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タイトル：	公表特許公報(A)_グルカゴン様ペプチド−２組成物およびその作製法および使用法
出願番号：	2014526254
年次：	2014
IPC分類：	C12N 15/09,A61K 38/00,A61P 1/04,A61P 3/02,A61P 1/00,A61P 1/12,A61P 3/04,A61P 3/10,A61P 37/06,A61P 1/18,A61P 37/08,A61P 31/04,A61P 15/08,C07K 14/605,C12P 21/02,C12N 1/15,C12N 1/19,C12N 1/21,C12N 5/10

特許情報キャッシュ

シェレンバーガー， フォルカー シルバーマン， ジョシュア ステマー， ウィレム ピー． ワン， チア−ウェイ ギーティング， ネイサン スピンク， ベンジャミン JP 2014526254 公表特許公報(A) 20141006 2014529994 20120912 グルカゴン様ペプチド−２組成物およびその作製法および使用法 アムニクス オペレーティング インコーポレイテッド 511188819 山本 秀策 100078282 森下 夏樹 100113413 シェレンバーガー， フォルカー シルバーマン， ジョシュア ステマー， ウィレム ピー． ワン， チア−ウェイ ギーティング， ネイサン スピンク， ベンジャミン US 61/573,748 20110912 C12N 15/09 20060101AFI20140909BHJP A61K 38/00 20060101ALI20140909BHJP A61P 1/04 20060101ALI20140909BHJP A61P 3/02 20060101ALI20140909BHJP A61P 1/00 20060101ALI20140909BHJP A61P 1/12 20060101ALI20140909BHJP A61P 3/04 20060101ALI20140909BHJP A61P 3/10 20060101ALI20140909BHJP A61P 37/06 20060101ALI20140909BHJP A61P 1/18 20060101ALI20140909BHJP A61P 37/08 20060101ALI20140909BHJP A61P 31/04 20060101ALI20140909BHJP A61P 15/08 20060101ALI20140909BHJP C07K 14/605 20060101ALI20140909BHJP C12P 21/02 20060101ALI20140909BHJP C12N 1/15 20060101ALI20140909BHJP C12N 1/19 20060101ALI20140909BHJP C12N 1/21 20060101ALI20140909BHJP C12N 5/10 20060101ALI20140909BHJP JPC12N15/00 AA61K37/02A61P1/04A61P3/02A61P1/00A61P1/12A61P3/04A61P3/10A61P37/06A61P1/18A61P37/08A61P31/04A61P15/08C07K14/605C12P21/02 CC12N1/15C12N1/19C12N1/21C12N5/00 101 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KM,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC US2012054941 20120912 WO2013040093 20130321 255 20140502 4B024 4B064 4B065 4C084 4H045 4B024AA01 4B024BA01 4B024CA06 4B024DA06 4B024EA01 4B024EA04 4B024GA11 4B024HA01 4B024HA20 4B064AG15 4B064CA19 4B064CC24 4B064CE11 4B064DA01 4B065AA26X 4B065AA90Y 4B065AA93Y 4B065AB01 4B065AC14 4B065BA02 4B065BD14 4B065CA24 4B065CA44 4C084AA02 4C084AA07 4C084BA44 4C084DB35 4C084NA14 4C084ZA661 4C084ZA681 4C084ZA701 4C084ZA811 4C084ZB081 4C084ZB131 4C084ZB351 4C084ZC351 4H045AA10 4H045AA20 4H045AA30 4H045BA41 4H045CA40 4H045DA30 4H045EA25 4H045FA74 4H045GA23 関連出願への相互参照 この出願は、２０１１年９月１２日に出願された米国仮出願第６１／５７３，７４８号への優先権の利益を主張し、この出願は、その全体が参考として本明細書に援用される。 グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）は、ヒトにおいて、関連するグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）も遊離させるプロセスであるプログルカゴンの翻訳後タンパク質切断により、３３アミノ酸のペプチドとして生成する内分泌ペプチドである。ＧＬＰ−２は、腸内分泌Ｌ細胞によって栄養依存式で産生され、分泌される。ＧＬＰ−２は、陰窩の細胞の増殖および腸細胞アポトーシスの減少の刺激を介して腸粘膜上皮の栄養に関する。ＧＬＰ−２は、特異的なＧＬＰ−２受容体を通じてその効果を発揮するが、腸における応答は、受容体が上皮では発現しないが腸ニューロンで発現するという点で間接的な経路によって媒介される（非特許文献１）。 ＧＬＰ−２の効果は多数あり、それらとして、腸管吸収および栄養素の同化の増大をもたらす腸栄養効果（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｔｒｏｐｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）（非特許文献２）；抗炎症活性；粘膜の治癒および修復；腸透過性の低下；ならびに腸間膜血流の増大（Ｂｒｅｍｈｏｌｍ， Ｌ．ら、Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ−２ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ ｂｌｏｏｄ ｆｌｏｗ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ． Ｓｃａｎ． Ｊ． Ｇａｓｔｒｏ．（２００９年）４４巻（３号）：３１４〜３１９頁）が挙げられる。外因的に投与されたＧＬＰ−２はヒトおよびげっ歯類においていくつもの効果を生じ、それらとしては、胃内容排出の緩慢化、腸の血流および腸の成長／粘膜の表面積の増大、腸機能の増強、骨破壊の減少および神経保護が挙げられる。ＧＬＰ−２は、内分泌的に作用して、腸の成長および代謝と栄養摂取とを結びつけることができる。しかし、炎症を起こした粘膜では、ＧＬＰ−２の作用は抗増殖性であり、炎症促進性サイトカインの発現が減少する一方でＩＧＦ−１の発現が増大し、炎症を起こした粘膜の治癒が促進される。 多くの患者で、結腸直腸癌、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、および外傷を含めた広範囲の状態に対して小腸または大腸の外科的除去が必要である。末端空腸瘻造設（ｅｎｄ ｊｅｊｕｎｏｓｔｏｍｙ）され結腸がない短腸症候群（ＳＢＳ）患者では、分泌性Ｌ細胞が除去されているので、食事に応答したＧＬＰ−２の放出が減少する。活動性のクローン病または潰瘍性大腸炎の患者では内在性血清ＧＬＰ−２濃度が上昇しており、これにより、粘膜傷害に対する正常な適応応答の可能性が示唆される（Ｂｕｃｈｍａｎ， Ａ． Ｌ．ら、Ｔｅｄｕｇｌｕｔｉｄｅ， ａ ｎｏｖｅｌ ｍｕｃｏｓａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ａｎａｌｏｇ ｏｆ ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ−２ （ＧＬＰ−２） ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｏｄｅｒａｔｅ ｔｏ ｓｅｖｅｒｅ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、（２０１０年）１６巻：９６２〜９７３頁）。 外因的に投与されたＧＬＰ−２およびＧＬＰ−２類似体は、動物モデルにおいて、げっ歯類における小腸切除後の栄養吸収の増強および完全非経口栄養誘導性形成不全の軽減、ならびにインドメタシン誘導性腸炎、デキストラン硫酸誘導性大腸炎および化学療法誘導性粘膜炎などの動物モデルにおける死亡率の低下および疾患に関連する組織病理の改善の実証を含め、腸上皮の成長および修復を促進することが実証されている。したがって、ＧＬＰ−２および関連する類似体は、短腸症候群、過敏性腸症候群、クローン病、および他の腸の疾患に対する治療になり得る（Ｍｏｏｒ， ＢＡら、ＧＬＰ−２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｍ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｓｔａｓｉｓ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｐｏｓｔ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｉｌｅｕｓ． Ｊ、ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．（２０１０年）３３３巻（２号）：５７４〜５８３頁）。しかし、ネイティブなＧＬＰ−２の半減期は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）によって切断されることに起因して、およそ７分である（Ｊｅｐｐｅｓｅｎ ＰＢら、Ｔｅｄｕｇｌｕｔｉｄｅ （ＡＬＸ−０６００）、ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＩＶ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ２ ａｎａｌｏｇｕｅ， ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｓｈｏｒｔ ｂｏｗｅｌ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ． Ｇｕｔ．（２００５年）５４巻（９号）：１２２４〜１２３１頁；Ｈａｒｔｍａｎｎ Ｂら（２０００年）Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＩＶ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎｏｔｒｏｐｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ−２ ｉｎ ｒａｔｓ ａｎｄ ｍｉｃｅ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４１巻：４０１３〜４０２０頁）。２位のアラニンをグリシンで置き換えることによってＧＬＰ−２配列を修飾することにより、ＤＰＰ−ＩＶによる分解が遮断され、それにより、テデュグルチド（ｔｅｄｕｇｌｕｔｉｄｅ）と称される類似体の半減期が０．９〜２．３時間延長されることが決定されている（Ｍａｒｉｅｒ ＪＦ， Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｅｄｕｇｌｕｔｉｄｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｐａｒｔｉｃｉｐａｎｔｓ ａｎｄ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｈｏｒｔ ｂｏｗｅｌ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ａｎｄ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｊ Ｃｌｉｎ ｐｈａｒｍａｃａｌ．（２０１０年）５０巻（１号）：３６〜４９頁）。しかし、短腸症候群の患者にテデュグルチドを利用する最近の臨床試験では、臨床的利益を実現するためにＧＬＰ−２類似体を毎日投与することを必要とした（Ｊｅｐｐｅｓｅｎ ＰＢ， Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｔｅｄｕｇｌｕｔｉｄｅ ｉｎ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ／ｏｒ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｆｌｕｉｄ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｈｏｒｔ ｂｏｗｅｌ ｓｙｎｄｒｏｍｅ． Ｇｕｔ（２０１１年）６０巻（７号）：９０２〜９１４頁）。 治療用タンパク質を化学修飾することにより、そのｉｎ ｖｉｖｏにおけるクリアランス速度およびそれに続く半減期を改変することができる。一般的な修飾の１つの例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を付加すること、一般には、アミン基（例えば、リシンの側鎖またはＮ末端）と反応するＰＥＧのアルデヒド基またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基を介してタンパク質にカップリングすることである。しかし、コンジュゲーションステップにより、分離する必要がある不均一な産物混合物が形成され、それにより産物が著しく損失し、製造が複雑になり、完全に化学的に均一な産物がもたらされない可能性がある。また、その結合部位の付近にあるアミノ酸の側鎖がペグ化プロセスによって修飾されている場合、薬理学的に活性なタンパク質の薬理的機能が妨害される可能性がある。他の手法としては、Ｆｃドメインと治療用タンパク質の遺伝子融合が挙げられ、これにより、治療用タンパク質のサイズが増大し、したがって、腎臓を通じたクリアランスの速度が低下する。さらに、Ｆｃドメインにより、ＦｃＲｎ受容体に結合し、リソソームから再利用される能力が付与され、その結果、薬物動態半減期が増大する。Ｆｃと融合したＧＬＰ−２の形態は、手術後イレウスに付随する胃腸炎のマウスモデルにおいて評価されている（Ｍｏｏｒ， ＢＡら、ＧＬＰ−２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｍ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｓｔａｓｉｓ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｐｏｓｔ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｉｌｅｕｓ． Ｊ、ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．（２０１０年）３３３巻（２号）：５７４〜５８３頁）。残念ながら、Ｆｃドメインは組換え発現の間に効率的に折り畳まれず、封入体として公知の不溶性沈殿物を形成する傾向がある。これらの封入体は可溶化しなければならず、また、誤って折り畳まれた凝集体から機能性タンパク質を再構成しなければならず、時間のかかる非効率的で費用のかかるプロセスである。Ｒｅｄｓｔｏｎｅ， ＨＡら、Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｇｌｕｃａｇｏｎ−Ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ−２ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｇｏｎｉｓｔｓ ｏｎ Ｃｏｌｏｎｉｃ Ａｎａｓｔｏｍｏｔｉｃ Ｗｏｕｎｄ Ｈｅａｌｉｎｇ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｒｅｓ Ｐｒａｃｔ．（２０１０年）；２０１０：Ａｒｔ．ＩＤ：６７２４５３Ｌｏｖｓｈｉｎ， Ｊ．およびＤ．Ｊ． Ｄｒｕｃｋｅｒ、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ． Ｐｅｄ． Ｄｉａｂｅｔｅｓ（２０００年）１巻（１号）：４９〜５７頁 したがって、より少ない頻度で投与することができ、より安全であり、作製の複雑さおよび費用がより少ない、ＧＬＰ−２に関連付けられる状態および疾患に対する予防および／または治療レジメンの一部として投与した際、半減期が増大し、活性および生物学的利用能が保持されるＧＬ−２組成物および製剤の考慮すべき必要性が残っている。本発明は、この必要性に対処し、その上関連する利点も提供する。本発明は、新規のＧＬＰ−２組成物およびその使用に関する。具体的には、本発明で提供される組成物は、特に、胃腸の状態を処置または改善するために使用される。一態様では、本発明は、組換えグルカゴン様タンパク質−２（「ＧＬＰ−２」）および１つまたは複数の延長組換えポリペプチド（「ＸＴＥＮ」）を含む融合タンパク質の組成物を提供する。対象ＸＴＥＮは、一般には、生じる融合タンパク質の性質が増強されるという点でＧＬＰ−２ペプチドに対する融合パートナーとして有用な非反復配列および非構造化コンフォメーションを有するポリペプチドである。一実施形態では、１つまたは複数のＸＴＥＮをＧＬＰ−２またはその配列変異体と連結し、その結果ＧＬＰ−２−ＸＴＥＮ融合タンパク質（「ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ」）が生じる。本開示は、融合タンパク質を含む医薬組成物およびＧＬＰ−２に関連する状態を治療するためのその使用も提供する。一態様では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物は、ＸＴＥＮと連結していない組換えＧＬＰ−２と比較して薬物動的性質および／または物理化学的性質が増強されており、それにより、より都合のよい投薬が可能になり、胃腸の状態に関連する１つまたは複数のパラメータが改善される。本明細書に開示されている実施形態のＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、本明細書において詳述されている通り、改善された性質および／または実施形態の１つまたは複数、またはその任意の組み合わせを示す。いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン、抗体、および抗体断片からなる群より選択される構成成分を有さない。 一実施形態では、本発明は、ＸＴＥＮを含む組換えＧＬＰ−２融合タンパク質であって、ＸＴＥＮが、ａ）ＸＴＥＮが少なくとも３６、または少なくとも７２、または少なくとも９６、または少なくとも１２０、または少なくとも１４４、または少なくとも２８８、または少なくとも５７６、または少なくとも８６４、または少なくとも１０００、または少なくとも２０００、または少なくとも３０００アミノ酸残基を含むこと、ｂ）グリシン（Ｇ）残基、アラニン（Ａ）残基、セリン（Ｓ）残基、トレオニン（Ｔ）残基、グルタミン酸（Ｅ）残基およびプロリン（Ｐ）残基の合計がＸＴＥＮの全アミノ酸残基の少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％を構成すること、ｃ）ＸＴＥＮが実質的に非反復性であり、したがって、（ｉ）ＸＴＥＮが、アミノ酸がセリンでない限り、同一のアミノ酸を３つ連続して含有しない、（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列の少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％が重複していない配列モチーフからなり、配列モチーフのそれぞれが、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択される３種、４種、５種または６種のアミノ酸からなる約９〜約１４アミノ酸残基、または約１２アミノ酸残基を含み、いかなる２つの連続したアミノ酸残基も、重複していない配列モチーフのそれぞれにおいて２回を超えて出現しない、または、（ｉｉｉ）ＸＴＥＮ配列の部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）スコアが１０未満であること、ｄ）ＸＴＥＮが、ＧＯＲアルゴリズムによって決定したところ９０％超、または９５％超、または９９％超のランダムコイル形成を有すること、ｅ）ＸＴＥＮが、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定したところ２％未満のアルファへリックスおよび２％のベータシートを有すること、ｆ）ＸＴＥＮが、ＴＥＰＩＴＯＰＥアルゴリズムによって解析した場合、予測Ｔ細胞エピトープを欠き、前記アルゴリズムによる前記予測についてのＴＥＰＩＴＯＰＥ閾値スコアの閾値が−９であり、前記融合タンパク質が、サイズ排除クロマトグラフィーまたは同等の方法によって測定した場合に少なくとも約４、または少なくとも約５、または少なくとも約６、または少なくとも約７、または少なくとも約８、または少なくとも約９、または少なくとも約１０、または少なくとも約１１、または少なくとも約１２、または少なくとも約１５、または少なくとも約２０の見かけの分子量率（ａｐｐａｒｅｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｆａｃｔｏｒ）を示し、治療有効量を用いて被験体に投与すると腸栄養効果を示すことを特徴とする組換えＧＬＰ−２融合タンパク質を提供する。前述の実施形態では、ＸＴＥＮは、要素（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つまたは（ａ）〜（ｄ）の任意の組合せを有してよい。前述の別の実施形態では、融合タンパク質の見かけの分子量は、少なくとも約２００ｋＤａ、または少なくとも約４００ｋＤａ、または少なくとも約５００ｋＤａ、または少なくとも約７００ｋＤａ、または少なくとも約１０００ｋＤａ、または少なくとも約１４００ｋＤａ、または少なくとも約１６００ｋＤａ、または少なくとも約１８００ｋＤａ、または少なくとも約２０００ｋＤａ、または少なくとも約３０００ｋＤａである。前述の別の実施形態では、融合タンパク質は、被験体に投与すると、約２４時間、または約３０時間、または約４８時間、または約７２時間、または約９６時間、または約１２０時間、または約１４４時間長い終末相半減期を示し、前記被験体はマウス、ラット、サルおよび人間から選択される。一実施形態では、融合タンパク質のＸＴＥＮは、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％が重複していない配列モチーフからなることを特徴とし、モチーフは、表３から選択される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＸＴＥＮは、アスパラギン残基とグルタミン残基の合計がＸＴＥＮの全アミノ酸配列の１０％未満、または５％未満、または２％未満であることをさらに特徴とする。他の実施形態では、融合タンパク質のＸＴＥＮは、メチオニン残基とトリプトファン残基の合計がＸＴＥＮの全アミノ酸配列の２％未満であることをさらに特徴とする。さらに他の実施形態では、融合タンパク質のＸＴＥＮは、ＸＴＥＮの有する正電荷を持つアミノ酸残基が５％未満であることをさらに特徴とする。一実施形態では、投与された融合タンパク質の腸栄養効果は、同等の用量を用いて被験体に投与した、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較して少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％または少なくとも約１２０％または少なくとも約１５０％または少なくとも約２００％の腸栄養効果である。一実施形態では、腸栄養効果はマウス、ラット、サル、およびヒトからなる群より選択される被験体において現れる。前述の実施形態では、前記投与は皮下投与、筋肉内投与、または静脈内投与である。別の実施形態では、腸栄養効果は、１用量、または３用量、または６用量、または１０用量、または１２用量またはそれより多くの用量の融合タンパク質を投与した後に決定される。別の実施形態では、腸栄養効果は、腸の成長、絨毛上皮の肥厚の増大、陰窩の細胞の増殖の増大、陰窩および絨毛軸の高さの増大、腸吻合後の治癒の増大、小腸の重量の増大、小腸の長さの増大、小腸上皮アポトーシスの減少、潰瘍の減少、腸管癒着の減少、および腸機能の増強からなる群より選択される。 一実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を投与することにより、小腸の重量が少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％増大する。別の実施形態では、投与により、小腸の長さが少なくとも約５％、または少なくとも約６％、または少なくとも約７％、または少なくとも約８％、または少なくとも約９％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％増大する。 一実施形態では、融合タンパク質のＧＬＰ−２配列は、最適にアラインメントすると、表１の配列からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する。別の実施形態では、融合タンパク質のＧＬＰ−２はヒトＧＬＰ−２を含む。別の実施形態では、融合タンパク質のＧＬＰ−２は、ヒト以外の種起源のＧＬＰ−２、例えば、ウシＧＬＰ−２、ブタＧＬＰ−２、ヒツジＧＬＰ−２、ニワトリＧＬＰ−２、およびイヌＧＬＰ−２などを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＧＬＰ−２はＡｌａ２の代わりにアミノ酸置換を有し、置換はグリシンである。さらに別の実施形態では、融合タンパク質のＧＬＰ−２は配列ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤを有する。 ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質の一実施形態では、ＸＴＥＮは、ＧＬＰ−２のＣ末端と連結している。ＸＴＥＮがＧＬＰ−２のＣ末端と連結している、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質の別の実施形態では、融合タンパク質は、ＧＬＰ−２構成成分およびＸＴＥＮ構成成分と連結した１〜約５０アミノ酸残基のスペーサー配列をさらに含む。一実施形態では、スペーサー配列は単一のグリシン残基である。 ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質の一実施形態では、ＸＴＥＮは、（ａ）全ＸＴＥＮアミノ酸残基が少なくとも３６〜約３０００、または約１４４〜約２０００、または約２８８〜約１０００アミノ酸残基であること、および、（ｂ）グリシン（Ｇ）残基、アラニン（Ａ）残基、セリン（Ｓ）残基、トレオニン（Ｔ）残基、グルタミン酸（Ｅ）残基およびプロリン（Ｐ）残基の合計が、ＸＴＥＮの全アミノ酸残基の少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％を構成することを特徴とする。 ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質の一実施形態では、融合タンパク質は、最適にアラインメントすると、表４、表８、表９、表１０、表１１、および表１２のいずれか１つから選択される同等の長さの配列と比較して少なくとも８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％または配列同一性を有する１つまたは複数のＸＴＥＮを含む。別の実施形態では、融合タンパク質は、配列が表４のＡＥ８６４であるＸＴＥＮを含む。別の実施形態では、融合タンパク質の配列は、図２８に記載の配列に対して少なくとも９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を有する。 一実施形態では、ＧＬＰ−２およびＸＴＥＮを含む融合タンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＧＬＰ２Ｒ細胞アッセイを用いてアッセイすると、ＧＬＰ−２受容体に約３０ｎＭ未満、または約１００ｎＭ未満、または約２００ｎＭ未満、または約３００ｎＭ未満または約３７０ｎＭ未満、または約４００ｎＭ未満、または約５００ｎＭ未満、または約６００ｎＭ未満、または約７００ｎＭ未満、または約８００ｎＭ未満、または約１０００ｎＭ未満、または約１２００ｎＭ未満、または約１４００ｎＭ未満のＥＣ５０で結合する。別の実施形態では、融合タンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＧＬＰ２Ｒ細胞アッセイを用いてアッセイすると、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２の効力の少なくとも約１％、または約２％、または約３％、または約４％、または約５％、または約１０％、または約２０％、または約３０％を保持する。本段落で前述した実施形態では、ＧＬＰ２Ｒ細胞はヒト組換えＧＬＰ−２グルカゴンファミリー受容体カルシウム最適化細胞または当技術分野で公知のＧＬＰ２Ｒを含む別の細胞であってよい。 単一のＧＬＰ−２が１つまたは２つのＸＴＥＮと連結した融合タンパク質の非限定的な例は表１３および表３２に示されている。一実施形態では、本発明は、表１３または表３３の配列と比較して少なくとも約８０％の配列同一性、あるいは、表１３または表３３の配列と比較して少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または約１００％の配列同一性を有する融合タンパク質組成物を提供する。しかし、本発明は、表１のＧＬＰ−２配列のいずれかによる表３３の配列のＧＬＰ−２の置換、および表４の任意のＸＴＥＮ配列による表３３の配列のＸＴＥＮの置換も提供する。いくつかの実施形態では、ＧＬＰ−２およびＸＴＥＮは、ＧＬＰ−２構成成分およびＸＴＥＮ構成成分と連結した１〜約５０アミノ酸残基のスペーサー配列をさらに含み、スペーサー配列は、場合によって、内在性哺乳動物のプロテアーゼを含めたプロテアーゼによって切断可能な切断配列を含む。そのようなプロテアーゼの例としては、これだけに限定されないが、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、カリクレイン、ＦＶＩＩＩａ、ＦＶＩＩＩａ、ＦＸａ、トロンビン、エラスターゼ−２、グランザイムＢ、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１７またはＭＭＰ−２０、ＴＥＶ、エンテロキナーゼ、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、およびソルターゼＡ、または表６から選択される配列が挙げられる。一実施形態では、切断配列を有する融合タンパク質組成物は、表３４の配列と比較して少なくとも約８０％の配列同一性、あるいは、表３４の配列と比較して少なくとも約８１％，８２％，８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％，８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または約１００％の配列同一性を有する配列を有する。しかし、本発明は、表１のＧＬＰ−２配列のいずれかによる表３４の配列のＧＬＰ−２の置換、および表４の任意のＸＴＥＮ配列による表３４の配列のＸＴＥＮの置換、および表６の任意の切断配列による表３４の配列の切断配列の置換も提供する。対象切断配列がＸＴＥＮと連結している実施形態では、プロテアーゼによって切断配列が切断されることにより、ＸＴＥＮが融合タンパク質から放出される。ＸＴＥＮとＧＬＰ−２を連結している切断配列を含む融合タンパク質のいくつかの実施形態では、ＧＬＰ−２構成成分は、切断配列が切断されることによってＸＴＥＮから放出されると生物学的に活性になるまたはＧＬＰ−２受容体に結合する能力が増大し、生じた切断されたタンパク質の活性は、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較して少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％である。前述の一実施形態では、切断配列は表６のプロテアーゼによって切断可能である。別の実施形態では、融合タンパク質は、表６の配列であってよい異なるプロテアーゼによって切断可能な２つの異種性切断配列によってＧＬＰ−２と連結したＸＴＥＮを含む。前述の一実施形態では、切断されたＧＬＰ２−ＸＴＥＮはＧＬＰ−２受容体に結合する能力が増大している。 本発明では、上記の通り特徴付けられるＧＬＰ−２およびＸＴＥＮを含む実施形態の融合タンパク質組成物は種々のＮ末端からＣ末端への配置であってよいと規定される。ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物の一実施形態では、本発明は、式Ｉの融合タンパク質を提供する： （ＧＬＰ−２）−（ＸＴＥＮ） Ｉ （式中、各出現に対してそれぞれ独立に、ＧＬＰ−２は、表１の配列を含めた本明細書で定義されているＧＬＰ−２タンパク質または類似体であり、ＸＴＥＮは、最適にアラインメントすると、表４、表８、表９、表１０、表１１、および表１２のいずれか１つからの同等の長さの配列に対して少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の配列同一性を示す配列を含めた、本明細書で定義されている延長組換えポリペプチドである）。一実施形態では、ＸＴＥＮはＡＥ８６４である。 ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物の別の実施形態では、本発明は、式ＩＩの融合タンパク質を提供する： （ＸＴＥＮ）−（ＧＬＰ−２） ＩＩ （式中、各出現に対してそれぞれ独立に、ＧＬＰ−２は、表１の配列を含めた本明細書で定義されているＧＬＰ−２タンパク質または類似体であり、ＸＴＥＮは、最適にアラインメントすると、表４、表８、表９、表１０、表１１、および表１２のいずれか１つからの同等の長さの配列に対して少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の配列同一性を示す配列を含めた、本明細書で定義されている延長組換えポリペプチドである）。一実施形態では、ＸＴＥＮはＡＥ８６４である。 ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物の別の実施形態では、本発明は、単離された式ＩＩＩの融合タンパク質を提供する： （ＸＴＥＮ）−（ＧＬＰ−２）−（ＸＴＥＮ） ＩＩＩ （式中、各出現に対してそれぞれ独立に、ＧＬＰ−２は、本明細書で定義されているＧＬＰ−２タンパク質または類似体（例えば、表１の配列を含めた）であり、ＸＴＥＮは、最適にアラインメントすると、表４、表８、表９、表１０、表１１、および表１２のいずれか１つからの同等の長さの配列に対して少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の配列同一性を示す配列を含めた、本明細書で定義されている延長組換えポリペプチドである）。一実施形態では、ＸＴＥＮはＡＥ８６４である。 ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物の別の実施形態では、本発明は、単離された式ＩＶの融合タンパク質を提供する： （ＧＬＰ−２）−（ＸＴＥＮ）−（ＧＬＰ−２） ＩＶ （式中、各出現に対してそれぞれ独立に、ＧＬＰ−２は、本明細書で定義されているＧＬＰ−２タンパク質または類似体（例えば、表１の配列を含めた）であり、ＸＴＥＮは、例えば、最適にアラインメントすると、表４、表８、表９、表１０、表１１、および表１２のいずれか１つからの同等の長さの配列に対して少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の配列同一性を示す配列を含めた、本明細書で定義されている延長組換えポリペプチドである）。一実施形態では、ＸＴＥＮはＡＥ８６４である。 ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物の別の実施形態では、本発明は、単離された式Ｖの融合タンパク質を提供する： （ＧＬＰ−２）−（Ｓ）ｘ−（ＸＴＥＮ）ｙ Ｖ （式中、各出現に対してそれぞれ独立に、ＧＬＰ−２は、表１の配列を含めた本明細書で定義されているＧＬＰ−２タンパク質または類似体であり、Ｓは、場合によって切断配列または制限部位と適合するアミノ酸を含んでよい、１〜約５０アミノ酸残基を有するスペーサー配列であり、ｘは０または１のいずれかであり、ＸＴＥＮは、最適にアラインメントすると、表４、表８、表９、表１０、表１１、および表１２のいずれか１つからの同等の長さの配列に対して少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の配列同一性を示す配列を含めた、本明細書で定義されている延長組換えポリペプチドである）。一実施形態では、ＸＴＥＮはＡＥ８６４である。式Ｖの実施形態では、切断配列を含むスペーサー配列は、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、カリクレイン、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＩＩａ因子（トロンビン）、エラスターゼ−２、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ−１７およびＭＭＰ−２０からなる群より選択される哺乳動物のプロテアーゼによって切断可能な配列である。