生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公表特許公報(A)_プロテアソーム脱ユビキチン化阻害剤スクリーニング |
| 出願番号： | 2014526259 |
| 年次： | 2014 |
| IPC分類： | C12Q 1/37,C12N 9/99 |
特許情報キャッシュ
ブルンジック，スラヴィカ ダーシー，パドレイグ ラーソン，ロルフ リンダー，スティッグ JP 2014526259 公表特許公報(A) 20141006 2014530625 20120906 プロテアソーム脱ユビキチン化阻害剤スクリーニング ヴィヴォルックス アーベー 513237663 小沢 慶之輔 100065651 ブルンジック，スラヴィカ ダーシー，パドレイグ ラーソン，ロルフ リンダー，スティッグ SE 1100678-0 20110916 C12Q 1/37 20060101AFI20140909BHJP C12N 9/99 20060101ALI20140909BHJP JPC12Q1/37C12N9/99 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KM,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC,VN SE2012000129 20120906 WO2013039438 20130321 43 20140513 4B063 4B063QA18 4B063QA19 4B063QQ03 4B063QQ08 4B063QQ36 4B063QQ79 4B063QR16 4B063QR48 4B063QR72 4B063QR77 4B063QS02 4B063QX01 本発明は、化合物が高特異性のプロテアソーム脱ユビキチン化阻害剤か否かを決定するために、該化合物をスクリーニングする方法に関する。 腫瘍細胞は、ユビキチン−プロテアソーム系（ＵＰＳ）において崩壊に対する高い感度を示し、このことは抗ガン療法の開発に魅力的な標的にする（非特許文献１）。ユビキチン−タグ付けられた基質は２６Ｓプロテアソームにより崩壊することが認められている。２６Ｓプロテアソームは、タンパク質分解性２０Ｓコア（２０Ｓ ＣＰ）が１９Ｓ制御粒子（１９Ｓ ＲＰ）で蓋されたものを含む多サブユニット複合体である（非特許文献２、３）。該２０Ｓ ＣＰは抗ガン剤開発に重要な標的として開発され、骨髄性白血病の治療用のボルテゾミブ（登録商標Ｖｅｌｃａｄｅ）の承認となった（非特許文献４）。低分子量化合物ｂ−ＡＰ１５（ＮＳＣ６８７８５２）はｐ５３−非依存性且つカテプシン−Ｄ−依存性のアポトーシスを引き起こすことが知られている（非特許文献５、６）。Masdehors, P et al., Increased sensitivity of CLL-derived lymphocytes to apoptotic death activation by the proteasome-specific inhibitor lactacystin. Br J Haematol 105, 752-757, doi:bjh1388 [pii] (1999).DeMartino, G N et al., PA700, an ATP-dependent activator of the 20 S proteasome, is an ATPase containing multiple members of a nucleotide binding protein family. J Biol Chem 69, 20878-20884, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd =Retrieve&db=PubMed &dopt=Citation&list_uids=8063704 (1994) (1994).Rechsteiner, M et al., The multicatalytic and 26 S proteases. J Biol Chem 268, 6065-6068, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi? cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt= Citation & list_uids=8454582 (1993).Adams, J & Kauffman, M, Development of the proteasome inhibitor Velcade (Bortezomib). Cancer Invest 22, 304-311, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi? cmd=Retrieve &db =PubMed&dopt=Citation&list_uids=15199612 (2004).Erdal, H et al., Induction of lysosomal membrane permeabilization by compounds that activate p53-independent apoptosis. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 192-197, doi:0408592102 [pii]10.1073/pnas.0408592102 (2005).Berndtsson, M et al., Induction of the lysosomal apoptosis pathway by inhibitors of the ubiquitin-proteasome system. Int J Cancer 124, 1463-1469, doi:10.1002/ijc.24004 (2009). 本発明の目的は、化合物が高特異性のプロテアソーム脱ユビキチン化阻害剤か否かを決定するために、該化合物をスクリーニングする方法を提供することである。 本発明の別の目的は、該方法で確認された、高特異性のプロテアソーム脱ユビキチン化阻害剤を提供することである。 本発明の更なる目的は、本発明の下記の概要、図面に例示された多くの好ましい発明の態様、及び添付の特許請求の範囲から明らかになるであろう。 本発明によると、公知の化合物ｂ−ＡＰ１５が、１９Ｓ ＲＰの脱ユビキチン化（ＤＵＢ）活性を無効にする新規なクラスのプロテアソーム阻害剤に関連すると認められる。 本発明によると、ｂ−ＡＰ１５が、２種の１９Ｓ ＲＰ ＤＵＢｓ、ＵＣＨＬ５及びＵＳＰ１４の活性を阻害するが、非プロテアソームＤＵＢｓに影響を及ぼさないことを見出した。ＤＵＢ阻害と一致して、ｂ−ＡＰ１５を用いた治療は、ボルテゾミブ治療と比較して、高分子量のポリユビキチン化タンパク質の蓄積を引き起こし、その結果より強い変性タンパク質反応を引き起こす。本発明によると、ｂ−ＡＰ１５によるアポトーシス誘発はボルテゾミブによるアポトーシス誘発と、ｐ５３腫瘍抑制剤の破壊に非感受性でありそしてアポトーシス阻害剤Ｂｃｌ−２の過剰発現に非感受性である点で、相違することも見出された。更に、ｂ−ＡＰ１５による治療は固体腫瘍異種移植片の成長を阻害することも見出された。その結果、１９Ｓ ＲＰのＤＵＢ活性の阻害は癌治療に有効な選択肢である。この理由で、ｂ−ＡＰ１５の活性パターンを共有する化合物は、潜在的抗ガン剤の開発の候補である。従って、ｂ−ＡＰ１５が上記の有益な性質を有することを確認する方法は、未知の活性パターンの他の化合物に適用可能であり、そしてこれらの化合物がｂ−ＡＰ１５の上記の性質を共有するか否かを確認するために有用である。もし共有するなら、そのように確認された化合物は抗ガン薬の開発の候補としての可能性がある。 詳しくは、本発明によると、化合物が高特異性のプロテアソーム脱ユビキチン化阻害剤か否かを決定するために、該化合物をスクリーニングする方法が開示され、該方法は、該化合物を２６Ｓプロテアソームのヒト１９Ｓ制御粒子（１９Ｓ ＲＰ）と接触させて、そして該化合物が脱ユビキチン化（ＤＵＢ）酵素ＵＣＨＬ５及びＵＳＰ１４の活性を阻害するか否かを決定することを含み、ここでＵＣＨＬ５及びＵＳＰ１４の活性の阻害は、該化合物が高特異性のプロテアソーム脱ユビキチン化阻害剤であることを示す。 本発明の好ましい側面によると、上記方法は、該化合物が非プロテアソーム関連ＤＵＢ酵素の活性に影響を及ぼすか否かを決定する追加のステップを含む。該非プロテアソーム関連ＤＵＢ酵素は少なくともＵＣＨＬ１、ＵＣＨＬ３、ＵＳＰ２、ＵＳＰ７、ＵＳＰ８の少なくとも１つを含むことが好ましい。 本発明の別の好ましい側面によると、ＵＣＨＬ５及びＵＳＰ１４活性の阻害の決定は、ユビキチン−ＡＭＣ又はＨＡ−ユビキチンビニルスルホンを基質としてヒト１９Ｓ ＲＰを用いて行われるアッセーにより実施される。 ｂ−ＡＰ１５により導かれる効果を更に特徴付けるために、この化合物で処理した細胞の遺伝子発現サインを、ＣＭＡＰデータベース（ｗｗｗ．ｂｒｏａｄ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｍａｐ）で提供される１３００を越える生物活性化合物についての発現サインの収集物と比較した（７）。ｂ−ＡＰ１５での処理は、いくつかの特徴付けられるプロテアソーム阻害剤の遺伝子発現プロフィルに匹敵する遺伝子発現プロフィルを誘発した。これらの中で、ＭＧ−２６２（８）、１５．プロスタグラジンＪ２（９）、セラストロール(celastrol)（１０）及びウイザフェリン(withaferin) A（１１）が最も活性な阻害剤である。ｂ−ＡＰ１５が細胞プロテアソーム機能を阻止することを確認するために、レポーター細胞系を使用した。該レポーター細胞系は、黄色蛍光タンパク質にタグされたユビキチン（ＵｂＧ７６Ｖ−ＹＦＰ）を発現し、該ユビキチンは構造的にプロテアソーム分解のための標的とされる（１２）。