５（２）：３８７−３９３（２０００））を評価する。各場合で、サラセミアマウスの分析の焦点は、ヘマトクリット、無効な赤血球形成評価、脾臓サイズ、鉄過負荷および臓器形態であろう。 異常ヘモグロビン症を治療するための組成物であって、ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）およびＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼからなる群より選択される１またはそれより多いエンドヌクレアーゼ（単数または複数）を含み、 前記エンドヌクレアーゼ（単数または複数）が、各々、Ｂｃｌ１１ａコード領域、Ｂｃｌ１１ａ遺伝子制御領域、成体ヒトβ−グロビン遺伝子座、胎性ヘモグロビン（ＨｂＦ）サイレンシング領域、Ｂｃｌ１１ａ制御ＨｂＦサイレンシング領域、γ−グロビン遺伝子プロモーター、δ−グロビン遺伝子プロモーター、およびβ−グロビン遺伝子突然変異部位からなる群より選択されるヌクレオチド配列に結合する、前記組成物。 前記エンドヌクレアーゼが、前記Ｂｃｌ１１ａコード領域または前記Ｂｃｌ１１ａ遺伝子制御領域に結合するＨＥである、請求項１の組成物。 前記ＨＥが、Ｉ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｉ−ＣｐａＭＩホーミングエンドヌクレアーゼ、およびＩ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択される、請求項２の組成物。 前記ＨＥが、Ｉ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼである、請求項３の組成物。 前記Ｉ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼが、配列番号２８または配列番号２９のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列内に、１またはそれより多いアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換が、Ｙ２０、Ｓ２２、Ｔ２４、Ｋ２６、Ｇ２７、Ｋ２８、Ｔ３１、Ｅ３３、Ｇ３５、Ｅ３７、Ｓ５９、Ｒ６１、Ｒ６３、Ｎ６４、Ｅ６５、Ｉ６６、Ｍ６８、Ｓ７０、Ｒ７０、Ｒ７２、Ｒ７４、Ｓ１０９、Ｎ１１０、Ａ１２１、Ｓ１２３、Ｎ１２４、Ｎ１３５、Ｓ１３７、Ｓ１５４、Ｌ１５８、Ｎ１５９、Ｄ１６２、Ｄ１６３、Ｉ１６６、Ｉ１６８、Ｓ１６８、Ｄ１７０、Ｉ１９３、Ｌ１９５、Ｒ２０２、Ｋ２０４、およびＴ２０６からなる群より選択される、請求項４の組成物。 前記Ｉ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼが、配列番号３１または配列番号３２のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列を含む、請求項５の組成物。 前記Ｉ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼが、配列番号３３またはその変異体のアミノ酸配列を含み、前記Ｉ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼが、Ｂｃｌ１１ａコード領域に特異的に結合可能である、請求項６の組成物。 前記エンドヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼであり、前記ＣＲＩＳＰＲがＲＮＡガイド鎖およびＣａｓ９エンドヌクレアーゼを含み、前記ＲＮＡガイド鎖が胎性ヘモグロビン（ＨｂＦ）サイレンシング領域への前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ結合を仲介する、請求項１の組成物。 前記ＲＮＡガイド鎖が、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、および配列番号５４からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項８の組成物。 前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、配列番号３７または機能性Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするその変異体のヌクレオチド配列にコードされる、請求項９の組成物。 前記エンドヌクレアーゼが、胎性ヘモグロビン（ＨｂＦ）サイレンシング領域に特異的に結合可能なＨＥである、請求項１の組成物。 前記ＨＥが、Ｉ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｉ−ＣｐａＭＩホーミングエンドヌクレアーゼ、およびＩ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択される、請求項１１の組成物。 前記ＨＥがＩ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼである、請求項１２の組成物。 前記Ｉ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼが、前記胎性ヘモグロビン（ＨｂＦ）サイレンシング領域に特異的に結合可能なＩ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼをコードする配列番号３４のヌクレオチド配列の変異体にコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１３の組成物。 