式Ｖの融合タンパク質の一実施形態では、ＧＬＰ−２はヒトＧＬＰ−２を含む。式Ｖの融合タンパク質の別の実施形態では、ＧＬＰ−２は、ヒト以外の種起源のＧＬＰ−２、例えば、ウシＧＬＰ−２、ブタＧＬＰ−２、ヒツジＧＬＰ−２、ニワトリＧＬＰ−２、およびイヌＧＬＰ−２を含む。式Ｖの融合タンパク質の別の実施形態では、ＧＬＰ−２はＡｌａ２の代わりにアミノ酸置換を有し、置換はグリシンである。式Ｖの融合タンパク質の別の実施形態では、ＧＬＰ−２は配列ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤを有する。式Ｖの融合タンパク質の別の実施形態では、融合タンパク質は、グリシン残基であるスペーサー配列を含む。 ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物の別の実施形態では、本発明は、単離された式ＶＩの融合タンパク質を提供する： （ＸＴＥＮ）ｘ−（Ｓ）ｘ−（ＧＬＰ−２）−（Ｓ）ｙ−（ＸＴＥＮ）ｙ ＶＩ （式中、各出現に対してそれぞれ独立に、ＧＬＰ−２は、本明細書で定義されているＧＬＰ−２タンパク質または類似体（例えば、表１の配列を含めた）であり、Ｓは、場合によって切断配列または制限部位と適合するアミノ酸を含んでよい、１〜約５０アミノ酸残基を有するスペーサー配列であり、ｘは０または１のいずれかであり、ｙは０または１のいずれかであり、ｘ＋ｙ≧１であり、ＸＴＥＮは、例えば、最適にアラインメントすると、表４、表８、表９、表１０、表１１、および表１２のいずれか１つからの同等の長さの配列に対して少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の配列同一性を示すものを含めた、本明細書で定義されている延長組換えポリペプチドである。一実施形態では、ＸＴＥＮはＡＥ８６４である。式ＶＩの実施形態では、切断配列を含むスペーサー配列は、これだけに限定されないが、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、カリクレイン、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＩＩａ因子（トロンビン）、エラスターゼ−２、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ−１７およびＭＭＰ−２０を含めた哺乳動物のプロテアーゼによって切断可能な配列である。 いくつかの実施形態では、治療有効用量の式Ｉ〜ＶＩのうちの１つの融合タンパク質をそれを必要とする被験体に投与することにより、融合タンパク質が治療域内にある時間を、同等の用量で被験体に投与した、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較して少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍、または少なくとも１０倍以上増大させることができる。他の場合では、治療有効用量の式Ｉ〜ＶＩの実施形態の融合タンパク質をそれを必要とする被験体に投与することにより、治療有効用量レジメンを維持するために必要な連続投薬間の時間を、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２を同等の用量で投与することと比較して少なくとも４８時間、または少なくとも７２時間、または少なくとも約９６時間、または少なくとも約１２０時間、または少なくとも約７日、または少なくとも約１４日、または少なくとも約２１日増大させることができる。 本明細書に記載の実施形態の融合タンパク質組成物を、任意の適切な本明細書に開示されているｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ（例えば、表３２のアッセイまたは実施例に記載のアッセイ）を用いて活性の保持について評価して（任意の組み入れられたＸＴＥＮを放出させる切断部位の切断後を含めて）、ＧＬＰ−２因子に関連する状態の治療において治療剤として使用するための配置の適性を決定することができる。一実施形態では、融合タンパク質は、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較して少なくとも約２％、または少なくとも約５％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％の活性を示す。別の実施形態では、ＧＬＰ−２構成成分およびＸＴＥＮ構成成分と連結している組み入れられた切断配列の酵素による切断によって融合タンパク質から放出されたＧＬＰ−２構成成分は、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較して少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％の生物学的活性を示す。 いくつかの実施形態では、融合タンパク質はＧＬＰ−２および１つまたは複数のＸＴＥＮを含み、被験体に投与すると、融合タンパク質はＸＴＥＮと連結していないＧＬＰ−２と比較して薬物動態的性質の増強を示し、性質の増強としては、これだけに限定されないが、終末相半減期が長くなること、曲線下面積が大きくなること、血中濃度が治療域内にとどまる時間が増大すること、治療域内の血中濃度をもたらす連続投薬間の時間が増大すること、連続投与した場合のＣｍａｘ血中濃度とＣｍｉｎ血中濃度の間の時間が増大すること、および投与するために必要な経時的な累積用量がＸＴＥＮと連結していないＧＬＰ−２と比較して減少するが、それでも治療域内の血中濃度がもたらされることが挙げられる。ＧＬＰ−２−ＸＴＥＮ組成物を投与する被験体は、これだけに限定されないが、マウス、ラット、サルおよびヒトを含んでよい。いくつかの実施形態では、被験体に投与された融合タンパク質の終末相半減期は、対応するＸＴＥＮと連結していない組換えＧＬＰ−２を被験体に同等の用量で投与した場合、対応するＧＬＰ−２と比較して少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約６倍、または少なくとも約８倍、または少なくとも約１０倍、または少なくとも約２０倍、または少なくとも約４０倍、または少なくとも約６０倍、または少なくとも約１００倍、またはさらに長く増大する。他の実施形態では、被験体に投与された融合タンパク質の終末相半減期は、少なくとも約１２時間、または少なくとも約２４時間、または少なくとも約４８時間、または少なくとも約７２時間、または少なくとも約９６時間、または少なくとも約１２０時間、または少なくとも約１４４時間、または少なくとも約２１日またはそれを超える。他の実施形態では、薬物動態的性質の増強は、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２を被験体に同等の用量で投与した場合、対応するＧＬＰ−２と比較して少なくとも約２倍、または少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約６倍、または少なくとも約８倍、または少なくとも約１０倍長い、または少なくとも約２０倍、または少なくとも約４０倍、または少なくとも約６０倍、または少なくとも約１００倍長い期間にわたって融合タンパク質の血中濃度が治療域内にとどまるという事実により反映される。半減期および治療域内にある時間が増大することにより、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較して、被験体に投与する融合タンパク質の投薬の頻度を少なくすること、およびその量（ｎｍｏｌ／ｋｇ単位の当量）を減少させることが可能になる。一実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を、治療有効用量レジメンを用いてそれを必要とする被験体に３回以上投与することにより、融合タンパク質の血中レベルについての少なくとも２つの連続したＣｍａｘピークおよび／またはＣｍｉｎトラフ間の時間が、同等の用量レジメンを用いて被験体に投与した、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較して少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍、または少なくとも６倍、または少なくとも８倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも約２０倍、または少なくとも約４０倍、または少なくとも約６０倍、または少なくとも約１００倍以上増大する。一実施形態では、治療有効量を用いてそれを必要とする被験体に投与したＧＬＰ２−ＸＴＥＮでは、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質の血中濃度が、少なくとも約２４時間、または少なくとも約４８時間、または少なくとも約７２時間、または少なくとも約９６時間、または少なくとも約１２０時間、または少なくとも約１４４時間にわたって、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ超、少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌ超、または少なくとも約２０００ｎｇ／ｍｌ超、または少なくとも約３０００ｎｇ／ｍｌ超、または少なくとも約４０００ｎｇ／ｍｌ超、または少なくとも約５０００ｎｇ／ｍｌ超、または少なくとも約１００００ｎｇ／ｍｌ超、または少なくとも約１５０００ｎｇ／ｍｌ超、または少なくとも約２００００ｎｇ／ｍｌ超、または少なくとも約３００００ｎｇ／ｍｌ超、または少なくとも約４００００ｎｇ／ｍｌ超にとどまる。別の実施形態では、適切な用量で被験体に投与したＧＬＰ２−ＸＴＥＮでは、単回投薬後にＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質の濃度の曲線下面積が少なくとも１０００００ｈｒ＊ｎｇ／ｍＬ、または少なくとも約２０００００ｈｒ＊ｎｇ／ｍＬ、または少なくとも約４０００００ｈｒ＊ｎｇ／ｍＬ、または少なくとも約６０００００ｈｒ＊ｎｇ／ｍＬ、または少なくとも約８０００００ｈｒ＊ｎｇ／ｍＬ、または少なくとも約１００００００ｈｒ＊ｎｇ／ｍＬ、または少なくとも約２００００００ｈｒ＊ｎｇ／ｍＬになる。一実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、同等の用量で投与した、ＸＴＥＮと連結していないＧＬＰ−２のレジメンと比較して、治療有効用量レジメンを維持するために必要な連続投薬間の時間を少なくとも４８時間、または少なくとも７２時間、または少なくとも約９６時間、または少なくとも約１２０時間、または少なくとも約７日、または少なくとも約１４日、または少なくとも約２１日増大させる終末相半減期を有する。 一実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、融合タンパク質およびＸＴＥＮが欠如している対応するＧＬＰ−２をｎｍｏｌ／ｋｇ単位の当量で同等の被験体にそれぞれ投与すると、融合タンパク質ではＸＴＥＮが欠如している対応するＧＬＰ−２と比較して少なくとも約３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも１５倍、または少なくとも２０倍長い、被験体における終末相半減期が達成されることを特徴とする。別の実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、ＸＴＥＮが欠如している対応するＧＬＰ−２およびｎｍｏｌ／ｋｇ単位でその２分の１、または３分の１、または４分の１、または５分の１、または６分の１の量の融合タンパク質を胃腸の状態を有する同等の被験体にそれぞれ投与すると、融合タンパク質により、ＸＴＥＮが欠如している対応するＧＬＰ−２と同等の、被験体における治療効果が達成されることを特徴とする。別の実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、融合タンパク質を、同等の被験体に、その他の点では等価なｎｍｏｌ／ｋｇ量を用いて投与した、ＸＴＥＮが欠如している対応するＧＬＰ−２の投薬間隔と比較して少なくとも約２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも１５倍、または少なくとも２０倍長い投薬間隔を用いて連続的に被験体に投与すると、融合タンパク質ではＸＴＥＮが欠如している対応するＧＬＰ−２と同様の、被験体における血中濃度が達成されることを特徴とする。別の実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、同等の被験体に、その他の点では同等のｎｍｏｌ／ｋｇ量を用いて投与した、ＸＴＥＮが欠如している対応するＧＬＰ−２の投薬間隔と比較して少なくとも約３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも１５倍、または少なくとも２０倍長い投薬間隔を用いて融合タンパク質を連続的に被験体に投与すると、融合タンパク質により、ＸＴＥＮが欠如している対応するＧＬＰ−２と同等の、被験体における治療効果が達成されることを特徴とする。別の実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、本段落の前述の特性の任意の組合せ、またはその全てを示す。本段落の実施形態では、対象組成物を投与する被験体は、これだけに限定されないが、マウス、ラット、サル、およびヒトを含んでよい。一実施形態では、被験体はラットである。別の実施形態では、被験体はヒトである。 一実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を被験体に投与することにより、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２で見られる効果と比較してより大きな治療効果がもたらされる。別の実施形態では、有効量の融合タンパク質を投与することにより、同等の被験体に同等のｎｍｏｌ／ｋｇ量を用いて投与した、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較してより大きな、腸炎の被験体における治療効果がもたらされる。前述では、被験体は、マウス、ラット、サル、およびヒトからなる群より選択される。前述の一実施形態では、被験体はヒトであり、腸炎はクローン病である。前述の別の実施形態では、被験体はラット被験体であり、腸炎はインドメタシンを用いて誘導される。本段落の前述の実施形態では、より大きな治療効果は、体重増加、小腸の長さ、小腸組織のＴＮＦα含有量の減少、粘膜の萎縮の減少、穿孔性潰瘍の発生率の低下、および絨毛の高さからなる群より選択される。一実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を被験体に投与することにより、小腸の重量が、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２によるものと比較して少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％大きく増大する。ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を被験体に投与する別の実施形態では、投与により、小腸の長さが、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２によるものと比較して少なくとも約５％、または少なくとも約６％、または少なくとも約７％、または少なくとも約８％、または少なくとも約９％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％大きく増大する。ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を被験体に投与する別の実施形態では、投与により、体重が、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２によるものと比較して少なくとも約５％、または少なくとも約６％、または少なくとも約７％、または少なくとも約８％、または少なくとも約９％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％大きく増大する。ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を被験体に投与する別の実施形態では、投与により、ＴＮＦα含有量の減少が、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２によるものと比較して小腸組織１ｇ当たり少なくとも約０．５ｎｇ、または少なくとも約０．６ｎｇ、または少なくとも約０．７ｎｇ、または少なくとも約０．８ｎｇ、または少なくとも約０．９ｎｇ、または少なくとも約１．０ｎｇ、または少なくとも約１．１ｎｇ、または少なくとも約１．２ｎｇ、または少なくとも約１．３ｎｇ、または少なくとも約１．４ｎｇ、またはそれを超える。ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を被験体に投与する別の実施形態では、投与により、絨毛の高さが、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２によるものと比較して少なくとも約５％、または少なくとも約６％、または少なくとも約７％、または少なくとも約８％、または少なくとも約９％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約１１％、または少なくとも約１２％大きく増大する。本段落の前述の実施形態では、融合タンパク質を、１回、または２回、または３回、または４回、または５回、または６回、または１０回、または１２回またはそれを超える連続用量で投与し、投与量は少なくとも約５ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約２５ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約２００ｎｍｏｌ／ｋｇである。 一実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組換え融合タンパク質は、これだけに限定されないが、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、カリクレイン、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＩＩａ因子（トロンビン）、エラスターゼ−２、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１７およびＭＭＰ−２０を含めた哺乳動物のプロテアーゼによって切断可能な切断配列を介してＸＴＥＮと連結したＧＬＰ−２を含み、切断配列における哺乳動物のプロテアーゼによる切断により、ＸＴＥＮ配列からＧＬＰ−２配列が放出され、放出されたＧＬＰ−２配列は、切断されていない融合タンパク質と比較して少なくとも約３０％の受容体結合活性の増大を示す。 本発明は、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を作製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の延長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）と融合したＧＬＰ−２を含む融合タンパク質を作製する方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかの融合タンパク質をコードする組換え核酸を含む宿主細胞を提供するステップと、宿主細胞を、融合タンパク質の発現を可能にする条件下で培養するステップと、融合タンパク質を回収するステップとを含む。該方法の一実施形態では、宿主細胞は原核細胞である。該方法の別の実施形態では、宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉである。該方法の別の実施形態では、融合タンパク質を、宿主細胞の細胞質から実質的に可溶性の形態で回収する。該方法の別の実施形態では、組換え核酸分子は、最適にアラインメントすると、表１３に記載のＤＮＡ配列からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する配列、またはその相補配列を有する。 本発明は、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質をコードする単離された核酸、ベクター、ならびにベクターおよび核酸を含む宿主細胞を提供する。一実施形態では、本発明は、表１３から選択されるＤＮＡ配列に対して少なくとも７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸配列、またはその相補配列を含む単離された核酸を提供する。別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の融合タンパク質実施形態のいずれかの融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列またはその相補配列を提供する。別の実施形態では、本発明は、発現ベクターまたは本段落の前述の実施形態の核酸を含む単離された宿主細胞を提供する。別の実施形態では、本発明は、前述の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。 さらに、本発明は、本明細書に記載の前述の実施形態のいずれかの融合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。さらに、本発明は、被験体における胃腸の状態の治療において使用するための本明細書に記載の前述の実施形態のいずれかの融合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、胃腸の状態を有する被験体に治療有効量の医薬組成物を投与することにより、融合タンパク質の血中濃度が、被験体に同等量を投与した、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較して少なくとも３倍長く融合タンパク質の治療域内で維持される。別の実施形態では、胃腸の状態を有する被験体に医薬組成物を治療有効用量レジメンを用いて３回以上投与することにより、融合タンパク質の血中レベルについて少なくとも２つの連続したＣｍａｘピークおよび／またはＣｍｉｎトラフ間の時間が、同等の用量レジメンを用いて被験体に投与した、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較して少なくとも４倍増大する。別の実施形態では、少なくとも約５ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約２５ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約２００ｎｍｏｌ／ｋｇの融合タンパク質を含む医薬組成物を被験体に静脈内投与、皮下投与、または筋肉内投与することにより、融合タンパク質の血中レベルが少なくとも７２時間にわたって１０００ｎｇ／ｍｌ超に維持される。本段落の前述の実施形態では、胃腸の状態は、胃炎、消化障害、吸収不良症候群、短消化管症候群、短腸症候群、盲管症候群、炎症性腸疾患、小児脂肪便症、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症性スプルー、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸炎、化学療法誘導性腸炎、過敏性腸症候群、小腸損傷、癌化学療法に起因する小腸損傷、胃腸傷害、下痢性疾患、腸管機能不全症、酸誘導性腸管傷害、アルギニン欠乏症、特発性精液減少症、肥満症、異化疾病、発熱性好中球減少症、糖尿病、肥満症、脂肪便、自己免疫疾患、食物アレルギー、低血糖症、胃腸関門障害、敗血症、細菌性腹膜炎、熱傷誘導性腸管損傷、胃腸運動の低下、腸管不全症、化学療法に付随する菌血症、腸管外傷、腸管虚血、腸間膜虚血、栄養失調、壊死性腸炎、壊死性膵炎、新生児哺乳不耐性（ｎｅｏｎａｔａｌ ｆｅｅｄｉｎｇ ｉｎｔｏｌｅｒａｎｃｅ）、ＮＳＡＩＤ誘導性胃腸損傷、栄養不足（ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）、胃腸管に対する完全非経口栄養による損傷、新生児栄養不足、放射線誘導性腸炎、放射線によって誘導される腸への傷害、粘膜炎、回腸嚢炎、および胃腸虚血からなる群より選択される。本段落の前述の実施形態では、被験体は、マウス、ラット、サルおよびヒトから選択される。 別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の胃腸の状態を処置するための医薬品の調製において使用するための本明細書に記載の実施形態のいずれかによるＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。 本発明は、被験体に治療有効量の融合タンパク質を投与することを含む被験体における胃腸の状態を処置する方法において使用するための、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。一実施形態では、胃腸の状態は、胃炎、消化障害、吸収不良症候群、短消化管症候群、短腸症候群、盲管症候群、炎症性腸疾患、小児脂肪便症、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症性スプルー、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸炎、化学療法誘導性腸炎、過敏性腸症候群、小腸損傷、癌化学療法に起因する小腸損傷、胃腸傷害、下痢性疾患、腸管機能不全症、酸誘導性腸管傷害、アルギニン欠乏症、特発性精液減少症、肥満症、異化疾病、発熱性好中球減少症、糖尿病、肥満症、脂肪便、自己免疫疾患、食物アレルギー、低血糖症、胃腸関門障害、敗血症、細菌性腹膜炎、熱傷誘導性腸管損傷、胃腸運動の低下、腸管不全症、化学療法に付随する菌血症、腸管外傷、腸管虚血、腸間膜虚血、栄養失調、壊死性腸炎、壊死性膵炎、新生児哺乳不耐性、ＮＳＡＩＤ誘導性胃腸損傷、栄養不足、胃腸管に対する完全非経口栄養による損傷、新生児栄養不足、放射線誘導性腸炎、放射線によって誘導される腸への傷害、粘膜炎、回腸嚢炎、および胃腸虚血からなる群より選択される。被験体における胃腸の状態を処置する方法において使用するための融合タンパク質の別の実施形態では、被験体に、治療有効用量レジメンを用いて２回またはそれより多くの連続用量の融合タンパク質を投与することにより、ＧＬＰ−２に対して確立された治療有効用量レジメンを用いて投与した、ＸＴＥＮが欠如している対応するＧＬＰ−２と比較して、融合タンパク質の血中レベルについての連続したＣｍａｘピークおよび／またはＣｍｉｎトラフの間の時間が引き伸ばされる。被験体における胃腸の状態を処置する方法において使用するための融合タンパク質の別の実施形態では、ＸＴＥＮが欠如している対応するＧＬＰ−２と比較してｎｍｏｌ／ｋｇ単位でより少量の融合タンパク質を被験体に投与することにより、その他の点では等価な用量レジメンの下で被験体に投与した場合、融合タンパク質により、ＸＴＥＮが欠如している対応するＧＬＰ−２と同等の治療効果が達成される。前述では、治療効果は、ＧＬＰ−２の血中濃度、腸間膜血流の増大、炎症の減少、体重増加の増大、下痢の減少、糞便の湿重量の減少、腸の創傷治癒、血漿シトルリン濃度の上昇、ＣＲＰレベルの低下、ステロイド療法の必要性の減少、粘膜完全性の増強または刺激、ナトリウム損失の減少、腸内への細菌のトランスロケーションの最小化、緩和、または予防、外科手術後の腸の回復の増強、刺激または加速、炎症性腸疾患の再発の予防、およびエネルギー恒常性の維持からなる群より選択される。 本発明は、被験体における胃腸の状態を処置するための医薬レジメンにおいて使用するための本明細書に記載の実施形態のいずれかによるＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。一実施形態では、医薬レジメンは、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を含む医薬組成物を含む。別の実施形態では、医薬レジメンは、被験体における治療効果を達成するために必要な医薬組成物の量を決定するステップをさらに含み、治療効果は、腸間膜血流の増大、炎症の減少、体重増加の増大、下痢の減少、糞便の湿重量の減少、腸の創傷治癒、血漿シトルリン濃度の上昇、ＣＲＰレベルの低下、ステロイド療法の必要性の減少、粘膜完全性の増強、ナトリウム損失の減少、腸内への細菌のトランスロケーションの予防、外科手術後の腸の回復の加速、炎症性腸疾患の再発の予防、およびエネルギー恒常性の維持からなる群より選択される。別の実施形態では、医薬レジメンは、有効量の医薬組成物を２回以上連続して被験体に投与することを含み、投与により、胃腸の状態に関連する少なくとも１つ、２つ、または３つのパラメータが、同等のｎｍｏｌ／ｋｇ量を用いて投与した、ＸＴＥＮと連結していないＧＬＰ−２と比較して少なくとも５％、または１０％、または２０％、または３０％、または４０％、または５０％、または６０％、または７０％、または８０％、または９０％大きく改善される。前述の一実施形態では、改善されるパラメータは、ＧＬＰ−２の血中濃度の上昇、腸間膜血流の増大、炎症の減少、体重増加の増大、下痢の減少、糞便の湿重量の減少、腸の創傷治癒、血漿シトルリン濃度の上昇、ＣＲＰレベルの低下、ステロイド療法の必要性の減少、粘膜完全性の増強、ナトリウム損失の減少、腸内への細菌のトランスロケーションの予防、外科手術後の腸の回復の加速、炎症性腸疾患の再発の予防、およびエネルギー恒常性の維持から選択される。別の実施形態では、医薬レジメンは、治療有効量の医薬組成物を７日、または１０日、または１４日または２１日、または２８日またはそれより多い日数ごとに１回投与することを含む。前述のある実施形態では、有効量は少なくとも約５ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約２５ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約２００ｎｍｏｌ／ｋｇである。レジメンの実施形態では、投与は皮下投与、筋肉内投与、または静脈内投与である。 本発明は、被験体における胃腸の状態を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態では、該方法は、前記被験体に本明細書に記載のＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を含む医薬組成物を含む組成物を有効量で投与することを含む。該方法の一実施形態では、有効量は少なくとも約５ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約２５ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約２００ｎｍｏｌ／ｋｇである。該方法の別の実施形態では、医薬組成物の投与は皮下投与、筋肉内投与、または静脈内投与である。該方法の別の実施形態では、有効量を投与することにより、融合タンパク質が被験体において約３０時間超の終末相半減期を示し、前記被験体は、マウス、ラット、サル、およびヒトからなる群より選択される。前述の実施形態では、胃腸の状態は、胃炎、消化障害、吸収不良症候群、短消化管症候群、短腸症候群、盲管症候群、炎症性腸疾患、小児脂肪便症、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症性スプルー、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸炎、化学療法誘導性腸炎、過敏性腸症候群、小腸損傷、癌化学療法に起因する小腸損傷、胃腸傷害、下痢性疾患、腸管機能不全症、酸誘導性腸管傷害、アルギニン欠乏症、特発性精液減少症、肥満症、異化疾病、発熱性好中球減少症、糖尿病、肥満症、脂肪便、自己免疫疾患、食物アレルギー、低血糖症、胃腸関門障害、敗血症、細菌性腹膜炎、熱傷誘導性腸管損傷、胃腸運動の低下、腸管不全症、化学療法に付随する菌血症、腸管外傷、腸管虚血、腸間膜虚血、栄養失調、壊死性腸炎、壊死性膵炎、新生児哺乳不耐性、ＮＳＡＩＤ誘導性胃腸損傷、栄養不足、胃腸管に対する完全非経口栄養による損傷、新生児栄養不足、放射線誘導性腸炎、放射線によって誘導される腸への傷害、粘膜炎、回腸嚢炎、および胃腸虚血からなる群より選択される。該方法の別の実施形態では、該方法を用いて、例えば、これだけに限定されないが、５−ＦＵ、アルトレタミン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クリサンタスパーゼ（ｃｒｉｓａｎｔａｓｐａｓｅ）、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、リポソーム化ドキソルビシン、ロイコボリン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、ストレプトゾシン、テガフール−ウラシル、テモゾロミド、チオテパ、チオグアニン、チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビンなどの化学療法剤に起因する小腸損傷を有する被験体を処置する。該方法の別の実施形態では、医薬組成物を投与することにより、前記被験体において腸栄養効果がもたらされる。該方法のさらに別の実施形態では、医薬組成物を投与することにより、前記被験体において腸栄養効果がもたらされ、腸栄養効果は、同等の用量を用いて被験体に投与した、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較して少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％または少なくとも約１２０％または少なくとも約１５０％または少なくとも約２００％の腸栄養効果である。前述の一実施形態では、腸栄養効果は、１用量、または３用量、または６用量、または１０用量、または１２用量またはそれより多くの用量の融合タンパク質を投与した後に決定される。前述の別の実施形態では、腸栄養効果は、腸の成長、絨毛上皮の肥厚の増大、陰窩の細胞の増殖の増大、陰窩および絨毛軸の高さの増大、腸吻合後の治癒の増大、小腸の重量の増大、小腸の長さの増大、小腸上皮アポトーシスの減少、および腸機能の増強からなる群より選択される。 別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を含む医薬組成物を含む包装材料および少なくとも第１の容器、ならびに医薬組成物を再構成し、かつ／または被験体に投与するための説明書を含むキットを提供する。 以下は本発明の非限定的な例示的実施形態である： 項目１．グルカゴン様タンパク質−２（ＧＬＰ−２）および延長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）を含む組換え融合タンパク質であって、ＸＴＥＮが、 （ａ）ＸＴＥＮが少なくとも３６アミノ酸残基を含むこと、 （ｂ）グリシン（Ｇ）残基、アラニン（Ａ）残基、セリン（Ｓ）残基、トレオニン（Ｔ）残基、グルタミン酸（Ｅ）残基およびプロリン（Ｐ）残基の合計がＸＴＥＮの全アミノ酸残基の約８０％超を構成すること、 （ｃ）ＸＴＥＮが実質的に非反復性であり、したがって、（ｉ）ＸＴＥＮが、アミノ酸がセリンでない限り、同一のアミノ酸を３つ連続して含有しない、（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列の少なくとも約８０％が重複していない配列モチーフからなり、配列モチーフのそれぞれがグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択される４〜６アミノ酸からなる約９〜約１４アミノ酸残基を含み、いかなる２つの連続したアミノ酸残基も重複していない配列モチーフのそれぞれにおいて２回を超えて出現しない、または、（ｉｉｉ）ＸＴＥＮ配列の部分配列スコアが１０未満であること、 （ｄ）ＸＴＥＮがＧＯＲアルゴリズムによって決定したところ９０％超のランダムコイル形成を有すること、 （ｅ）ＸＴＥＮが、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定したところ２％未満のアルファへリックスおよび２％のベータシートを有すること、および （ｆ）ＸＴＥＮが、ＴＥＰＩＴＯＰＥアルゴリズムによって解析した場合、予測Ｔ細胞エピトープを欠き、前記アルゴリズムによる前記予測についてのＴＥＰＩＴＯＰＥ閾値スコアの閾値が−９であり、前記融合タンパク質が少なくとも約４の見かけの分子量率を示し、治療有効量を用いて被験体に投与した時に腸栄養効果を示すことを特徴とする組換え融合タンパク質。 項目２．腸栄養効果が、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２を同等の用量を用いて被験体に投与した場合に、対応するＧＬＰ−２と比較して少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％または少なくとも約１２０％または少なくとも約１５０％または少なくとも約２００％の腸栄養効果である、項目１に記載の組換え融合タンパク質。 項目３．被験体が、マウス、ラット、サル、およびヒトからなる群より選択される、項目１に記載の組換え融合タンパク質。 項目４．前記投与が皮下投与、筋肉内投与、または静脈内投与である、前記項目のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 項目５．