免疫ブロット及びフローサイトメトリーはＵｂ−ＹＦＰレポーターの用量依存性蓄積（ＩＣ５０＝０．８μＭ）を明らかにし、プロテアソーム機能の損傷を示唆した。プロテアソーム機能の阻害はユビキチンターンオーバーにおける欠陥により特徴付けられるので（１３）、結腸癌ＨＣＴ１１６細胞を該化合物で処理し、そしてユビキチン接合のレベルを免疫ブロット法により分析した。ｂ−ＡＰ１５での処理は、２０Ｓ ＣＰ阻害剤であるボルテゾミブと比較して、より高分子量のポリユビキチン化タンパク質の時間依存性蓄積を引き起こし、ｂ−ＡＰ１５はＵＰＳの別のブランチを阻害することを示唆する。 多くの細胞サイクル制御タンパク質のターンオーバーは、サイクリン依存性キナーゼｐ２１ Ｃｉｐ１，ｐ２７ Ｋｉｐ１の阻害剤を含むＵＰＳ及び腫瘍抑制剤ｐ５３により制御される（４）。ｂ−ＡＰ１５での処理はそれらのレベルを用量依存的に増加させた。これと対照的に、ホスホリル化ｐ５３（Ｓｅｒ １５において）（１４）又はＨ２ＡＸ（Ｓｅｒ １３９において）（１５）のようなＤＮＡ損傷マーカーのレベルに増加は観察されなかったが、これはｂ−ＡＰ１５が遺伝毒性剤ではないことを示唆する。細胞サイクル調節剤の蓄積はＧ２／Ｍ相境界に拘束された細胞サイクルに付随した。ｂ−ＡＰ１５処理後６時間ほどで、細胞はＧ２／Ｍ相で蓄積し始め、より長い時間曝すと、サブＧ１ ＤＮＡ含量が増加した。 サブＧ１ ＤＮＡ含量の増加は、（ｉ）アポトーシス媒介体カスパーゼ−３の活性化、及び（ｉｉ）カスパーゼ基質ポリ−ＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）及びサイトケラチン−１８の開裂と関係する。サイトケラチン−１８のカスパーゼ開裂及び減少した細胞生存性は、Ｕｂ−ＹＦＰレポーターの蓄積を誘発した濃度範囲と同じ濃度範囲で観察された。ボルテゾミブによるアポトーシス誘発はｐ５３に依存性であり、そしてＢｃｌ−２タンパク質の過剰発現により阻害された（１６、１７）。ＨＣＴ１１６結腸癌細胞の同質遺伝子系クローンの使用により、ｂ−ＡＰ１５は、ｐ５３の遺伝子崩壊又はＢｃｌ−２の過剰発現により影響されないサイトケラチン−１８のカスパーゼ開裂を誘発する。更に、アポトーシス調節剤ＢＡＸ又はＰＵＭＡの遺伝子崩壊は、ｂ−ＡＰ１５感度に影響を及ぼさないが、ボルテゾミブで誘発されるアポトーシスは阻害される。 ２０Ｓ ＣＰは、プロテアソームのそれぞれカスパーゼ様、トリプシン様及びキモトリプシン様の活性に関与するβ１、β２及びβ４タンパク質分解性サブユニットを含む（１８）。活性特異性基質を使用するイン ビトロ実験は、モル過剰のｂ−ＡＰ１５を用いた処理後にこれらの活性のいずれにおいても変更を示さない。更なる基質オーバーレイアッセーは、ｂ−ＡＰ１５での処理後に二重に又は一重に蓋された２６Ｓプロテアソームの存在を明らかにしたが、細胞に観察されたプロテアソーム機能の減少は１９Ｓ ＲＰ及び２０Ｓ ＣＰの解離により引き起こされたのではないことを示唆する（１９，２０）。 ｂ−ＡＰ１５は、二つの立体的に接近したβ炭素を有するα−βジエノン実体を含む。構造的に似た薬理作用団が一クラスのユビキチンイソペプチダーゼ阻害剤を含むことが以前に記載された（２１）。しかしながら、細胞ＤＵＢ活性を、ｂ−ＡＰ１５処理細胞上でユビキチン７−アミド−４−メチルクマリン（Ｕｂ−ＡＭＣ）を使用して試験した時、Ｕｂ−ＡＭＣ開裂における減少は観察できなかった。これは、ｂ−ＡＰ１５が一般的なＤＵＢ阻害剤ではないことを示す。本発明者等の意見では、薬理作用団構造における類似性、及びｂ−ＡＰ１５が２０Ｓ ＣＰと独立してプロテアソーム活性を阻害することを示すデータは、ｂ−ＡＰ１５が１９Ｓ ＲＰの脱ユビキチン化活性を阻止するプロテアソーム阻害剤の新規なクラスを表すことを示す。 Ｕｂ−ＡＭＣ及び精製した１９Ｓ ＲＰ又は２６Ｓプロテアソームを使用したイン ビトロアッセーにより、ｂ−ＡＰ１５は１９Ｓ ＲＰ及び２６Ｓプロテアソームの両方の脱ユビキチン化活性を阻害することが確認された。このために、組み換えユビキチン−ＧＦＰの開裂を阻害するｂ−ＡＰ１５の能力を検定した。組み換えユビキチン−ＧＦＰは１９Ｓ ＲＰ ＤＵＢ活性のための基質である（２２）。１９Ｓ ＲＰをｂ−ＡＰ１５で処理するとＵｂ−ＧＦＰの開裂を効果的に阻害した。ポリユビキチン鎖に存在するユビキチン結合のタイプは、ユビキチンで修飾された基質の運命を決定する。Ｋ４８結合ポリユビキチン鎖は一般に、分解のために結合したタンパク質を標的とするが（２３）、一方、Ｋ６３結合鎖は、ＤＮＡ修復（２４）及び有糸分裂染色体分離（２５）を含む非タンパク質分解の役割に関係する。ユビキチン鎖分解反応は、ｂ−ＡＰ１５がＫ４８結合ユビキチンテトラマー及びＫ６３結合ユビキチンテトラマーの両方の１９Ｓ ＲＰ処理を阻害することを明らかにした。観察されたユビキチン鎖分解の阻害は、ｂ−ＡＰ１５処理細胞中の高分子量ユビキチン複合体の蓄積を説明できた。 プロテアソームの脱ユビキチン化活性は３つのＤＵＢｓ、即ち、全て１９Ｓ ＲＰ２６−２８内に局在するＵＣＨＬ５、ＵＳＰ１４及びＰＯＨ１、の作用に起因する。ＵＣＨＬ５及びＵＳＰ１４の両方は、システインプロテアーゼの一般的阻害剤であるＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）に感受性であり、一方、ＰＯＨ１はＮＥＭによる阻害に非感受性であるが、Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラキス−（２−ピリジルメチル）エチレンジアミン（ＴＰＥＮ）のような金属キレート化剤に感受性である（２９）。阻害実験は、残留ＤＵＢ活性が１９Ｓ ＲＰのＮＥＭ及びｂ−ＡＰ１５を用いた同時処理の後でも存在することを示した。この残留ＤＵＢ活性は１９Ｓ ＲＰのｂ−ＡＰ１５とＴＰＥＮとの同時処理により無効にされ、ｂ−ＡＰ１５はＮＥＭ感受性ＤＵＢｓの一つ又は両方を主として阻害することを示唆する。どのＤＵＢｓがｂ−ＡＰ１５処理により阻害されたかを詳細に確認するために、競合ラベリング実験を、ヘマグルチニンのタグ付けしたユビキチンビニルスルホノン（ＨＡ−ＵｂＶＳ）、即ち、システインクラスのＤＵＢｓと不可逆的に反応する活性部位に向けたプローブ、を用いて行った（２６）。ｂ−ＡＰ１５を用いた１９Ｓ ＲＰ又は２６Ｓプロテアーゼの培養は、ＵＣＨＬ５及びＵＳＰ１４に対応する分子量の２つのＤＵＢｓのＵｂ−ＶＳラベリングを無効にしたが、２つの関連する非プロテアーゼ関連ＤＵＢ酵素であるＵＣＨＬ５及びＵＳＰ５の活性に影響を及ぼさなかった。 イン ビトロアッセーで得られた結果が細胞に観察された細胞毒性作用に拡大適用できることを確認するために、薬物処理細胞（１μＭ，３ｈ）から誘導された溶解物に対してＨＡ−ＵｂＶＳを使用して追加のラベリング実験を行った。免疫ブロット分析は、活性の損失及びＨＡ−ＵｂＶＳラベリングの減少により、ＵＳＰ１４及びＵＣＨＬ５の両方の分子量の下方シフトを示した。重要なことは、処理細胞又は処理細胞溶解物からのＤＵＢｓのＨＡ−ＵｂＶＳラベリング プロフィール全体における変更は観察されなかったことである。これはｂ−ＡＰ１５が一般的ＤＵＢｓ阻害剤ではないことの追加の確認である。 イン ビボにおける腫瘍成長に対するｂ−ＡＰ１５の効果を調査するために、該化合物を、ヒト腫瘍又はマウス異種移植片のいずれかを有するマウスに投与した。ＦａＤｕ頭及び首の癌を、ＳＣＩＤマウス異種移植片として且つｐ５３ｍｕｔ腫瘍のモデルとして選んだが、このモデルは循環する細胞死生体指標を使用する研究に適するからである（３０）。ｂ−ＡＰ１５を用いての毎日の処理後にＦａＤｕ腫瘍成長の著しい阻害が観察された（処理／対照腫瘍容積、Ｔ／Ｃ＝０．４、ｐ＝＜０．００１）。同様に、ｂ−ＡＰ１５（１日オン／２日オフの日程）は肺癌を有するＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて腫瘍成長を阻止した（Ｔ／Ｃ＝０．１６，ｐ＝＜０．０１）。ｂ−ＡＰ１５処理群に悪い副作用は観察されず、研究の結論において、平均重量減少は＜５％であった。ｂ−ＡＰ１５がイン ビボで腫瘍細胞死を促進するか否かを調べるために、サイトケラチン−１８（ＣＫ１８）の血漿レベルを分析した。サイトケラチン−１８はアポトーシス及び細胞死のための生体指標である（３０、３１）。このヒトタンパク質に特異性のアッセーを使用した。ｂ−ＡＰ１５処理は、血液循環(circulation)においてＦａＤｕ腫瘍から誘導されたヒトＣＫ１８のレベルが著しく増加する結果となる（ｐ＝０．０１）。カスパーゼ開裂ＣＫ１８（ＣＫ１８−Ａｓｐ３９６）のレベルは全レベルと比較して中程度に増加し、アポトーシスはｂ−ＡＰ１５処理腫瘍における細胞死の独占的メカニズムではないことを示唆する。イン ビボにおけるプロテアソーム脱ユビキチン化を阻害するｂ−ＡＰ１５の能力を研究するために、ポリユビキチン複合体の蓄積を、Ｋ４８結合ポリユビキチン鎖に特異性の抗体により分析した。処理腫瘍の組織学的分析は、ポリユビキチン複合体の蓄積を確認した。これらの結果は、ｂ−ＡＰ１５がプロテアソームＤＵＢ活性及び腫瘍成長をイン ビトロで阻害することを示す。 ユビキチンＣ−末端ヒドロラーゼ（ＵＣＨ）及びユビキチン特異性プロテアーゼ（ＵＳＰ）は、ヒトゲノムによりコードされる約１００個のＤＵＢｓの主なサブグループである（３２）。１９Ｓ ＲＰ中のＵＣＨＬ５及びＵＳＰ１４に対するｂ−ＡＰ１５の特異性のメカニズムは、該１９Ｓ ＲＰ中のこれらの酵素のユニークな配置構造に関係するか、又は１９Ｓ ＲＰ構造の薬物誘発変更によるかもしれない。本願の発見は、ＵＣＨＬ５及びＵＳＰ１４の両方の損失は、いずれか１つの損失とは違って、ポリユビキチン化タンパク質の蓄積及び細胞タンパク質分解の阻害に導くことを示す当業界の報告（３３）と一致する。 Ｂｃｌ−２を過剰発現する細胞又はｐ５３が不足した細胞のアポトーシスを誘発するｂ−ＡＰ１５の能力は、ボルテゾミブ耐性におけるこれらのタンパク質の役割の考察において特に興味深い（１６、１７、３４）。