前記Ｉ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼが、配列番号３４のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列内に１またはそれより多いアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換が、Ｌ２６、Ｒ２８、Ｒ３０、Ｎ３２、Ｓ４０、Ｅ４２、Ｇ４４、Ｑ４６、Ａ７０、Ｓ７２、Ｓ７８、Ｋ８０、およびＴ８２からなる群より選択される、請求項１４の組成物。 前記Ｉ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼが、配列番号３４のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列内に１またはそれより多いアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換が、Ｆ１８２、Ｎ１８４、Ｉ１８６、Ｓ１９０、Ｋ１９１、Ｑ１９７、Ｖ１９９、Ｓ２０１、Ｋ２２５、Ｋ２２７、Ｄ２３６、Ｖ２３８、およびＴ２４０からなる群より選択される、請求項１５の組成物。 ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬ−ＨＥ、またはＴＲＥＸ２タンパク質をさらに含む、請求項１の組成物。 異常ヘモグロビン症の治療のための組成物であって、ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）およびＣａｓ９エンドヌクレアーゼからなる群より選択される１またはそれより多いエンドヌクレアーゼ（単数または複数）をコードする１またはそれより多いポリヌクレオチドを含み、 前記エンドヌクレアーゼ（単数または複数）の各々が、Ｂｃｌ１１ａコード領域、Ｂｃｌ１１ａ遺伝子制御領域、成体ヒトβ−グロビン遺伝子座、胎性ヘモグロビン（ＨｂＦ）サイレンシング領域、Ｂｃｌ１１ａ制御ＨｂＦサイレンシング領域、γ−グロビン遺伝子プロモーター、δ−グロビン遺伝子プロモーター、およびβ−グロビン遺伝子突然変異部位からなる群より選択されるヌクレオチド配列に結合する、前記組成物。 前記エンドヌクレアーゼが、前記Ｂｃｌ１１ａコード領域または前記Ｂｃｌ１１ａ遺伝子制御領域に結合するＨＥである、請求項１８の組成物。 前記ＨＥが、Ｉ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｉ−ＣｐａＭＩホーミングエンドヌクレアーゼ、およびＩ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択される、請求項１９の組成物。 前記ＨＥがＩ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼである、請求項２０の組成物。 前記Ｉ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼが、配列番号２８または配列番号２９のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列内に１またはそれより多いアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換が、Ｙ２０、Ｓ２２、Ｔ２４、Ｋ２６、Ｇ２７、Ｋ２８、Ｔ３１、Ｅ３３、Ｇ３５、Ｅ３７、Ｓ５９、Ｒ６１、Ｒ６３、Ｎ６４、Ｅ６５、Ｉ６６、Ｍ６８、Ｓ７０、Ｒ７０、Ｒ７２、Ｒ７４、Ｓ１０９、Ｎ１１０、Ａ１２１、Ｓ１２３、Ｎ１２４、Ｎ１３５、Ｓ１３７、Ｓ１５４、Ｌ１５８、Ｎ１５９、Ｄ１６２、Ｄ１６３、Ｉ１６６、Ｉ１６８、Ｓ１６８、Ｄ１７０、Ｉ１９３、Ｌ１９５、Ｒ２０２、Ｋ２０４、およびＴ２０６からなる群より選択される、請求項２１の組成物。 前記Ｉ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼが、配列番号３１または配列番号３２のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列を含む、請求項２２の組成物。 前記Ｉ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼが、配列番号３３またはその変異体のアミノ酸配列を含み、前記Ｉ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼが、Ｂｃｌ１１ａコード領域に特異的に結合可能である、請求項２３の組成物。 前記エンドヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼであり、前記ＣＲＩＳＰＲがＲＮＡガイド鎖およびＣａｓ９エンドヌクレアーゼを含み、前記ＲＮＡガイド鎖が胎性ヘモグロビン（ＨｂＦ）サイレンシング領域への前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの結合を仲介する、請求項２４の組成物。 前記ＲＮＡガイド鎖が、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、および配列番号５４からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項２５の組成物。 前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、配列番号３７または機能性Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするその変異体のヌクレオチド配列にコードされる、請求項２６の組成物。 前記エンドヌクレアーゼが、胎性ヘモグロビン（ＨｂＦ）サイレンシング領域に特異的に結合可能なＨＥである、請求項１８の組成物。 前記ＨＥが、Ｉ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｉ−ＣｐａＭＩホーミングエンドヌクレアーゼ、およびＩ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択される、請求項２８の組成物。 