１用量、または３用量、または６用量、または１０用量、または１２用量またはそれより多くの用量の融合タンパク質を投与した後に腸栄養効果を決定する、前記項目のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 項目６．腸栄養効果が、腸の成長、絨毛上皮の肥厚の増大、陰窩の細胞の増殖の増大、陰窩および絨毛軸の高さの増大、腸吻合後の治癒の増大、小腸の重量の増大、小腸の長さの増大、小腸上皮アポトーシスの減少、および腸機能の増強からなる群より選択される、前記項目のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 項目７．投与により、小腸の重量が少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％増大する、項目６に記載の組換え融合タンパク質。 項目８．投与により、小腸の長さが少なくとも約５％、または少なくとも約６％、または少なくとも約７％、または少なくとも約８％、または少なくとも約９％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％増大する、項目６に記載の組換え融合タンパク質。 項目９．ＧＬＰ−２配列が、最適にアラインメントした時に、表１の配列からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する、前記項目のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 項目１０．ＧＬＰ−２がヒトＧＬＰ−２を含む、前記項目のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 項目１１．ＧＬＰ−２が、ウシＧＬＰ−２、ブタＧＬＰ−２、ヒツジＧＬＰ−２、ニワトリＧＬＰ−２、およびイヌＧＬＰ−２からなる群より選択される、項目９から項目１１のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 項目１２．ＧＬＰ−２がＡｌａ２の代わりにアミノ酸置換を有し、置換がグリシンである、前記項目のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 項目１３．ＧＬＰ−２が配列ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤを有する、項目１から項目９のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 項目１４．ＸＴＥＮがＧＬＰ−２のＣ末端と連結している、前記項目のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 項目１５．ＧＬＰ−２構成成分およびＸＴＥＮ構成成分と連結した１〜約５０アミノ酸残基のスペーサー配列をさらに含む、項目１４に記載の組換え融合タンパク質。 項目１６．スペーサー配列がグリシン残基である、項目１５に記載の組換え融合タンパク質。 項目１７．ＸＴＥＮが、 （ａ）全ＸＴＥＮアミノ酸残基が少なくとも３６〜約３０００アミノ酸残基であること、 （ｂ）グリシン（Ｇ）残基、アラニン（Ａ）残基、セリン（Ｓ）残基、トレオニン（Ｔ）残基、グルタミン酸（Ｅ）残基およびプロリン（Ｐ）残基の合計がＸＴＥＮの全アミノ酸残基の少なくとも約９０％を構成することを特徴とする、前記項目のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 項目１８．ＸＴＥＮが、アスパラギン残基とグルタミン残基の合計がＸＴＥＮの全アミノ酸配列の１０％未満であることを特徴とする、前記項目のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 項目１９．ＸＴＥＮが、メチオニン残基とトリプトファン残基の合計がＸＴＥＮの全アミノ酸配列の２％未満であることを特徴とする、前記項目のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 項目２０．ＸＴＥＮが、最適にアラインメントした時に、表４、表８、表９、表１０、表１１、および表１２のいずれか１つから選択される同等の長さの配列と比較して少なくとも９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する、前記項目のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 項目２１．ＸＴＥＮが、最適にアラインメントした時に、表４のＡＥ８６４配列と比較して少なくとも９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する、前記項目のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 項目２２．融合タンパク質の配列が、図２８に記載の配列に対して少なくとも９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を有する、項目１から項目９までまたは項目１３のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 項目２３．被験体に投与した時に、少なくとも約３０時間の終末相半減期を示す、前記項目のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 項目２４．融合タンパク質が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＧＬＰ２Ｒ細胞アッセイを用いてアッセイした時に、約３０ｎＭ未満、または約１００ｎＭ未満、または約２００ｎＭ未満、または約３００ｎＭ未満、または約３７０ｎＭ未満、または約４００ｎＭ未満、または約５００ｎＭ未満、または約６００ｎＭ未満、または約７００ｎＭ未満、または約８００ｎＭ未満、または約１０００ｎＭ未満、または約１２００ｎＭ未満、または約１４００ｎＭ未満のＥＣ５０でＧＬＰ−２受容体に結合し、ＧＬＰ２Ｒ細胞がヒト組換えＧＬＰ−２グルカゴンファミリー受容体カルシウム最適化細胞である、前記項目のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 項目２５．融合タンパク質が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＧＬＰ２Ｒ細胞アッセイを用いてアッセイした時に、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２の効力の少なくとも約１％、または約２％、または約３％、または約４％、または約５％、または約１０％、または約２０％、または約３０％を保持し、ＧＬＰ２Ｒ細胞が、ヒト組換えＧＬＰ−２グルカゴンファミリー受容体カルシウム最適化細胞である、前記項目のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 項目２６．（ａ）ｎｍｏｌ／ｋｇ単位の当量の融合タンパク質およびＸＴＥＮが欠如している対応するＧＬＰ−２を同等の被験体にそれぞれ投与すると、融合タンパク質ではＸＴＥＮが欠如している対応するＧＬＰ−２と比較して少なくとも約３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも１５倍、または少なくとも２０倍長い、被験体における終末相半減期が達成されること、 （ｂ）ＸＴＥＮが欠如している対応するＧＬＰ−２およびｎｍｏｌ／ｋｇ単位でその２分の１、または３分の１、または４分の１、または５分の１、または６分の１の量の融合タンパク質を胃腸の状態を有する同等の被験体にそれぞれ投与すると、融合タンパク質により、ＸＴＥＮが欠如している対応するＧＬＰ−２と同等の、被験体における治療効果が達成されること、 （ｃ）融合タンパク質を、被験体に、同等の被験体に、その他の点では等価なｎｍｏｌ／ｋｇ量を用いて投与した、ＸＴＥＮが欠如している対応するＧＬＰ−２の投薬間隔と比較して少なくとも約２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも１５倍、または少なくとも２０倍長い投薬間隔を用いた連続用量で投与すると、融合タンパク質ではＸＴＥＮが欠如している対応するＧＬＰ−２と同様の、被験体における血中濃度が達成されること、または、 （ｄ）融合タンパク質を、被験体に、同等の被験体に、その他の点では等価なｎｍｏｌ／ｋｇ量を用いて投与した、ＸＴＥＮが欠如している対応するＧＬＰ−２の投薬間隔と比較して少なくとも約３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍、または少なくとも１０倍または少なくとも１５倍、または少なくとも２０倍長い投薬間隔を用いた連続用量で投与すると、融合タンパク質ではＸＴＥＮが欠如している対応するＧＬＰ−２と同等の、被験体における治療効果が達成されることを特徴とする、前記項目のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 項目２７．被験体が、マウス、ラット、サル、およびヒトからなる群より選択される、項目２６に記載の組換え融合タンパク質。 項目２８．被験体がラットである、項目２７に記載の組換え融合タンパク質。 項目２９．投与により、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２で見られる効果と比較してより大きな治療効果がもたらされる、項目２６から項目２８のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 項目３０．有効量の融合タンパク質を投与することにより、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２を同等の被験体に同等のｎｍｏｌ／ｋｇ量を用いて投与した場合に、対応するＧＬＰ−２と比較してより大きな、腸炎の被験体における治療効果がもたらされる、項目２６から項目２９のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 項目３１．被験体が、マウス、ラット、サル、およびヒトからなる群より選択される、項目２６から項目３０のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 項目３２．被験体がヒトであり、腸炎がクローン病である、 項目３１に記載の組換え融合タンパク質。 項目３３．被験体がラット被験体であり、腸炎がインドメタシンを用いて誘導される、項目３１に記載の組換え融合タンパク質。 項目３４．より大きな治療効果が、体重増加、小腸の長さ、小腸組織のＴＮＦα含有量の減少、粘膜の萎縮の減少、穿孔性潰瘍の発生率の低下、および絨毛の高さからなる群より選択される、項目２９から項目３３のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 項目３５．投与により、小腸の重さが、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２によるものと比較して少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％大きく増大する、項目３４に記載の組換え融合タンパク質。 項目３６．投与により、小腸の長さが、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２によるものと比較して少なくとも約５％、または少なくとも約６％、または少なくとも約７％、または少なくとも約８％、または少なくとも約９％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％大きく増大する、項目３４に記載の組換え融合タンパク質。 項目３７．投与により、体重が、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２によるものと比較して少なくとも約５％、または少なくとも約６％、または少なくとも約７％、または少なくとも約８％、または少なくとも約９％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％大きく増大する、項目３４に記載の組換え融合タンパク質。 項目３８．ＴＮＦα含有量の減少が、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２によるものと比較して小腸組織１ｇ当たり少なくとも約０．５ｎｇ、または少なくとも約０．６ｎｇ、または少なくとも約０．７ｎｇ、または少なくとも約０．８ｎｇ、または少なくとも約０．９ｎｇ、または少なくとも約１．０ｎｇ、または少なくとも約１．１ｎｇ、または少なくとも約１．２ｎｇ、または少なくとも約１．３ｎｇ、または少なくとも約１．４ｎｇ、またはそれを超える、項目３４に記載の組換え融合タンパク質。 項目３９．絨毛の高さが、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２によるものと比較して少なくとも約５％、または少なくとも約６％、または少なくとも約７％、または少なくとも約８％、または少なくとも約９％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約１１％、または少なくとも約１２％高い、項目３４に記載の組換え融合タンパク質。 項目４０．１回、または２回、または３回、または４回、または５回、または６回、または１０回、または１２回またはそれを超える連続用量で投与される、項目２９から項目３９のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 項目４１．有効量が少なくとも約５ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約２５ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約２００ｎｍｏｌ／ｋｇである、項目３０から項目４０のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 項目４２．ＧＬＰ−２がＸＴＥＮに、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、カリクレイン、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＩＩａ因子（トロンビン）、エラスターゼ−２、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ−１７およびＭＭＰ−２０からなる群より選択される哺乳動物のプロテアーゼによって切断可能な切断配列を介して連結しており、切断配列における哺乳動物のプロテアーゼによる切断により、ＸＴＥＮ配列からＧＬＰ−２配列が放出され、放出されたＧＬＰ−２配列が、切断されていない融合タンパク質と比較して少なくとも約３０％の受容体結合活性の増大を示す、前記項目のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 項目４３．１つまたは複数の延長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）と融合したＧＬＰ−２を含む融合タンパク質を作製する方法であって、 （ａ）項目１から項目４１のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする組換え核酸を含む宿主細胞を提供するステップと、 （ｂ）宿主細胞を、融合タンパク質の発現を可能にする条件下で培養するステップと、 （ｃ）融合タンパク質を回収するステップとを含む、方法。 項目４４．（ａ）宿主細胞が原核細胞である、または （ｂ）融合タンパク質を、宿主細胞の細胞質から実質的に可溶性の形態で回収する、項目４３に記載の方法。 項目４５．組換え核酸分子が、最適にアラインメントした時に、表１３に記載のＤＮＡ配列からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する配列、またはその相補物を有する、項目４３に記載の方法。 項目４６．（ａ）表１３から選択されるＤＮＡ配列に対して少なくとも７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する核酸配列、またはその相補物、または （ｂ）項目１から項目４１のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはその相補物。を含む単離された核酸。 項目４７．項目４３から項目４６のいずれか一項に記載の核酸を含む発現ベクターまたは単離された宿主細胞。 項目４８．項目４７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。 項目４９．項目１から項目４１のいずれか一項に記載の融合タンパク質、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。 項目５０．式Ｖ：（ａ）（ＧＬＰ−２）−（Ｓ）ｘ−（ＸＴＥＮ）（Ｖ）に従って構成された、項目１に記載の組換え融合タンパク質（式中、各出現に対してそれぞれ独立に、（ｂ）ＧＬＰ−２は、最適にアラインメントした時に、表１の配列からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する配列であり、（ｃ）Ｓは、場合によって表６の切断配列または制限部位と適合するアミノ酸を含んでよい、１〜約５０アミノ酸残基を有するスペーサー配列であり、（ｄ）ｘは０または１のいずれかである）。 項目５１．ＧＬＰ−２がヒトＧＬＰ−２を含む、項目５０に記載の組換え融合タンパク質。 項目５２．ＧＬＰ−２が、ウシＧＬＰ−２、ブタＧＬＰ−２、ヒツジＧＬＰ−２、ニワトリＧＬＰ−２、およびイヌＧＬＰ−２からなる群より選択される、項目５０に記載の組換え融合タンパク質。 項目５３．ＧＬＰ−２がＡｌａ２の代わりにアミノ酸置換を有し、置換がグリシンである、項目５１または項目５２に記載の組換え融合タンパク質。 項目５４．ＧＬＰ−２が配列ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤを有する、項目５０に記載の組換え融合タンパク質。 項目５５．グリシン残基であるスペーサー配列を含む、項目５０から項目５４のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 項目５６．ＸＴＥＮが、最適にアラインメントした時に、表４、表８、表９、表１０、表１１、および表１２のいずれか１つから選択される同等の長さの配列と比較して少なくとも９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する、項目５０から項目５５のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 項目５７．ＸＴＥＮが、最適にアラインメントした時に、表４のＡＥ８６４配列と比較して少なくとも９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する、項目５０から項目５５のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 項目５８．胃腸の状態を有する被験体に治療有効量の医薬組成物を投与することにより、融合タンパク質の血中濃度が、被験体に同等量を投与した、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較して少なくとも３倍長く融合タンパク質の治療域内で維持される、項目４９に記載の医薬組成物。 項目５９．胃腸の状態を有する被験体に、医薬組成物を治療有効用量レジメンを用いて３回以上投与することにより、融合タンパク質の血中レベルについての少なくとも２つの連続したＣｍａｘピークおよび／またはＣｍｉｎトラフ間の時間が、同等の用量レジメンを用いて被験体に投与した、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較して少なくとも４倍増大する、項目４９に記載の医薬組成物。 項目６０．胃腸の状態が、胃炎、消化障害、吸収不良症候群、短消化管症候群、短腸症候群、盲管症候群、炎症性腸疾患、小児脂肪便症、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症性スプルー、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸炎、化学療法誘導性腸炎、過敏性腸症候群、小腸損傷、癌化学療法に起因する小腸損傷、胃腸傷害、下痢性疾患、腸管機能不全症、酸誘導性腸管傷害、アルギニン欠乏症、特発性精液減少症、肥満症、異化疾病、発熱性好中球減少症、糖尿病、肥満症、脂肪便、自己免疫疾患、食物アレルギー、低血糖症、胃腸関門障害、敗血症、細菌性腹膜炎、熱傷誘導性腸管損傷、胃腸運動の低下、腸管不全症、化学療法に付随する菌血症、腸管外傷、腸管虚血、腸間膜虚血、栄養失調、壊死性腸炎、壊死性膵炎、新生児哺乳不耐性、ＮＳＡＩＤ誘導性胃腸損傷、栄養不足、胃腸管に対する完全非経口栄養による損傷、新生児栄養不足、放射線誘導性腸炎、放射線によって誘導される腸への傷害、粘膜炎、回腸嚢炎、および胃腸虚血からなる群より選択される、項目５９または項目６０に記載の医薬組成物。 項目６１．少なくとも約５ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約２５ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約２００ｎｍｏｌ／ｋｇの融合タンパク質を含む医薬組成物を被験体に静脈内投与、皮下投与、または筋肉内投与した後、融合タンパク質の血中レベルが少なくとも７２時間にわたって１０００ｎｇ／ｍｌ超で維持される、項目４９に記載の医薬組成物。 項目６２．被験体がマウス、ラット、サルおよびヒトから選択される、項目６１に記載の医薬組成物。 項目６３．胃腸の状態を処置するための医薬品の製造において使用するための、項目１から項目４１のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 項目６４．胃腸の状態が、胃炎、消化障害、吸収不良症候群、短消化管症候群、短腸症候群、盲管症候群、炎症性腸疾患、小児脂肪便症、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症性スプルー、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸炎、化学療法誘導性腸炎、過敏性腸症候群、小腸損傷、癌化学療法に起因する小腸損傷、胃腸傷害、下痢性疾患、腸管機能不全症、酸誘導性腸管傷害、アルギニン欠乏症、特発性精液減少症、肥満症、異化疾病、発熱性好中球減少症、糖尿病、肥満症、脂肪便、自己免疫疾患、食物アレルギー、低血糖症、胃腸関門障害、敗血症、細菌性腹膜炎、熱傷誘導性腸管損傷、胃腸運動の低下、腸管不全症、化学療法に付随する菌血症、腸管外傷、腸管虚血、腸間膜虚血、栄養失調、壊死性腸炎、壊死性膵炎、新生児哺乳不耐性、ＮＳＡＩＤ誘導性胃腸損傷、栄養不足、胃腸管に対する完全非経口栄養による損傷、新生児栄養不足、放射線誘導性腸炎、放射線によって誘導される腸への傷害、粘膜炎、回腸嚢炎、虚血、および脳卒中からなる群より選択される、項目６３に記載の組換え融合タンパク質。 項目６５．被験体に治療有効量の融合タンパク質を投与することを含む、被験体における胃腸の状態を処置する方法において使用するための、項目１から項目４１のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 項目６６．胃腸の状態が、胃炎、消化障害、吸収不良症候群、短消化管症候群、短腸症候群、盲管症候群、炎症性腸疾患、小児脂肪便症、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症性スプルー、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸炎、化学療法誘導性腸炎、過敏性腸症候群、小腸損傷、癌化学療法に起因する小腸損傷、胃腸傷害、下痢性疾患、腸管機能不全症、酸誘導性腸管傷害、アルギニン欠乏症、特発性精液減少症、肥満症、異化疾病、発熱性好中球減少症、糖尿病、肥満症、脂肪便、自己免疫疾患、食物アレルギー、低血糖症、胃腸関門障害、敗血症、細菌性腹膜炎、熱傷誘導性腸管損傷、胃腸運動の低下、腸管不全症、化学療法に付随する菌血症、腸管外傷、腸管虚血、腸間膜虚血、栄養失調、壊死性腸炎、壊死性膵炎、新生児哺乳不耐性、ＮＳＡＩＤ誘導性胃腸損傷、栄養不足、胃腸管に対する完全非経口栄養による損傷、新生児栄養不足、放射線誘導性腸炎、放射線によって誘導される腸への傷害、粘膜炎、回腸嚢炎、虚血、および脳卒中からなる群より選択される、項目６５に記載の使用のための組換え融合タンパク質。 項目６７．被験体に、治療有効用量レジメンを用いて２回またはそれより多くの連続用量の融合タンパク質を投与することにより、ＧＬＰ−２に対して確立された治療有効用量レジメンを用いて投与した、ＸＴＥＮが欠如している対応するＧＬＰ−２と比較して融合タンパク質の血中レベルについての連続したＣｍａｘピークおよび／またはＣｍｉｎトラフの間の時間が延長される、項目６５に記載の使用のための組換え融合タンパク質。 項目６８．ＸＴＥＮが欠如している対応するＧＬＰ−２をその他の点では等価な用量レジメンの下で被験体に投与することと比較して、ｎｍｏｌ／ｋｇ単位でより少量の融合タンパク質を被験体に投与し、融合タンパク質によりＸＴＥＮが欠如している対応するＧＬＰ−２と同等の治療効果が達成される、項目６５に記載の使用のための組換え融合タンパク質。 項目６９．治療効果が、ＧＬＰ−２の血中濃度、腸間膜血流の増大、炎症の減少、体重増加の増大、下痢の減少、糞便の湿重量の減少、腸の創傷治癒、血漿シトルリン濃度の上昇、ＣＲＰレベルの低下、ステロイド療法の必要性の減少、粘膜完全性の増強または刺激、ナトリウム損失の減少、腸内への細菌のトランスロケーションの最小化、緩和、または予防、外科手術後の腸の回復の増強、刺激または加速、炎症性腸疾患の再発の予防、およびエネルギー恒常性の維持からなる群より選択される、項目６８に記載の使用のための組換え融合タンパク質。 項目７０．被験体における胃腸の状態を処置するための、項目１から項目４１のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物を含む医薬レジメンにおいて使用するための組換え融合タンパク質。 項目７１．医薬レジメンが、被験体における治療効果を達成するために必要な医薬組成物の量を決定するステップをさらに含み、治療効果が、腸間膜血流の増大、炎症の減少、体重増加の増大、下痢の減少、糞便の湿重量の減少、腸の創傷治癒、血漿シトルリン濃度の上昇、ＣＲＰレベルの低下、ステロイド療法の必要性の減少、粘膜完全性の増強、ナトリウム損失の減少、腸内への細菌のトランスロケーションの予防、外科手術後の腸の回復の加速、炎症性腸疾患の再発の予防、およびエネルギー恒常性の維持からなる群より選択される、項目７０に記載の組換え融合タンパク質。 項目７２．胃腸の状態が、胃炎、消化障害、吸収不良症候群、短消化管症候群、短腸症候群、盲管症候群、炎症性腸疾患、小児脂肪便症、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症性スプルー、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸炎、化学療法誘導性腸炎、過敏性腸症候群、小腸損傷、癌化学療法に起因する小腸損傷、胃腸傷害、下痢性疾患、腸管機能不全症、酸誘導性腸管傷害、アルギニン欠乏症、特発性精液減少症、肥満症、異化疾病、発熱性好中球減少症、糖尿病、肥満症、脂肪便、自己免疫疾患、食物アレルギー、低血糖症、胃腸関門障害、敗血症、細菌性腹膜炎、熱傷誘導性腸管損傷、胃腸運動の低下、腸管不全症、化学療法に付随する菌血症、腸管外傷、腸管虚血、腸間膜虚血、栄養失調、壊死性腸炎、壊死性膵炎、新生児哺乳不耐性、ＮＳＡＩＤ誘導性胃腸損傷、栄養不足、胃腸管に対する完全非経口栄養による損傷、新生児栄養不足、放射線誘導性腸炎、放射線によって誘導される腸への傷害、粘膜炎、回腸嚢炎、虚血、および脳卒中からなる群より選択される、項目７０に記載の組換え融合タンパク質。 項目７３．胃腸の状態を有する被験体を処置するための医薬レジメンが、医薬組成物を被験体に２回以上有効量で投与することを含み、投与により、同等のｎｍｏｌ／ｋｇ量を使用して投与した、ＸＴＥＮと連結していないＧＬＰ−２と比較して、胃腸の状態に関連する少なくとも１つ、２つ、または３つのパラメータが少なくとも５％、または１０％、または２０％、または３０％、または４０％、または５０％、または６０％、または７０％、または８０％、または９０％大きく改善される、項目７０に記載の組換え融合タンパク質。 項目７４．改善されるパラメータがＧＬＰ−２の血中濃度の上昇、腸間膜血流の増大、炎症の減少、体重増加の増大、下痢の減少、糞便の湿重量の減少、腸の創傷治癒、血漿シトルリン濃度の上昇、ＣＲＰレベルの低下、ステロイド療法の必要性の減少、粘膜完全性の増強、ナトリウム損失の減少、腸内への細菌のトランスロケーションの予防、外科手術後の腸の回復の加速、炎症性腸疾患の再発の予防、およびエネルギー恒常性の維持から選択される、項目７３に記載の組換え融合タンパク質。 項目７５．レジメンが、治療有効量の項目４９に記載の医薬組成物を７日、または１０日、または１４日、または２１日、または２８日またはそれより多い日数ごとに１回投与することを含む、項目７０に記載の組換え融合タンパク質。 項目７６．有効量が少なくとも約５ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約２５ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約２００ｎｍｏｌ／ｋｇである、項目７５に記載の組換え融合タンパク質。 項目７７．前記投与が皮下投与、筋肉内投与、または静脈内投与である、項目７３から項目７６のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 項目７８．被験体における胃腸の状態を処置する方法であって、前記被験体に、項目４９に記載の医薬組成物を有効量で含む組成物を投与することを含む、方法。 項目７９．有効量が少なくとも約５ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約２５ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約２００ｎｍｏｌ／ｋｇである、項目７８に記載の方法。 項目８０．融合タンパク質が前記被験体において約３０時間超の終末相半減期を示す、項目７９に記載の方法。 項目８１．胃腸の状態が、胃炎、消化障害、吸収不良症候群、短消化管症候群、短腸症候群、盲管症候群、炎症性腸疾患、小児脂肪便症、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症性スプルー、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸炎、化学療法誘導性腸炎、過敏性腸症候群、小腸損傷、癌化学療法に起因する小腸損傷、胃腸傷害、下痢性疾患、腸管機能不全症、酸誘導性腸管傷害、アルギニン欠乏症、特発性精液減少症、肥満症、異化疾病、発熱性好中球減少症、糖尿病、肥満症、脂肪便、自己免疫疾患、食物アレルギー、低血糖症、胃腸関門障害、敗血症、細菌性腹膜炎、熱傷誘導性腸管損傷、胃腸運動の低下、腸管不全症、化学療法に付随する菌血症、腸管外傷、腸管虚血、腸間膜虚血、栄養失調、壊死性腸炎、壊死性膵炎、新生児哺乳不耐性、ＮＳＡＩＤ誘導性胃腸損傷、栄養不足、胃腸管に対する完全非経口栄養による損傷、新生児栄養不足、放射線誘導性腸炎、放射線によって誘導される腸への傷害、粘膜炎、回腸嚢炎、虚血、および脳卒中からなる群より選択される、項目７８から項目８０のいずれか一項に記載の方法。 項目８２．胃腸の状態がクローン病である、項目８１に記載の方法。 項目８３．被験体が、マウス、ラット、サル、およびヒトからなる群より選択される、項目７８から項目８２のいずれか一項に記載の方法。 項目８４．前記投与が皮下投与、筋肉内投与、または静脈内投与である、項目７８から項目８３のいずれか一項に記載の方法。 項目８５．前記投与により、前記被験体において腸栄養効果がもたらされる、項目７８から項目８４のいずれか一項に記載の方法。 項目８６．腸栄養効果が、同等の用量を用いて被験体に投与した、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較して少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％または少なくとも約１２０％または少なくとも約１５０％または少なくとも約２００％の腸栄養効果である、項目８５に記載の方法。 項目８７．１用量、または３用量、または６用量、または１０用量、または１２用量またはそれより多くの用量の融合タンパク質を投与した後に腸栄養効果を決定する、項目８５または項目８６に記載の方法。 項目８８．腸栄養効果が、腸の成長、絨毛上皮の肥厚の増大、陰窩の細胞の増殖の増大、陰窩および絨毛軸の高さの増大、腸吻合後の治癒の増大、小腸の重量の増大、小腸の長さの増大、小腸上皮アポトーシスの減少、および腸機能の増強からなる群より選択される、項目８５から項目８７のいずれか一項に記載の方法。 具体的には、組換えＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、本明細書に開示されている性質の１つまたは複数、またはその任意の組合せを示し得ることが意図されている。 参照による組み込み 本明細書において言及されている全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が、具体的にかつ個々に参照により組み込まれることが示されたのと同じ程度に参照により本明細書に組み込まれる。 例示的な実施形態が記載されている以下の発明の詳細な説明および添付図を参照することにより、本発明の特徴および利点をさらに説明することができる。図１は、アルゴリズムＳｅｇＳｃｏｒｅの論理的フローチャートの概略図である。この図では、以下の説明が適用される：ｉ、ｊ−配列全体にわたって実行される制御ループに使用されるカウンターである；ＨｉｔＣｏｕｎｔ−この変数は、部分配列がブロック内で同一の部分配列と何回遭遇するかを記録するカウンターである；ＳｕｂＳｅｑＸ−この変数は、重複性が確認された部分配列を保持する；ＳｕｂＳｅｑＹ−この変数は、ＳｕｂＳｅｑＸが再度確認された部分配列を保持する；ＢｌｏｃｋＬｅｎ−この変数は、使用者により決定されたブロックの長さを保持する；ＳｅｇＬｅｎ−この変数は、セグメントの長さを保持する。プログラムは、長さ３、４、５、６、７、８、９、および１０の部分配列に対してスコアが生じるようにハードコードされている；Ｂｌｏｃｋ−この変数は、長さＢｌｏｃｋＬｅｎの文字列を保持する。この文字列はインプットＸＴＥＮ配列からの文字で構成され、ｉカウンターの位置によって決定される；ＳｕｂＳｅｑＬｉｓｔ−これは、生じた部分配列スコアの全てを保持する一覧である。図２は、反復性を決定するための１１アミノ酸の仮定ＸＴＥＮへのアルゴリズムＳｅｇＳｃｏｒｅの適用を示す図である。Ｎアミノ酸からなるＸＴＥＮ配列を長さＳ（この場合Ｓ＝３）のＮ−Ｓ＋１部分配列に分ける。全ての部分配列のペアワイズ比較を実施し、同一の部分配列の平均数を算出し、その結果、この場合、部分配列スコア１．８９が生じる。図３は短縮ＸＴＥＮ配列を作製するためのドナーＸＴＥＮ配列の使用を例示する図である。図３ＡではＡＧ８６４の配列が提供され、ＡＧ５７６配列を生成するために使用した配列に下線が引かれている。図３は短縮ＸＴＥＮ配列を作製するためのドナーＸＴＥＮ配列の使用を例示する図である。図３ＢではＡＧ８６４の配列が提供され、ＡＧ２８８配列を生成するために使用した配列に下線が引かれている。図３は短縮ＸＴＥＮ配列を作製するためのドナーＸＴＥＮ配列の使用を例示する図である。図３ＣではＡＧ８６４の配列が提供され、ＡＧ１４４配列を生成するために使用した配列に下線が引かれている。図３は短縮ＸＴＥＮ配列を作製するためのドナーＸＴＥＮ配列の使用を例示する図である。図３ＤではＡＥ８６４の配列が提供され、ＡＥ５７６配列を生成するために使用した配列に下線が引かれている。図３は短縮ＸＴＥＮ配列を作製するためのドナーＸＴＥＮ配列の使用を例示する図である。図３ＥではＡＥ８６４の配列が提供され、ＡＥ２８８配列を生成するために使用した配列に下線が引かれている。図４は、ＸＴＥＮの組立て、作製および評価における代表的なステップの概略フローチャートである。図５は、融合タンパク質をコードするＧＬＰ２−ＸＴＥＮポリヌクレオチド構築物の組立てにおける代表的なステップの概略フローチャートである。個々のオリゴヌクレオチド５０１をアニーリングして１２アミノ酸モチーフ（「１２−ｍｅｒ」）などの配列モチーフ５０２にし、それを、ライブラリー由来の追加的な配列モチーフとライゲーションして、所望の長さのＸＴＥＮ５０４を包含するプールを創出するとともに、より低濃度の、ＢｂｓＩ制限部位、およびＫｐｎＩ制限部位を含有するオリゴ５０３にライゲーションする。生じたライゲーション産物のプールをゲル精製し、ＸＴＥＮの所望の長さのバンドをカットし、ストッパー配列５０５を有する単離されたＸＴＥＮ遺伝子をもたらす。ＸＴＥＮ遺伝子をスタッファーベクターにクローニングする。この場合、ベクターは、任意選択のＣＢＤ配列５０６およびＧＦＰ遺伝子５０８をコードする。次いで、ＢｂｓＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いた消化を行って、５０７および５０８を除去し、終止コドンを置く。次いで、生じた産物を、ＢｓａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化した、ＧＬＰ−２をコードする遺伝子を含有するベクターにクローニングし、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質をコードする遺伝子５００をもたらす。