ｂ−ＡＰ１５及びボルテゾミブの両方は、細胞プロテアソーム活性を封鎖するが、異なる経路でアポトーシスを誘発する。理論により拘束されるのを望まないが、ＤＵＢ阻害は高分子量ユビキチン基質複合体に関係するという観察は、この文脈で特に関連があるようである。シャベロン遺伝子の強い発現がｂ−ＡＰ１５−処理細胞に観察され、タンパク質毒性反応の誘発を示す。 以下に、本発明を、多くの図を含む図面により例示された好ましい態様を参照してより詳しく記述する。ｂ−ＡＰ１５によるユビキチン−プロテアソーム系の阻害。１９Ｓ ＲＰによる脱ユビキチン化のｂ−ＡＰ１５による阻害。ｂ−ＡＰ１５による１９Ｓ ＲＰ ＤＵＢｓ ＵＣＨＬ５及びＵＳＰ１４の阻害。ｂ−ＡＰ１５によるイン ビボでの腫瘍成長の阻害。ｂ−ＡＰ１５により引き起こされた可能性のあるＤＮＡ損傷の不在。ｂ−ＡＰ１５による、アポトーシスの誘発及びＨＣＴ−１１６細胞の細胞生存の阻害。ＨＣＴ−１１６細胞の同質クローンにおけるアポトーシス誘発の用量反応（レスポンス）曲線。プロテアソームタンパク質活性の阻害ｂ−ＡＰ１５の不在。ｂ−ＡＰ１５により引き起こされる１９Ｓ粒子及び２０Ｓ粒子の解離の不在、又はｂ−ＡＰ１５により引き起こされるユビキチン結合の変更の不在。ｂ−ＡＰ１５は一般的ＤＵＢ阻害剤ではない。ｂ−ＡＰ１５結合の生化学的特徴付け。ｂ−ＡＰ１５は一般的ＤＵＢ阻害剤ではない。ｂ−ＡＰ１５での処理による動物体重の著しい変更の不在。ＮＣ１６０細胞系中の細胞系のｂ−ＡＰ１５及びボルテゾミブに対する感度。方法 イン ビトロプロテアソーム活性アッセーを、黒９６穴マイクロタイタープレート中で、反応バッファ（２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，０．５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０３％ＳＤＳ）中のヒト２０Ｓプロテアソーム（ボストン ビオケム）を使用して、プロテアソーム活性用の基質としてＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ，Ｚ−ＬＬＥ−ＡＭＣ又はＢｏｃ−ＬＲＲＡＭＣを用いて行った。脱ユビキチナーゼ活性アッセーを、ヒト１９Ｓ ＲＰ（ボストン ビオケム）を用いて、基質としてユビキチン−ＡＭＣを用いて行った。異種移植片研究のために、１ｘ１０６ＦａＤｕ頭−首細胞又は２ｘ１０５ルイス肺ガン（ＬＬＣ）細胞を含む１００μｌの細胞懸濁液を、ＳＣＩＤ又はＣ５７８ＢＬ／６Ｊマウスの脇腹に皮下注射した。腫瘍取得後、マウスを対照群又は処理群にランダム化し、そして５ｍｇｋｇ−１のｂ−ＡＰ１５又はビヒクルを投与した。イン ビボのレベルのアポトーシス及び細胞死を、Ｍ３０ Ａｐｏｐｔｏｓｅｎｓｅ（登録商標）及びＭ６５ ＥＬＩＳＡ（登録商標）アッセー（Ｐｅｖｉｖａ）を用いて、血漿中の開裂したカスパーゼの検出及びサイトケラチン−１８の合計レベルから決定した。該方法を以下に詳細に記載する。試薬：試薬を下記の源から得た：２０Ｓ プロテアソーム（Ｅ−３６０），２６Ｓ プロテアソーム（Ｅ−３６５），１９Ｓ プロテアソーム（Ｅ−３６６），Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ（Ｓ−２８０），Ｚ−ＬＬＥ−ＡＭＣ（Ｓ−２３０），Ｂｏｃ−ＬＲＲ−ＡＭＣ（Ｓ−３００），ユビキチン−ＡＭＣ（Ｕ−５５０），テトラ−ユビキチンＫ６３（ＵＣ−３１０），テトラ−ユビキチンＫ４８（ＵＣ−２１０），脱結合酵素セット（ＫＥ１０），ＨＡ−ユビキチンビニルスルホン（Ｕ−２１２）（ボストン ビオケム）；抗−アクチン（ＡＣ−１５），ＯＤＣ−１（ＨＰＡ００１５３６）（シグマ アルドリッヒ）；抗−ＬＣ−３（２７７５），抗−ＧＡＰＤＨ（２１１８），抗−ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（４６９５）、抗−ホスホ−ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（９１０１）（細胞シグナル化）；Ｎ−エチルマレイミド（３４１１５）（ＥＭＤケミカルズ）；抗ユビキチンＫ４８（Ａｐｕ２），抗ユビキチン（ＭＡＢ１５１０）（ミリポア）；抗−ｐ５３（ＤＯ１），抗−ＵＣＨＬ５（Ｈ−１１０），Ｈｄｍ２（ＳＭＰ１４）（サンタ クルズ）；抗−ＰＡＲＰ（Ｃ２−１０），抗−ｐ２７（Ｇ１７３−５２４），抗−活性カスパーゼ ３（Ｃ９２−６０５）（ＢＤ ビオサイエンシーズ）；抗−ＵＳＰ１４（Ａ３００−９１９Ａ）（ベチル ラボラトリーズ）；抗−ＨＡ（１２ＣＡ５）（ロッシュ）；ｂ−ＡＰ１５（ＮＳＣ６８７８５２）を、米国国立ガン研究所の開発治療プログラム(http://www.dtp.nci.nih.gov)から得たか、又はオンコ ターゲッチング エービー（スエーデン、ウプサラ）により合成した。ボルテゾミブをカロリンスカ病院、腫瘍学部門、スエーデン、から得た。細胞培養：ＭＣＦ７細胞を、ＭＥＭ／１０％ウシ胎仔血清中に維持した。ＨＴ−１１６ ｐ５３＋／＋，ｐ５３−／−，Ｂｃｌ−２＋／＋，ＰＵＭＡ−／−，及びＢＡＸ−／−細胞をマッコイ（ＭｃＣｏｙ’ｓ）５Ａ修飾培地／１０％ウシ胎仔血清中に維持した。該ＨＴ−１１６ ｐ５３＋／＋，ｐ５３−／−，ＰＵＭＡ−／−，及びＢＡＸ−／−が記載されたように生成した（３６）。該ＨＴ−１１６ Ｂｃｌ−２＋／＋細胞系を、親のＨＴ−１１６ ｐ５３＋／＋細胞にｐＣＥＰ４ Ｂｃｌ−２（Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ１６４６１）をトランスフェクトし（３７）そして高発現クローンを単離することにより生成した。ＦａＤｕ及びＬＬＣ３細胞を、１０％ウシ胎仔血清、ピルビン酸Ｎａ塩、Ｈｅｐｅｓ及び非必須アミノ酸を補充したＤＭＥＭ高グルコース培地中に維持した。４Ｔ１．１２Ｂガン細胞を、１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ培地中に維持した。プロテアソームレポーター細胞系Ｍｅ１ＪｕＳｏ Ｕｂ−ＹＦＰを、記載されたように生成した（３８）。細胞をダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ）修飾イーグル（Ｅａｇｌｅ’ｓ）培地／１０％ウシ胎仔血清中に維持した。網膜上皮細胞系を記載されたように生成した（３９）。全ての細胞を３７℃で５％ＣＯ２中に維持した。連結度マップ分析：マイクロアレー基準遺伝子発現分析及び連結度マップ（ＣＭＡＰ）分析を、前に記載されたようにして行った（４０）。要約すると、ＭＣＦ７細胞を、ｂ−ＡＰ１５（１μＭ，６時間）又はビヒクル（０．１％ＤＭＳＯ、６時間）に暴露した。ＲＮＡを単離し（ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉｐｒｅｐ．ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）、次いで質の制御、ラベル付け及びＧｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０アレー（アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社）にハイブリデーションした。生のデータを、Ｍａｓ５（アフィメトリックス社）を使用して標準化し、そして順位付けした。３０の最も誘発された（アップタグ）及び３０の最も抑制された（ダウンタグ）転写産物を選ぶために、下記の基準を使用した：アップタグ：ｂ−ＡＰ１５実験において、３００を越える任意単位の呼び出し（ｃａｌｌ）及び発現が存在する；ダウンタグ：ｂ−ＡＰ１５処理及びビヒクル処理の両方の後に呼び出しが存在し、そしてビヒクル実験において３００を越える任意単位の発現が存在する。ＣＭＡＰとの両立性のために、ＨＧ Ｕ１３３Ａ上に存在するタグ（即ちプローブ）のみを使用した。生の発現データ及び標準化発現データを、遺伝子発現オムニバス(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)に寄託番号ＧＳＥ２４１５０で寄託した。プロテアソーム及びＤＵＢ阻害アッセー：２０Ｓ ＣＰ（２ｎＭ）（ボストン ビオケム）を使用したイン ビトロ プロテアソーム活性アッセーを、３７℃で１００μｌの反応バッファ（２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，０．５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０３％ＳＤＳ）中で行った。サンプルを、指示した化合物を用いて１０分間培養し、次いで、クロモトリプシン様、カスパーゼ様、及びトリプシン様活性の検出のために、それぞれ１０μＭのＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ，Ｚ−ＬＬＥ−ＡＭＣ又はＢｏｃ−ＬＲＲ−ＡＭＣを添加した。ＤＵＢ阻害アッセーには、１９Ｓ ＲＰ（５ｎＭ），２６Ｓ（５ｎＭ），ＵＣＨ−Ｌ１（５ｎＭ）、ＵＣＨ−Ｌ３（０．３ｎＭ）、ＵＳＰ２ＣＤ（５ｎＭ）、ＵＳＰ７ＣＤ（５ｎＭ）、ＵＳＰ８ＣＤ（５ｎＭ）及びＢＡＰ１（５ｎＭ）を、ｂ−ＡＰ１５と共に培養し、ついでユビキチン−ＡＭＣ（１０００ｎＭ）を添加した。蛍光発光を、３６０ｎｍ励起及び４６０ｎｍ発光フィルターを備えたワラック マルチィプルラベル（Ｗａｌｌａｃ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ）カウンター又はテカン インフィニット（Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ）Ｍ１０００を用いて監視した。基質オーバーレイアッセー：自然（ｎａｔｉｖｅ）ゲル電気泳動を記載されたように行った（４１）。