前記ＨＥが、Ｉ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼである、請求項２９の組成物。 前記Ｉ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼが、前記胎性ヘモグロビン（ＨｂＦ）サイレンシング領域に特異的に結合可能なＩ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼをコードする配列番号３４のヌクレオチド配列の変異体にコードされるアミノ酸配列を含む、請求項３０の組成物。 前記Ｉ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼが、配列番号３４のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列内に１またはそれより多いアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換が、Ｌ２６、Ｒ２８、Ｒ３０、Ｎ３２、Ｓ４０、Ｅ４２、Ｇ４４、Ｑ４６、Ａ７０、Ｓ７２、Ｓ７８、Ｋ８０、およびＴ８２からなる群より選択される、請求項３１の組成物。 前記Ｉ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼが、配列番号３４のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列内に１またはそれより多いアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換が、Ｆ１８２、Ｎ１８４、Ｉ１８６、Ｓ１９０、Ｋ１９１、Ｑ１９７、Ｖ１９９、Ｓ２０１、Ｋ２２５、Ｋ２２７、Ｄ２３６、Ｖ２３８、およびＴ２４０からなる群より選択される、請求項３１の組成物。 ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬＥ−ＨＥ融合タンパク質、および／またはＴＲＥＸ２ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１８の組成物。 ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）およびＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドであって、前記エンドヌクレアーゼが、Ｂｃｌ１１ａコード領域、Ｂｃｌ１１ａ遺伝子制御領域、成体ヒトβ−グロビン遺伝子座、胎性ヘモグロビン（ＨｂＦ）サイレンシング領域、Ｂｃｌ１１ａ制御ＨｂＦサイレンシング領域、γ−グロビン遺伝子プロモーター、δ−グロビン遺伝子プロモーター、およびβ−グロビン遺伝子突然変異部位からなる群より選択されるヌクレオチド配列に結合する、前記ポリヌクレオチド。 前記エンドヌクレアーゼが、前記Ｂｃｌ１１ａコード領域または前記Ｂｃｌ１１ａ遺伝子制御領域に結合するＨＥである、請求項３５のポリヌクレオチド。 前記ＨＥが、Ｉ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｉ−ＣｐａＭＩホーミングエンドヌクレアーゼ、およびＩ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択される、請求項３６のポリヌクレオチド。 前記ＨＥが、Ｉ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼである、請求項３７のポリヌクレオチド。 前記Ｉ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼが、配列番号２８または配列番号２９のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列内に、１またはそれより多いアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換が、Ｙ２０、Ｓ２２、Ｔ２４、Ｋ２６、Ｇ２７、Ｋ２８、Ｔ３１、Ｅ３３、Ｇ３５、Ｅ３７、Ｓ５９、Ｒ６１、Ｒ６３、Ｎ６４、Ｅ６５、Ｉ６６、Ｍ６８、Ｓ７０、Ｒ７０、Ｒ７２、Ｒ７４、Ｓ１０９、Ｎ１１０、Ａ１２１、Ｓ１２３、Ｎ１２４、Ｎ１３５、Ｓ１３７、Ｓ１５４、Ｌ１５８、Ｎ１５９、Ｄ１６２、Ｄ１６３、Ｉ１６６、Ｉ１６８、Ｓ１６８、Ｄ１７０、Ｉ１９３、Ｌ１９５、Ｒ２０２、Ｋ２０４、およびＴ２０６からなる群より選択される、請求項３８のポリヌクレオチド。２５． 前記Ｉ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼが、配列番号３１または配列番号３２のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列を含む、請求項２４のポリヌクレオチド。 前記Ｉ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼが、配列番号３３またはその変異体のアミノ酸配列を含み、前記Ｉ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼが、Ｂｃｌ１１ａコード領域に特異的に結合可能である、請求項３９のポリヌクレオチド。 前記エンドヌクレアーゼが、胎性ヘモグロビン（ＨｂＦ）サイレンシング領域に特異的に結合可能なＨＥである、請求項４０のポリヌクレオチド。 前記ＨＥが、Ｉ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｉ−ＣｐａＭＩホーミングエンドヌクレアーゼ、およびＩ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択される、請求項４１のポリヌクレオチド。 前記ＨＥがＩ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼである、請求項３５のポリヌクレオチド。 