図６は、ＧＬＰ−２およびＸＴＥＮを含む融合タンパク質をコードする遺伝子の組立て、その融合タンパク質としての発現および回収、ならびにその候補ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ産物としての評価における代表的なステップの概略フローチャートである。図７は、例示的なＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質の概略図であり（図７Ａ〜Ｈ）、全てＮ末端からＣ末端への方向で示されている。図７Ａは、それぞれが単一のＧＬＰ−２およびＸＴＥＮを含むＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質（１００）の２つの異なる配置を示し、第１の配置ではＸＴＥＮ分子（１０２）がＧＬＰ−２（１０３）のＣ末端に付着しており、第２の配置ではＸＴＥＮ分子がＧＬＰ−２（１０３）のＮ末端に付着している。図７Ｂは、それぞれが単一のＧＬＰ−２、スペーサー配列およびＸＴＥＮを含むＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質（１００）の２つの異なる配置を示し、第１の配置ではＸＴＥＮ分子（１０２）がスペーサー配列（１０４）のＣ末端に付着しており、スペーサー配列がＧＬＰ−２（１０３）のＣ末端に付着しており、第２の配置ではＸＴＥＮ分子がスペーサー配列（１０４）のＮ末端に付着しており、スペーサー配列がＧＬＰ−２（１０３）のＮ末端に付着している。図７Ｃは、それぞれが単一のＧＬＰ−２の２つの分子およびＸＴＥＮの１つの分子を含むＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質（１０１）の２つの異なる配置を示し、第１の配置ではＸＴＥＮが第１のＧＬＰ−２のＣ末端と連結しており、そのＧＬＰ−２は第２のＧＬＰ−２のＣ末端と連結しており、第２の配置は方向が逆であり、ＸＴＥＮが第１のＧＬＰ−２のＮ末端と連結しており、そのＧＬＰ−２は第２のＧＬＰ−２のＮ末端と連結している。図７Ｄは、それぞれが単一のＧＬＰ−２の２つの分子、スペーサー配列およびＸＴＥＮの１つの分子を含むＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質（１０１）の２つの異なる配置を示し、第１の配置ではＸＴＥＮがスペーサー配列のＣ末端と連結しており、スペーサー配列が第２のＧＬＰ−２のＣ末端と連結した第１のＧＬＰ−２のＣ末端と連結しており、第２の配置は方向が逆であり、ＸＴＥＮがスペーサー配列のＮ末端と連結しており、スペーサー配列が第１のＧＬＰ−２のＮ末端と連結しており、そのＧＬＰ−２は第２のＧＬＰ−２のＮ末端と連結している。図７Ｅはそれぞれが単一のＧＬＰ−２の２つの分子、スペーサー配列およびＸＴＥＮの１つの分子を含むＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質（１０１）の２つの異なる配置を示し、第１の配置ではＸＴＥＮが第１のＧＬＰ−２のＣ末端と連結しており、第１のＧＬＰ−２が第２のＧＬＰ−２分子のＣ末端と連結したスペーサー配列のＣ末端と連結しており、第２の配置では配置が逆であり、ＸＴＥＮがスペーサー配列のＮ末端と連結した第１のＧＬＰ−２のＮ末端に連結しており、今度はそれがＧＬＰ−２の第２の分子のＮ末端と連結している。図７Ｆは、それぞれがＧＬＰ−２の１つの分子およびＧＬＰ−２のＮ末端およびＣ末端と連結したＸＴＥＮの２つの分子を含むＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質（１０５）の配置を示す。図７Ｇは、２つのＸＴＥＮと連結した単一のＧＬＰ−２の配置（１０６）を示し、第２のＸＴＥＮはスペーサー配列によってＧＬＰ−２と隔てられている。図７Ｈは、２つのＸＴＥＮと連結した２つのＧＬＰ−２の配置（１０６）を示し、第２のＸＴＥＮは、第１のＧＬＰ−２のＣ末端、および、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮのＣ末端にある第２のＧＬＰ−２のＮ末端と連結している。図８は、図７の対応するＧＬＰ２−ＸＴＥＮポリペプチドをコードするＧＬＰ２−ＸＴＥＮ遺伝子の例示的なポリヌクレオチド構築物の概略図であり（図８Ａ〜Ｈ）、全て５’から３’への方向で示されている。これらの例示的な実施例では、遺伝子は、１つのＧＬＰ−２およびＸＴＥＮ（２００）；または１つのＧＬＰ−２、１つのスペーサー配列および１つのＸＴＥＮ（２００）；２つのＧＬＰ−２および１つのＸＴＥＮ（２０１）；または２つのＧＬＰ−２、スペーサー配列および１つのＸＴＥＮ（２０１）；１つのＧＬＰ−２および２つのＸＴＥＮ（２０５）；または２つのＧＬＰ−２および２つのＸＴＥＮ（２０６）を有するＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質をコードする。これらの描写では、ポリヌクレオチドは以下の構成成分：ＸＴＥＮ（２０２）、ＧＬＰ−２（２０３）、および切断配列（２０４）を含んでよいスペーサーアミノ酸をコードし、全ての配列がインフレームで連結している。図９は、プロセシング戦略が異なるＧＬＰ２−ＸＴＥＮ発現ベクターの設計の概略図である。図９Ａは、ＧＬＰ−２をコードする配列の３’末端と融合したＸＴＥＮをコードする例示的な発現ベクターを示す。このベクター内に追加的なリーダー配列は必要ないことに留意されたい。図９Ｂは、ＣＢＤリーダー配列およびＴＥＶプロテアーゼ部位を有する、ＧＬＰ−２をコードする配列の３’末端と融合したＸＴＥＮをコードする発現ベクターを示す。図９Ｃは、ＣＢＤおよびＴＥＶプロセシング部位が最適化されたＮ末端リーダー配列（ＮＴＳ）と置き換えられた発現ベクターを示す。図９Ｄは、ＮＴＳ配列、ＸＴＥＮ、ＧＬＰ−２をコードする配列、次にＸＴＥＮをコードする第２の配列をコードする発現ベクターを示す。図１０は、ＸＴＥＮをコードする遺伝子のコンビナトリアル遺伝子組立てプロセスを例示する図である。この場合、遺伝子は６つの基本断片から組み立てられ、各断片は、４つの異なるコドン型（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）で利用可能である。これにより、１２アミノ酸モチーフの組立てにおいて４０９６の理論的多様性が可能になる。図１１は、融合タンパク質ＧＬＰ２−２Ｇ＿ＡＥ８６４の特徴付けデータを示す図である。図１１Ａは、実施例１６に記載のＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４ロットＡＰ６９０のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。ゲルは、示されている通り、分子量標準物質および２μｇまたは１０μｇの標準品のレーンを示す。図１１Ｂは、６６７ｋＤａ、１６７ｋＤａ、４４ｋＤａ、１７ｋＤａ、および３．５ｋＤａの分子量標準物質と比較した、実施例１６に記載のＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４ロットＡＰ６９０のサイズ排除クロマトグラフィー分析の結果を示す。図１２は、実施例１６に記載のＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４ロットＡＰ６９０のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す図である。８３，１４２Ｄａに、全長のインタクトなＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮを示す主要なピークがあり、総タンパク質量の５％未満のｄｅｓ−Ｈｉｓ ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮを示す８３，００３Ｄａの追加的な副次的なピークが検出された。図１３は、実施例１７に記載のＧＬＰ−２受容体結合アッセイの結果を示すグラフである。図１４は、皮下（ＳＣ）投与後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の薬物動態の結果を示すグラフである。試料を融合タンパク質濃度について分析した。これは実施例１８に記載の通り抗ＸＴＥＮ／抗ＸＴＥＮサンドイッチＥＬＩＳＡおよび抗ＧＬＰ２／抗ＸＴＥＮサンドイッチＥＬＩＳＡの両方によって実施したものであり、両方のアッセイについての結果がプロットされている。図１５は、実施例１９に記載の通り抗ＸＴＥＮ／抗ＸＴＥＮサンドイッチＥＬＩＳＡおよび抗ＧＬＰ２／抗ＸＴＥＮサンドイッチＥＬＩＳＡの両方によって実施した、２つの異なる投与量レベルをＳＣ投与した後のＷｉｓｔａｒラットにおけるＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の薬物動態の結果を示すグラフであり、両方のアッセイについての結果がプロットされている。図１６は、雄のカニクイザルにおける、融合タンパク質を単一の投与量レベル（２ｍｇ／ｋｇ）で皮下投与（四角）または静脈内投与（三角形）した後のＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の薬物動態の結果を示すグラフである。試料を融合タンパク質濃度について分析し、これは実施例２０に記載の通り抗ＧＬＰ２／抗ＸＴＥＮ ＥＬＩＳＡによって実施した。図１７は、実施例２０に記載の通りヒトにおける２４０時間の予測半減期を予測するために使用した３つの種のＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮの半減期のアロメトリックスケーリングの線形回帰を示すグラフである。図１８は、実施例２１に記載の、ビヒクル群および処置群のラットにおける小腸の重量および長さの結果を示すグラフである。図１９は、実施例２１に記載の、ビヒクル、ＧＬＰ２−２Ｇペプチド（ＸＴＥＮなし）またはＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮで処置した群を用いた、マウスデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）モデルにおける体重の変化の結果を示すグラフである。図２０は、実施例２１に記載の、ビヒクル回腸（図２０Ａ）および空腸（図２０Ｂ）ならびにＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ回腸（図２０Ｃ）および空腸（図２０Ｄ）からのＤＳＳモデルマウスの代表的な病理組織検査切片を示す写真である。図２１は、実施例２１に記載の、ビヒクル、ＧＬＰ２−２Ｇペプチド（ＸＴＥＮなし）またはＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮで処置した群を用い、アッセイしたインドメタシン誘導性小腸炎のクローン病のラットモデルの試験１の結果を示すグラフである。図２１Ａは、実験終了時の体重の結果を示す。図２１Ｂは、各群からの小腸の長さの結果を示す。図２１Ｃは、各群からの小腸の重量の結果を示す。図２１Ｄは、各群からの潰瘍の長さおよび小腸における潰瘍の百分率の結果を示す。図２１Ｅは、各群からの小腸における接着およびトランス潰瘍形成（ｔｒａｎｓｕｌｃｅｒａｔｉｏｎ）のスコアの結果を示す。図２１Ｆは、各群からの小腸の炎症の長さおよび百分率の結果を示す。図２１Ｇは、各群からの小腸のＴＮＦαアッセイの結果を示す。図２１は、実施例２１に記載の、ビヒクル、ＧＬＰ２−２Ｇペプチド（ＸＴＥＮなし）またはＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮで処置した群を用い、アッセイしたインドメタシン誘導性小腸炎のクローン病のラットモデルの試験１の結果を示すグラフである。図２１Ａは、実験終了時の体重の結果を示す。図２１Ｂは、各群からの小腸の長さの結果を示す。図２１Ｃは、各群からの小腸の重量の結果を示す。図２１Ｄは、各群からの潰瘍の長さおよび小腸における潰瘍の百分率の結果を示す。図２１Ｅは、各群からの小腸における接着およびトランス潰瘍形成（ｔｒａｎｓｕｌｃｅｒａｔｉｏｎ）のスコアの結果を示す。図２１Ｆは、各群からの小腸の炎症の長さおよび百分率の結果を示す。図２１Ｇは、各群からの小腸のＴＮＦαアッセイの結果を示す。図２１は、実施例２１に記載の、ビヒクル、ＧＬＰ２−２Ｇペプチド（ＸＴＥＮなし）またはＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮで処置した群を用い、アッセイしたインドメタシン誘導性小腸炎のクローン病のラットモデルの試験１の結果を示すグラフである。図２１Ａは、実験終了時の体重の結果を示す。図２１Ｂは、各群からの小腸の長さの結果を示す。図２１Ｃは、各群からの小腸の重量の結果を示す。図２１Ｄは、各群からの潰瘍の長さおよび小腸における潰瘍の百分率の結果を示す。図２１Ｅは、各群からの小腸における接着およびトランス潰瘍形成（ｔｒａｎｓｕｌｃｅｒａｔｉｏｎ）のスコアの結果を示す。図２１Ｆは、各群からの小腸の炎症の長さおよび百分率の結果を示す。図２１Ｇは、各群からの小腸のＴＮＦαアッセイの結果を示す。図２１は、実施例２１に記載の、ビヒクル、ＧＬＰ２−２Ｇペプチド（ＸＴＥＮなし）またはＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮで処置した群を用い、アッセイしたインドメタシン誘導性小腸炎のクローン病のラットモデルの試験１の結果を示すグラフである。図２１Ａは、実験終了時の体重の結果を示す。図２１Ｂは、各群からの小腸の長さの結果を示す。図２１Ｃは、各群からの小腸の重量の結果を示す。図２１Ｄは、各群からの潰瘍の長さおよび小腸における潰瘍の百分率の結果を示す。図２１Ｅは、各群からの小腸における接着およびトランス潰瘍形成（ｔｒａｎｓｕｌｃｅｒａｔｉｏｎ）のスコアの結果を示す。図２１Ｆは、各群からの小腸の炎症の長さおよび百分率の結果を示す。図２１Ｇは、各群からの小腸のＴＮＦαアッセイの結果を示す。図２２は、実施例２１に記載の、ビヒクル、ＧＬＰ２−２Ｇペプチド（ＸＴＥＮなし）またはＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮで処置した群を用い、アッセイしたインドメタシン誘導性小腸炎のクローン病のラットモデルの試験２の結果を示すグラフである。図２２Ａは、各群からの小腸のトランス潰瘍形成スコアを示す。図２２Ｂは、各群からの小腸の接着スコアを示す。図２３は、実施例２１に記載の、ビヒクル−インドメタシンなし処置群（図２３Ａ）、ビヒクル−インドメタシン処置群（図２３Ｂ）およびＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ処置群（図２２Ｃ、Ｄ）からのインドメタシン誘導性小腸炎のクローン病のラットモデルの試験２からの代表的な病理組織検査切片を示す写真である。図２４は、実施例２１に記載の、疾患にかかっているラット、ビヒクルで処置したラット、ＧＬＰ２−２Ｇペプチドで処置したラット、およびＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮで処置したラットからの、小腸の長さ（図２４Ａ）、絨毛の高さ（図２４Ｂ）および粘膜の萎縮、潰瘍形成、浸潤の測定値の病理組織検査スコアリング（図２４Ｃ）の結果を示すグラフである。アスタリスクは、ビヒクル（疾患にかかっている）対照群との統計的有意差がある群を示す。図２５は、実施例２５に記載の、分子量が既知のタンパク質標準物質と対照して測定したグルカゴン−ＸＴＥＮ構築物試料（示されている通り）のサイズ排除クロマトグラフィー分析の結果を示す、吸収対保持容量として出力されたグラフである。グルカゴン−ＸＴＥＮ構築物は、１）グルカゴン−Ｙ２８８；２）グルカゴンＹ−１４４；３）グルカゴン−Ｙ７２；および４）グルカゴン−Ｙ３６である。結果は、ＸＴＥＮ部分の長さが増大するのに伴って見かけの分子量が増大することを示す。図２６は、実施例２６に記載の、さまざまな長さの非構造化ポリペプチドと連結したＧＦＰの種々の組成物を皮下または静脈内のいずれかに単回投与した後のカニクイザルにおける薬物動態プロファイル（血漿中濃度）を示すグラフである。組成物は、ＧＦＰ−Ｌ２８８、ＧＦＰ−Ｌ５７６、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿ＡＦ５７６、ＧＦＰ−Ｙ５７６およびＸＴＥＮ＿ＡＤ８３６−ＧＦＰであった。注射後の種々の時間に血液試料を分析し、血漿中のＧＦＰの濃度を、捕捉用にＧＦＰに対するポリクローナル抗体、および検出用に同じポリクローナル抗体のビオチン化調製物を使用したＥＬＩＳＡによって測定した。結果は血漿中濃度対投薬後の時間（時間）として示されており、具体的には、ＸＴＥＮの配列の長さが最長の組成物であるＸＴＥＮ＿ＡＤ８３６−ＧＦＰについて半減期が相当に増大したことが示されている。配列の長さが最も短い構築物であるＧＦＰ−Ｌ２８８は半減期が最も短かった。図２７は、ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４がＧＦＰのＮ末端と融合した融合タンパク質の安定性試験の試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（実施例２７を参照されたい）を示す写真である。ＧＦＰ−ＸＴＥＮを、カニクイザル血漿およびラット腎臓溶解物中、３７℃で最大７日間インキュベートした。さらに、カニクイザルに投与したＧＦＰ−ＸＴＥＮも評価した。０日目、１日目および７日目に試料を取り出し、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって分析し、その後、ＧＦＰに対する抗体を用いたウェスタン分析を用いて検出した。図２８は、ＧＬＰ２−２Ｇ＿ＡＥ８６４のアミノ酸配列を示す図である。 本発明の実施形態を説明する前に、そのような実施形態は、単に例として提供されていること、および本明細書に記載の本発明の実施形態に対する種々の代替を、本発明の実施において使用することができることが理解されるべきである。当業者は、本発明から逸脱することなく多数の変形、変化および置換をすぐに思いつくであろう。 特に定義されていなければ、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または等価である方法および材料を本発明の実施または試験において用いることができるが、適切な方法および材料が下に記載されている。矛盾する場合は、定義を含めた特許明細書に支配される。さらに、材料、方法および実施例は単に例示的なものであり、それに限定されるものではない。当業者は、本発明から逸脱することなく多数の変形、変化および置換をすぐに思いつくであろう。 定義 本出願に関しては、以下の用語は特に指定のない限りそれらに帰する意味を有する。 本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」および「ｔｈｅ（その）」は、文脈によりそうでないことが明確に規定されない限り、複数の参照対象を包含する。例えば、「ａ（１つの）細胞」という用語は、それらの混合物を含めた複数の細胞を包含する。 「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖状であっても分岐状であってもよく、修飾されたアミノ酸を含んでよく、また、非アミノ酸が割り込んでいてよい。この用語は、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または標識用構成成分とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作によって修飾されたアミノ酸のポリマーも包含する。 本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、これだけに限定されないが、Ｄ型光学異性体またはＬ型光学異性体の両方、およびアミノ酸の類似体およびペプチド模倣薬を含めた、天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸もしくは合成アミノ酸のいずれかを指す。アミノ酸を示すために、標準の１文字または３文字のコードが使用される。 「天然Ｌ−アミノ酸」という用語は、グリシン（Ｇ）、プロリン（Ｐ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、セリン（Ｓ）、およびトレオニン（Ｔ）のＬ型光学異性体を意味する。 「天然に存在しない」という用語は、配列に適用される場合、および本明細書で使用される場合、哺乳動物に見いだされる野生型配列または天然に存在する配列に対する対応物を有さない、それと相補的でない、またはそれに対する相同性の程度が高くないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列を意味する。例えば、天然に存在しないポリペプチドまたは断片は、適切にアラインメントすると、天然の配列と比較して９９％以下、９８％以下、９５％以下、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下またはさらに低いアミノ酸配列同一性を共有し得る。 「親水性」および「疎水性」という用語は、物質が水に対して有する親和性の程度を指す。親水性の物質は水に対して強力な親和性を有し、水中に溶解する、水と混ざる、または水で湿る傾向があるが、疎水性の物質は水に対する親和性が実質的に欠如しており、水を寄せつけず、水を吸収しない傾向があり、また、水に溶解しない、または水と混ざらない、または水で湿らない傾向がある。アミノ酸は、それらの疎水性に基づいて特徴付けることができる。いくつもの尺度が開発されてきた。その例は、Ｌｅｖｉｔｔ， Ｍら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（１９７６年）１０４巻：５９頁によって開発された尺度であり、これはＨｏｐｐ， ＴＰら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ（１９８１年）７８巻：３８２４頁に列挙されている。「親水性アミノ酸」の例は、アルギニン、リシン、トレオニン、アラニン、アスパラギン、およびグルタミンである。特に興味深いのは、親水性アミノ酸であるアスパラギン酸、グルタミン酸、およびセリン、およびグリシンである。「疎水性アミノ酸」の例は、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、およびバリンである。 「断片」とは、タンパク質に適用される場合、治療活性および／または生物学的活性の少なくとも一部分を保持する、ネイティブな生物学的に活性なタンパク質の短縮型である。「変異体」とは、タンパク質に適用される場合、生物学的に活性なタンパク質の治療活性および／または生物学的活性の少なくとも一部分を保持する、ネイティブな生物学的に活性なタンパク質に対して配列相同性を有するタンパク質である。例えば、変異体タンパク質は、参照の生物学的に活性なタンパク質と比較して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を共有してよい。本明細書で使用される場合、「生物学的に活性なタンパク質部分」という用語は、例えば部位特異的突然変異誘発、コードする遺伝子の合成、挿入によって意図的に、または、突然変異を通じて偶発的に修飾されたタンパク質を包含する。 「配列変異体」という用語は、それらのネイティブな配列または元の配列と比較して、１つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失、または置換によって修飾されたポリペプチドを意味する。挿入は、タンパク質のどちらかの末端または両方の末端に位置してよく、かつ／またはアミノ酸配列の内部領域内に位置づけられていてよい。非限定的な例は、生物学的に活性なペイロードタンパク質の配列へのＸＴＥＮ配列の挿入である。欠失変異体では、本明細書に記載のポリペプチドの１つまたは複数のアミノ酸残基が除去される。したがって、欠失変異体はペイロードポリペプチド配列の全ての断片を含む。置換変異体では、ポリペプチドの１つまたは複数のアミノ酸残基が除去され、代替の残基と置き換えられる。一態様では、置換は天然に保存されており、この種類の保存された置換は当技術分野で周知である。 本明細書で使用される場合、「内部ＸＴＥＮ」とは、ＧＬＰ−２の配列に挿入されたＸＴＥＮ配列を指す。内部ＸＴＥＮは、２つの近接するアミノ酸の間に挿入することによってＸＴＥＮ配列をＧＬＰ−２の配列に挿入することによって、またはＸＴＥＮが、ＧＬＰ−２の部分的な内部の配列と置き換わる場合に構築することができる。 本明細書で使用される場合、「末端ＸＴＥＮ」とは、ＧＬＰ−２のＮ末端もしくはＣ末端に、もしくはその中に、またはＧＬＰ−２のＮ末端もしくはＣ末端においてタンパク質切断配列に融合したＸＴＥＮ配列を指す。末端ＸＴＥＮはＧＬＰ−２のネイティブな末端に融合することができる。あるいは、末端ＸＴＥＮでＧＬＰ−２の末端配列を置き換えることができる。 「ＸＴＥＮ放出部位」という用語は、哺乳動物のプロテアーゼが認識し、切断することができ、それによりＸＴＥＮまたはＸＴＥＮの一部がＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質から放出される、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質内の切断配列を指す。本明細書で使用される場合、「哺乳動物のプロテアーゼ」とは、哺乳動物の体液、細胞または組織に通常存在するプロテアーゼを意味する。ＸＴＥＮ放出部位は、種々の哺乳動物のプロテアーゼ（「ＸＴＥＮ放出プロテアーゼ」としても公知である）、例えば、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、カリクレイン、ＦＶＩＩＩａ、ＦＶＩＩＩａ、ＦＸａ、ＦＩＩａ（トロンビン）、エラスターゼ−２、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ−１７、ＭＭＰ−２０など、または被験体において融合タンパク質に近接して存在する任意のプロテアーゼによって切断されるように工学的に操作することができる。定義済みの切断部位を認識することができる他の同等のプロテアーゼ（内在性または外因性）を利用することができる。切断部位は、利用されるプロテアーゼに対して調節し、それに合わせて調整することができる。 「内部に（ｗｉｔｈｉｎ）」という用語は、第２のポリペプチドと連結した第１のポリペプチドについて言及する場合、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドのＮ末端を、それぞれ第２のポリペプチドまたは第１のポリペプチドのＣ末端と接続する連結、ならびに第２のポリペプチドの配列内への第１のポリペプチドの挿入を包含する。例えば、ＸＴＥＮがＧＬＰ−２ポリペプチドの「内部に（ｗｉｔｈｉｎ）」連結している場合、ＸＴＥＮは、ＧＬＰ−２ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端と連結していてもよく、任意の２つのアミノ酸の間に挿入されていてもよい。 本発明の目的に関して「活性」とは、融合タンパク質の構成成分の、対応するネイティブな生物学的に活性な融合タンパク質のタンパク質構成成分と一致する作用または効果を指し、「生物学的活性」とは、これだけに限定されないが、受容体結合性、アンタゴニスト活性、アゴニスト活性、細胞応答または生理的応答、またはペイロードＧＬＰ−２に関して当技術分野で公知の効果を含めた、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける生物学的機能または効果を指す。 本明細書で使用される場合、「ＥＬＩＳＡ」という用語は、本明細書に記載の、または別なふうに当技術分野で公知の酵素結合免疫吸着検定法を指す。 「宿主細胞」とは、対象ベクターに対するレシピエントになり得る、またはレシピエントになっている個々の細胞または細胞培養物を包含する。宿主細胞とは、単一の宿主細胞の後代を包含する。後代は、天然の、偶発的な、または意図的な突然変異に起因して、必ずしも元の親細胞と完全に同一であるとは限らない可能性がある（総ＤＮＡ相補配列の形態またはゲノムにおいて）。宿主細胞としては、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて本発明のベクターでトランスフェクトされた細胞を包含する。 「単離された」とは、本明細書に開示されている種々のポリペプチドを説明するために使用される場合、同定され、その天然の環境の構成成分から分離および／または回収されたポリペプチドを意味する。その天然の環境の混入構成成分は、一般には、ポリペプチドの診断または治療への使用に干渉する材料であり、それらとしては、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質を挙げることができる。当業者には明らかである通り、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片は、「単離」してその天然に存在する対応物と区別することを必要としない。さらに、「濃縮された」、「分離された」または「希釈された」ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片は、体積当たりの濃度または分子の数が一般にその天然に存在する対応物よりも大きいという点で、その天然に存在する対応物から区別可能である。一般に、組換え手段によって作出し、宿主細胞において発現させることができるポリペプチドは、「単離された」と考えられる。 「単離された」核酸とは、同定され、通常核酸の天然の供給源中に付随する少なくとも１つの混入核酸分子から分離された核酸分子である。例えば、単離されたポリペプチドコード核酸分子は、それが天然に見いだされる形態または状況にあるもの以外のものである。したがって、単離されたポリペプチドコード核酸分子は、天然の細胞に存在する場合と同様の特定のポリペプチドコード核酸分子とは区別される。しかし、単離されたポリペプチドコード核酸分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞とは異なる染色体内の場所または染色体外の場所にある場合、通常ポリペプチドを発現する細胞に含有されるポリペプチドコード核酸分子を包含する。 「キメラ」タンパク質とは、天然に存在するものとは異なる配列内の位置にある少なくとも１つの領域を含む少なくとも１つの融合ポリペプチドを含有する。領域は、通常は別々のタンパク質に存在し、融合ポリペプチドにおいて一緒にされてもよく、通常は同じタンパク質に存在するが、融合ポリペプチドにおいて新しい並びに置かれてもよい。キメラタンパク質は、例えば、化学合成によって、またはペプチド領域が所望の関係でコードされているポリヌクレオチドを創出し、翻訳することによって創出することができる。 「コンジュゲートした」、「連結した」「融合した」および「融合」は、本明細書では互換的に使用される。これらの用語は、２つ以上の化学元素、配列または構成成分を、化学的コンジュゲーションまたは組換え手段を含めた何らかの手段によってつなぎ合わせることを指す。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結している。一般に、「作動可能に連結した」とは、連結しているＤＮＡ配列が連続しており、読み取り相にあることまたはインフレームであることを意味する。「インフレームの融合」とは、２つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、元のＯＲＦの正しい読み枠が維持されるようにつないで、継続的なより長いＯＲＦを形成することを指す。したがって、生じた組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによりコードされるポリペプチドに対応する２つ以上のセグメントを含有する単一のタンパク質である（セグメントは天然では通常そのようにつながっていない）。 ポリペプチドに関しては、「直鎖状配列」または「配列」とは、ポリペプチド内のアミノ酸の、アミノ末端からカルボキシル末端方向への順序であり、配列内で互いに近隣する残基がポリペプチドの一次構造で連続している。「部分配列」とは、一方の方向または両方向に追加的な残基を含むことが公知のポリペプチドの一部の直鎖状配列である。 「異種性」とは、比較されている残りの実体とは遺伝子型が別個の実体に由来することを意味する。例えば、ネイティブなコード配列から取り出され、ネイティブな配列以外のコード配列に作動可能に連結したグリシンリッチ配列は、異種性グリシンリッチ配列である。「異種性」という用語は、ポリヌクレオチド、ポリペプチドに適用される場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、それが比較されている残りの実体とは遺伝子型が別個の実体に由来することを意味する。 「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は互換的に使用される。これらの用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのポリマーの形態のヌクレオチド、またはその類似体を指す。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造を有してよく、公知または未知の任意の機能を果たしてよい。以下は非限定的なポリヌクレオチドの例である：遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連鎖解析によって定義された複数の遺伝子座（単一の遺伝子座）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチドなどの修飾されたヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含んでよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーを組立てる前、またはその後に付与することができる。ヌクレオチドの配列には、非ヌクレオチド構成成分が割り込んでいてよい。ポリヌクレオチドは、重合後に、例えば、標識用構成成分とコンジュゲーションすることによってなどでさらに修飾することができる。 「ポリヌクレオチドの相補配列」という用語は、参照配列と比較して相補的な塩基配列および逆方向を有し、したがって、参照配列と完全な忠実度でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド分子を意味する。 「組換え」とは、ポリヌクレオチドに適用される場合、そのポリヌクレオチドが、クローニング、制限および／またはライゲーションステップを含んでよい組換えステップ、ならびに宿主細胞における組換えタンパク質の発現がもたらされる他の手順の種々の組合せの産物であることを意味する。 「遺伝子」および「遺伝子断片」という用語は、本明細書では互換的に使用される。これらの用語は、転写され、翻訳された後に特定のタンパク質をコードすることができる少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドを指す。遺伝子または遺伝子断片は、ポリヌクレオチドが 少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有する限りは、ゲノムＤＮＡであってもｃＤＮＡであってもよく、コード領域全体またはそのセグメントを包含してよい。「融合遺伝子」とは、連結した少なくとも２つの異種ポリヌクレオチドで構成される遺伝子である。 「相同性」または「相同な」または「配列同一性」とは、２つ以上のポリヌクレオチド配列間または２つ以上のポリペプチド配列間の配列類似性または互換性を指す。２つの異なるアミノ酸配列間の配列同一性、類似性または相同性を決定するためにＢｅｓｔＦｉｔなどのプログラムを使用する場合、初期設定を用いることもでき、適切なスコアリング行列、例えば、ｂｌｏｓｕｍ４５またはｂｌｏｓｕｍ８０などを選択して、同一性、類似性または相同性スコアを最適化することもできる。相同なポリヌクレオチドとは、本明細書で定義されているストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、その配列と比較して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％、およびなおより好ましくは９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドであることが好ましい。相同なポリペプチドの配列同一性は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、なおより好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５〜９９％、最も好ましくは１００％同一であることが好ましい。 「ライゲーション」とは、２つの核酸断片または遺伝子の間にリン酸ジエステル結合を形成し、それらを連結するプロセスを指す。ＤＮＡ断片または遺伝子をライゲーションするためには、ＤＮＡの末端が互いと適合しなければならない。いくつかの場合には、末端は、エンドヌクレアーゼ消化によって直接適合する。しかし、まず、一般にエンドヌクレアーゼ消化後に生じる付着末端を平滑末端に変換して、ライゲーションを調整することが必要な場合がある。 「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、ポリヌクレオチドが、他の配列よりも検出可能に大きな程度（例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍）でその標的配列とハイブリダイズする条件を指すことを包含する。一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、部分的に、洗浄ステップを行う温度および塩濃度に関して表される。一般には、ストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３で約１．