要約すると、精製２６Ｓプロテアソーム（ボストン ビオケム）４μｇを１０μＭ又は５０μＭのｂ−ＡＰ１５と混合し、そして３７℃で１０分間培養した。サンプルを４％非変性ＰＡＧＥ上で解像した。ゲルをアッセーバッファ（２０ｎＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ＡＴＰ，０．１ｍＭ Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ）中に潜らせ、そしてプロテアソームをＵＶ照明下で可視化した。ユビキチン開裂アッセー：組み換えＵｂ−ＧＦＰプラスミドｐｅｔ１９ｂ Ｕｂ−Ｍ−ＧＦＰを記載されたようにして生成した（４２）。要約すると、組み換えＵｂ−ＧＦＰをＢＬ２１ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞から、ヒス（Ｈｉｓ）アフィニティ精製により精製した。開裂アッセーに、１９Ｓ ＲＰ（２５ｎＭ）を１０ｍＭのＮＥＭ、２５０μＭのＴＰＥＮ又は５０μＭのｂ−ＡＰ１５と共に１０分間培養し、次いで組み換えＵｂ−ＧＦＰ（２００ｎＭ）を添加した。ユビキチン鎖分解反応を、Ｕｂ−ＧＦＰをＫ４８−又はＫ６３−結合ユビキチンテトラマー（５０ｎｇ）に置き換えた以外は本質的に前述のように行った。Ｕｂ−ＧＦＰ開裂又はユビキチン分解のレベルは、抗ユビキチン抗体を用いた免疫ブロット法により決定した。ユビキチン化Ｈｄｍ２基質を、ボストン ビオケムプロトコル（Ｋ−２００）に従って生成した。開裂アッセーに、１９Ｓ ＲＰ（２５ｎＭ）を５０μＭのｂ−ＡＰ１５又はＤＭＳＯと共に１０分間培養し、次いでユビキチン化Ｈｄｍ２基質（１００ｎＭ）を添加した。ユビキチン化Ｈｄｍ２基質及びユビキチン化Ｈｄｍ２の開裂は、抗Ｈｄｍ２抗体を用いた免疫ブロット法により決定した。プロテアソーム単離：ＨＣＴ−１１６細胞をボルテゾミブ（１００ｎＭ）又はｂ−ＡＰ１５（１μＭ）で３時間処理した。刺激の後、該細胞を５０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、２５０ｍＭのスクロース、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭのＤＴＴ及び０．０２５％ジギトニン中に溶解した。サンプルを軽く超音波分解し、氷上で１５分間培養した。これらのサンプルからのプロテアソームを、製造者のプロトコルに従って単離した。ＤＵＢｓのＵｂＶＳラベル付け：細胞溶解物中のＤＵＢｓのラベル付けに、サブコンフルエント細胞をトリプシン化により収穫し、ＰＢＳで３回洗い、そして１５００ＲＰＭで５分間遠心分離した。細胞ペレットをバッファ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、２５０ｍＭのスクロース、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭのＤＴＴ）を用いて氷上で１５分間溶解した。破片を遠心分離により除去し、２５μｇのタンパク質を１μＭのＨＡ−ＵｂＶＳで３７℃にて３０分間ラベル付けした。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分解し、そして指示した抗体を用いて免疫ブロット法により分析した。細胞アポトーシス及び生存率の決定：アポトーシスの決定のために、親のＨＣＴ−１１６ｐ５３＋／＋細胞を次第に増加する用量のボルテゾミブ又はｂ−ＡＰ１５で２４時間処理した。処理用量は、最大アポトーシスを２４時間の期間にわたって生じる薬物濃度に基づいた。ＨＣＴ−１１６細胞を９６穴マイクロタイタープレートに、穴当たり１０，０００細胞で播種し、そして一晩培養した。細胞を指示した薬物で２４時間処理した。培養期間の終わりに、ＮＰ４０を組織培養培地に０．１％となるまで加え、各穴の２５μｌの内容物を、Ｍ３０−Ａｐｏｐｔｏｓｅｎｓｅ（登録商標）ＥＬＩＳＡを使用して、前に記載されたようにして（４３）検定した。細胞生存率を、酸ホスファターゼ活性を測定するか、又はＦＭＣＡ法（４４）を用いて決定した。酸ホスファターゼ活性のために、細胞を９６穴培養プレートに、穴当たり５，０００細胞で播種し、そして３７℃で１２時間培養した。化合物を成長培地内の該細胞に添加し、そして３７℃で７２時間培養した。細胞を２００μｌの温ＰＢＳで洗った。酢酸ＮａバッファｐＨ５中のパラ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ，２ｍｇ／ｍｌ）を１穴当たり１００μｌ添加した。細胞を２時間培養し、その後、反応を、１Ｎ ＮａＯＨの添加により停止した。吸光率を４０５ｎｍで測定した。 ＦＭＣＡアッセーのために、細胞を薬物調製された３８４穴プレートに、滴下ロボットＰｒｅｃｉｓｉｏｎ ２０００（ビオ−テク インストルメンツ社（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．）、ウィノースキー、ＶＴ）を使用して播種した。該プレートを７２時間培養し、次にＣＯ２培養器（Ｃｙｔｏｍａｔ ２Ｃ，ケンドロ、ソレンツナ、スエーデン）を有するＯＲＣＡロボット（ベックマン コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ））、ディスペンサーモジュール（Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ ３８４，Ｔｉｔｅｒｔｅｋ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）、ワッシャーモジュール（ＥＬｘ４０５、ビオ−テク インストルメンツ社）、脱蓋ステーション、プレートホテル、バーコード読取り器（ベックマン コールター）、液ハンドラー（Ｂｉｏｍｅｋ ２０００、ベックマン コールター）及び多目的読取り器（ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａ、ビーエムジー ラブテク ゲーエムベーハー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）、オッフェンバーグ、ドイツ）から成る一体型ＨＴＳ ＳＡＩＧＡＮ Ｃｏｒｅ Ｓｙｓｔｅｍに、自動ＦＭＣＡのために移した。生存指標（ＳＩ）を、ブランク値を差し引いた、対照に対するテスト穴の蛍光のパーセントと定義する。細胞サイクル分析：細胞サイクルを決定するために、ＨＣＴ−１１６細胞をｂ−ＡＰ１５又はＤＭＳＯで処理した。細胞をトリプシン化により収穫し、洗い、そして７０％氷冷EtOH中に12時間固定した。細胞を、ＰＢＳ中にヨウ化プロジウム（５０μｇ／ｍｌ）及びＲＮＡｓｅ Ａ（０．５μｇ／ｍｌ）を含む染色溶液に再度懸濁した。サンプルをBD FACS calibur上で操作した。細胞サイクルの各相中の細胞パーセントを、ＭｏｄＦｉｔソフトウェアを用いて決定した。イン ビボ腫瘍実験：動物実験を、動物保護に関するスエーデン政府法的規制に完全に準じて、地方倫理委員会からの許可の下で行った。動物をケージ当たり最大５匹で収容し、殺菌水及び食物を気ままに与えた。全てのマウスを毎日監視しそして秤量した。頭及び首の癌モデルには、１ｘ１０６ＦａＤｕ細胞を含む１００μｌの細胞懸濁液を、該動物の右後脇腹に皮下注射した。注射後、腫瘍成長を毎日キャリパーで測定し、そして腫瘍容積を式：ＬｘＷ２ｘ０．４４により計算した。腫瘍がほぼ２００ｍｍ３のサイズに成長した時（０日）、マウスを無作為抽出して、ビヒクル（ｎ＝１０）又は５ｍｇ／ｋｇ−１のｂ−ＡＰ１５（ｎ＝１５）のいずれかを、皮下注射により毎日受け取るようにした。結腸ガンモデルには、Ｂｃｌ−２（ＨＣＴ−１１６Ｂｃｌ−２＋）を安定に導入した２．５ｘ１０６個のＨＣＴ−１１６結腸ガン細胞をヌードマウスの右脇腹に皮下接種した。接種１日後、マウスを、腹腔内注射（ｉ．ｐ．）により５ｍｇ／ｋｇ−１で処理した。動物を毎日観察して、腫瘍の開始及び成長を制定した。肺癌モデルには、２ｘ１０５個のルイス肺ガン（ＬＬＣ）細胞を含む１００μｌの細胞懸濁液をＣ５７／Ｂ６マウスの右後脇腹に皮下注射した。腫瘍がほぼ５０ｍｍ３のサイズに成長した時（０日）、マウスを無作為抽出して、ビヒクル（ｎ＝４）又は５ｍｇ／ｋｇ−１のｂ−ＡＰ１５（ｎ＝４）のいずれかを、腹腔内注射で、２日間の処理、次いで２日間の処理なし（２日オン／２日オフ）から成る処理サイクルを２週間行って受け取らせた。乳癌モデルには、１ｘ１０５個の４ＴＤ細胞を含む１００μｌの細胞懸濁液をＢＡＬＢ／ｃマウスの右乳房脂肪体に皮下注射した。腫瘍がほぼ２５ｍｍ３のサイズに成長した時（０日）、マウスを無作為抽出して、ビヒクル（ｎ＝５）又は２．５ｍｇ／ｋｇ−１のｂ−ＡＰ１５（ｎ＝５）のいずれかを、腹腔内注射で、１日間の処理、次いで３日間の処理なし（１日オン／３日オフ）から成る処理サイクルを３週間行って受け取るようにした。ＡＭＬ研究では、雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、５ｘ１０５個のＣ１４９８ＡＭＬ細胞を尾の静脈に静脈内注射した。８日後、マウスを無作為抽出して、５ｍｇ／ｋｇ−１のｂ−ＡＰ１５（ｎ＝１０）又はビヒクル（ｎ＝１０）のいずれかを腹腔内注射で７日間受け取らせた（日＋８till＋１４）。悪性細胞注射から１９日後、全てのマウスを殺害し、肝臓、卵巣（腫瘍のこのモデルのための標的器官）の組織病理学的兆候を評価し、そしてグループ間で比較した。薬物を投与するために、ｂ−ＡＰ１５をＣｒｅｍｐｈｏｒ ＥＬ：ＰＥＧ４００（１：１）に加熱により溶解して、２ｍｇ／ｍｌの作業濃度を得た。作業在庫品（ストック）を、注射直前に０．９％の食塩水に１：１０で希釈した。マウス血漿中のカスパーゼ開裂ＣＫ１８の決定：アポトーシス関連ＣＫ１８−Ａｓｐ３９６フラグメントの測定のために、血漿１２．５ｍｌを最後の処理から２４時間後に集め、Ｍ３０−Ａｐｏｐｔｏｓｅｎｓｅ（登録商標）アッセーを用いて分析した。