前記Ｉ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼが、前記胎性ヘモグロビン（ＨｂＦ）サイレンシング領域に特異的に結合可能なＩ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼをコードする配列番号３４のヌクレオチド配列の変異体にコードされるアミノ酸配列を含む、請求項４３のポリヌクレオチド。 前記Ｉ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼが、配列番号３４のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列内に１またはそれより多いアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換の各々が、Ｌ２６、Ｒ２８、Ｒ３０、Ｎ３２、Ｓ４０、Ｅ４２、Ｇ４４、Ｑ４６、Ａ７０、Ｓ７２、Ｓ７８、Ｋ８０、およびＴ８２からなる群より選択される、請求項４４のポリヌクレオチド。 前記Ｉ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼが、配列番号３４のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列内に１またはそれより多いアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換が、Ｆ１８２、Ｎ１８４、Ｉ１８６、Ｓ１９０、Ｋ１９１、Ｑ１９７、Ｖ１９９、Ｓ２０１、Ｋ２２５、Ｋ２２７、Ｄ２３６、Ｖ２３８、およびＴ２４０からなる群より選択される、請求項４５のポリヌクレオチド。 ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬＥ−ＨＥ融合タンパク質、および／またはＴＲＥＸ２ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項３５のポリヌクレオチド。 Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの、Ｂｃｌ１１ａコード領域、Ｂｃｌ１１ａ遺伝子制御領域、成体ヒトβ−グロビン遺伝子座、胎性ヘモグロビン（ＨｂＦ）サイレンシング領域、Ｂｃｌ１１ａ制御ＨｂＦサイレンシング領域、γ−グロビン遺伝子プロモーター、δ−グロビン遺伝子プロモーター、およびβ−グロビン遺伝子突然変異部位への結合を仲介するＲＮＡガイド鎖をコードするポリヌクレオチド。 前記ＲＮＡガイド鎖が、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの胎性ヘモグロビン（ＨｂＦ）サイレンシング領域への特異的結合を仲介する、請求項４８のポリヌクレオチド。 前記胎性ヘモグロビン（ＨｂＦ）サイレンシング領域が、配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項４９のポリヌクレオチド。 前記胎性ヘモグロビン（ＨｂＦ）サイレンシング領域が、配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項５０のポリヌクレオチド。 前記ＲＮＡガイド鎖が、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、および配列番号５４からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項５０または請求項５１のポリヌクレオチド。 ベクター、ならびにホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）およびＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクター系であって、前記エンドヌクレアーゼが、Ｂｃｌ１１ａコード領域、Ｂｃｌ１１ａ遺伝子制御領域、成体ヒトβ−グロビン遺伝子座、胎性ヘモグロビン（ＨｂＦ）サイレンシング領域、Ｂｃｌ１１ａ制御ＨｂＦサイレンシング領域、γ−グロビン遺伝子プロモーター、δ−グロビン遺伝子プロモーター、およびβ−グロビン遺伝子突然変異部位からなる群より選択されるヌクレオチド配列に結合する、前記ベクター系。 前記ベクターが、ＡＡＶ６、修飾アデノウイルスベクター、組込み不全レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）、および組込み不全泡沫状ウイルスベクター（ＩＤＦＶ）からなる群より選択される、請求項５３のベクター系。 前記エンドヌクレアーゼが、前記Ｂｃｌ１１ａコード領域または前記Ｂｃｌ１１ａ遺伝子制御領域に結合するＨＥである、請求項５３のベクター系。 前記ＨＥが、Ｉ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｉ−ＣｐａＭＩホーミングエンドヌクレアーゼ、およびＩ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択される、請求項５５のベクター系。 前記ＨＥが、Ｉ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼである、請求項５６のベクター系。 前記Ｉ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼが、配列番号２８または配列番号２９のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列内に、１またはそれより多いアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換が、Ｙ２０、Ｓ２２、Ｔ２４、Ｋ２６、Ｇ２７、Ｋ２８、Ｔ３１、Ｅ３３、Ｇ３５、Ｅ３７、Ｓ５９、Ｒ６１、Ｒ６３、Ｎ６４、Ｅ６５、Ｉ６６、Ｍ６８、Ｓ７０、Ｒ７０、Ｒ７２、Ｒ７４、Ｓ１０９、Ｎ１１０、Ａ１２１、Ｓ１２３、Ｎ１２４、Ｎ１３５、Ｓ１３７、Ｓ１５４、Ｌ１５８、Ｎ１５９、Ｄ１６２、Ｄ１６３、Ｉ１６６、Ｉ１６８、Ｓ１６８、Ｄ１７０、Ｉ１９３、Ｌ１９５、Ｒ２０２、Ｋ２０４、およびＴ２０６からなる群より選択される、請求項５７のベクター系。