５Ｍ未満のＮａイオン濃度、一般には、約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（または他の塩）であり、温度が、短いポリヌクレオチド（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、長いポリヌクレオチド（例えば、５０ヌクレオチド超）については少なくとも約６０℃である条件になる。例えば、「ストリンジェントな条件」は、５０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中、３７℃でのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣ／１％ＳＤＳ中、６０℃〜６５℃で各１５分３回の洗浄を含んでよい。あるいは、約６５℃、６０℃、５５℃、または４２℃の温度を用いることができる。ＳＳＣ濃度は約０．１〜２×ＳＳＣで変動してよく、ＳＤＳは約０．１％で存在する。そのような洗浄温度は、一般には、定義済みのイオン強度およびｐＨにおける特異的な配列の熱的融点よりも約５℃〜２０℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、標的配列の５０％が完全に一致するプローブとハイブリダイズする温度である（定義済みのイオン強度およびｐＨの下で）。核酸ハイブリダイゼーションのためのＴｍおよび条件を算出するための方程式は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．ら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１年に見いだすことができる。一般には、非特異的なハイブリダイゼーションを遮断するために遮断試薬を使用する。そのような遮断試薬としては、例えば、せん断し変性させたサケ精子ＤＮＡ、約１００〜２００μｇ／ｍｌが挙げられる。約３５〜５０％ｖ／ｖの濃度のホルムアミドなどの有機溶媒も、ＲＮＡ：ＤＮＡのハイブリダイゼーションなどの特定の状況下で使用することができる。これらの洗浄条件の有用な変形は当業者には容易に明らかになろう。 「パーセント同一性」、「配列同一性の百分率」、および「％同一性」という用語は、ポリヌクレオチド配列に適用される場合、標準化アルゴリズムを使用してアラインメントした少なくとも２つのポリヌクレオチド配列間の一致する残基の百分率を指す。そのようなアルゴリズムにより、２つの配列間のアラインメントを最適化し、したがって、２つの配列のより意味のある比較を実現するために、比較される配列内に、標準化され、再現性のあるやり方でギャップを挿入ことができる。パーセント同一性は、定義済みのポリヌクレオチド配列全体の長さにわたって測定することもでき、それよりも短い長さ、例えば、より大きな定義済みのポリヌクレオチド配列から取得した断片、例えば、少なくとも４５個、少なくとも６０個、少なくとも９０個、少なくとも１２０個、少なくとも１５０個、少なくとも２１０個または少なくとも４５０個の連続した残基の断片の長さにわたって測定することもできる。そのような長さは単に例示的なものであり、本明細書の表、図または配列表において示されている配列に支持される任意の断片長を用いて、百分率同一性を測定することができる長さを説明することができることが理解される。配列同一性の百分率は、２つの最適にアラインメントされた配列を比較のウィンドウにわたって比較し、一致する位置（両方のポリペプチド配列において同一の残基が出現する位置）の数を決定し、一致する位置の数を比較のウィンドウ内の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性の百分率をもたらすことによって算出する。長さが異なる配列を比較する場合、最も短い配列によって比較のウィンドウの長さが規定される。配列同一性を算出する際には保存された置換は考慮しない。 「パーセント（％）配列同一性」とは、本明細書において同定されるポリペプチド配列に関しては、配列をアラインメントし、必要であれば、最大のパーセント配列同一性を実現するためにギャップを導入し、また、いかなる保存された置換も配列同一性の一部として考えず、それにより、最適なアラインメントがもたらされた後の、第２の、参照ポリペプチド配列またはその部分のアミノ酸残基と同一である、クエリ配列内のアミノ酸残基の百分率と定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、当技術分野の技術の範囲内の種々のやり方で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することによって実現することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたる最適なアラインメントを実現するために必要な任意のアルゴリズムを含めた、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。パーセント同一性は、定義済みのポリペプチド配列全体の長さにわたって測定することもでき、それよりも短い長さ、例えば、より大きな、定義済みのポリペプチド配列から取得した断片、例えば、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも７０個または少なくとも１５０個の連続した残基の断片の長さにわたって測定することもできる。そのような長さは単に例示的なものであり、本明細書の表、図または配列表において示されている配列によって支持される任意の断片長を用いて、百分率同一性を測定することができる長さを説明することができることが理解される。 ポリヌクレオチド配列に関して使用される「反復性」とは、配列の内部の相同性の程度、例えば、所与の長さの同一のヌクレオチド配列の発生頻度などを指す。反復性は、例えば、同一の配列の頻度を分析することによって測定することができる。 「ベクター」とは、挿入核酸分子を宿主細胞内および／またはその間に運ぶ、適切な宿主において自己複製することが好ましい核酸分子である。この用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡの細胞への挿入に関して主に機能するベクター、ＤＮＡまたはＲＮＡの複製に関して主に機能するベクターの複製、およびＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳に関して機能する発現ベクターを包含する。上記の機能の２つ以上をもたらすベクターも包含される。「発現ベクター」とは、適切な宿主細胞に導入すると、ポリペプチド（複数可）に転写し、翻訳することができるポリヌクレオチドである。「発現系」とは、通常、所望の発現産物がもたらされるように機能することができる発現ベクターを含む適切な宿主細胞を含む。 「血清分解抵抗性」とは、ポリペプチドに適用される場合、一般には血清または血漿中のプロテアーゼを伴う血液またはその構成成分における分解に抵抗するポリペプチドの能力を指す。血清分解抵抗性は、タンパク質を、一般には、種々の日数（例えば、０．２５日、０．５日、１日、２日、４日、８日、１６日）にわたって、一般には約３７℃でヒト（または、必要に応じてマウス、ラット、サル）の血清または血漿と合わせることによって測定することができる。これらの時点での試料をウェスタンブロットアッセイにかけ、抗体を用いてタンパク質を検出することができる。抗体はタンパク質のタグになり得る。タンパク質がウェスタンにおいて単一のバンドを示す場合、タンパク質のサイズは注入したタンパク質のサイズと同一であり、したがって分解は生じていない。この典型的な方法では、ウェスタンブロットまたは同等の技法によって判断したところタンパク質の５０％が分解された時点が、タンパク質の血清分解半減期または「血清半減期」である。 「ｔ１／２」、「終末相半減期」、「排出半減期」および「循環半減期（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）」という用語は、本明細書では互換的に使用され、本明細書で使用される場合、ｌｎ（２）／Ｋｅｌとして算出される終末相半減期を意味する。Ｋｅｌは、対数濃度対時間曲線の終末直線部分の線形回帰によって算出される終末排出速度定数である。半減期とは、一般には、生きている生物体内に蓄積した投与された物質の分量の半分が正常な生物学的プロセスによって代謝または排除されるのに必要な時間を指す。 「活性なクリアランス」とは、タンパク質が、濾過による以外で循環から除去される機構を意味し、細胞、受容体、代謝、またはタンパク質の分解に媒介される循環からの除去を包含する。 「見かけの分子量率」および「見かけの分子量」とは、特定のアミノ酸またはポリペプチド配列によって示される見かけの分子量の相対的な増大または減少の基準に関する関連用語である。見かけの分子量は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）または同様の方法を用い、球状タンパク質標準物質と比較することによって決定され、「見かけのｋＤａ」単位で測定される。見かけの分子量率とは、見かけの分子量と実際の分子量の比であり、後者は、アミノ酸組成に基づいて、組成内のアミノ酸の各種類の算出された分子量を足すことによって、またはＳＤＳ電気泳動ゲルにおいて分子量標準物質に対する比較から推定することによって予測される。代表的なタンパク質の見かけの分子量および見かけの分子量率のどちらの決定についても実施例に記載されている。 「流体力学的半径」または「ストークス半径」という用語は、溶液中の分子が溶液を通じて体を移動し、溶液の粘度の抵抗を受けると仮定することによって測定される、その分子の有効な半径（Ｒｈ、ｎＭ）である。本発明の実施形態では、ＸＴＥＮ融合タンパク質の流体力学的半径は、より直観的な基準である「見かけの分子量率」と相関する。タンパク質の「流体力学的半径」は、水溶液中でのその拡散の速度ならびに巨大分子のゲル内を移動するその能力に影響を及ぼす。タンパク質の流体力学的半径は、その分子量によってだけでなく、形状および緻密さを含めたその構造によっても決定される。流体力学的半径を決定するための方法は当技術分野で周知であり、例えば、米国特許第６，４０６，６３２号および同第７，２９４，５１３号に記載の通り、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いることによる。大部分のタンパク質が、タンパク質が最小の流体力学的半径を有し得る最も緻密な三次元構造である球状構造を有する。いくつかのタンパク質は、無作為かつ開いた、非構造化、または「直鎖状の」コンフォメーションをとり、その結果として、同様の分子量の典型的な球状タンパク質と比較してはるかに大きな流体力学的半径を有する。 「生理的条件」とは、温度、塩濃度、ｐＨを含めた、生きている被験体の条件を模倣する、生きている宿主におけるこれらの一連の条件ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏにおける条件を指す。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて使用するための生理的に関連する条件の宿主が確立されている。一般に、生理的緩衝液は、生理的濃度の塩を含有し、約６．５から約７．８まで、好ましくは約７．０から約７．５までにわたる中性のｐＨに調整される。種々の生理的緩衝液がＳａｍｂｒｏｏｋら（２００１年）に列挙されている。生理的に関連する温度範囲は、約２５℃から約３８℃まで、好ましくは約３５℃から約３７℃までにわたる。 「反応性基」とは、第２の反応性基とカップリングすることができる化学構造である。反応性基の例は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、アジド基（ａｚｉｄｅ ｇｒｏｕｐ）である。いくつかの反応性基は、活性化して、第２の反応性基とのカップリングを容易にすることができる。活性化の非限定的な例はカルボキシル基とカルボジイミドの反応、カルボキシル基の活性化エステルへの変換、またはカルボキシル基のアジド官能基への変換である。 「制御放出作用剤」、「緩慢放出作用剤」、「デポ製剤」および「持続放出作用剤」とは、本発明のポリペプチドの放出の持続時間を、作用剤の不在下でポリペプチドを投与した場合の放出の持続時間と比較して延長することができる作用剤を指すために互換的に使用される。本発明の異なる実施形態は異なる放出速度を有してよく、その結果、治療量が異なる。 「抗原」、「標的抗原」および「免疫原」という用語は、本明細書では互換的に使用され、抗体断片または抗体断片に基づく治療薬が結合するまたは特異性を有する構造または結合の決定因子を指す。 「ペイロード」という用語は、本明細書で使用される場合、生物学的活性または治療的活性を有するタンパク質またはペプチド配列；小分子のファルマコフォアの対応物を指す。ペイロードの例としては、これだけに限定されないが、サイトカイン、酵素、ホルモン、血液凝固因子、および増殖因子が挙げられる。ペイロードは、化学療法剤、抗ウイルス化合物、毒素、または造影剤などの遺伝子融合したまたは化学的にコンジュゲートした部分をさらに含んでよい。これらのコンジュゲートした部分は、切断可能であっても切断不可能であってもよいリンカーを介して残りのポリペプチドとつながっていてよい。 「アンタゴニスト」という用語は、本明細書で使用される場合、本明細書に開示されているネイティブなポリペプチドの生物学的活性を部分的にまたは完全に遮断する、阻害する、または中和する任意の分子を包含する。ポリペプチドのアンタゴニストを同定するための方法は、ネイティブなポリペプチドを候補アンタゴニスト分子と接触させるステップと、通常ネイティブなポリペプチドに付随する１つまたは複数の生物学的活性の検出可能な変化を測定するステップとを含んでよい。本発明に関しては、アンタゴニストは、生物学的に活性なタンパク質の効果を減少させるタンパク質、核酸、炭水化物、抗体または任意の他の分子を含んでよい。 「アゴニスト」という用語は、最も広範な意味で使用され、本明細書に開示されているネイティブなポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子を包含する。適切なアゴニスト分子として、具体的には、アゴニスト抗体または抗体断片、ネイティブなポリペプチドの断片またはアミノ酸配列変異体、ペプチド、小有機分子などが挙げられる。ネイティブなポリペプチドのアゴニストを同定するための方法は、ネイティブなポリペプチドを候補アゴニスト分子と接触させるステップと、通常ネイティブなポリペプチドに付随する１つまたは複数の生物学的活性の検出可能な変化を測定するステップとを含んでよい。 「阻害定数」、または「Ｋｉ」は、互換的に使用され、酵素−阻害剤複合体の解離定数、または阻害剤の酵素に対する結合親和性の逆数を意味する。 本明細書で使用される場合、「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「和らげること」または「向上させること」は、互換的に使用され、治療的利益を実現するため、現存する状態を治癒するもしくはその重症度を低下させるため、または、発症の可能性もしくは状態の発生の重症度について、それに対する予防的利益を実現する、それを予防する、もしくはそれを低下させるために、薬物または生物製剤を投与することを意味する。治療的利益とは、治療されている基礎をなす状態または基礎をなす状態に伴う生理的症状のうちの１つまたは複数が根絶または向上し、したがって、被験体はなお基礎をなす状態を患っている可能性があるが、それでも被験体において改善が観察されることを意味する。 「治療効果」または「治療的利益」とは、本明細書で使用される場合、これだけに限定されないが、ヒトまたは他の動物における疾患の緩和、向上、または予防を含めた生理的効果、または、他の点では、生物学的に活性なタンパク質に保有される抗原エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力以外に本発明の融合タンパク質を投与することによって生じるヒトまたは動物の身体的または精神的なウェルビーイングの増強を指す。予防的利益のために、組成物を、特定の状態を発症する危険性がある被験体、または、診断（例えば、クローン病）されていない場合があるにもかかわらず状態の生理的症状のうちの１つまたは複数を訴えている被験体に投与することができる。 「治療有効量」および「治療有効用量」という用語は、本明細書で使用される場合、１回投薬または反復投薬で被験体に投与すると、単独でまたは融合タンパク質組成物の一部としてのいずれかで、病態または状態の任意の症状、態様、測定パラメータまたは特性に対する任意の検出可能な有益な効果を有することができる量の薬物または生物学的に活性なタンパク質を指す。そのような効果は、絶対的に有益である必要はない。治療有効量の決定は、特に本明細書において提供される詳細な開示を踏まえて、十分に当業者の能力の範囲内である。 「治療有効用量レジメン」という用語は、本明細書で使用される場合、単独でまたは融合タンパク質組成物の一部としてのいずれかの生物学的に活性なタンパク質の、継続的に投与する複数回投薬（すなわち、少なくとも２回以上）のためのスケジュールを指し、用量は病態または状態の任意の症状、態様、測定パラメータまたは特性に対する持続性の有益な効果をもたらすための治療有効量で示されている。 Ｉ）一般的な技法本発明の実施では、別段の指定のない限り、当技術分野の技術の範囲内である免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクスおよび組換えＤＮＡの従来の技法を用いる。その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．ら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１年；「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７年；「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」シリーズ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ．；「ＰＣＲ ２： ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｍ．Ｊ． ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｂ．Ｄ． ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ． Ｔａｙｌｏｒ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９５年；「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」、Ｈａｒｌｏｗ， Ｅ．および，Ｌａｎｅ， Ｄ．編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８年；「Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、第１１版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、２００５年；およびＦｒｅｓｈｎｅｙ， Ｒ．Ｉ．、「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、第４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｓｏｍｅｒｓｅｔ、ＮＪ、２０００年を参照されたい。 ＩＩ）グルカゴン様−２タンパク質 本発明は、一部、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質組成物をもたらすＧＬＰ−２および１つまたは複数の延長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）を含む融合タンパク質組成物に関する。 「グルカゴン様タンパク質−２」または「ＧＬＰ−２」とは、集合的に、本明細書では、ヒトＧＬＰ−２の種ホモログであるヒトグルカゴン様ペプチド−２、および、例えば、これだけに限定されないが、成熟配列の２位のアラニンがグリシンで置換された変異体（「２Ｇ」）ならびに２位のアラニンがＶａｌ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＬｅｕまたはＩｌｅで置換された変異体などの変異体を含めた成熟ＧＬＰ−２の生物学的活性の少なくとも一部分を有する非天然の配列変異体を意味する。ＧＬＰ−２または配列変異体は、米国特許第５，７８９，３７９号；同第５，８３４，４２８号；同第５，９９０，０７７号；同第５，９９４，５００号；同第６，１８４，２０１号；同第７，１８６，６８３号；同第７，５６３、７７０号；米国特許出願第２００２００２５９３３号；および同第２００３０１６２７０３号に記載の通り、単離され、合成され、特徴付けられ、またはクローニングされている。 ヒトＧＬＰ−２は、小腸および大腸の上皮の腸内分泌細胞からＧＬＰ−１と一緒に分泌される３３アミノ酸ペプチドである。プログルカゴン遺伝子の１８０アミノ酸産物が翻訳後に膵臓のＡ細胞および腸のＬ細胞において組織特異的な様式でプロセシングされて、３３アミノ酸のＧＬＰ−２になる（Ｏｒｓｋｏｖら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．（１９８９年）２４７巻：１９３〜１９６頁；Ｈａｒｔｍａｎｎら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（２０００年）２１巻：７３〜８０頁）。膵臓のＡ細胞では、主要な生理活性ホルモンはＰＣＳＫ２／ＰＣ２によって切断されたグルカゴンである。腸のＬ細胞では、ＰＣＳＫ１／ＰＣ１により、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、グリセンチンおよびオキシントモジュリンが遊離する。ＧＬＰ−２は、粘膜の成長および栄養吸収の促進、腸の恒常性、胃の運動性の調節、胃酸分泌および腸のヘキソース輸送、腸透過性の低下および腸間膜血流の増大を含む、広範囲にわたる効果を有する多面的な腸栄養性ホルモンとして機能する（Ｅｓｔａｌｌ ＪＬ、Ｄｒｕｃｋｅｒ ＤＪ（２００６年）Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ−２． Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ Ｎｕｔｒ ２６巻：３９１〜４１１頁）、（Ｇｕａｎ Ｘら（２００６年）ＧＬＰ−２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｏｃａｌｉｚｅｓ ｔｏ ｅｎｔｅｒｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｌｏｏｄ ｆｌｏｗ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １３０巻：１５０〜１６４頁；Ｓｔｅｐｈｅｎｓ Ｊら（２００６年）Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ−２ ａｃｕｔｅｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｐｒｏｘｉｍａｌ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｂｌｏｏｄ ｆｌｏｗ ｉｎ ＴＰＮ−ｆｅｄ ｎｅｏｎａｔａｌ ｐｉｇｌｅｔｓ． Ａｍ Ｊ、Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ Ｉｎｔｅｇｒ Ｃｏｍｐ、Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９０巻：Ｒ２８３〜Ｒ２８９頁；Ｎｅｌｓｏｎ ＤＷら（２００７年）Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＧＬＰ−２ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｏｎ ｖａｇａｌ ａｆｆｅｒｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４８巻：１９５４〜１９６２頁）。ＧＬＰ−２に媒介される効果は、腸内（Ｂｊｅｒｋｎｅｓ Ｍ， Ｃｈｅｎｇ Ｈ（２００１年）：Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｂｙ ｅｎｔｅｒｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８巻：１２４９７〜１２５０２頁）および迷走神経（Ｎｅｌｓｏｎら、２００７年）、上皮下筋線維芽細胞（Ｏｒｓｋｏｖ Ｃら（２００５年）ＧＬＰ−２ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｃｏｌｏｎｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｖｉａ ＫＧＦ， ｒｅｌｅａｓｅｄ ｂｙ ｓｕｂｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｗｉｔｈ ＧＬＰ−２ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ． Ｒｅｇｕｌ Ｐｅｐｔ １２４巻：１０５〜１１頁）、および腸上皮細胞のサブセット（Ｔｈｕｌｅｓｅｎ Ｊら（２０００年）Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ２ （ＧＬＰ−２） ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ：ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｉ．ｖ． ｉｎｊｅｃｔｅｄ （１２５） ＩＧＬＰ−２． Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ２１巻：１５１１〜１５１７頁）に位置するグルカゴン／セクレチンＧタンパク質−共役受容体スーパーファミリーのメンバーであるＧＬＰ−２受容体の結合およびその活性化によって誘発される。さらに、ＧＬＰ−２は、炎症促進サイトカインの効果の向上を含めた、炎症性事象の間の腸の適応、修復および保護において重要な役割を果たす（Ｓｉｇａｌｅｔ ＤＬら（２００７年）Ｅｎｔｅｒｉｃ ｎｅｕｒａｌ ｐａｔｈｗａｙｓ ｍｅｄｉａｔｅ ｔｈｅ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ２． Ａｍ Ｊ、Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ、Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９３巻：Ｇ２１１〜Ｇ２２１頁）。ＧＬＰ−２により、短腸症候群（ＳＢＳ）のげっ歯類またはヒトにおける栄養吸収および消化管適応も増強される（Ｊｅｐｐｅｓｅｎら、（２００１年）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２０巻：８０６〜８１５頁）。 一態様では、本発明は、ネイティブなヒトＧＬＰ−２の生物学的活性または生物学的機能の少なくとも一部分を保持する、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、哺乳動物（家畜動物を含める）由来のものなどの天然の配列であるＧＬＰ−２配列に対して相同性を有する配列であるヒトＧＬＰ−２と同一であるＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質組成物内のＧＬＰ−２配列を含めることを意図している。一実施形態では、ＧＬＰ−２は、対応するネイティブなＧＬＰ−２の生物学的活性の少なくとも一部分を保持する非天然のＧＬＰ−２配列変異体、断片、または天然の配列の模倣物、例えば、これだけに限定されないが、成熟ＧＬＰ−２ペプチド配列の２位のアラニンのグリシンでの置換（「ＧＬＰ−２−２Ｇ」）などである。別の実施形態では、融合タンパク質のＧＬＰ−２は、配列ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤを有する。ＧＬＰ−２に対して相同性を有する配列は、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴなどの標準の相同性検索技法によって、またはＣｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅｓ（例えば、ＣＡＳ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ）、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＵｎｉＰｒｏｔ）などの公共のデータベースおよびＧｃｎＳｃｑ（例えば、Ｄｅｒｗｅｎｔ）などの会員制提供データベースにおいて見いだすことができる。 表１は、本発明のＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質に包含されるＧＬＰ−２のアミノ酸配列の非限定的な一覧を提供する。融合タンパク質組成物に組み入れられるＧＬＰ−２配列または相同な誘導体はいずれも個々の突然変異を表１の配列のアミノ酸内およびその間にシャッフリングすることによって、または表１の配列のアミノ酸を置き換えることによって構築することができる。生じたＧＬＰ−２配列を活性について評価することができ、ネイティブなＧＬＰ−２の生物学的活性の少なくとも一部分を保持するものが、本発明の融合タンパク質組成物に含めるために有用であり得る。いくつかの実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮに組み入れることができるＧＬＰ−２としては、表１から選択されるアミノ酸配列と比較して少なくとも約８０％の配列同一性、あるいは、８１％，８２％、８３％、８４％、８５％、８６％，８７％，８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するタンパク質が挙げられる。 対象組成物のＧＬＰ−２は、ネイティブな、全長のＧＬＰ−２ポリペプチドに限定されないが、配列変異体、またはその断片を有する組換え型ならびに生物学的かつ／または薬理学的に活性な形態も包含する。例えば、ＧＬＰ−２において種々のアミノ酸の欠失、挿入および置換を行って、野生型ＧＬＰ−２の１つまたは複数の生物学的活性または薬理的性質を示す変異体を創出することができることが理解されよう。ポリペプチド配列内のアミノ酸に対する保存された置換の例が表２に示されている。本明細書に開示されている特異的な配列と比較したＧＬＰ−２の配列同一性が１００％未満であるＧＬＰ２−ＸＴＥＮの実施形態では、本発明では、所与のＧＬＰ−２の所与のアミノ酸残基の他の１９種の天然Ｌ−アミノ酸のいずれかによる置換が意図されており、これは、近接するアミノ酸残基を含めたＧＬＰ−２の配列内の任意の位置におけるものであってよい。いくつかの実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮに組み入れられたＧＬＰ−２変異体では、成熟ペプチドの２位のアラニン（Ａ）がグリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、グルタミン酸（Ｅ）、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ロイシン（Ｋ）またはイソロイシン（Ｉ）で置換されている。そのような置換により、ジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−４）に対する抵抗性を付与することができる。一実施形態では、ＧＬＰ−２配列の２位のアラニンがグリシンで置換されている。いずれか１つの置換により、生物学的活性に望ましくない変化がもたらされる場合には、代替のアミノ酸のうちの１つを使用することができ、また、構築物タンパク質は、本明細書に記載の方法（例えば、表３２のアッセイ）によって、または、例えば、米国特許第５，３６４，９３４号（その内容全体が参照により組み込まれる）に記載されている保存された突然変異および保存されていない突然変異に対する技法およびガイドラインのいずれかを用いて、または当技術分野で公知の方法を用いて評価する。さらに、変異体は、例えば、ネイティブなペプチドの生物学的活性；例えば、ＧＬＰ−２受容体に結合する能力および／またはＧＬＰ−２受容体を活性化する能力の全てではないにしてもいくらかを保持するＧＬＰ−２の全長のネイティブなアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端において１つまたは複数のアミノ酸残基が付加または欠失しているポリペプチドを含んでよい。 ＧＬＰ−２の配列変異体としては、対応する野生型ＧＬＰ−２と実質的に同じまたはそれよりも良い生物学的活性を示すものであろうと、あるいは野生型ＧＬＰ−２と比較して実質的に改変されたまたは低下した生物学的活性を示すものであろうと、限定することなく、野生型ＧＬＰ−２の配列とは１つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失、または置換によって異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。そのようなＧＬＰ−２変異体は、全てが参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，１８６，６８３号または米国特許第５，７８９，３７９号、同第５，９９４，５００号に記載されているものを含め、当技術分野で公知である。 ＩＩＩ）延長組換えポリペプチド 一態様では、本発明は、ＧＬＰ−２配列と連結し、かつ／またはそれに組み入れ、それによりＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質をもたらすための融合タンパク質パートナー（複数可）として有用なＸＴＥＮポリペプチド組成物を提供する。ＸＴＥＮは、一般に、生理的条件下で二次構造または三次構造の程度が低い、またはそれを有さない、天然に存在しない実質的に非反復性の配列を有するポリペプチドである。ＸＴＥＮは、一般には約３６〜約３０００アミノ酸を有し、その大部分または全体は小さな親水性アミノ酸である。本明細書で使用される場合、「ＸＴＥＮ」とは、全抗体または抗体断片（例えば、単鎖抗体およびＦｃ断片）を明確に排除する。ＸＴＥＮは、ＧＬＰ−２タンパク質と連結してＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を創出した場合に種々の役割を果たし、特定の望ましい薬物動態的性質、物理化学的性質および薬学的性質を付与するという点で、融合タンパク質パートナーとしての有用性を有する。そのようなＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質組成物の性質は、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較して増強されており、それにより、以下により詳細に記載されている通り特定の胃腸の状態の治療において有用なものになる。 生物学的に活性なタンパク質と融合するためのＸＴＥＮの選択の判断基準は、一般には、次に融合タンパク質組成物の性質を増強させるために使用するＸＴＥＮの物理化学的性質およびコンフォメーション構造の属性に関する。ＸＴＥＮの非構造化特性および物理的／化学的性質は、部分的に、ＸＴＥＮポリペプチドの４〜６個の親水性アミノ酸に不釣り合いに限定された全体的なアミノ酸組成、数量化できる非反復設計におけるアミノ酸の連結、および長さによってもたらされる。ＸＴＥＮには一般的であるが、ポリペプチドには珍しい有利な特徴では、本明細書に開示されているＸＴＥＮの性質は、種々の長さの範囲内で同様の性質を保有し、その多くが実施例において実証されている表４の例示的な配列の多様性によって証明されるように、絶対的な一次アミノ酸配列に縛られない。本発明のＸＴＥＮは以下の有利な性質の１つまたは複数を示す：コンフォメーションが柔軟であること、二次構造が低下または欠如していること、水溶性の程度が高いこと、プロテアーゼ抵抗性の程度が高いこと、免疫原性が低いこと、哺乳動物の受容体への結合性が低いこと、電荷の程度が規定されていること、および流体力学的（またはストークス）半径が増大していること；それらを融合タンパク質パートナーとして特に有用なものにする性質。次に、ＸＴＥＮと融合したＧＬＰ−２を含む融合タンパク質の性質の増強の非限定的な例としては、全体的な溶解度および／または代謝安定性が増大すること、タンパク質分解の受けやすさが低下すること、免疫原性が低下すること、皮下または筋肉内に投与された際の吸収の速度が低下すること、腎臓によるクリアランスが低下すること、基質との相互作用が増強されること、および薬物動態的性質が増強されることが挙げられる。本発明のＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物の薬物動態的性質の増強としては、終末相半減期が長くなること（例えば、２倍、３倍、４倍またはそれ以上）、曲線下面積（ＡＵＣ）が増大すること（例えば、２５％、５０％、１００％またはそれ以上）、分布容積が低下すること、皮下または筋肉内に注射した後の吸収が遅くなり（同様の経路で投与した、ＸＴＥＮと連結していないＧＬＰ−２と比較して）、したがってＣｍａｘが低下することが挙げられ、それにより今度はＧＬＰ−２の有害作用が低下し、それにより、集合的に、被験体に投与されるＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物の融合タンパク質により治療的活性がもたらされる時間が増大する。いくつかの実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物は、生物学的に活性なＧＬＰ−２の持続放出を可能にする切断配列（下でより詳細に記載されている）を含む。そのような切断配列を有するＧＬＰ２−ＸＴＥＮは、皮下または筋肉内に投与された際にデポ剤としての機能を果たし得る。