各サンプルを異好性遮断試薬（スカンチボディズ ラボラトリー社）０．４ｍｌと混合した。肺転移の決定：４Ｔ１細胞は６−チオグアニンに耐性なので、均一化した組織を６−チオグアニンの存在下で培養することにより、転移を決定することができる。転移４Ｔ１細胞の決定のためのプロトコルは記載されている通り（４５）であった。要約すると、処理又は未処理の動物からの肺を均一化しそしてコラゲナーゼ又はエラスターゼで処理した。細胞を６０μＭの６−チオグアニンの存在下で２週間成長させ、そして転移コロニーの数をギムザ染色により決定した。免疫染色：腫瘍セクションをキシレンで脱パラフィン化し、再水和し、そして次ぎに、１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ウシ血清アルブミン中に希釈したＫ−４８ユビキチン又は活性カスパーゼ３（１／５００）を用いて一晩培養し、そして標準アビジン−ビオチン−ペルオキシターゼ複合体技術（ベクター ラボラトリーズ）により可視化した。対比染色をメイヤーのヘマトキシリンを用いて行った。統計的分析：処理グループの比較のために、不対ｔテスト（マン−ウイットニー）を行い、方法アノバ及びカプラン−メイヤー（ＡＮＯＶＡ ａｎｄ Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ）サバイバル（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘテスト）を繰り返した。全ての統計的分析は（グラフパッドプリズム）ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン５．０）を使用して行った。Ｐが０．０５未満のとき、統計的意義が達成された。［実施例１］ ｂ−ＡＰ１５はユビキチン−プロテアソーム系を阻害する。 ｂ−ＡＰ１５（１μＭ）で６時間処理したＭＣＦ７細胞のＣＭＡＰ読み取りを表３に示す。 ｂ−ＡＰ１５はプロテアソームレポーター細胞系中のユビキチンでタグ付けられたＹＦＰの分解を阻害する（図１ａ）。ＵｂＧ７６Ｖ−ＹＦＰ蓄積のレベルを、フローサイトメトリー及び免疫ブロット法により決定した。即ち、ｂ−ＡＰ１５（１μＭ）又はボルテゾミブ（１００ｎＭ）で処理したＨＣＴ−１１６細胞中のユビキチン結合体の免疫ブロット（図１ｂ）；指示したｂ−ＡＰ１５濃度で２４時間処理した後のＨＣＴ−１１６細胞中のユビキチン結合体、カスパーゼ３活性ＰＡＲＰ開裂、ｐ５３，ｐ２１Ｃｉｐ１及びｐＫｉｐ１の免疫ブロット（図１ｃ）；ボルテゾミブ（１００ｍＭ）又はｂ−ＡＰ１５（１μＭ）で処理した後のＨＣＴ−１１６細胞中のＯＤＣ−１レベルの免疫ブロット（図１ｄ）；値は、β−アクチンに対して標準化したＯＤＣ−１の定量化光学密度単位を表す。ｂ−ＡＰ１５処理ＨＣＴ−１１６細胞の細胞サイクルプロフィール（図１ｅ）；細胞はヨウ化プロピジウム染色及びフローサイトメトリーにより分析した。ボルテゾミブ（１００ｍＭ）又はｂ−ＡＰ１５（１μＭ）で処理した後の、カスパーゼ開裂サイトケラチン−１８（ＣＫ１８−Ａｓｐ３９８）についてＥＬＩＳＡにより決定した同質遺伝子系ＨＣＴ−１１６細胞中のカスパーゼ活性レベル（＊＊ｐ＝０．０１，＊＊＊ｐ＝０．００１）（図１ｆ）。［実施例２］ ｂ−ＡＰ１５は１９Ｓ ＲＰによる脱ユビキチン化を阻害する。 ｂ−ＡＰ１５での処理後の１９Ｓ ＲＰ又は２６ＳプロテアソームによるＵｂ−ＡＭＣ開裂の阻害；一般的ＤＵＢ阻害剤であるユビキチンアルデヒド（Ｕｂａｌ）を対照として含めた（図２ａ）。Ｕｂ−ＧＦＰの１９Ｓ ＲＰ媒介開裂の免疫ブロット（図２ｂ）；１９Ｓ ＲＰをＤＭＳＯ又は指示した濃度のｂ−ＡＰ１５で前処理し、次いで組み換えＤＵＢ基質としてＵｂ−ＧＦＰを添加した。ｂ−ＡＰ１５（５０μＭ）処理後の１９Ｓ ＲＰ Ｕｂ−ＧＦＰ開裂の動力学（図２ｃ）。ｂ−ＡＰ１５はＨｄｍ２の脱ユビキチン化を阻害する（図２ｄ）；ユビキチン化Ｈｄｍ２を、ＤＭＳＯ又はｂ−ＡＰ１５（５０μＭ）で処理した１９Ｓ ＲＰに添加し、次いで免疫ブロッティングした。ＤＭＳＯ又はｂ−ＡＰ１５（５０μＭ）で処理した後の、Ｋ６３／Ｋ４８結合ユビキチン４量体の１９Ｓ ＲＰによるユビキチン鎖分解反応（図２ｅ）。［実施例３］ ｂ−ＡＰ１５は１９Ｓ ＲＰ ＤＵＢｓ ＵＣＨＬ５及びＵＳＰ１４を阻害する。 １９Ｓ ＲＰをＤＭＳＯ、ＮＥＭ（１０ｍＭ）、ｂ−ＡＰ１５（５０μＭ）（図３ａ）又はＴＰＥＮ（２５０μＭ）（図３ｂ）で前処理し、Ｕｂ−ＧＦＰを添加し、そして抗ＧＦＰ抗体で免疫ブロッティングした。プロテアソームＤＵＢｓの活性部位指向ラベル付け（図３ｃ）；精製１９Ｓ又は２６ＳプロテアソームをＤＭＳＯ、ＮＥＭ又はｂ−ＡＰ１５で前処理し、次いでＨＡ−ＵｂＶＳでラベル付けし、そして免疫ブロッティングをした。ｂ−ＡＰ１５（１μＭ）で３時間処理したＨＣＴ−１１６細胞の免疫ブロット（図３ｄ）；全細胞溶解物からのＤＵＢｓをＨＡ−ＵｂＶＳでラベル付けし、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び指示した抗体を用いた免疫ブロッティングを行った。［実施例４］ ｂ−ＡＰ１５はイン ビボにおける腫瘍の成長を阻害する。 ＦａＤｕヒト腫瘍異種移植片を有するＳＣＩＤマウスを腫瘍取得（２００ｍｍ３）について無作為にし、そして毎日、ビヒクル（ｎ＝１０）又は５ｍｇ ｋｇ−１のｂ−ＡＰ１５（ｎ＝１５）のいずれかを１０日間皮下注射により処理した。平均腫瘍体積±ＳＥＭを示す（＊＊＊Ｐ＝＜０．００１）（図４ａ）。ｂ−ＡＰ１５処理後の循環する腫瘍誘導ＣＫ１８及びカスパーゼ開裂（ＣＫ１８−Ａｓｐ３９６）の合計レベル（＊＊ｐ＝０．０１）（図４ｂ）。ＨＣＴ−１１６Ｂｅｌ−２＋細胞に挑戦したヌードマウスの無病率（図４ｃ）。マウスをビヒクル（ｎ＝６）又は５ｍｇ ｋｇ−１のｂ−ＡＰ１５（ｎ＝６）のいずれかで１週当たり４−５回、３週間処理し、そして腫瘍開始について監視した（ｌｏｇ−ランク、Ｐ＝０．０１３６，ハザード比＝７．９）。同系の肺ガン（ＬＬＣ）腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、ビヒクル（ｎ＝４）又は５ｍｇ ｋｇ−１のｂ−ＡＰ１５（ｎ＝４）を用いて１日オン／２日オフのサイクルで処理した（図４ｄ）；平均腫瘍体積±ＳＥＭを示す（Ｐ＝＜０．０１）。同所乳癌（４Ｔ１）を有するＢＡＬＢ／ｃマウスを、ビヒクル（ｎ＝５）又は２．５ｍｇ ｋｇ−１のｂ−ＡＰ１５（ｎ＝５）を用いて１日オン／３日オフのサイクルで処理した（図４ｅ）；平均腫瘍体積±ＳＥＭを示す（＊＊Ｐ＝＜０．０１）。ビヒクル又はｂ−ＡＰ１５処理４Ｔ１乳癌からの肺転移性コロニーのボックス及びウィスカープロット（図４ｆ）；ボックスは上部及び下部の四分位数及び平均を示し、ウィスカーは最大値及び最小値を示す。ビヒクル及びｂ−ＡＰ１５処理４Ｔ１におけるＫ４８−結合ユビキチン蓄積及び開裂カスパーゼ−３についての代表的な免疫組織化学的染色、元の倍率×２０（図４ｇ）。ビヒクル及びｂ−ＡＰ１５処理マウスの肝臓及び卵巣におけるＡＭＬ浸潤（図４ｈ）。ビヒクル処理マウスの肝臓は、グリコーゲン枯渇及び非特異性出血と共に、白血病性芽細胞の浸潤を示した。ビヒクル処理マウスの卵巣は、白血病性芽細胞の大きい浸潤と間質性出血を示した。これと対照的に、ｂ−ＡＰ１５処理マウスからの肝臓及び卵巣は、浸潤を少ししか示さず、正常な形態を示した（元の倍率×２０）。［実施例５］ ｂ−ＡＰ１５はＤＮＡ損傷を誘発しない。 ＨＣＴ−１１６細胞をｂ−ＡＰ１５又はドキソルビシン（１００ｎＭ，１８時間の遺伝毒性ストレス用の正の対照として）で処理した（図５）。細胞溶解物を、ホスホリル化ｐ５３の抗体及びＤＮＡ損傷についてのヒストンＨ２ＡＸマーカーに対して、負荷対照としてのｐ５３及びβ−アクチンの合計レベルで免疫ブロットした。［実施例６］ ｂ−ＡＰ１５はアポトーシスを誘発しそしてＨＣＴ−１１６細胞の細胞生存を阻害するが、一方ＰＢＭＣ（末梢血液単核細胞）及び不死化ｈＴＥＲＴ−ＲＰＥ１は感受性がより低い。 ＨＣＴ−１１６細胞を次第に増加する濃度のｂ−ＡＰ１５で２４時間処理し、アポトーシスのレベルを、ＥＬＩＳＡアッセーによりカスパーゼ開裂サイトケラチン−１８（ＣＫ１８）のレベルを測定することにより決定した（図６ａ）。ＨＣＴ−１１６細胞を次第に増加する濃度のｂ−ＡＰ１５で４８時間処理した。細胞生存率を酸−ホスファターゼ活性アッセーにより決定した。平均値±ｓ．ｄ．を示す（図６ｂ）。ＨＣＴ−１１６又はｈＴＥＲＴ−ＲＰＥ１細胞を次第に増加する濃度のｂ−ＡＰ１５で７２時間処理し、次いでＦＭＣＡ法（４４）を用いて細胞毒性を分析した（図６ｃ）。ＨＣＴ−１１６又はｈＴＥＲＴ−ＲＰＥ１細胞を増加する濃度のボルテゾミブで７２時間処理し、次いでＦＭＣＡ法を用いて細胞毒性を分析した（図６ｄ）。ＨＴＥＲＴ−ＲＰＥ１は、不死化したヒト網膜色素上皮細胞系である（３９）。ＩＣ５０を、グラフパッドプリズム（グラフパッドソフトウェア社、カルフォルニア、米国）中の対数（ｌｏｇ）濃度／効果曲線から、非直線回帰分析（可変ヒル勾配を有する４パラメータモデル）を用いて決定した（図６ｅ，６ｆ）。濃度／反応曲線を、ＦＭＣＡアッセーを用いて、それぞれ８個の濃度のｂ−ＡＰ１５及びボルテゾミブで２倍希釈にて３回生じさせた。結果を４回又は５回の独立した実験から、ｌｏｇＩＣ５０＋ＳＤとして表す（ＨＣＴ−１１６、ｎ＝５；ＰＢＭＣ、ｎ＝４；ｈＴＥＲＴ−ＲＰＥ１、ｎ＝５）。［実施例７］ ＨＣＴ−１１６細胞の同質遺伝子クローンにおけるアポトーシス誘発の用量反応曲線。 ＨＣＴ−１１６細胞を次第に増大する濃度のボルテゾミブ又はｂ−ＡＰ１５で２４時間処理し、そしてアポトーシスのレベルを、ＥＬＩＳＡアッセーによりカスパーゼ開裂サイトケラチン−１８（ＣＫ−１８）のレベルを測定することにより決定した（平均ひだ(折り畳み、fold)変化±ｓ．ｄ．，ｎ＝４）（図７）。［実施例８］ ｂ−ＡＰ１５はプロテアソームのタンパク質分解活性を阻害しない。 ２０Ｓ ＣＰ（２ｎＭ）をＤＭＳＯ、ｂ−ＡＰ１５（５０μＭ）又はボルテゾミブ（１００ｎＭ）でアッセーバッファ（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ，０．５ｍＭのＥＤＴＡ，０．０３％ＳＤＳ）中で５分間予備処理し、次いでそれぞれプロテアソームキモトリプシン様、カスパーゼ様及びトリプシン様の活性の分析のために、蛍光性基質（Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ，Ｚ−ＬＬＥ−ＡＭＣ又はＢｏｃ−ＬＲＲ−ＡＭＣ）を１００μＭ添加した（図８ａ）。アッセーバッファ（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ，５０ｍＭのＮａＣｌ，１ｍＭのＭｇＣｌ２，２ｍＭのＡＴＰ，１ｍＭのＤＴＴ）中の２６Ｓプロテアソーム（２ｎＭ）を、図８ａに示した実験のように処理した（図８ｂ）。値は、ひだ開裂を相対的蛍光単位で表す。［実施例９］ ｂ−ＡＰ１５は１９Ｓ及び２０Ｓ粒子の解離を引き起こさない又はユビキチン結合を変更しない。ｂ−ＡＰ１５処理プロテアソームの基質オーバーレイアッセー（図９ａ）。 精製した２６Ｓプロテアソームを、天然ゲル電気泳動法により分離したｂ−ＡＰ１５（１０μＭ又は５０μＭ）で処理し、そしてペプチターゼ活性用の蛍光性基質としてＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣを使用してタンパク質分解活性について検定した。ゲルの分析は、対照及びｂ−ＡＰ１５レーンの両方で、二重に（ＲＰ２ＣＰ）及び１重に（ＲＰ１ＣＰ）蓋されたプロテアソームの存在を示した。０．０３％ＳＤＳの添加は、蓋されていない２０Ｓコア粒子の存在下で増加を示さなかった。ｂ−ＡＰ１５はプロテアソーム−ユビキチン結合活性を変更しない（図９ｂ）。ＨＣＴ−１１６細胞をボルテゾミブ（１００ｎＮＭ）又はｂ−ＡＰ１５（１μＭ）で処理し、そしてプロテアソームをアフィニティ精製した。会合ポリユビキチンのレベルを免疫ブロット法により決定した。［実施例１０］ ｂ−ＡＰ１５は一般的なＤＵＢ阻害剤ではない。 ＨＣＴ−１１６をｂ−ＡＰ１５（１μＭ）で３時間処理した（図１０）。１０ｍＭのＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）で処理した溶解物を全ＤＵＢ阻害の対照として含ませた。ＤＵＢ活性を細胞溶解物から、蛍光基質ユビキチン−７−アミド−４−メチルクマリン（Ｕｂ−ＡＭＣ）の開裂を測定することにより決定した。［実施例１１］ ｂ−ＡＰ１５の生化学的特性評価。ｂ−ＡＰ１５の用量反応（図１１ａ）。 精製した１０Ｓプロテアソーム（５ｎＭ）を、指示した濃度のｂ−ＡＰ１５で処理し、そしてＤＵＢ活性を、Ｕｂ−ＡＭＣ開裂の検出により決定した。ＩＣ５０値（２．１±０．４１１μＭ）を、グラフパッドプリズム中の対数（ｌｏｇ）濃度曲線から、非直線回帰分析を用いて決定した（平均値±ＳＤ，ｎ＝３）。細胞なしアッセーで観察されたＩＣ５０は細胞内で観察されたＩＣ５０よりも幾分高いことに注目されたい。これは多分、ｂ−ＡＰ１５の疎水性（ＸＬｏｇＰ＝３．３）により細胞内の該化合物が豊富になることによるであろう（１１）。ｂ−ＡＰ１５阻害の可逆性（図１ｂ）。阻害の可逆性を、酵素／ｂ−ＡＰ１５複合体の急速な希釈の後、ＤＵＢ活性の回復を測定することにより決定した。反応に通常使用される１９Ｓ濃度の５０倍（２５０ｍＭ）と、ｂ−ＡＰ１５についての計算ＩＣ５０値の１０倍（２５μＭ）とを含む反応混合物を氷上で１５分培養し、次いで反応バッファ中に５０倍希釈して、１９Ｓについては５ｎＭの最終濃度そしてｂ−ＡＰ１５については０．５μＭの最終濃度を得た。Ｕｂ−ＡＭＣ開裂の線形反応曲線は、ｂ−ＡＰ１５が可逆的阻害剤であることを示す。ｂ−ＡＰ１５はシスチン残基と非特異的に反応するか否かの決定（図１１ｃ）。１９Ｓ（５ｎＭ）を、還元されたグルタチオン（ＧＳＨ（２ｍＭ））と混合したｂ−ＡＰ１５（１０μＭ）又はｂ−Ａｐ１５（１０μＭ）と処理した。グルタチオンの存在は、１９Ｓ ＤＵＢ活性のｂ−ＡＰ１５媒介阻害を低減しなかった。［実施例１２］ ｂ−ＡＰ１５は一般的なＤＵＢ阻害剤ではない。 ＨＣＴ−１１６細胞をｂ−ＡＰ１５（１μＭ）で３時間処理し、そしてプロテアソームをアフィニティ精製した（図１２ａ）。プロテアソームＤＵＢ活性を、Ｕｂ−ＡＭＣ／ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣの開裂として表して、プロテアソーム回復について標準化した（Ｐ＝０．０１２、不対ｔ−テスト、２回随行）。ｂ−ＡＰ１５は非プロテアソーム性ＤＵＢを阻害しない（図１２ｂ）。組み換え非プロテアソーム性ＤＵＢをｂ−ＡＰ１５で処理し、％活性を決定した。２９３Ｔ細胞及びＨｅＬａ細胞からの細胞溶解物をｂ−ＡＰ１５（５０μＭ）で処理し、次いでＨＡ−ＵｂＶＳを用いて活性ラベル付けした（図１２ｃ）。全サンプルをＳＤ−ＰＡＧＥ上で操作し、次いでα−ＨＡ抗体を用いて免疫ブロッティングした。［実施例１３］ ｂ−ＡＰ１５処理は動物体重を著しく変更しない（図１３）。 対照と異種移植用の処理動物との間で、始点と終点での体重の差異を図４に示した：ＦａＤｕ、−１．３％；ＬＬＣ，＋２．１％；４Ｔ１，＋５．８％。ボックスは上部及び下部の四分位数及び平均を示し、ウィスカーは最大値及び最小値を示す。［実施例１４］ ＮＣ１６０細胞系内の細胞系のｂ−ＡＰ１５及びボルテゾミブに対する感度（図１４）。 図示したのは、個々の細胞系についてのＩＣ５０値（左側のグラフ）及び各腫瘍型についての中央ＩＣ５０値（右側のグラフ）である。データはwww.dtp.nci.nih.gov.から取った。矢印は、各薬物に対して２つの最も感度が高い腫瘍細胞型を示す。実施例１５：ｂ−ＡＰ１５処理細胞に観察されたシャベロン遺伝子の発現。 ｂ−ＡＰ１５処理細胞に観察されたシャベロン遺伝子の発現（表１）は、タンパク質毒性反応の誘発を示す。 定量的ＰＣＲによる更なる分析は、ｂ−ＡＰ１５がボルテゾミブよりも強いＨＳＰＡ６（Ｈｓｐ７０Ｂ’），ＨＳＰＡ１Ｂ及びＤＮＡＪＢ１（Ｈｓｐ４０）発現を誘発することを示した（表２）。損傷タンパク質の蓄積に反応して誘発されることが知られたＨＳＰＡ６（３５）は、ｂ−ＡＰ１５により１０００倍より大きく誘発された。これらの発見は、ＤＵＢ阻害の結果として蓄積される高分子量ユビキチン基質複合体は、Ｂｃｌ−２過剰発現に不感受性の、強い細胞毒性を産生することができることを示す。 ｂ−ＡＰ１５への細胞反応は、アポトーシス制御の関与についてだけでなく、ＮＣｌ−６０細胞系パネル（http://dtp.nci.nih.gov.)内の腫瘍細胞系の感度についても、ボルテゾミブへの細胞反応と相違する。１９Ｓ ＲＰ ＤＵＢ活性の阻害剤は２０Ｓ酵素活性の阻害剤とは相違する治療的スペクトルを示し、従って腫瘍学における治療選択の在庫を拡張する。参照文献1. Masdehors, P et al., Increased sensitivity of CLL-derived lymphocytes to apoptotic death activation by the proteasome-specific inhibitor lactacystin. Br J Haematol 105, 752-757, doi:bjh1388 [pii] (1999). 2. DeMartino, G N et al., PA700, an ATP-dependent activator of the 20 S proteasome, is an ATPase containing multiple members of a nucleotide binding protein family. J Biol Chem 69, 20878-20884, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd =Retrieve&db=PubMed &dopt=Citation&list_uids=8063704 (1994) (1994). 3. Rechsteiner, M et al., The multicatalytic and 26 S proteases. J Biol Chem 268, 6065-6068, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt= Citation&list_uids=8454582 (1993). 4. Adams, J & Kauffman, M, Development of the proteasome inhibitor Velcade (Bortezomib). Cancer Invest 22, 304-311, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi? cmd=Retrieve &db =PubMed&dopt=Citation&list_uids=15199612 (2004). 5. Erdal, H et al., Induction of lysosomal membrane permeabilization by compounds that activate p53-independent apoptosis. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 192-197, doi:0408592102 [pii]10.1073/pnas.0408592102 (2005). 6. Berndtsson, M et al., Induction of the lysosomal apoptosis pathway by inhibitors of the ubiquitin-proteasome system. Int J Cancer 124, 1463-1469, doi:10.1002/ijc.24004 (2009). 