２５．前記Ｉ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼが、配列番号３１または配列番号３２のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列を含む、請求項２４のポリヌクレオチド。 前記Ｉ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼが、配列番号３１または配列番号３２のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列を含む、請求項５８のベクター系。 前記Ｉ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼが、配列番号３３またはその変異体のアミノ酸配列を含み、前記Ｉ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼが、Ｂｃｌ１１ａコード領域に特異的に結合可能である、請求項５９のベクター系。 前記エンドヌクレアーゼが、胎性ヘモグロビン（ＨｂＦ）サイレンシング領域に特異的に結合可能なＨＥである、請求項５３のベクター系。 前記ＨＥが、Ｉ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｉ−ＣｐａＭＩホーミングエンドヌクレアーゼ、およびＩ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択される、請求項６１のベクター系。 前記ＨＥがＩ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼである、請求項６２のベクター系。 前記Ｉ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼが、前記胎性ヘモグロビン（ＨｂＦ）サイレンシング領域に特異的に結合可能なＩ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼをコードする配列番号３４のヌクレオチド配列の変異体にコードされるアミノ酸配列を含む、請求項６３のベクター系。 前記Ｉ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼが、配列番号３４のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列内に１またはそれより多いアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換が、Ｌ２６、Ｒ２８、Ｒ３０、Ｎ３２、Ｓ４０、Ｅ４２、Ｇ４４、Ｑ４６、Ａ７０、Ｓ７２、Ｓ７８、Ｋ８０、およびＴ８２からなる群より選択される、請求項６４のベクター系。 前記Ｉ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼが、配列番号３４のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列内に１またはそれより多いアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換が、Ｆ１８２、Ｎ１８４、Ｉ１８６、Ｓ１９０、Ｋ１９１、Ｑ１９７、Ｖ１９９、Ｓ２０１、Ｋ２２５、Ｋ２２７、Ｄ２３６、Ｖ２３８、およびＴ２４０からなる群より選択される、請求項６４のベクター系。 ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬＥ−ＨＥ融合タンパク質、および／またはＴＲＥＸ２ヌクレアーゼをコードするヌクレオチドをさらに含む、請求項５３のベクター系。 ベクター、ならびにＢｃｌ１１ａコード領域、Ｂｃｌ１１ａ遺伝子制御領域、成体ヒトβ−グロビン遺伝子座、胎性ヘモグロビン（ＨｂＦ）サイレンシング領域、Ｂｃｌ１１ａ制御ＨｂＦサイレンシング領域、γ−グロビン遺伝子プロモーター、δ−グロビン遺伝子プロモーター、およびβ−グロビン遺伝子突然変異部位からなる群より選択されるヌクレオチド配列へのＣａｓ９エンドヌクレアーゼの結合を仲介するＲＮＡガイド鎖をコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター系。 成体ヒトβ−グロビン遺伝子座内の前記ヌクレオチド配列が、胎性ヘモグロビン（ＨｂＦ）サイレンシング領域である、請求項６８のベクター系。 前記胎性ヘモグロビン（ＨｂＦ）サイレンシング領域が、配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項６９のベクター系。 前記胎性ヘモグロビン（ＨｂＦ）サイレンシング領域が、配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項６９のベクター系。 前記ＲＮＡガイド鎖が、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、および配列番号５４からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項７０または請求項７１のベクター系。 ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）およびＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼからなる群より選択される１またはそれより多いエンドヌクレアーゼ（単数または複数）をコードするポリヌクレオチドを含む細胞であって、前記エンドヌクレアーゼ（単数または複数）の各々が、Ｂｃｌ１１ａコード領域、Ｂｃｌ１１ａ遺伝子制御領域、成体ヒトβ−グロビン遺伝子座、胎性ヘモグロビン（ＨｂＦ）サイレンシング領域、Ｂｃｌ１１ａ制御ＨｂＦサイレンシング領域、γ−グロビン遺伝子プロモーター、δ−グロビン遺伝子プロモーター、およびβ−グロビン遺伝子突然変異部位からなる群より選択されるヌクレオチド配列に結合する、前記細胞。 