具体的には、本開示の対象ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、本明細書に開示されている改善された性質の１つまたは複数、またはその任意の組合せを示し得ることが意図されている。いくつかの実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物により、同等に投与したＸＴＥＮと連結していないＧＬＰ−２と比較してより頻度の少ない投薬が可能になる。そのようなＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質組成物は、本明細書に記載の特定のＧＬＰ−２に関連する疾患、障害または状態を治療するために有用である。 本発明のＸＴＥＮを含む組成物などのタンパク質の物理化学的性質を決定するための種々の方法およびアッセイは当技術分野で公知である。そのような性質としては、これだけに限定されないが、二次構造または三次構造、溶解度、タンパク質凝集、融解性、コンタミネーションおよび含水量が挙げられる。そのような方法としては、分析的遠心分離、ＥＰＲ、ＨＰＬＣ−イオン交換、ＨＰＬＣ−サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、ＨＰＬＣ−逆相、光散乱、キャピラリー電気泳動、円偏光二色性、示差走査熱量測定、蛍光、ＨＰＬＣ−イオン交換、ＩＲ、ＮＭＲ、ラマン分光法、屈折率測定、およびＵＶ／可視分光法が挙げられる。追加的な方法は、Ａｒｎａｕら、Ｐｒｏｔ Ｅｘｐｒ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆ（２００６年）、４８巻、１〜１３頁に開示されている。 ＧＬＰ２−ＸＴＥＮのＸＴＥＮ構成成分（複数可）は、ポリマーの長さが延長されているにもかかわらず、生理的条件下で変性したペプチド配列のように挙動するように設計する。「変性した」とは、ペプチド骨格のコンフォメーションの自由度が大きいことを特徴とする溶液中のペプチドの状態を説明する。大部分のペプチドおよびタンパク質は、高濃度の変性剤の存在下でまたは温度上昇時に変性したコンフォメーションをとる。変性したコンフォメーションにあるペプチドは、例えば、特徴的な円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを有し、また、ＮＭＲによって決定された通り、長距離の相互作用が欠如していることを特徴とする。「変性したコンフォメーション」および「非構造化コンフォメーション」は本明細書では同義に使用される。いくつかの実施形態では、本発明は、生理的条件下で、二次構造を大きく欠く変性した配列と類似したＸＴＥＮ配列を提供する。他の場合では、ＸＴＥＮ配列は生理的条件下で二次構造を実質的に欠く。この場合で使用される「大きく欠く」とは、本明細書に記載の手段によって測定または決定したところ、二次構造に寄与するＸＴＥＮ配列のＸＴＥＮアミノ酸残基が５０％未満であることを意味する。この場合に使用される「実質的に欠く」とは、本明細書に記載の方法によって測定または決定したところ、ＸＴＥＮ配列のＸＴＥＮアミノ酸残基の少なくとも約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％、または少なくとも約９９％が二次構造に寄与しないことを意味する。 所与のポリペプチドにおける二次構造および三次構造の存在または不在を見分けるための種々の方法が当技術分野において確立されている。具体的には、二次構造は、分光光度的に、例えば、「遠ＵＶ」スペクトルの領域（１９０〜２５０ｎｍ）で円偏光二色性分光法によって測定することができる。アルファヘリックスおよびベータ−シートなどの二次構造エレメントは、それぞれ、形状および大きさが特徴的なＣＤスペクトルを生じさせる。二次構造は、ポリペプチド配列に関して、米国特許出願公開第２００３０２２８３０９Ａ１に記載の通り、特定のコンピュータプログラムまたはアルゴリズム、例えば周知のＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズム（Ｃｈｏｕ， Ｐ． Ｙら（１９７４年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３巻：２２２〜４５頁）およびＧａｒｎｉｅｒ−Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ−Ｒｏｂｓｏｎアルゴリズム（「Ｇｏｒアルゴリズム」）（Ｇａｒｎｉｅｒ Ｊ、Ｇｉｂｒａｔ ＪＦ、Ｒｏｂｓｏｎ Ｂ．（１９９６年）、ＧＯＲ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｆｒｏｍ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２６６巻：５４０〜５５３頁）などを使用して予測することもできる。所与の配列について、アルゴリズムにより、いくつかの二次構造が存在するかまたは二次構造が全く存在しないかを予測することができ、例えば、アルファヘリックスもしくはベータシートを形成する配列の残基の総計および／もしくは百分率、またはランダムコイル形成（二次構造が欠如している）が生じることが予測される配列の残基の百分率として表される。ポリペプチド配列は、例えば、ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ．ｃｇｉ？ｒｍ＝ｍｉｓｃ１におけるワールドワイドウェブ上のサイトを使用するＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズム、および、ｎｐｓａ−ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ．ｐｌ？ｐａｇｅ＝ｎｐｓａ＿ｇｏｒ４．ｈｔｍｌのＧｏｒアルゴリズムを使用して（どちらも２０１２年９月５日にアクセスした）分析することができる。 一実施形態では、対象融合タンパク質組成物に使用するＸＴＥＮ配列のアルファヘリックスの百分率は、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定したところ、０％から約５％未満までにわたる。別の実施形態では、融合タンパク質組成物のＸＴＥＮ配列のベータ−シートの百分率は、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定したところ、０％から約５％未満までにわたる。いくつかの実施形態では、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定したところ、融合タンパク質組成物のＸＴＥＮ配列のアルファヘリックスの百分率は０％から約５％未満までにわたり、ベータ−シートの百分率は０％から約５％未満までにわたる。一実施形態では、融合タンパク質組成物のＸＴＥＮ配列のアルファヘリックスの百分率は約２％未満であり、ベータ−シートの百分率は約２％未満である。ＧＯＲアルゴリズムによって決定したところ、融合タンパク質組成物のＸＴＥＮ配列のランダムコイルの百分率は高程度である。いくつかの実施形態では、ＧＯＲアルゴリズムによって決定したところ、ＸＴＥＮ配列のランダムコイルは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９１％、より好ましくは少なくとも約９２％、より好ましくは少なくとも約９３％、より好ましくは少なくとも約９４％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、より好ましくは少なくとも約９７％、より好ましくは少なくとも約９８％、最も好ましくは少なくとも約９９％である。一実施形態では、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定したところ、融合タンパク質組成物のＸＴＥＮ配列のアルファヘリックスの百分率は０％から約５％未満までにわたり、ベータシートの百分率は０％から約５％未満までにわたり、ランダムコイルは、ＧＯＲアルゴリズムによって決定したところ、少なくとも約９０％である。別の実施形態では、融合タンパク質組成物のＸＴＥＮ配列のアルファヘリックスの百分率は約２％未満であり、ベータ−シートの百分率は約２％未満であり、ランダムコイルは、ＧＯＲアルゴリズムによって決定したところ、少なくとも約９０％である。 １．非反復配列 ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ実施形態のＸＴＥＮ配列は実質的に非反復性であることが意図されている。一般に、反復性アミノ酸配列は、コラーゲンおよびロイシンジッパーなどの天然の反復配列によって例示されている通り、凝集する、または高次構造を形成する傾向を有する。これらの反復性アミノ酸は、接触して、結晶構造または偽結晶構造を形成する傾向もある。対照的に、非反復配列は凝集する傾向が低いことにより、そうでなければ、配列が反復性の場合には凝集する可能性がある荷電アミノ酸の頻度が比較的低い長い配列のＸＴＥＮを設計することが可能になる。対象ＸＴＥＮの非反復性は、以下の特徴の１つまたは複数を評価することによって観察することができる。一実施形態では、「実質的に非反復性の」ＸＴＥＮ配列は、配列内に、アミノ酸がセリンでない限り、アミノ酸の種類が同一であるアミノ酸を３つ連続して有さず、その場合、３つ以下の連続したアミノ酸はセリン残基である。別の実施形態では、下により詳しく記載されている通り、「実質的に非反復性の」ＸＴＥＮ配列は、９〜１４アミノ酸残基のモチーフを含み、モチーフは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択される３種類、４種類、５種類、または６種類のアミノ酸からなり、いかなる１つのモチーフ内のいかなる２つの連続したアミノ酸残基の配列も、配列モチーフ内で３回以上繰り返されない。 ポリペプチドまたは遺伝子の反復性の程度は、コンピュータプログラムまたはアルゴリズムによって、当技術分野で公知の他の手段によって測定することができる。本発明によると、ＸＴＥＮなどの特定のポリペプチドの反復性の程度の算出に使用するアルゴリズムは、本明細書に開示されており、アルゴリズムによって解析される配列の例が提供される（下の実施例を参照されたい）。一実施形態では、所定の長さのポリペプチドの反復性は、方程式１：（式中、ｍ＝（ポリペプチドのアミノ酸長）−（部分配列のアミノ酸長）＋１であり、Ｃｏｕｎｔｉ＝配列ｉ内の唯一の部分配列のそれぞれの出現の累積数である）によって示される式によって算出することができる（以下「部分配列スコア」）。 ＸＴＥＮなどのポリペプチドの反復性を定量化するために、「ＳｅｇＳｃｏｒｅ」と称されるアルゴリズムを展開して前述の方程式を適用し、それにより部分配列スコアをもたらした。所定のアミノ酸長の配列を、設定された長さ内で現れる長さ「ｓ」の唯一の部分配列の回数（「カウント」）を決定し、所定の配列の長さ内の部分配列の絶対数で割ることによって反復性について解析した。図１は、ＳｅｇＳｃｏｒｅアルゴリズムの論理的フローチャートを示し、図２は、１１アミノ酸および３アミノ酸残基の部分配列長を有する仮ＸＴＥＮについての部分配列スコアがどのように導かれるかの概略図を示す。例えば、２００アミノ酸残基の所定のポリペプチドの長さは、１９２の重複している９アミノ酸部分配列および１９８の３ｍｅｒ部分配列を有するが、任意の所与のポリペプチドの部分配列スコアは唯一の部分配列の絶対数および唯一の部分配列（異なるアミノ酸配列を意味する）のそれぞれが所定の配列の長さにおいてどのくらいの頻度で現れるかに左右される。 本発明に関しては、「部分配列スコア」とは、累積的なＸＴＥＮポリペプチドの２００個の連続したアミノ酸にわたる唯一の３ｍｅｒ枠のそれぞれの出現の合計を、２００アミノ酸配列内の唯一の３ｍｅｒ部分配列の絶対数で割ったものを意味する。反復性ポリペプチドおよび非反復性ポリペプチドの２００個の連続したアミノ酸から導かれたそのような部分配列スコアの例は実施例３０において示されている。一実施形態では、本発明は、１つのＸＴＥＮを含むＧＬＰ２−ＸＴＥＮであって、ＸＴＥＮの部分配列スコアが１２未満、より好ましくは１０未満、より好ましくは９未満、より好ましくは８未満、より好ましくは７未満、より好ましくは６未満、最も好ましくは５未満であるＧＬＰ２−ＸＴＥＮを提供する。別の実施形態では、本発明は、２つ以上のＸＴＥＮを含むＧＬＰ２−ＸＴＥＮであって、少なくとも１つのＸＴＥＮの部分配列スコアが１０未満、または９未満、または８未満、または７未満、または６未満、または５未満、またはそれ以下であるＧＬＰ２−ＸＴＥＮを提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、少なくとも２つのＸＴＥＮを含むＧＬＰ２−ＸＴＥＮであって、３６アミノ酸以上の個々のＸＴＥＮの部分配列スコアが１０未満、または９未満、または８未満、または７未満、または６未満、または５未満、またはそれ以下であるＧＬＰ２−ＸＴＥＮを提供する。本段落の実施形態では、ＸＴＥＮは、実質的に非反復性であると特徴付けられる。 一態様では、本発明のＸＴＥＮの非反復特性は、絶対的な一次配列ではなく、ＸＴＥＮにおいて優性である特定の種類のアミノ酸と共に、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質の物理化学的性質および生物学的性質のうちの１つまたは複数を増強する。これらの性質の増強としては、反復配列を有するポリペプチドを含む融合タンパク質と比較して、宿主細胞における融合タンパク質の発現の程度が高いこと、ＸＴＥＮをコードする遺伝子の遺伝的安定性が高いこと、溶解度の程度が高いこと、凝集する傾向が低いこと、および生じたＧＬＰ２−ＸＴＥＮの薬物動態が増強されていることが挙げられる。これらの性質の増強により、より効率的な製造、低費用の商品が可能になり、かつ／またはいくつかの場合には１００ｍｇ／ｍｌを超える、非常に高濃度のタンパク質を含有するＸＴＥＮを含む医薬調製物の製剤化が容易になる。いくつかの実施形態では、実施形態のＸＴＥＮポリペプチド配列は、哺乳動物に投与すると免疫原性を低下させるまたは実質的に排除するために、内部の反復性の程度が低くなるように設計する。グリシン、セリンおよびグルタミン酸などの３つのアミノ酸のみに大きく限定される短い、繰り返しモチーフで構成されるポリペプチド配列は、これらの配列には予測Ｔ細胞エピトープが存在しないにもかかわらず、哺乳動物に投与すると比較的高い抗体力価をもたらす可能性がある。これは、タンパク質凝集体、架橋した免疫原、および反復性炭水化物を含めた繰り返しエピトープを有する免疫原は免疫原性が高く、それにより、例えば、Ｂ細胞活性化を引き起こすＢ細胞受容体の架橋がもたらされることが示されているので、ポリペプチドの反復性によって引き起こされる可能性がある。（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ， Ｊ．ら（２００７年）Ｖａｃｃｉｎｅ、２５巻：１６７６〜８２頁；Ｙａｎｋａｉ， Ｚ．ら（２００６年）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ、３４５巻：１３６５〜７１頁；Ｈｓｕ， Ｃ． Ｔ．ら（２０００年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６０巻：３７０１〜５頁）；Ｂａｃｈｍａｎｎ ＭＦら、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５年）２５巻（１２号）：３４４５〜３４５１頁）。 ２．例示的な配列モチーフ 本発明は、多数の短い配列の単位、またはモチーフを含み、モチーフのアミノ酸配列が実質的に非反復性である、融合パートナーとして使用するＸＴＥＮを包含する。非反復性は、多量体化してＸＴＥＮ配列を創出する配列モチーフのライブラリーを使用する「構成単位」手法を用いてさえも満たされる。モチーフ自体は一般に非反復性アミノ酸配列からなるのでＸＴＥＮ配列はわずか４つの異なる種類の配列モチーフの多数の単位からなり得るが、その一方で、ＸＴＥＮ配列全体は、配列が実質的に非反復性になるように設計する。 一実施形態では、ＸＴＥＮは、約３６〜約３０００超、または約１００〜約２０００超、または約１４４〜約１０００超、またはさらに長いアミノ酸残基の実質的に非反復性の配列を有し、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または約１００％は重複していない配列モチーフからなり、モチーフのそれぞれは約９〜３６アミノ酸残基を有する。本明細書で使用される場合、「重複していない」とは、個々のモチーフがアミノ酸残基を共有するのではなく、他のモチーフまたはアミノ酸残基と直鎖状に連結していることを意味する。他の実施形態では、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または約１００％は重複していない配列モチーフからなり、モチーフのそれぞれは９〜１４アミノ酸残基を有する。さらに他の実施形態では、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または約１００％は重複していない配列モチーフからなり、モチーフのそれぞれは１２アミノ酸残基を有する。これらの実施形態では、配列モチーフが実質的に（例えば、９０％以上）または排他的に小さな親水性アミノ酸で構成され、したがって、配列全体は構造化されていない柔軟な特性を有することが好ましい。ＸＴＥＮに含まれるアミノ酸の例は、例えば、アルギニン、リシン、トレオニン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、およびグリシンである。一実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、長さが約３６〜約３０００超、または約１００〜約２０００超、または約１４４〜約１０００超のアミノ酸残基である実質的に非反復性の配列に並んだグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）またはプロリン（Ｐ）から選択される４〜６種類のアミノ酸を有することが優勢である。いくつかの実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）またはプロリン（Ｐ）からなる群より選択される４種類、５種類、または６種類のアミノ酸で構成される。いくつかの実施形態では、ＸＴＥＮは、約３６〜約１０００超、または約１００〜約２０００超、または約４００〜約３０００超のアミノ酸残基の配列を有し、配列の少なくとも約８０％は重複していない配列モチーフからなり、モチーフのそれぞれは９〜３６アミノ酸残基を有し、モチーフのそれぞれの少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または１００％は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択される４〜６種類のアミノ酸からなり、全長のＸＴＥＮ内の１種のアミノ酸の含有量はいずれも３０％以下である。他の実施形態では、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０％は重複していない配列モチーフからなり、モチーフのそれぞれは９〜３６アミノ酸残基を有し、モチーフはグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択される４〜６種類のアミノ酸からなり、全長のＸＴＥＮ内の１種のアミノ酸の含有量はいずれも４０％以下、または約３０％以下、または約２５％以下である。他の実施形態では、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０％は重複していない配列モチーフからなり、モチーフのそれぞれはグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択される４〜６種類のアミノ酸からなる１２アミノ酸残基を有し、全長のＸＴＥＮ内の１種のアミノ酸の含有量はいずれも４０％以下、または３０％以下、または約２５％以下である。さらに他の実施形態では、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％〜約１００％は重複していない配列モチーフからなり、モチーフのそれぞれはグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）からなる１２アミノ酸残基を有する。 さらに他の実施形態では、ＸＴＥＮは、約３６〜約３０００超のアミノ酸残基の実質的に非反復性の配列を含み、配列の少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％は９〜１４アミノ酸残基の重複していない配列モチーフからなり、モチーフはグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択される４〜６種類のアミノ酸からなり、いかなる１つのモチーフ内のいかなる２つの連続したアミノ酸残基の配列も、配列モチーフ内で３回以上繰り返されない。他の実施形態では、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％は１２アミノ酸残基の重複していない配列モチーフからなり、モチーフはグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択される４〜６種類のアミノ酸からなり、いかなる１つの配列モチーフ内のいかなる２つの連続したアミノ酸残基の配列も、配列モチーフ内で３回以上繰り返されない。他の実施形態では、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％は１２アミノ酸残基の重複していない配列モチーフからなり、モチーフは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）からなり、いかなる１つの配列モチーフ内のいかなる２つの連続したアミノ酸残基の配列も、配列モチーフ内で３回以上繰り返されない。さらに他の実施形態では、ＸＴＥＮは１２アミノ酸配列モチーフからなり、アミノ酸は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択され、いかなる１つの配列モチーフ内のいかなる２つの連続したアミノ酸残基の配列も、配列モチーフ内で３回以上繰り返されず、全長のＸＴＥＮ内の１種のアミノ酸の含有量はいずれも３０％以下である。前述の実施形態は、実質的に非反復性のＸＴＥＮ配列の例である。さらなる例は下で詳説されている。 いくつかの実施形態では、本発明は、１つ、または２つ、または３つ、または４つ、５つ、６つまたはそれ以上の、約３６〜約１０００アミノ酸残基、または累積的に約１００〜約３０００アミノ酸残基の非反復性ＸＴＥＮ配列（複数可）であって、配列の少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％〜約１００％が、表３のアミノ酸配列から選択される４つ以上の重複していない配列モチーフの多数の単位からなり、配列全体は実質的に非反復性のままであるＸＴＥＮ配列を含むＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ＸＴＥＮは、配列の約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％または約１００％が、表３から選択される単一のモチーフファミリーから選択される重複していない配列の多数の単位からなり、ファミリー配列が提供される、重複していない配列モチーフを含む。モチーフに適用されるファミリーとは、ＸＴＥＮが、表３のモチーフカテゴリー；すなわち、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、ＡＱ、ＢＣ、またはＢＤから選択されるモチーフを有すること、およびモチーフファミリー由来ではないＸＴＥＮ内の任意の他のアミノ酸が、必要とされる性質、例えば、コードしているヌクレオチドによる制限部位の組み込み、切断配列の組み込みを可能にすることなどを実現するため、またはＧＬＰ２−ＸＴＥＮのＧＬＰ−２構成成分へのより良い連結を実現するために選択されることを意味する。ＸＴＥＮファミリーのいくつかの実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、ＡＤモチーフファミリー、またはＡＥモチーフファミリー、またはＡＦモチーフファミリー、またはＡＧモチーフファミリー、またはＡＭモチーフファミリー、またはＡＱモチーフファミリー、またはＢＣファミリー、またはＢＤファミリーの重複していない配列の多数の単位モチーフを含み、生じたＸＴＥＮは、上記の相同性の範囲を示す。ＸＴＥＮファミリーの他の実施形態では、所与のファミリーの各ＸＴＥＮは表３の同じファミリーの少なくとも４つの異なるモチーフ；例えば、ＡＤまたはＡＥまたはＡＦまたはＡＧまたはＡＭの４つのモチーフなどを有する。他の実施形態では、ＸＴＥＮは、下でより詳細に記載されているモチーフのアミノ酸組成によって付与することができる正味の電荷、二次構造の欠如、または反復性の欠如などの性質を含めた、所望の物理化学特性を実現するために選択される表３のモチーフファミリーのうちの２つ以上由来のモチーフ配列の多数の単位を含む。本段落の上文に記載されている実施形態では、ＸＴＥＮに組み入れるモチーフまたはモチーフの部分を、本明細書に記載の方法を用いて選択し組み立てて、約３６、約４２、約７２、約１４４、約２８８、約５７６、約８６４、約１０００、約２０００〜約３０００アミノ酸残基、または任意の中間の長さのＸＴＥＮを実現することができる。対象ＧＬＰ２−ＸＴＥＮに組み込むために有用なＸＴＥＮファミリー配列の非限定的な例は表４に示されている。表４に関して言及される指定の配列は表４に記載されている配列を有することが意図されているが、ＡＥ１４４配列への全般的な言及は、例えば、１４４アミノ酸残基を有する任意のＡＥ配列、例えば、ＡＥ１４４＿１Ａ、ＡＥ１４４＿２Ａなどを包含するものとする、またはＡＧ１４４配列への全般的な言及は、例えば、１４４アミノ酸残基を有する任意のＡＧ配列、例えば、ＡＧ１４４＿１、ＡＧ１４４＿２、ＡＧ１４４＿Ａ、ＡＧ１４４＿Ｂ、ＡＧ１４４＿Ｃなどを包含するものとする。 他の実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物は、約３６〜約３０００アミノ酸残基または約１４４〜約２０００アミノ酸残基または約２８８アミノ酸残基または約１０００アミノ酸残基の非反復性ＸＴＥＮ配列を１つまたは複数を含み、配列の少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％〜約１００％は、ファミリー配列として、またはモチーフが２つ以上のモチーフのファミリーから選択される場合のいずれかで、表８〜１１のポリペプチド配列のうちの１つまたは複数から選択される重複していない３６アミノ酸配列モチーフからなる。 ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮ構成成分のアミノ酸の１００％未満がグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択される４〜６アミノ酸からなる、または配列の１００％未満が表３の配列モチーフまたは表４および表８〜１２の配列からなる、または表４のＸＴＥＮと比較して１００％未満の配列同一性を有する実施形態では、他のアミノ酸残基は、任意の他の１４種の天然Ｌ−アミノ酸から選択されるが、優先的に、親水性アミノ酸から選択され、したがって、ＸＴＥＮ配列は、少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の親水性アミノ酸を含有する。グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）ではないＸＴＥＮアミノ酸は、ＸＴＥＮ配列全体を通して分散しており、配列モチーフ内またはその間に位置する、またはＸＴＥＮ配列の短いひと続きの１つまたは複数に集中している。ＧＬＰ２−ＸＴＥＮのＸＴＥＮ構成成分が、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）以外のアミノ酸を含む場合では、アミノ酸は疎水性残基ではなく、またＸＴＥＮ構成成分の二次構造を実質的に付与しないはずであることが望ましい。ＸＴＥＮの構築においてあまり好ましくない疎水性残基としては、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、およびメチオニンが挙げられる。さらに、ＸＴＥＮ配列を、以下のアミノ酸を５％未満または４％未満または３％未満または２％未満または１％未満含有するまたは全く含有しないように設計することができる：システイン（ジスルフィドの形成および酸化を回避するため）、メチオニン（酸化を回避するため）、アスパラギンおよびグルタミン（アミド分解（ｄｅｓａｍｉｄａｔｉｏｎ）を回避するため）。したがって、いくつかの実施形態では、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）に加えて他のアミノ酸を含むＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮ構成成分は、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって測定したところアルファヘリックスおよびベータシートに寄与している残基が５％未満であり、ＧＯＲアルゴリズムによって測定したところランダムコイル形成が少なくとも９０％、または少なくとも約９５％またはそれを超える配列を有する。 ３．配列の長さ 別の態様では、本発明は、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物に組み込むためのさまざまな長さのＸＴＥＮを提供し、ＸＴＥＮ配列（複数可）の長さは、融合タンパク質において実現されるべき性質または機能に基づいて選択される。意図された性質または機能に応じて、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物は、担体としての機能を果たすことができる短いまたは中間の長さのＸＴＥＮおよび／またはより長いＸＴＥＮ配列を含む。限定するものではないが、ＸＴＥＮまたはＸＴＥＮの断片としては、短いセグメントの約６〜約９９アミノ酸残基、中間の長さの約１００〜約３９９アミノ酸残基、およびより長い長さの約４００〜約３０００アミノ酸残基が挙げられる。したがって、対象ＧＬＰ２−ＸＴＥＮは、長さが約６アミノ酸残基、または約１２アミノ酸残基、または約３６アミノ酸残基、または約４０アミノ酸残基、または約１００アミノ酸残基、または約１４４アミノ酸残基、または約２８８アミノ酸残基、または約４０１アミノ酸残基、または約５００アミノ酸残基、または約６００アミノ酸残基、または約７００アミノ酸残基、または約８００アミノ酸残基、または約９００アミノ酸残基、または約１０００アミノ酸残基、または約１５００アミノ酸残基、または約２０００アミノ酸残基、または約２５００アミノ酸残基、または約３０００アミノ酸残基に至るまでの長さのＸＴＥＮまたはＸＴＥＮの断片を包含する。他の場合では、ＸＴＥＮ配列は、約６〜約５０アミノ酸残基、または約１００〜１５０アミノ酸残基、約１５０〜２５０アミノ酸残基、約２５０〜４００アミノ酸残基、約４００〜約５００アミノ酸残基、約５００〜９００アミノ酸残基、約９００〜１５００アミノ酸残基、約１５００〜２０００、または約２０００〜約３０００アミノ酸残基の長さであってもよい。ＸＴＥＮの正確な長さは、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物の生物学的活性に悪影響を及ぼすことなく変動させることができる。一実施形態では、本明細書に開示されているＧＬＰ２−ＸＥＮに使用するＸＴＥＮのうちの１つまたは複数は、３６アミノ酸、４２アミノ酸、１４４アミノ酸、２８８アミノ酸、５７６アミノ酸、または８６４アミノ酸の長さであり、ＸＴＥＮファミリー配列、すなわち、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、ＡＱ、ＢＣまたはＢＤのうちの１つから選択することができる。別の実施形態では、本発明において使用するＸＴＥＮのうちの１つまたは複数は、ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４、ＸＴＥＮ＿ＡＥ５７６、ＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８、ＸＴＥＮ＿ＡＥ１４４、ＸＴＥＮ＿ＡＥ４２、ＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４、ＸＴＥＮ＿ＡＧ５７６、ＸＴＥＮ＿ＡＧ２８８、ＸＴＥＮ＿ＡＧ１４４、およびＸＴＥＮ＿ＡＧ４２または表４の他のＸＴＥＮ配列からなる群より選択される。ＧＬＰ２−ＸＴＥＮの実施形態では、１つまたは複数のＸＴＥＮまたはＸＴＥＮ配列の断片は、個々に、表４から選択されるモチーフまたはＸＴＥＮ、または長さが同等であるその断片と比較して少なくとも約８０％の配列同一性、あるいは、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を示す。いくつかの実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、第１のＸＴＥＮ配列および少なくとも第２のＸＴＥＮ配列を含み、ＸＴＥＮ配列内の残基の累積長は約１００〜約３０００超または約４００〜約１０００超のアミノ酸残基であり、ＸＴＥＮは、配列または長さが同一であってもよく、異なってもよい。本明細書で使用される場合、「累積長」とは、２つ以上のＸＴＥＮがＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質に組み入れられている場合、アミノ酸残基の全長を包含するものとする。 下により詳しく記載されている通り、被験体に投与される融合タンパク質に標的半減期または他の物理化学的性質が付与されるようにＸＴＥＮの長さを選択することによってＧＬＰ２−ＸＴＥＮを設計する方法が開示されている。ＸＴＥＮを担体として使用する場合、本発明では非反復性の非構造化ポリペプチドの長さが増大することにより、ＸＴＥＮの非構造性が増強され、それに対応して、ＸＴＥＮ担体を含む融合タンパク質の生物学的性質および薬物動態的性質が増強されるという発見を活用する。一般に、約４００残基よりも長いＸＴＥＮ累積長を融合タンパク質組成物に組み入れると、短い累積長、例えば、約２８０残基未満と比較して半減期が長くなる。実施例においてより詳細に記載されている通り、ＸＴＥＮの長さが比例的に増大することにより、単一のファミリー配列モチーフ（例えば、表３の４つのＡＥモチーフ）の繰り返し序列によって創出されたものであっても、より短いＸＴＥＮの長さと比較して、ＧＯＲアルゴリズムによって決定したところランダムコイル形成の百分率がより高い、またはＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定したところアルファヘリックスまたはベータシートの含有量が減少した配列が提供される。さらに、非構造化ポリペプチド融合パートナーの長さが増大することにより、実施例に記載の通り、配列の長さが短い非構造化ポリペプチドパートナーを有する融合タンパク質と比較して終末相半減期が不均衡に増大した融合タンパク質がもたらされる。 ＸＴＥＮが主に担体としての役割を果たすいくつかの実施形態では、本発明は、１つまたは複数のＸＴＥＮを含むＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物を包含し、融合タンパク質（複数可）の累積的なＸＴＥＮ配列の長さは約１００超、約２００超、約４００超、約５００超、約６００超、約８００超、約９００超、または１０００〜約３０００アミノ酸残基であり、融合タンパク質は、被験体に投与すると、同等の用量で投与した、ＸＴＥＮと連結していないＧＬＰ−２と比較して薬物動態的性質の増強を示す。前述の一実施形態では、１つまたは複数のＸＴＥＮ配列は、表４から選択される配列に対して少なくとも約８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９８％またはそれ以上の同一性を示し、もしあれば、担体配列（複数可）の残りは少なくとも９０％の親水性アミノ酸を含有し、配列全体の約２％未満は疎水性アミノ酸または芳香族アミノ酸またはシステインからなる。ＸＴＥＮと連結していないＧＬＰ−２と比較したＧＬＰ２−ＸＴＥＮの薬物動態的性質の増強は下により詳細に記載されている。 別の態様では、本発明は、より長い「ドナー」ＸＴＥＮ配列から、長さが短いまたは中間のＸＴＥＮを創出するための方法であって、より長いドナー配列をＮ末端またはＣ末端において短縮することによって創出する、またはドナー配列の内部から断片を創出し、それにより、長さが短いまたは中間のＸＴＥＮをもたらす方法を提供する。非限定的な例では、図３Ａ〜Ｃに概略的に示されている通り、８６４アミノ酸残基のＡＧ８６４配列を短縮して、１４４残基を有するＡＧ１４４、２８８残基を有するＡＧ２８８、５７６残基を有するＡＧ５７６、または他の中間の長さをもたらすことができ、一方、ＡＥ８６４配列（図３Ｄ、Ｅに示されている）を短縮して、ＡＥ２８８またはＡＥ５７６または他の中間の長さをもたらすことができる。具体的には、そのような手法を、本明細書に記載のＸＴＥＮ実施形態のいずれか、または表４または表８〜１２に列挙されている配列のいずれかと共に利用して、所望の長さのＸＴＥＮをもたらすことができることが意図されている。 ４．正味の電荷 他の実施形態では、ＸＴＥＮポリペプチドは、ＸＴＥＮ配列に正味の電荷を持つアミノ酸残基を組み込むこと、および含有される疎水性アミノ酸の割合を低くするまたは疎水性アミノ酸を含有させないことによって付与される非構造化特性を有する。全体的な正味の電荷および正味の電荷密度は、ＸＴＥＮ配列内の、正または負のいずれかの荷電アミノ酸の含有量を改変することによって制御され、一般には、正味の電荷は、反対の電荷を持つ残基によって相殺される残基を越えて荷電した状態に寄与しているポリペプチド内のアミノ酸の百分率として表される。