7. Lamb, J et al., The Connectivity Map: using gene-expression signatures to connect small molecules, genes, and disease. Science 313, 1929-1935, doi:313/5795/1929 [pii]10.1126/science.1132939 (2006). 8. Adams, J et al., Potent and selective inhibitors of the proteasome: dipeptidyl boronic acids. Bioorg Med Chem Lett 8, 333-338 333-338, doi:S0960894X98000298 [pii] (1998). 9. Shibata, T et al., An endogenous electrophile that modulates the regulatory mechanism of protein turnover: inhibitory effects of 15-deoxy-Delta 12,14-prostaglandin J2 on proteasome. Biochemistry 42, 13960-13968, doi:10.1021/bi035215a (2003). 10. Yang, H et al., Celastrol, a triterpene extracted from the Chinese "Thunder of God Vine," is a potent proteasome inhibitor and suppresses human prostate cancer growth in nude mice. Cancer Res 66, 4758-4765 4758-4765, doi:66/9/4758 [pii]10.1158/0008-5472.CAN05-4529 (2006). 11. Yang, H et al., The tumor proteasome is a primary target for the natural anticancer compound Withaferin A isolated from "Indian winter cherry". Mol Pharmacol 71, 426-437, doi:mol.106.030015 [pii]10.1124/mol.106.030015 (2007). 12. Menendez-Benito, V et al., Endoplasmic reticulum stress compromises the ubiquitin-proteasome system. Hum Mol Genet 14, 2787-2799, doi:ddi312 [pii]10.1093/hmg/ddi312 (2005). 13. Mimnaugh, E G et al., Rapid deubiquitination of nucleosomal histones in human tumor cells caused by proteasome inhibitors and stress response inducers: effects on replication, transcription, translation, and the cellular stress response. Biochemistry 36, 14418-14429, doi:10.1021/bi970998jbi970998j [pii] (1997). 14. Shieh, S Y et al., DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2. Cell 91, 325-334, doi:S0092-8674(00)80416-X [pii] (1997). 15. Rogakou, E P et al., DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem 273, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd= Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=9488723 (1998). 16. Ling, X et al., Cancer cell sensitivity to bortezomib is associated with surviving expression and p53 status but not cancer cell types. J Exp Clin Cancer Res 29, 8 (2010). 17. Paoluzzi, L et al., The BH3-only mimetic ABT-737 synergizes the antineoplastic activity of proteasome inhibitors in lymphoid malignancies. Blood 112, 2906-2916 (2008). 18. Borissenko, L & Groll, M, 20S proteasome and its inhibitors: crystallographic knowledge for drug development. Chem Rev 107, 687-717, doi:10.1021/cr0502504 (2007). 19. Eytan, E et al., ATP-dependent incorporation of 20S protease into the 26S complex that degrades proteins conjugated to ubiquitin. Proc Natl Acad Sci U S A 86, 7751-7755, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed& dopt=Citation&list_uids=2554287 (1989). 20. Chu-Ping, M et al., Identification, purification, and characterization of a high molecular weight, ATP-dependent activator (PA700) of the 20 S proteasome. J Biol Chem 269, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed& dopt=Citation&list_uids=8106396 (1994). 21. Mullally, J E & Fitzpatrick, F A, Pharmacophore model for novel inhibitors of ubiquitin isopeptidases that induce p53-independent cell death. Mol Pharmacol 62, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed& dopt=Citation&list_uids=12130688 (2002). 22. Guterman, A & Glickman, M H, Complementary roles for Rpn11 and Ubp6 in deubiquitination and proteolysis by the proteasome. J Biol Chem 279, 17291738, doi:10.1074/jbc.M307050200 [pii] (2004). 23. Glickman, M H & Ciechanover, A, The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: destruction for the sake of construction. Physiol Rev 82, 373-428, doi:10.1152/physrev.00027.2001 (2002). 24. Hofmann, R M & Pickart, C M et al., Noncanonical MMS2-encoded ubiquitin conjugating enzyme functions in assembly of novel polyubiquitin chains for DNA repair. Cell 96, 645-653, doi:S0092-8674(00)80575-9 [pii] (1999). 25. Vong, Q P et al., Chromosome alignment and segregation regulated by ubiquitination of surviving cells. Science 310, 1499-1504, doi:310/5753/1499 [pii]10.1126/science.1120160 (2005). 26. Borodovsky, A et al., A novel active site-directed probe specific for deubiquitylating enzymes reveals proteasome association of USP14. EMBO J 20, 5187-5196, doi:10.1093/emboj/20.18.5187 (2001). 