前記細胞が幹細胞である、請求項７３の細胞。 前記細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹（ＥＳ）細胞、および赤血球前駆細胞からなる群より選択される幹細胞である、請求項７３の細胞。 前記細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および赤血球前駆細胞からなる群より選択される幹細胞である、請求項７３の細胞。 前記エンドヌクレアーゼが、前記Ｂｃｌ１１ａコード領域に特異的に結合可能なＨＥである、請求項７３の細胞。 前記ＨＥが、Ｉ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｉ−ＣｐａＭＩホーミングエンドヌクレアーゼ、およびＩ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択される、請求項７７の細胞。 前記ＨＥが、Ｉ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼである、請求項７８の細胞。 前記Ｉ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼが、配列番号２８または配列番号２９のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列内に、１またはそれより多いアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換が、Ｙ２０、Ｓ２２、Ｔ２４、Ｋ２６、Ｇ２７、Ｋ２８、Ｔ３１、Ｅ３３、Ｇ３５、Ｅ３７、Ｓ５９、Ｒ６１、Ｒ６３、Ｎ６４、Ｅ６５、Ｉ６６、Ｍ６８、Ｓ７０、Ｒ７０、Ｒ７２、Ｒ７４、Ｓ１０９、Ｎ１１０、Ａ１２１、Ｓ１２３、Ｎ１２４、Ｎ１３５、Ｓ１３７、Ｓ１５４、Ｌ１５８、Ｎ１５９、Ｄ１６２、Ｄ１６３、Ｉ１６６、Ｉ１６８、Ｓ１６８、Ｄ１７０、Ｉ１９３、Ｌ１９５、Ｒ２０２、Ｋ２０４、およびＴ２０６からなる群より選択される、請求項７９の細胞。２５。 前記Ｉ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼが、配列番号３１または配列番号３２のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列を含む、請求項８０の細胞。 前記Ｉ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼが、配列番号３３またはその変異体のアミノ酸配列を含み、前記Ｉ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼが、Ｂｃｌ１１ａコード領域に特異的に結合可能である、請求項８１の細胞。 前記ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼがＣａｓ９エンドヌクレアーゼおよびＲＮＡガイド鎖を含み、前記ＲＮＡガイド鎖が胎性ヘモグロビン（ＨｂＦ）サイレンシング領域への前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの結合を仲介する、請求項７３の細胞。 前記ＲＮＡガイド鎖が、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、および配列番号５４からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項８３の細胞。 前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、配列番号３７または機能性Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするその変異体のヌクレオチド配列にコードされる、請求項８４の細胞。 前記エンドヌクレアーゼが、胎性ヘモグロビン（ＨｂＦ）サイレンシング領域に結合するＨＥである、請求項７３の細胞。 前記ＨＥが、Ｉ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｉ−ＣｐａＭＩホーミングエンドヌクレアーゼ、およびＩ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択される、請求項８６の細胞。 前記ＨＥが、Ｉ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼである、請求項８７の細胞。 前記Ｉ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼが、前記胎性ヘモグロビン（ＨｂＦ）サイレンシング領域に特異的に結合可能なＩ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼをコードする配列番号３４のヌクレオチド配列の変異体にコードされるアミノ酸配列を含む、請求項８８の細胞。 前記Ｉ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼが、配列番号３４のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列内に１またはそれより多いアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換が、Ｌ２６、Ｒ２８、Ｒ３０、Ｎ３２、Ｓ４０、Ｅ４２、Ｇ４４、Ｑ４６、Ａ７０、Ｓ７２、Ｓ７８、Ｋ８０、およびＴ８２からなる群より選択される、請求項８９の細胞。 