いくつかの実施形態では、組成物のＸＴＥＮの正味の電荷密度は、＋０．１電荷／残基を上回る、または−０．１電荷／残基を下回る。本明細書では、タンパク質またはペプチドの「正味の電荷密度」とは、正味の電荷をタンパク質またはプロペプチド内のアミノ酸の総数で割ったものを意味する。他の実施形態では、ＸＴＥＮの正味の電荷は、約０％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、または約２０％またはそれ以上であってよい。いくつかの実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、セリンまたはグリシンなどの他の残基によって隔てられた荷電残基を含み、それにより、よりよい発現または精製の挙動が導かれる。正味の電荷に基づいて、いくつかのＸＴＥＮの等電点（ｐＩ）は、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、さらには６．５である。一実施形態では、ＸＴＥＮは１．５から４．５の間の等電点を有し、生理的条件下で正味の負電荷を有する。 ヒトまたは動物における大部分の組織および表面は正味の負電荷を有するので、いくつかの実施形態では、ＸＴＥＮを含有する組成物と種々の表面、例えば、血管、健康な組織、または種々の受容体などとの間の非特異的な相互作用を最小限にするために、ＸＴＥＮ配列を、正味の負電荷を有するように設計する。特定の理論に縛られず、ＸＴＥＮは、個々に正味の負電荷を有し、ＸＴＥＮポリペプチドの配列にわたって分布しているＸＴＥＮポリペプチドの個々のアミノ酸間の静電気的反発に起因して、開いたコンフォメーションをとることができる。いくつかの実施形態では、セリン、アラニン、トレオニン、プロリンまたはグリシンなどの他の残基によって隔てられた少なくとも９０％または９５％の荷電残基を有するＸＴＥＮ配列を設計し、それにより、より均一な電荷の分布、よりよい発現または精製の挙動が導かれる。配列の長さが延長されたＸＴＥＮにおけるそのような正味の負電荷の分布により、非構造化コンフォメーションが導かれ、今度はそれにより、流体力学的半径が有効に増大し得る。好ましい実施形態では、対象ＸＴＥＮの負電荷は、グルタミン酸残基を組み込むことによって付与される。一般に、グルタミン残基は、ＸＴＥＮ配列にわたって均一の間隔に置かれる。いくつかの場合には、ＸＴＥＮは、２０ｋＤａのＸＴＥＮ当たり約１０〜８０個、または約１５〜６０個、または約２０〜５０個のグルタミン酸残基を含有してよく、それにより、ｐＫａが非常に類似した荷電残基を有するＸＴＥＮをもたらすことができ、それにより、産物の電荷の均一性を増大させ、その等電点を鮮明にし、生じるＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質の物理化学的性質を増強し、したがって、精製手順を単純化することができる。例えば、負電荷を持つＸＴＥＮが望まれる場合、ＸＴＥＮは、ＡＥファミリー配列から単独で選択することができ、それは、組み入れられたグルタミン酸に起因しておよそ１７％の正味の電荷を有する、または、所望の程度の正味の電荷をもたらすために表３のグルタミン酸を含有するモチーフを種々の割合で含んでよい。ＡＥ ＸＴＥＮの非限定的な例としては、これだけに限定されないが、表４または表９のＡＥ３６ポリペプチド配列、ＡＥ４２ポリペプチド配列、ＡＥ４８ポリペプチド配列、ＡＥ１４４ポリペプチド配列、ＡＥ２８８ポリペプチド配列、ＡＥ５７６ポリペプチド配列、ＡＥ６２４ポリペプチド配列、ＡＥ８６４ポリペプチド配列、およびＡＥ９１２ポリペプチド配列、またはその断片が挙げられる。一実施形態では、表４または表９のＸＴＥＮ配列は、所望の正味の負電荷を実現するために、追加的なグルタミン酸残基を含むように改変することができる。したがって、一実施形態では、本発明は、ＸＴＥＮ配列がグルタミン酸を約１％、２％、４％、８％、１０％、１５％、１７％、２０％、２５％、さらには約３０％含有するＸＴＥＮを提供する。いくつかの場合には、ＸＴＥＮは、２０ｋＤａのＸＴＥＮ当たり約１０〜８０個、または約１５〜６０個、または約２０〜５０個のグルタミン酸残基を含有してよく、それにより、ｐＫａが非常に類似した荷電残基を有するＸＴＥＮをもたらすことができ、それにより、産物の電荷の均一性を増大させ、その等電点を鮮明にし、生じるＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質の物理化学的性質を増強し、したがって、精製手順を単純化することができる。一実施形態では、本発明は、正味の負電荷を実現するために、グルタミン酸に加えてアスパラギン酸残基をＸＴＥＮに組み込むことを意図している。 特定の理論に縛られず、より高い正味の負電荷を持つＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物のＸＴＥＮは、種々の負に荷電した表面、例えば、血管、組織、または種々の受容体などとの非特異的な相互作用が少なく、それが、活性なクリアランスの低下にさらに寄与することが予測される。逆に、正味の電荷が低い（またはそれを有さない）ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物のＸＴＥＮは、腸における炎症過程における食細胞の公知の寄与を考慮すると、関連するＧＬＰ−２の生物学的活性を強化し得る表面との相互作用の程度が高いと考えられる。 他の場合では、正味の電荷が望まれない場合、ＸＴＥＮは、例えば、表３のＡＧモチーフ、または表３のＡＭモチーフなどの、正味の電荷をほぼ持たないＡＧファミリーのＸＴＥＮ構成成分から選択することができる。ＡＧ ＸＴＥＮの非限定的な例としては、これだけに限定されないが、表４および表１１のＡＧ４２ポリペプチド配列、ＡＧ１４４ポリペプチド配列、ＡＧ２８８ポリペプチド配列、ＡＧ５７６ポリペプチド配列、およびＡＧ８６４ポリペプチド配列、またはその断片が挙げられる。別の実施形態では、ＸＴＥＮは、ＡＥモチーフおよびＡＧモチーフを種々の割合で含んでよい（所与の使用のために最適であると考えられる正味の電荷を持たせるためまたは所与の物理化学的性質を維持するため）。 本発明の組成物のＸＴＥＮは、一般には、正に荷電したアミノ酸を有さない、またはその含有量が少ない。いくつかの実施形態では、ＸＴＥＮは、約１０％未満の、正電荷を持つアミノ酸残基、または約７％未満、または約５％未満、または約２％未満、または約１％未満の、正電荷を持つアミノ酸残基を有してよい。しかし、本発明は、リシンなどの正電荷を持つアミノ酸を限られた数でＸＴＥＮに組み入れて、リシンのイプシロンアミンと、ＧＬＰ−２ペプチドの反応性基、リンカーブリッジ、またはＸＴＥＮ骨格とコンジュゲートさせるための薬物または小分子の反応性基との間のコンジュゲーションを可能にした構築物を意図している。前述の一実施形態では、ＸＴＥＮは、約１個から約１００個の間のリシン残基、または約１〜約７０個のリシン残基、または約１〜約５０個のリシン残基、または約１〜約３０個のリシン残基、または約１〜約２０個のリシン残基、または約１〜約１０個のリシン残基、または約１〜約５個のリシン残基、あるいは、ただ１つのリシン残基を有する。前述のリシンを含有するＸＴＥＮを使用すると、ＸＴＥＮ、ＧＬＰ−２、それに加えてＧＬＰ−２に関連する疾患または障害の治療において有用な化学療法剤を含む融合タンパク質が構築され、ＸＴＥＮ構成成分に組み入れる作用剤の分子の最大数は、ＸＴＥＮに組み入れるリシンまたは反応性側鎖を有する他のアミノ酸（例えば、システイン）の数によって決定される。したがって、本発明は、ＸＴＥＮ、ＧＬＰ−２、それに加えてＧＬＰ−２に関連する疾患または障害の治療において有用な化学療法剤を含む融合タンパク質が構築され、ＸＴＥＮ構成成分に組み入れる作用剤の分子の最大数がシステインの数によって決定される、１〜約１０個のシステイン残基、または約１〜約５個のシステイン残基、あるいは、ただ１つのシステイン残基を有するＸＴＥＮも提供する。 疎水性アミノ酸によりポリペプチドの構造が付与されるので、本発明は、一般には、５％未満、または２％未満、または１％未満の疎水性アミノ酸含有量になるＸＴＥＮ内の疎水性アミノ酸の含有量を提供する。一実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮ構成成分内のメチオニンおよびトリプトファンについてのアミノ酸含有量は一般には、５％未満、または２％未満、最も好ましくは１％未満である。別の実施形態では、ＸＴＥＮは、全ＸＴＥＮ配列の１０％未満の、正電荷を持つアミノ酸残基、または約７％未満、約５％未満、または約２％未満の、正電荷を持つアミノ酸残基を有し、メチオニン残基とトリプトファン残基の合計が２％未満であり、アスパラギン残基とグルタミン残基の合計が５％未満である配列を有する。 ５．低免疫原性 別の態様では、本発明は、ＸＴＥＮ配列が低程度の免疫原性を有するまたは実質的に非免疫原性である組成物を提供する。ＸＴＥＮの低免疫原性には、いくつかの因子、例えば、非反復配列、非構造化コンフォメーション、溶解度の程度が高いこと、自己凝集の程度が低いことまたはそれが欠如していること、配列内のタンパク質分解部位の程度が低いことまたはそれが欠如していること、およびＸＴＥＮ配列内のエピトープの程度が低いことまたはそれが欠如していることが寄与する可能性がある。 立体構造エピトープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｅｐｉｔｏｐｅ）は、多数の不連続なタンパク質抗原のアミノ酸配列で構成されるタンパク質表面の領域によって形成される。タンパク質の正確な折り畳みにより、これらの配列が、宿主体液性免疫系によって「外来」と認識され得る、明確に定義された安定な空間的配置、またはエピトープになり、その結果、タンパク質に対する抗体の産生または細胞媒介性免疫応答の活性化がもたらされる。後者の場合、個体におけるタンパク質に対する免疫応答は、その個体のＨＬＡ−ＤＲアロタイプのペプチド結合特異性の機能であるＴ細胞エピトープ認識の影響を重度に受ける。ＭＨＣクラスＩＩペプチド複合体とＴ細胞の表面上の同族のＴ細胞受容体の会合により、ＣＤ４分子などの特定の他の補助受容体の架橋結合と共に、Ｔ細胞内で活性化された状態を誘導することができる。活性化により、Ｂ細胞などの他のリンパ球をさらに活性化するサイトカインが放出されて、抗体が産生される、または完全な細胞性免疫応答としてＴキラー細胞が活性化される。 ＡＰＣ（抗原提示細胞）の表面上での提示のために所与のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するペプチドの能力は、いくつもの因子、とりわけ、その一次配列に左右される。一実施形態では、低程度の免疫原性は、抗原提示細胞における抗原プロセシングに抵抗するＸＴＥＮ配列を設計し、かつ／またはＭＨＣ受容体に十分に結合しない配列を選択することによって実現される。本発明は、ＭＨＣＩＩ受容体との結合が低下するとともに、Ｔ細胞受容体または抗体が結合するエピトープの形成が回避され、その結果免疫原性の程度が低くなるように設計された実質的に非反復性のＸＴＥＮポリペプチドを有するＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。免疫原性の回避は、少なくとも部分的に、ＸＴＥＮ配列のコンフォメーションの柔軟性、すなわち、アミノ酸残基の選択および順序に起因した二次構造の欠如の結果に帰することができる。例えば、水溶液中または生理的条件下で、立体構造エピトープがもたらされ得る緻密に折り畳まれたコンフォメーションをとる傾向が低い配列が特に興味深い。従来の治療実務および投薬を用いてＸＴＥＮを含む融合タンパク質を投与することにより、一般に、ＸＴＥＮ配列に対する中和性抗体は形成されず、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物内のＧＬＰ−２融合パートナーの免疫原性も低下する。 一実施形態では、対象融合タンパク質に利用するＸＴＥＮ配列は、ヒトＴ細胞によって認識されるエピトープを実質的に含まなくてよい。免疫原性の低いタンパク質を生成するためにそのようなエピトープを排除することは、以前に開示されている。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ９８／５２９７６、ＷＯ０２／０７９２３２、およびＷＯ００／３３１７を参照されたい。ヒトＴ細胞エピトープについてのアッセイは記載されている（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ， Ｍ．ら（２００３年）Ｊ ｌｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２８１巻：９５〜１０８頁）。Ｔ細胞エピトープまたは非ヒト配列の生成を伴わずにオリゴマー形成することができるペプチド配列が特に興味深い。これは、これらの配列のダイレクトリピートをＴ細胞エピトープの存在について、およびヒトのものではない６〜１５ｍｅｒ、特に、９ｍｅｒの配列の出現について試験し、次いで、ＸＴＥＮ配列の設計を変更して、エピトープ配列を排除または撹乱することによって実現される。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ受容体に結合することが予測されるＸＴＥＮのエピトープの数を制限することによってＸＴＥＮ配列を実質的に非免疫原性にする。ＭＨＣ受容体に結合することができるエピトープの数が減少すると、同時に、Ｔ細胞活性化ならびにＴ細胞ヘルパー機能の潜在性が低下し、Ｂ細胞の活性化または上方制御が低下し、また抗体産生が減少する。低程度の予測Ｔ細胞エピトープは、実施例３１に示されている通り、ＴＥＰＩＴＯＰＥ（Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ， Ｔ．ら（１９９９年）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｃｃｈｎｏｌ、１７巻：５５５〜６１頁）などのエピトープ予測アルゴリズムによって決定することができる。タンパク質内の所与のペプチド枠のＴＥＰＩＴＯＰＥスコアは、Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ， Ｔ．ら（１９９９年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７巻：５５５頁）に開示されている通り、そのペプチド枠と多数の最も一般的なヒトＭＨＣ対立遺伝子の結合のＫｄ（解離定数、親和性、解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ））の対数である。スコアは、約１０〜約−１０の少なくとも２０ｌｏｇ（１×１０１０Ｋｄ〜１×１０−１０Ｋｄの結合制約に対応する）にわたり、ＭＨＣ上のペプチド提示の間にアンカー残基としての機能を果たす疎水性アミノ酸、例えば、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆなどを回避することによって低下させることができる。いくつかの実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮに組み入れられるＸＴＥＮ構成成分は、ＴＥＰＩＴＯＰＥ閾値スコア約−５、または−６、または−７、または−８、または−９、またはＴＥＰＩＴＯＰＥスコア−１０において予測Ｔ細胞エピトープを有さない。本明細書で使用される場合、スコア「−９」は、スコア−５よりもストリンジェントなＴＥＰＩＴＯＰＥ閾値になる。 別の実施形態では、対象ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質に組み入れられたものを含めた本発明のＸＴＥＮ配列は、ＸＴＥＮの配列由来の公知のタンパク質分解部位を制限し、それによりＸＴＥＮがＭＨＣＩＩ受容体に結合することができる小さなペプチドにプロセシングされることを減少させることによって実質的に非免疫原性にされている。別の実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、二次構造を実質的に欠く配列を使用し、それにより、構造のエントロピーが高いことに起因して多くのプロテアーゼに対する抵抗性を付与することによって実質的に非免疫原性にされている。したがって、ＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを低下させること、およびＸＴＥＮから公知のタンパク質分解部位を排除することにより、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質組成物のＸＴＥＮを含めたＸＴＥＮ組成物が、免疫系のものを含めた哺乳動物の受容体と実質的に結合することができなくなる。一実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮは、哺乳動物の受容体に対して＞１００ｎＭのＫｄの結合性、または哺乳動物の細胞表面ポリペプチド受容体または循環ポリペプチド受容体に対して５００ｎＭ超のＫｄ、または１μＭ超のＫｄを有する。 さらに、非反復配列および対応するＸＴＥＮのエピトープの欠如により、Ｂ細胞のＸＴＥＮに結合するまたはＸＴＥＮによって活性化される能力が限定される。反復配列は、わずかなＢ細胞によってさえも認識され、それと多価の接触を形成することができ、多数のＴ細胞非依存性受容体が架橋した結果として、Ｂ細胞の増殖および抗体産生を刺激することができる。対照的に、ＸＴＥＮはその延長された配列にわたって多くの異なるＢ細胞と接触することができるが、配列の反復性が欠如しているので、個々のＢ細胞は個々のＸＴＥＮと１つまたは少数の接触しかできない。いかなる理論にも縛られず、ＸＴＥＮは、一般には、Ｂ細胞の増殖、したがって免疫応答を刺激する傾向がはるかに低い。一実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮの免疫原性はＸＴＥＮと融合していない対応するＧＬＰ−２と比較して低下している。一実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮを哺乳動物に最大３回非経口投与することにより、１：１００の血清希釈度では検出可能であるが１：１０００の希釈度では検出できない抗ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ ＩｇＧがもたらされる。別の実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮを哺乳動物に最大３回非経口投与することにより、１：１０００の血清希釈度では検出可能であるが、１：１０，０００の希釈度では検出できない抗ＧＬＰ−２ ＩｇＧがもたらされる。別の実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮを哺乳動物に最大３回非経口投与することにより、１：１０，０００の血清希釈度では検出可能であるが、１：１，０００，０００の希釈度では検出できない抗ＸＴＥＮ ＩｇＧがもたらされる。前述の実施形態では、哺乳動物はマウス、ラット、ウサギ、またはカニクイザルであってよい。 反復性の程度が高い配列と比較した非反復配列を有するＸＴＥＮの追加的な特徴は、非反復性ＸＴＥＮの方が弱い抗体との接触を形成することである。抗体は多価の分子である。例えば、ＩｇＧは２つの同一の結合部位を有し、ＩｇＭは１０個の同一の結合部位を含有する。したがって、反復配列に対する抗体は、そのような反復配列と高い結合活性で多価の接触を形成することができ、これは、そのような反復配列の効力および／または排除に影響を及ぼし得る。対照的に、非反復性ＸＴＥＮに対する抗体により、一価の相互作用がもたらされ、その結果、免疫クリアランスの可能性が低くなり、したがって、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物が循環中にとどまる時間が長くなり得る。 ６．流体力学的半径の増大 別の態様では、本発明は、ＸＴＥＮポリペプチドが高い流体力学的半径を有し、ＸＴＥＮが組み入れられているＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質にそれに対応する見かけの分子量の増大が付与されるＸＴＥＮを提供する。実施例２５において詳述されている通り、ＸＴＥＮを治療用タンパク質配列と連結することにより、ＸＴＥＮと連結していない治療用タンパク質と比較して流体力学的半径の増大、見かけの分子量の増大、および見かけの分子量率の増大を有し得るＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物がもたらされる。例えば、引き伸ばされた半減期が望まれる治療的適用では、治療用タンパク質を含む融合タンパク質に流体力学的半径が大きいＸＴＥＮを組み入れる組成物は、組成物の流体力学的半径を、およそ３〜５ｎｍの糸球体の孔径を越えて有効に拡大し（約７０ｋＤＡの見かけの分子量に対応する）（Ｃａｌｉｃｅｔｉ． ２００３年、Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ． Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ５５巻：１２６１〜１２７７頁）、その結果、対応して終末相半減期が増大し、他の薬物動態的性質が増強された循環タンパク質の腎臓クリアランスが低下する。タンパク質の流体力学的半径は、その分子量によってだけでなく、形状または緻密さを含めたその構造によっても決定される。特定の理論に縛られず、ＸＴＥＮは、二次構造を付与する可能性が欠如している配列内の特定のアミノ酸によって付与されるペプチドの個々の電荷間の静電気的反発または固有の柔軟性に起因して、開いたコンフォメーションをとり得る。ＸＴＥＮポリペプチドの開いた、延長され構造化されていないコンフォメーションは、配列の長さおよび／または分子量が同等であり、典型的な球状タンパク質などの二次構造および／または三次構造を有するポリペプチドと比較してより大きく比例する流体力学的半径を有し得る。流体力学的半径を決定するための方法は、例えば、米国特許第６，４０６，６３２号および同第７，２９４，５１３号に記載の通りサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用することによるものなど、当技術分野で周知である。実施例２５の結果により実証されている通り、長さが増大したＸＴＥＮを付加することにより、流体力学的半径のパラメータ、見かけの分子量、および見かけの分子量率が比例的に増大し、それにより、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮを所望の特徴的カットオフ見かけの分子量または流体力学的半径に合わせて調整することが可能になる。したがって、ある特定の実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を、融合タンパク質の流体力学的半径が少なくとも約５ｎｍ、または少なくとも約８ｎｍ、または少なくとも約１０ｎｍ、または１２ｎｍ、または少なくとも約１５ｎｍになり得るようにＸＴＥＮを用いて配置することができる。前述の実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質内のＸＴＥＮによって付与される大きな流体力学的半径により、生じた融合タンパク質の腎臓クリアランスの低下がもたらされる可能性があり、それにより、対応する終末相半減期の増大、平均保持時間の増大、および／または腎臓クリアランス速度の低下が導かれる。 ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質の分子量をサイズ排除クロマトグラフィー分析から導く場合、二次構造の程度が低いことに起因するＸＴＥＮの開いたコンフォメーションにより、融合タンパク質の見かけの分子量が増大する。いくつかの実施形態では、ＧＬＰ−２および少なくとも第１のまたは多数のＸＴＥＮを含むＧＬＰ２−ＸＴＥＮの見かけの分子量は、少なくとも約２００ｋＤａ、または少なくとも約４００ｋＤａ、または少なくとも約５００ｋＤａ、または少なくとも約７００ｋＤａ、または少なくとも約１０００ｋＤａ、または少なくとも約１４００ｋＤａである。したがって、１つまたは複数のＸＴＥＮを含むＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質の見かけの分子量は、融合タンパク質の実際の分子量よりも約２倍大きい、または約３倍大きい、または約４倍大きい、または約８倍大きい、または約１０倍大きい、または約１２倍大きい、または約１５倍大きいまたは約２０倍大きい。一実施形態では、本明細書に開示されている実施形態のいずれかの単離されたＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質の見かけの分子量率は、生理的条件下で、約２超、または約３超、または約４超、または約５超、または約６超、または約７超、または約８超、または約１０超、または約１５超、または約２０超である。別の実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質の見かけの分子量率は、生理的条件下で、融合タンパク質の実際の分子量に対して約３〜約２０、または約５〜約１５、または約８〜約１４、または約１０〜約１２である。 ＩＶ）．ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物 本発明は、一部において、１つまたは複数のＸＴＥＮと連結したＧＬＰ−２を含む融合タンパク質組成物に関し、融合タンパク質は、被験体に投与すると、現存するＧＬＰ−２を置き換えるまたは強化するように作用する。本発明は、それを必要とする被験体に外因的に投与されたＧＬＰ−２の終末相半減期を増大させることの長年にわたる必要性に対処する。治療用タンパク質の循環半減期を増大させる１つのやり方は、タンパク質の腎臓クリアランスを確実に低下させることである。循環半減期を増大させるための別のやり方は、受容体、タンパク質の活性な代謝、または他の内在性機構のいずれによって媒介されるにせよ、治療用タンパク質の活性なクリアランスを低下させることである。どちらも、タンパク質をポリマーとコンジュゲートすることによって実現することができ、いくつかの場合にはタンパク質に分子サイズ（または流体力学的半径）の増大を付与すること、したがって、腎臓クリアランスを低下させることができ、他の場合では、タンパク質とクリアランス受容体または代謝もしくはクリアランスに寄与する他のタンパク質との結合に干渉する。したがって、本発明の特定の目的としては、これだけに限定されないが、現在利用可能なＧＬＰ−２調製物と比較して、循環半減期または終末相半減期がより長く、ＧＬＰ−２組成物の必要な投与の回数または頻度が減少し、ネイティブなＧＬＰ−２の生物学的活性の少なくとも一部分が保持され、かつＧＬＰ−２に関連する疾患または胃腸の状態を処置する能力が増強し、その結果、臨床症候および全体的なウェルビーイングがより効率的に、より有効に、より経済的に改善され、安全性が高い、改善されたＧＬＰ−２分子を提供することが挙げられる。 これらの必要性に応じるために、第１の態様では、本発明は、１つまたは複数のＸＴＥＮと共有結合で連結した生物学的に活性なＧＬＰ−２を含み、それによりＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質がもたらされる単離された融合タンパク質組成物を提供する。対象ＧＬＰ−２−ＸＴＥＮは、野生型ＧＬＰ−２の１つまたは複数の生物学的活性または治療活性を媒介し得る。ＧＬＰ２−ＸＴＥＮは、組換えによって、またはＧＬＰ−２とＸＴＥＮの化学的コンジュゲーションによって作製することができる。一実施形態では、ＧＬＰ−２はネイティブなＧＬＰ−２である。別の実施形態では、ＧＬＰ−２は、ネイティブなＧＬＰ−２の生物学的活性の少なくとも一部分を保持する天然の配列の配列変異体である。一実施形態では、ＧＬＰ−２は、最適にアラインメントすると、表１の配列からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する配列である。別の実施形態では、ＧＬＰ−２は、成熟ＧＬＰ−２ペプチドの残基番号２のアラニンがグリシンで置換された配列変異体である。一実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮは、配列ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤを有するＧＬＰ−２を含む。一実施形態では、本発明は、１つまたは複数のＸＴＥＮを含む、Ｎ末端および／またはＣ末端が修飾された形態のＧＬＰ−２を含むＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。 対象組成物のＧＬＰ−２、特に表１に開示されているものは、それらの対応する核酸およびアミノ酸配列とともに当技術分野で周知であり、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅｓ（例えば、ＣＡＳ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ）、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＵｎｉＰｒｏｔ）などの公共のデータベース、およびＧｅｎＳｅｑ（例えば、Ｄｅｒｗｅｎｔ）などの会員制提供データベースにおいて説明および配列が入手可能である。ポリヌクレオチド配列は、所与のＧＬＰ−２（例えば、全長または成熟）をコードする野生型ポリヌクレオチド配列であってもよく、いくつかの場合には、配列は、野生型ポリヌクレオチド配列の変異体（例えば、野生型の生物学的に活性なタンパク質をコードし、ＤＮＡ配列が、例えば特定の種において発現させるために最適化されているポリヌクレオチド、または野生型タンパク質の変異体、例えば、部位特異的な突然変異体または対立遺伝子変異体などをコードするポリヌクレオチドであってもよい。野生型またはコンセンサスｃＤＮＡ配列またはＧＬＰ−２のコドン最適化配列変異体を使用して、本発明によって意図されているＧＬＰ２−ＸＴＥＮ構築物を、当技術分野で公知の方法を用いて、かつ／または本明細書において提供され、実施例においてより詳細に記載されている手引きおよび方法と併せて創出することは、十分に当業者の能力の範囲内である。 いくつかの実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、ネイティブなＧＬＰ−２の生物学的活性の少なくとも一部分を保持する。本発明のＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、ＧＬＰ−２受容体に結合し、それを活性化することができる。一実施形態では、本発明のＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質のＥＣ５０値は、本明細書に記載のものまたは当技術分野で公知の他のものなどのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＧＬＰ−２受容体結合アッセイを用いて評価した場合、約３０ｎＭ未満、または約１００ｎＭ未満、または約２００ｎＭ未満、または約３００ｎＭ未満、または約４００ｎＭ未満、または約５００ｎＭ未満、または約６００ｎＭ未満、または約７００ｎＭ未満、または約８００ｎＭ未満、または約１０００ｎＭ未満、または約１２００ｎＭ未満、または約１４００ｎＭ未満である。別の実施形態では、本発明のＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、実施例に記載のものまたは当技術分野で公知の他のものなどのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＧＬＰ２Ｒ細胞アッセイを用いてアッセイした場合、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２の効力の少なくとも約１％、または約２％、または約３％、または約４％、または約５％、または約１０％、または約２０％、または約３０％を保持する。 いくつかの実施形態では、本開示のＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、腸栄養活性、創傷治癒活性および抗炎症活性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質組成物は、被験体に投与すると、本明細書に開示されている胃腸に関連するパラメータの１つ、２つ、３つ、またはそれ以上が、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２構成成分によって実現されるパラメータ（複数可）と比較して少なくとも約２０％、または３０％、または４０％、または５０％、または６０％、または７０％、または８０％、または９０％、または１００％、または１２０％、または１４０％、少なくとも約１５０％大きく改善される。パラメータは、とりわけ、ＧＬＰ−２の血中濃度、腸間膜血流の増大、炎症の減少、体重増加の増大、下痢の減少、糞便の湿重量の減少、腸の創傷治癒、血漿シトルリン濃度の上昇、ＣＲＰレベルの低下、ステロイド療法の必要性の減少、粘膜完全性の増強または刺激、ナトリウム損失の減少、体重を維持するために必要な非経口栄養の減少、腸内への細菌のトランスロケーションの最小化、緩和、または予防、外科手術後の腸の回復の増強、刺激または加速、炎症性腸疾患の再発の予防、またはエネルギー恒常性の実現または維持から選択される測定パラメータであってよい。一実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を被験体に投与することにより、腸が外科的に切除された（例えば、短腸症候群）またはクローン病の被験体に投与した場合、同等のｎｍｏｌ／ｋｇ用量および用量レジメンで投与した、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較して小腸の重量および／または長さを増大させる能力が大きくなる。別の実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、クローン病（自然に獲得されたものか実験的に誘導したもののいずれか）の被験体に投与した場合、同等のｎｍｏｌ／ｋｇ用量および用量レジメンで投与した、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２構成成分と比較して少なくとも約１０％、または２０％、または３０％、または４０％、または５０％、または６０％、または７０％、または８０％、または少なくとも約９０％大きな、潰瘍形成を減少させる能力を示す。別の実施形態では、融合タンパク質は、クローン病（自然に獲得されたものか実験的に誘導したもののいずれか）の被験体に投与した場合、同等のｎｍｏｌ／ｋｇ用量および用量レジメンで投与した、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２構成成分と比較して少なくとも約２０％、または３０％、または４０％、または５０％、または６０％、または７０％、または８０％、または少なくとも約９０％の炎症性サイトカインを減少させる能力を示す。別の実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、クローン病（自然に獲得されたものか実験的に誘導したもの、例えば、インドメタシンの投与のいずれか）の被験体に投与した場合、同等のｎｍｏｌ／ｋｇ用量および用量レジメンで投与した、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２構成成分と比較して少なくとも約１０％、または２０％、または３０％、または４０％、または５０％、または６０％、または７０％、または８０％、または少なくとも約９０％大きな、粘膜の萎縮を低下させる能力を示す。別の実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、クローン病（自然に獲得されたものか実験的に誘導したもの、例えば、インドメタシンの投与のいずれか）の被験体に投与した場合、同等のｎｍｏｌ／ｋｇ用量および用量レジメンで投与した、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２構成成分と比較して少なくとも約５％、または少なくとも約６％、または７％、または８％、または９％、または１０％、または１１％、または１２％、または１５％、または少なくとも約２０％大きな、腸絨毛の高さを増大させる能力を示す。別の実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、クローン病（自然に獲得されたものか実験的に誘導したもの、例えば、インドメタシンの投与のいずれか）の被験体に投与した場合、同等のｎｍｏｌ／ｋｇ用量および用量レジメンで投与した、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２構成成分と比較して少なくとも約１０％、または２０％、または３０％、または４０％、または５０％、または６０％、または７０％、または８０％、または少なくとも約９０％大きな、体重を増大させる能力を示す。本段落の前述の実施形態では、被験体は、マウス、ラット、サルおよびヒトからなる群より選択される。 本発明の組成物は、被験体に投与すると、例えば、これだけに限定されないが、潰瘍、胃炎、消化障害、吸収不良症候群、短消化管症候群、短腸症候群、盲管症候群、炎症性腸疾患、小児脂肪便症、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症性スプルー、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸炎、化学療法誘導性腸炎、過敏性腸症候群、小腸損傷、癌化学療法に起因する小腸損傷、胃腸傷害、下痢性疾患、腸管機能不全症、酸誘導性腸管傷害、アルギニン欠乏症、特発性精液減少症、肥満症、異化疾病、発熱性好中球減少症、糖尿病、肥満症、脂肪便、自己免疫疾患、食物アレルギー、低血糖症、胃腸関門障害、敗血症、細菌性腹膜炎、熱傷誘導性腸管損傷、胃腸運動の低下、腸管不全症、化学療法に付随する菌血症、腸管外傷、腸管虚血、腸間膜虚血、栄養失調、壊死性腸炎、壊死性膵炎、新生児哺乳不耐性、ＮＳＡＩＤ誘導性胃腸損傷、栄養不足、胃腸管に対する完全非経口栄養による損傷、新生児栄養不足、放射線誘導性腸炎、放射線によって誘導される腸への傷害、癌の化学療法に付随する粘膜炎および過敏性腸疾患、回腸嚢炎、虚血、および脳卒中などのＧＬＰ−２に関連する胃腸の状態を媒介または予防するまたは向上させるために有用な融合タンパク質を含む。 