27. Lam, Y A et al., Specificity of the ubiquitin isopeptidase in the PA700 regulatory complex of 26 S proteasomes. J Biol Chem 272, 28438-28446, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=9353303 (1997). 28. Verma, R et al., Role of Rpn11 metalloprotease in deubiquitination and degradation by the 26S proteasome. Science 298, 611-615, doi:10.1126/science.10758981075898 [pii] (2002). 29. Yao, T & Cohen, R E, A cryptic protease couples deubiquitination and degradation by the proteasome. Nature 419, 403-407, doi:10.1038/nature01071nature01071 [pii] (2002). 30. Olofsson, MH et al., Specific demonstration of drug-induced tumour cell apoptosis in human xenograft models using a plasma biomarker. Cancer Biomarkers 5, 117-125, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19407366 (2009). 31. Kramer, G et al., Differentiation between cell death modes using measurements of different soluble forms of extracellular cytokeratin 18. Cancer Res 64, 1751-1756 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed& dopt=Citation&list_uids=14996736 (2004). 32. Reyes-Turcu, F E et al., Regulation and cellular roles of ubiquitin-specific deubiquitinating enzymes. Annu Rev Biochem 78, 363-397, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=19489724 (2009). 33. Koulich, E et al., Relative structural and functional roles of multiple deubiquitylating proteins associated with mammalian 26S proteasome. Mol Biol Cell 19, 1072-1082, doi:E07-10-1040 [pii]10.1091/mbc.E07-10-1040 (2008). 34. Fennell, D A et al., BCL-2 family regulation by the 20S proteasome inhibitor bortezomib. Oncogene 27, 1189-1197, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd= Retrieve&db= PubMed& dopt=Citation&list_uids=17828309 (2008). 35. Noonan, E J et al., Hsp70B' regulation and function. Cell Stress Chaperones 12, 393-402, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed& dopt=Citation&list_uids=18229458 (2007). 36. Bunz, F. et al., Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage. Science 282, 1497-1501 (1998).37. Pietenpol, J A et al., Paradoxical inhibition of solid tumor cell growth by bcl2. Cancer Res 54, 3714-3717 (1994).38. Menendez-Benito, V et al., Endoplasmic reticulum stress compromises the ubiquitin-proteasome system. Hum Mol Genet 14, 2787-2799, doi:ddi312 [pii]10.1093/hmg/ddi312 (2005).39. Bodnar, A G et al., Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells. Science 279, 349-352 (1998).40. Lamb, J et al., The Connectivity Map: using gene-expression signatures to connect small molecules, genes, and disease. Science 313, 1929-1935, doi:313/5795/1929 [pii]10.1126/science.1132939 (2006).41. Elsasser, S et al., Characterization of the proteasome using native gel electrophoresis. Methods Enzymol 398, 353-363, doi:S0076-6879(05)98029-4 [pii]10.1016/S0076- 6879(05)98029-4 (2005).42. Guterman, A & Glickman, M H, Complementary roles for Rpn11 and Ubp6 in deubiquitination and proteolysis by the proteasome. J Biol Chem 279, 1729-1738, doi:10.1074/jbc.M307050200M307050200 [pii] (2004).43. Hagg, M et al., A novel high-through-put assay for screening of pro-apoptotic drugs. Invest New Drugs 20, 253-259 (2002).44. Lindhagen, E et al., The fluorometric microculture cytotoxicity assay. Nat Protoc 3, 1364-1369, doi:nprot.2008.114 [pii]10.1038/nprot.2008.114 (2008).45. Pulaski, B A & Ostrand-Rosenberg, S, Mouse 4T1 breast tumor model. Curr Protoc Immunol Chapter 20, Unit 20 22, doi:10.1002/0471142735.im2002s39 (2001).46. Sawada, G. A. et al., Increased lipophilicity and subsequent cell partitioning decrease passive transcellular diffusion of novel, highly lipophilic antioxidants. J Pharmacol Exp Ther 288, 1317-1326 (1999). 化合物が高特異性のプロテアソーム脱ユビキチン化阻害剤か否かを決定するために、該化合物をスクリーニングする方法であって、該化合物を２６Ｓプロテアソームのヒト１９Ｓ制御粒子（１９Ｓ ＲＰ）と接触させ、そして該化合物が脱ユビキチン化（ＤＵＢ）酵素ＵＣＨＬ５及びＵＳＰ１４の活性を阻害するか否かを決定することを含み、ここでＵＣＨＬ５及びＵＳＰ１４の活性の阻害は、該化合物が高特異性のプロテアソーム脱ユビキチン化阻害剤であることを示す、上記スクリーニング方法。 上記化合物が非プロテアソーム関連ＤＵＢ酵素の活性に影響を及ぼすか否かを決定する追加のステップを含む、請求項１に記載の方法。 上記非プロテアソーム関連ＤＵＢ酵素が少なくともＵＣＨＬ１、ＵＣＨＬ３、ＵＳＰ２、ＵＳＰ７及びＵＳＰ８から成る群の少なくとも１員を含む、請求項２に記載の方法。 ＵＣＨＬ５及びＵＳＰ１４活性の阻害の上記決定は、ユビキチン−ＡＭＣ又はＨＡ−ユビキチンビニルスルホンを基質としてヒト１９Ｓ ＲＰを用いて行われるアッセーにより実施される、請求項３に記載の方法。 化合物が高特異性のプロテアソーム脱ユビキチン化阻害剤か否かを決定するために、該化合物をスクリーニングする方法であって、該化合物を２６Ｓプロテアソームのヒト１９Ｓ制御粒子（１９Ｓ ＲＰ）と接触させ、そして該化合物が脱ユビキチン化（ＤＵＢ）酵素ＵＣＨＬ５及びＵＳＰ１４の活性を阻害するか否かを決定することを含む。ＵＣＨＬ５及びＵＳＰ１４の活性の阻害は、該化合物が高特異性のプロテアソーム脱ユビキチン化阻害剤であることを示す。【選択図】 図１０