前記Ｉ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼが、配列番号３４のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列内に１またはそれより多いアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換が、Ｆ１８２、Ｎ１８４、Ｉ１８６、Ｓ１９０、Ｋ１９１、Ｑ１９７、Ｖ１９９、Ｓ２０１、Ｋ２２５、Ｋ２２７、Ｄ２３６、Ｖ２３８、およびＴ２４０からなる群より選択される、請求項８９の細胞。 ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬＥ−ＨＥ融合タンパク質、および／またはＴＲＥＸ２ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項７３の細胞。 ゲノム編集幹細胞であって、ホーミングエンドヌクレアーゼおよび修正テンプレートの導入によって生成される、前記ゲノム編集幹細胞。 前記修正テンプレートが、グロビン遺伝子座内の重要な制御配列またはコード配列の修飾を可能にするヌクレオチド配列を含む、請求項９３のゲノム編集幹細胞。 前記幹細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹（ＥＳ）細胞、および赤血球前駆細胞からなる群より選択される、請求項９３のゲノム編集幹細胞。 前記幹細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および赤血球前駆細胞からなる群より選択される、請求項９３のゲノム編集幹細胞。 サラセミアおよび鎌状赤血球症などの異常ヘモグロビン症の治療のための組成物および方法を提供する。組成物および方法には：（ａ）Ｂｃｌ１１ａコード領域を破壊し；（ｂ）Ｂｃｌ１１ａ遺伝子制御領域を破壊し；（ｃ）成体ヒトβ−グロビン遺伝子座を修飾し；（ｄ）ＨｂＦサイレンシングＤＮＡ制御要素または経路、例えばＢｃｌ１１ａが制御するＨｂＦサイレンシング領域を破壊し；（ｅ）１またはそれより多いγ−グロビン遺伝子プロモーター（単数または複数）を突然変異させて、γ−グロビン遺伝子の発現増加を達成し；（ｆ）１またはそれより多いδ−グロビン遺伝子プロモーター（単数または複数）を突然変異させて、δ−グロビン遺伝子の発現増加を達成し；そして／または（ｇ）１またはそれより多いβ−グロビン遺伝子突然変異（単数または複数）を修正するため、１またはそれより多いエンドヌクレアーゼ（単数または複数）またはエンドヌクレアーゼ融合タンパク質（単数または複数）が含まれ、１またはそれより多いホーミングエンドヌクレアーゼ（単数または複数）および／またはホーミングエンドヌクレアーゼ融合タンパク質（単数または複数）および／またはＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ（単数または複数）および／またはＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ融合タンパク質（単数または複数）が含まれる。 配列表20141104A16333全文3 ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）およびＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドであって、前記エンドヌクレアーゼが、Ｂｃｌ１１ａコード領域、Ｂｃｌ１１ａ遺伝子制御領域、成体ヒトβ−グロビン遺伝子座、胎性ヘモグロビン（ＨｂＦ）サイレンシング領域、Ｂｃｌ１１ａ制御ＨｂＦサイレンシング領域、γ−グロビン遺伝子プロモーター、δ−グロビン遺伝子プロモーター、およびβ−グロビン遺伝子突然変異部位からなる群より選択されるヌクレオチド配列に結合する、前記ポリヌクレオチド。 エンドヌクレアーゼが、（ａ）前記Ｂｃｌ１１ａコード領域または前記Ｂｃｌ１１ａ遺伝子制御領域に結合するＨＥ；（ｂ）Ｉ−Ｏｎｕ１ホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｉ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼ、およびＩ−ＣｐａＭＩホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるＨＥ；（ｃ）胎性ヘモグロビン（ＨｂＦ）サイレンシング領域に特異的に結合可能なＨＥ；（ｄ）Ｉ−Ｏｎｕ１ホーミングエンドヌクレアーゼ；（ｅ）胎性ヘモグロビン（ＨｂＦ）サイレンシング領域に特異的に結合可能なＩ−Ｏｎｕ１ホーミングエンドヌクレアーゼをコードする配列番号３４のヌクレオチド配列の変異体にコードされるアミノ酸配列を含むＩ−Ｏｎｕ１ホーミングエンドヌクレアーゼ；（ｆ）配列番号３４のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列内に１またはそれより多いアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換の各々が、Ｌ２６、Ｒ２８、Ｒ３０、Ｎ３２、Ｓ４０、Ｅ４２、Ｇ４４、Ｑ４６、Ａ７０、Ｓ７２、Ｓ７８、Ｋ８０、およびＴ８２からなる群より選択される、Ｉ−Ｏｎｕ１ホーミングエンドヌクレアーゼ；または（ｇ）配列番号３４のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列内に１またはそれより多いアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換が、Ｆ１８２、Ｎ１８４、Ｉ１８６、Ｓ１９０、Ｋ１９１、Ｑ１９７、Ｖ１９９、Ｓ２０１、Ｋ２２５、Ｋ２２７、Ｄ２３６、Ｖ２３８、およびＴ２４０からなる群より選択される、Ｉ−Ｏｎｕ１ホーミングエンドヌクレアーゼである、請求項１のポリヌクレオチド。 ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬＥ−ＨＥ融合タンパク質、および／またはＴＲＥＸ２ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１または２のポリヌクレオチド。 ベクター、ならびに以下の（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドを含むベクター系：（ａ）請求項１から３のいずれかに記載のポリヌクレオチド；（ｂ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドであって、ここで、該Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは配列番号３７または機能性Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするその変異体のヌクレオチド配列、および胎性ヘモグロビン（ＨｂＦ）サイレンシング領域へのＣａｓ９エンドヌクレアーゼの結合を仲介するＲＮＡガイド鎖を含んでいてもよく、ここで、該ＲＮＡガイド鎖は配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、および配列番号５４からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含んでいてもよい、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド。 前記ベクターが、ＡＡＶ６、修飾アデノウイルスベクター、組込み不全レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）、および組込み不全泡沫状ウイルスベクター（ＩＤＦＶ）からなる群より選択される、請求項４のベクター系。 請求項１から３のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペピチド。 以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）：（ａ）請求項１から３のいずれかに記載のポリヌクレオチド；（ｂ）請求項４または５に記載のベクター系；（ｃ）請求項６に記載のポリペプチドを含む、異常ヘモグロビン症を治療するための組成物。 請求項１から３のいずれかに記載のポリヌクレオチド、請求項４または５に記載のベクター系、または請求項６に記載のポリペプチドを含む細胞。 前記細胞が（ａ）幹細胞；（ｂ）造血幹細胞（ＨＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹（ＥＳ）細胞、および赤血球前駆細胞からなる群より選択される幹細胞；または（ｃ）造血幹細胞（ＨＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および赤血球前駆細胞からなる群より選択される幹細胞である、請求項８の細胞。 ゲノム編集幹細胞であって、ホーミングエンドヌクレアーゼおよび修正テンプレートの導入によって生成される、前記ゲノム編集幹細胞。 ホーミングエンドヌクレアーゼが（ａ）前記Ｂｃｌ１１ａコード領域またはＢｃｌ１１ａ遺伝子制御領域に結合するＨＥ；（ｂ）Ｉ−Ｏｎｕ１ホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｉ−ＨｊｅＭＩホーミングエンドヌクレアーゼ、およびＩ−ＣｐａＭＩホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるＨＥ；（ｃ）胎性ヘモグロビン（ＨｂＦ）サイレンシング領域に特異的に結合可能なＨＥ；（ｄ）Ｉ−Ｏｎｕ１ホーミングエンドヌクレアーゼ；（ｅ）胎性ヘモグロビン（ＨｂＦ）サイレンシング領域に特異的に結合可能なＩ−Ｏｎｕ１ホーミングエンドヌクレアーゼをコードする配列番号３４のヌクレオチド配列の変異体にコードされるアミノ酸配列を含むＩ−Ｏｎｕ１ホーミングエンドヌクレアーゼ；（ｆ）配列番号３４のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列内に１またはそれより多いアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換の各々が、Ｌ２６、Ｒ２８、Ｒ３０、Ｎ３２、Ｓ４０、Ｅ４２、Ｇ４４、Ｑ４６、Ａ７０、Ｓ７２、Ｓ７８、Ｋ８０、およびＴ８２からなる群より選択される、Ｉ−Ｏｎｕ１ホーミングエンドヌクレアーゼ；または（ｇ）配列番号３４のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列内に１またはそれより多いアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換が、Ｆ１８２、Ｎ１８４、Ｉ１８６、Ｓ１９０、Ｋ１９１、Ｑ１９７、Ｖ１９９、Ｓ２０１、Ｋ２２５、Ｋ２２７、Ｄ２３６、Ｖ２３８、およびＴ２４０からなる群より選択される、Ｉ−Ｏｎｕ１ホーミングエンドヌクレアーゼである、請求項１０に記載のゲノム編集幹細胞。 ホーミングエンドヌクレアーゼが、ＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインおよび／またはＴＲＥＸ２ヌクレアーゼドメインに融合されている、請求項１０または１１に記載のゲノム編集幹細胞。 請求項１０から１２のいずれかに記載のゲノム編集幹細胞であって、（ａ）修正テンプレートが、グロビン遺伝子座内の重要な制御配列またはコード配列の修飾を可能にするヌクレオチド配列を含む；（ｂ）幹細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹（ＥＳ）細胞、および赤血球前駆細胞からなる群より選択される；または（ｃ）幹細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および赤血球前駆細胞からなる群より選択される、前記ゲノム編集幹細胞。