ネイティブなＧＬＰ−２と比較して、薬物動態パラメータの増大、溶解度の増大、安定性の増大、またはいくつかの他の薬学的性質の増強が得られ、それにより、有効性、安全性が増強された組成物、または投薬頻度の低下をもたらし、かつ／または患者の管理を改善するための組成物がもたらされるＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質組成物が特に興味深い。本明細書に開示されている実施形態のＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、本明細書において詳述されている改善された性質および／または実施形態の１つまたは複数、またはその任意の組合せを示す。したがって、対象ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質組成物は、例えば、被験体に投与すると、ＸＴＥＮと連結していないＧＬＰ−２と比較してｉｎ ｖｉｖｏにおける曝露またはＧＬＰ２−ＸＴＥＮが治療域内にとどまる長さを増大させることによって生理活性ＧＬＰ−２の治療効果を改善することを含めて考慮して、種々の目的で設計され、調製される。 一実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、単一のＸＴＥＮ（例えば、上記のＸＴＥＮ）と連結した単一のＧＬＰ−２分子を含む。別の実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮは、２つのＸＴＥＮと連結した単一のＧＬＰ−２を含み、ＸＴＥＮは同一であっても異なってもよい。別の実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、第１のＸＴＥＮおよび第２のＸＴＥＮと連結した単一のＧＬＰ−２分子を含み、ＧＬＰ−２は、表１から選択されるタンパク質配列と比較して少なくとも約８０％の配列同一性、あるいは、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する配列であり、第１のＸＴＥＮおよび第２のＸＴＥＮは、それぞれ、表４から選択される１つまたは複数の配列、またはその断片と比較して少なくとも約８０％の配列同一性、あるいは、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する配列である。別の実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、表３３および表３４の配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性、あるいは、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。 １．ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質の配置 本発明は、ＧＬＰ−２構成成分とＸＴＥＮ構成成分が特異的なＮ末端からＣ末端までの配置で連結したＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質組成物を提供する。 ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物の一実施形態では、本発明は、式Ｉの融合タンパク質を提供する： （ＧＬＰ−２）−（ＸＴＥＮ） Ｉ （式中、各出現に対してそれぞれ独立に、ＧＬＰ−２は、表１の配列に対して少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含めた、本明細書で定義されているＧＬＰ−２タンパク質または変異体であり、ＸＴＥＮは、これだけに限定されないが、表４に記載されている配列に対して少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含めた、本明細書に記載の延長組換えポリペプチドである）。 ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物の別の実施形態では、本発明は、式ＩＩの融合タンパク質を提供する： （ＸＴＥＮ）−（ＧＬＰ−２） ＩＩ （式中、各出現に対してそれぞれ独立に、ＧＬＰ−２は、表１の配列に対して少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含めた、本明細書で定義されているＧＬＰ−２タンパク質または変異体であり、ＸＴＥＮは、これだけに限定されないが、表４に記載されている配列に対して少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含めた、本明細書に記載の延長組換えポリペプチドである）。 ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物の別の実施形態では、本発明は、単離された式ＩＩＩの融合タンパク質を提供する： （ＸＴＥＮ）−（ＧＬＰ−２）−（ＸＴＥＮ） ＩＩＩ （式中、各出現に対してそれぞれ独立に、ＧＬＰ−２は、表１の配列に対して少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含めた、本明細書で定義されているＧＬＰ−２タンパク質または変異体であり、ＸＴＥＮは、これだけに限定されないが、表４に記載されている配列に対して少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含めた、本明細書に記載の延長組換えポリペプチドである）。 ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物の別の実施形態では、本発明は、単離された式ＩＶの融合タンパク質を提供する： （ＧＬＰ−２）−（ＸＴＥＮ）−（ＧＬＰ−２） ＩＶ （式中、各出現に対してそれぞれ独立に、ＧＬＰ−２は、表１の配列に対して少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含めた、本明細書で定義されているＧＬＰ−２タンパク質または変異体であり、ＸＴＥＮは、これだけに限定されないが、表４に記載されている配列に対して少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含めた、本明細書に記載の延長組換えポリペプチドである）。 ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物の別の実施形態では、本発明は、単離された式Ｖの融合タンパク質を提供する： （ＧＬＰ−２）−（Ｓ）ｘ−（ＸＴＥＮ） Ｖ （式中、各出現に対してそれぞれ独立に、ＧＬＰ−２は、表１の配列に対して少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含めた、本明細書で定義されているＧＬＰ−２タンパク質または変異体であり、Ｓは、切断配列または制限部位と適合するアミノ酸を場合によって含んでよい、１〜約５０アミノ酸残基を有するスペーサー配列であり、ｘは０または１のいずれかであり、ＸＴＥＮは、これだけに限定されないが、表４に記載されている配列に対して少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含めた、本明細書に記載の延長組換えポリペプチドである）。 ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物の別の実施形態では、本発明は、単離された式ＶＩの融合タンパク質を提供する： （ＸＴＥＮ）ｘ−（Ｓ）ｘ−（ＧＬＰ−２）−（Ｓ）ｙ−（ＸＴＥＮ）ｙ ＶＩ （式中、各出現に対してそれぞれ独立に、ＧＬＰ−２は、表１の配列に対して少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含めた、本明細書で定義されているＧＬＰ−２タンパク質または変異体であり、Ｓは、切断配列または制限部位と適合するアミノ酸を場合によって含んでよい、１〜約５０アミノ酸残基を有するスペーサー配列であり、ｘは０または１のいずれかであり、ｙは０または１のいずれかであり、ｘ＋ｙ≧１であり、ＸＴＥＮは、これだけに限定されないが、表４に記載されている配列に対して少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含めた、本明細書に記載の延長組換えポリペプチドである）。 式Ｉ〜ＶＩの実施形態は、長さが約３６アミノ酸から３０００アミノ酸までにわたる１つまたは複数のＸＴＥＮ（例えば、表４から選択される配列またはその断片、またはそれに対して少なくとも約９０〜９５％またはそれ以上の配列同一性を示す配列）がＧＬＰ−２のＮ末端またはＣ末端と連結しているＧＬＰ２−ＸＴＥＮの配置を包含する。式Ｖの実施形態は、ＸＴＥＮが、制限部位と適合するアミノ酸を場合によって含んでもよく、切断配列（例えば、下でより詳細に記載されている表５および表６の配列）を含んでもよいスペーサー配列を介してＧＬＰ−２と連結しており、したがって、制限部位の場合ではＸＴＥＮコード配列をＧＬＰ２−ＸＴＥＮ構築物に組み込むことができ、切断配列の場合では切断配列に適したプロテアーゼの作用によってＸＴＥＮを融合タンパク質から放出されることができる配置をさらに提供する。式Ｖの一実施形態では、融合タンパク質は、単一のグリシン残基であるスペーサー配列を含む。 ２．スペーサーおよび切断配列を有するＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質配置 別の態様では、本発明は、組成物に機能性もしくは性質を組み入れるもしくはそれを増強するために、または融合タンパク質組成物の組立てもしくは製造の補助として設計した１つまたは複数のスペーサー配列をＸＴＥＮに組み入れ、またはそれに近接させて配置したＧＬＰ２−ＸＴＥＮを提供する。そのような性質としては、これだけに限定されないが、構成成分の放出を可能にするためのＴＥＶまたは表６の他の切断配列などの切断配列（複数可）を含めること、ＸＴＥＮをコードするヌクレオチドとＧＬＰ−２をコードするヌクレオチドの連結を可能にするための、または発現ベクターの構築を容易にするヌクレオチド制限部位と適合するアミノ酸を含めること、およびＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質の領域内の立体障害を減少させるために設計されたリンカーが挙げられる。 ある実施形態では、ＧＬＰ−２構成成分がその所望の三次構造を仮定し、かつ／またはその標的受容体と適切に相互作用することができるように、ＸＴＥＮ配列とＧＬＰ−２構成成分の間にスペーサー配列を導入して立体的な障害を減少させることができる。スペーサーおよび望ましいスペーサーを同定する方法については、例えば、参照により明確に本明細書に組み込まれるＧｅｏｒｇｅら（２００３年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １５巻：８７１〜８７９頁を参照されたい。一実施形態では、スペーサーは、１〜５０アミノ酸残基の長さ、または約１〜２５残基、または約１〜１０残基の長さの１つまたは複数のペプチド配列を含む。スペーサー配列は、切断部位を除いて、２０種の天然Ｌアミノ酸のいずれを含んでもよく、１）例えば、これだけに限定されないが、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、プロリン（Ｐ）およびアスパラギン酸（Ｄ）などの立体障害のない親水性アミノ酸を含み、２）実質的に非反復性であるという点でＸＴＥＮ様の性質を有することが好ましい。さらに、スペーサー配列は、Ｔ細胞エピトープの導入が回避されるように設計し、この決定は、上および実施例に記載されている。いくつかの場合には、スペーサーはポリグリシンまたはポリアラニンであってよい、またはグリシン残基、セリン残基およびアラニン残基の組合せの混合物であることが優勢である。一実施形態では、スペーサー配列は、切断部位アミノ酸を除いて、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）から選択されるアミノ酸からなる約１〜１０アミノ酸を有し、二次構造を実質的に欠く；例えば、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎおよび／またはＧＯＲアルゴリズムによって決定したところ約１０％未満、または約５％未満である。一実施形態では、スペーサー配列はＧＰＥＧＰＳである。別の実施形態では、スペーサー配列は単一のグリシン残基である。別の実施形態では、スペーサー配列は、表６の切断配列と連結したＧＰＥＧＰＳである。 特定の実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、融合タンパク質に組み入れられたペイロードＧＬＰ−２配列ともう１つのＸＴＥＮの間の接合部（複数可）で連結した１つまたは複数のスペーサー配列を含み、スペーサー配列は、制限部位をコードするヌクレオチドと適合するアミノ酸を含む。別の実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、融合タンパク質に組み入れられたペイロードＧＬＰ−２配列とシグナル配列の間の接合部（複数可）で連結した１つまたは複数のスペーサー配列を含み、スペーサー配列は、発現後にＧＬＰ２−ＸＴＥＮを放出させるための切断配列（例えば、ＴＥＶ）を含む。別の実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、融合タンパク質に組み入れられたペイロードＧＬＰ−２配列ともう１つのＸＴＥＮの間の接合部（複数可）で連結した１つまたは複数のスペーサー配列を含み、スペーサー配列は、制限部位をコードするヌクレオチドと適合するアミノ酸を含み、アミノ酸およびもう１つのスペーサー配列アミノ酸は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）から選択される。別の実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、融合タンパク質に組み入れられたペイロードＧＬＰ−２配列ともう１つのＸＴＥＮの間の接合部（複数可）で連結した１つまたは複数のスペーサー配列を含み、スペーサー配列は、制限部位をコードするヌクレオチドと適合するアミノ酸を含み、もう１つのスペーサー配列は表５の配列から選択される。各スペーサー配列の正確な配列は、特定のＧＬＰ２−ＸＴＥＮ構築物のために使用する発現ベクター内のクローニング部位と適合するように選択する。単一のＸＴＥＮがＮ末端またはＣ末端に付着している実施形態については、２つの構成成分の接合部の単一のスペーサー配列のみが必要になる。当業者には明らかになる通り、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ遺伝子全体を、ＧＬＰ−２をコードする遺伝子およびＸＴＥＮをコードする遺伝子を使用してライゲーションするのではなく、合成によって生成する場合には、制限部位と適合するアミノ酸を含むスペーサー配列を構築物から省くことができる。 別の態様では、本発明は、切断配列がスペーサー配列に組み入れられたＧＬＰ２−ＸＴＥＮの配置を提供する。いくつかの実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質組成物内のスペーサー配列は、同一であるまたは異なる１つまたは複数の切断配列を含み、切断配列にプロテアーゼを作用させて、ＸＴＥＮ配列（複数可）を融合タンパク質から放出させることができる。一実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮへの切断配列の組み込みは、ＸＴＥＮ構成成分から放出されると活性になる、またはより活性になるＧＬＰ−２の放出が可能になるように設計する。切断配列は、ＧＬＰ−２配列の十分近く、一般にはＧＬＰ−２配列から１８アミノ酸以内、または１２アミノ酸以内、または６アミノ酸以内、または２アミノ酸以内に位置し、したがって、切断後にＧＬＰ−２に付着している残りの残基はいずれもＧＬＰ−２の活性（例えば、ＧＬＰ−２受容体との結合など）に目に見えるほど干渉せず、なおプロテアーゼが切断配列の切断を行うことができる十分な接近性がもたらされる。いくつかの場合には、切断配列を含むＧＬＰ２−ＸＴＥＮは、ＧＬＰ−２と切断配列の間またはＸＴＥＮと切断配列の間に、切断配列へのプロテアーゼの接近を容易にするための１つまたは複数のスペーサー配列アミノ酸も含み、スペーサーアミノ酸は、好ましいアミノ酸としてグリシン、セリンおよびアラニンを含めた任意の天然のアミノ酸を含む。一実施形態では、切断部位は哺乳動物の被験体に内在するプロテアーゼによって切断することが可能な配列であり、したがって、被験体に投与した後にＧＬＰ２−ＸＴＥＮを切断することができる。そのような場合では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮは、ＧＬＰ−２のプロドラッグまたは循環デポ剤としての機能を果たすことができる。前述の特定の構築物では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮは、Ｎ末端および／またはＣ末端に連結した１つまたは２つのＸＴＥＮを有し、したがって、ＸＴＥＮを放出させ、それにより活性型のＧＬＰ−２を自由にすることができる。前述の構築物の一実施形態では、切断配列が切断されることによって融合タンパク質から放出されたＧＬＰ−２は、インタクトなＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質と比較して少なくとも約２倍、または少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約６倍、または少なくとも約８倍、または少なくとも約１０倍、または少なくとも約２０倍の生物学的活性の増大を示す。 本発明によって意図されている切断部位の例としては、これだけに限定されないが、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、カリクレイン、ＦＶＩＩＩａ、ＦＶＩＩＩａ、ＦＸａ、ＦＩＩａ（トロンビン）、エラスターゼ−２、グランザイムＢ、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１７またはＭＭＰ−２０から選択される哺乳動物の内在性プロテアーゼによって、またはＴＥＶ、エンテロキナーゼ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（商標）プロテアーゼ（ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ）、およびソルターゼ（ｓｏｒｔａｓｅ）Ａなどの非哺乳動物のプロテアーゼによって切断可能なポリペプチド配列が挙げられる。前述のプロテアーゼおよびその他によって切断されることが公知の配列は当技術分野で公知である。本発明によって意図されている例示的な切断配列および配列内のそれぞれのカット部位が表６に示されており、その配列変異体も示されている。したがって、切断配列、特に、炎症の間に存在する内在性プロテアーゼに対して感受性の表６の切断配列により、ＧＬＰ−２の放出がもたらされ、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮの特定の実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮのインタクトな形態から放出されるＧＬＰ−２構成成分のより高程度の活性、ならびに被験体に投与される高用量のＧＬＰ２−ＸＴＥＮについての追加的な安全域がもたらされる。例えば、メタロプロテイナーゼ（ｍｅｔａｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）の多くがクローン病および炎症を起こした腸において上昇することが実証されている（Ｄ ＳｃｈｕｐｐａｎおよびＴ Ｆｒｅｉｔａｇ． Ｆｉｓｔｕｌｉｓｉｎｇ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ： ＭＭＰｓ ｇｏｎｅ ａｗｒｙ． Ｇｕｔ（２００４年）５３巻（５号）：６２２〜６２４頁）。一実施形態では、本発明は、切断された際にＧＬＰ−２が融合タンパク質から放出されるように動作可能に位置づけられた１つまたは複数の切断配列を含むＧＬＰ２−ＸＴＥＮであって、１つまたは複数の切断配列が表６から選択される配列に対して少なくとも約８６％、または少なくとも約９２％またはそれ以上の配列同一性を有するＧＬＰ２−ＸＴＥＮを提供する。別の実施形態では、切断配列を含むＧＬＰ２−ＸＴＥＮは、表３４から選択される配列と比較して少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。 いくつかの実施形態では、カット部位の両側に隣接している２つまたは３つのアミノ酸（全部で４〜６アミノ酸）のみを切断配列に組み入れ、今度はそれを、該実施形態のＧＬＰ２−ＸＴＥＮに組み入れる。他の実施形態では、組み入れられた表６の切断配列は、公知の配列内の任意の１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸について１つもしくは複数の欠失もしくは挿入、または１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸置換を有してよく、欠失、挿入または置換により、感受性が低下するかまたは増強されるが、プロテアーゼに対する感受性はなくならず、その結果、ＧＬＰ−２がＸＴＥＮから放出される速度を調整することができる。表６に例示的な置換が示されている。 ＊スラッシュの前、間または後の多数のアミノ酸の一覧は、その位置で置換することができる代替のアミノ酸を示し、「−」は、中央の列に示されている対応するアミノ酸を置換することができる任意のアミノ酸を示す 。 ３．例示的なＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質配列 Ｎ末端またはＣ末端のいずれかで接合している、１つまたは２つのＸＴＥＮと連結した単一のＧＬＰ−２を含有する融合タンパク質の配列の非限定的な例は表１３および表３２に示されている。一実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物は、表１３または表３３から選択されるＧＬＰ２−ＸＴＥＮと比較して少なくとも約８０％の配列同一性、あるいは、表１３または表３３のＧＬＰ２−ＸＴＥＮと比較して少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または約１００％の配列同一性を有する融合タンパク質を含む。しかし、本発明は、表１のＧＬＰ−２配列のいずれかの、表１３または表３３のＧＬＰ２−ＸＴＥＮのＧＬＰ−２構成成分による置換、および／または表４の任意の配列の、表１３または表３３のＧＬＰ２−ＸＴＥＮのＸＴＥＮ構成成分による置換も意図している。好ましい実施形態では、前述の例の生じたＧＬＰ２−ＸＴＥＮは、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２の生物学的活性、例えば、ＧＬＰ−２受容体に結合しそれを活性化し、かつ／または腸栄養効果、増殖性効果、または創傷治癒効果をもたらす能力の少なくとも一部分を保持する。本段落の上文に記載されている前述の融合タンパク質では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、１つまたは複数の切断配列、例えば、表６の配列をさらに含んでよく、切断配列はＧＬＰ−２とＸＴＥＮの間に位置する。切断配列（複数可）を含むいくつかの実施形態では、インタクトなＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物を、そのインタクトな形態ではＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較して生物学的活性は低いが半減期が長いが、被験体に投与すると、切断配列（複数可）において内在性プロテアーゼによって切断されることによってＧＬＰ−２構成成分が融合タンパク質から徐々に放出され、そこでＧＬＰ−２構成成分が活性、すなわち、ＧＬＰ−２受容体に有効に結合する能力を示すように設計する。非限定的な例では、切断配列を有するＧＬＰ２−ＸＴＥＮは、表３４の配列と比較して約８０％の配列同一性を有する、または、表３４の配列と比較して約８５％、または約９０％、または約９５％、または約９７％、または約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。しかし、本発明は、表１のＧＬＰ−２配列のいずれかの、表３４のＧＬＰ２−ＸＴＥＮのＧＬＰ−２構成成分による置換、表４の任意の配列の、表３４のＧＬＰ２−ＸＴＥＮのＸＴＥＮ構成成分による置換、および表６の任意の切断配列の、表３４のＧＬＰ２−ＸＴＥＮの切断構成成分による置換も意図している。いくつかの場合には、本段落の前述の実施形態のＧＬＰ２−ＸＴＥＮは、プロドラッグまたは循環デポ剤としての機能を果たし、その結果、ＸＴＥＮと連結していないＧＬＰ−２と比較して終末相半減期が長くなる。そのような場合では、活性な循環組成物の割合がより小さいので、より高い濃度のＧＬＰ２−ＸＴＥＮを被験体に投与して、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較して延長された期間にわたって治療的な血中レベルを維持することができる。 該実施形態のＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物を、生物学的活性について本明細書に記載のアッセイもしくはｉｎ ｖｉｖｏパラメータ（例えば、実施例のアッセイまたは表３２のアッセイ）を用いて、またはＧＬＰ−２欠乏の前臨床モデルにおけるもしくはヒトにおける臨床試験における薬力学的効果についてＧＬＰ−２生物学的活性を評価するための実施例に記載の方法または当技術分野で公知の他の方法を用いて評価して、配置またはＧＬＰ−２配列変異体の適性を決定することができ、ネイティブなＧＬＰ−２配列と比較して少なくとも約４０％、または約５０％、または約５５％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％またはそれ以上の生物学的活性を保持するＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物（任意の組み入れられたＸＴＥＮを放出させる切断部位の切断後を含めて）が、ＧＬＰ−２に関連する状態の治療において使用するために適しているとみなされる。 Ｖ）．本発明のＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物の性質 （ａ）ＧＬＰ２−ＸＴＥＮの薬物動態的性質 ＸＴＥＮと連結していないＧＬＰ−２と比較して薬物動態が増強されたＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を提供することは本発明の目的である。所与のＸＴＥＮとＧＬＰ−２を連結することによって増強することができるＧＬＰ−２の薬物動態的性質としては、これだけに限定されないが、終末相半減期、曲線下面積（ＡＵＣ）、Ｃｍａｘ、分布容積、生物学的に活性なＧＬＰ２−ＸＴＥＮを、ＸＴＥＮと連結していないＧＬＰ−２と比較してより長い期間にわたって最小の有効用量または血液単位濃度を上回る治療域内で維持すること、および生物学的利用能；より頻度の低い投薬または薬理効果の増強を可能にし、それにより、胃腸の状態の治療における有用性を増強する性質が挙げられる。 ネイティブなＧＬＰ−２は、ヒトにおける終末相半減期がおよそ７分であることが報告されているが（Ｊｅｐｐｅｓｅｎ ＰＢら、Ｔｅｄｕｇｌｕｔｉｄｅ （ＡＬＸ−０６００）， ａ ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＩＶ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ２ ａｎａｌｏｇｕｅ， ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｓｈｏｒｔ ｂｏｗｅｌ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ． Ｇｕｔ．（２００５年）５４巻（９号）：１２２４〜１２３１頁；Ｈａｒｔｍａｎｎ Ｂら（２０００年）Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＩＶ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎｏｔｒｏｐｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ−２ ｉｎ ｒａｔｓ ａｎｄ ｍｉｃｅ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４１巻：４０１３〜４０２０頁）、類似体であるテデュグルチドは、ヒトにおいておよそ０．９〜２．３時間の終末相半減期を示した（Ｍａｒｉｅｒ ＪＦ、Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｅｄｕｇｌｕｔｉｄｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｐａｒｔｉｃｉｐａｎｔｓ ａｎｄ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｈｏｒｔ ｂｏｗｅｌ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ａｎｄ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２０１０年）５０巻（１号）：３６〜４９頁）。ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ実施形態の薬物動態的性質はＸＴＥＮと連結していないＧＬＰ−２の同等の形態、すなわち、組換え型のネイティブな配列またはテデュグルチド様類似体と比較するべきであることが当業者には理解されよう。 ＸＴＥＮによって性質が増強された結果として、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮは、本明細書に記載の方法によって組成物に適していることが決定された用量および用量レジメンで使用した場合、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質組成物を投与することにより、同等の用量のＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較して延長された期間にわたって所望の薬理効果または臨床効果がもたらされる循環濃度を実現することができる。本明細書で使用される場合、「同等の用量」とは、被験体に同等に投与される活性なＧＬＰ−２ファルマコフォア（例えば、ＧＬＰ−２）についてｍｏｌ／ｋｇが相当する用量を意味する。当技術分野では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質の「同等の投与量」とは、作用剤の重量は大きいが投与される融合タンパク質の用量中のＧＬＰ−２のモル当量が基本的に同じであることを示すことが理解されよう。 一実施形態では、本発明は、融合タンパク質のＧＬＰ−２構成成分に１つまたは複数のＸＴＥＮを連結させることによって融合タンパク質の薬物動態が増強されるＧＬＰ２−ＸＴＥＮであって、融合タンパク質の見かけの分子量率が少なくとも約２倍、または少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約６倍、または少なくとも約７倍、または少なくとも約８倍、または少なくとも約１０倍、または少なくとも約１２倍、または少なくとも約１５倍増大し、被験体に投与した時のＧＬＰ２−ＸＴＥＮの終末相半減期がＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較して少なくとも約２倍、または少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約６倍、または少なくとも約７倍、または少なくとも約８倍、または少なくとも約１０倍以上増大するＧＬＰ２−ＸＴＥＮを提供する。前述の実施形態では、融合タンパク質は、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮに組み入れられた少なくとも２つのＸＴＥＮ分子を含み、ＸＴＥＮは同一であってもよく、配列組成（および正味の電荷）または長さが異なるものであってもよい。ＸＴＥＮは、表４から選択される配列と比較して少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有してよい。特定の理論に縛られず、正味の電荷がより高いＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物のＸＴＥＮは、上記の通り、種々の負に荷電した表面、例えば、血管、組織、または種々の受容体などとの非特異的な相互作用が少なく、それが、活性なクリアランスの低下にさらに寄与することが予測される。逆に、正味の電荷が低い（またはそれを有さない）ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物のＸＴＥＮは、炎症応答の間の腸内の炎症細胞の公知の関連性を考慮すると、関連するＧＬＰ−２の生物学的活性を強化する表面との相互作用の程度がより高いことが予測される。したがって、本発明は、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物内のＸＴＥＮの種類および長さを選択し、それを位置づけることによって融合タンパク質の効力の程度、生物学的利用能、および半減期を調整することができるＧＬＰ２−ＸＴＥＮを提供する。したがって、本発明は、表１のＧＬＰ−２と表４のＸＴＥＮを、構築物の薬物動態的性質が増強され、全身クリアランスが低下するように、例えば式Ｉ〜ＶＩのいずれか１つから選択される配置で組み合わせ、作製した組成物を意図している。本発明は、さらに、会合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）の低下または解離速度の上昇のいずれかの結果としてクリアランス受容体への結合性が低下した特定のリガンドがＮ末端またはＣ末端のいずれかの障害の影響を受ける可能性があるという事実を活用し、別の分子であるＧＬＰ−２、ＸＴＥＮ、またはスペーサー配列の結合性が低下しようとしまいと、その末端を組成物の別のポリペプチドとの連結に使用する。ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質の特定の配置の選択を本明細書に開示されている方法によって試験して、クリアランス受容体との結合性の程度を低下させ、活性なクリアランスの速度の低下が実現される配置を確認することができる。 一実施形態では、本発明は、薬物動態的性質が増強されたＧＬＰ２−ＸＴＥＮであって、表１３、表３２または表３３のいずれか１つから選択される配列と比較して少なくとも約８０％の配列同一性、あるいは、８１％、８２％、８３％，８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列であるＧＬＰ２−ＸＴＥＮを提供する。他の実施形態では、薬物動態的性質が増強されたＧＬＰ２−ＸＴＥＮは、表４の配列と比較して少なくとも約８０％の配列同一性、あるいは、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または約９９％の配列同一性を有する１つまたは複数のＸＴＥＮと連結した表１の配列と比較して少なくとも約８０％の配列同一性、あるいは、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または約９９％の配列同一性を有するＧＬＰ−２配列を含む。対象組成物に関して、患者の利便性を改善するため、投薬間の間隔を増大させるため、および持続的効果を達成するために必要な薬物の量を減少させるために、終末相半減期がより長いＧＬＰ２−ＸＴＥＮが一般に好ましい。本段落の上文に記載されている実施形態では、融合タンパク質を投与することにより、対象状態を評価するために有用なものとして本明細書に開示されているパラメータ、例えば、血中濃度が維持されること、腸の機能が維持されること、大腸炎、短腸症候群またはクローン病などの胃腸の状態に伴う症状の発症が予防されること、同等の用量または用量レジメンで被験体に投与した、融合タンパク質と連結していない対応するＧＬＰ−２構成成分と比較して低用量の融合タンパク質が使用されることの少なくとも１つ、２つ、３つ以上が改善される。あるいは、本段落の上文に記載されている実施形態では、融合タンパク質を投与することにより、融合タンパク質と連結していない対応するＧＬＰ−２構成成分と比較して、同等の用量の融合タンパク質を使用するが、投与間の間隔が２倍、または３倍、または４倍、または５倍、または６倍、または７倍、または８倍、または１０倍、または２０倍長い用量レジメンを用いて被験体に投与して対象状態を評価するために有用なものとして、本明細書に開示されているパラメータの少なくとも１つが改善される。前述の実施形態では、パラメータ（複数可）の改善を実現するために投与されるミリモル／ｋｇ単位の総用量は、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２構成成分の少なくとも約３分の１、または少なくとも約４分の１、または少なくとも約５分の１、または少なくとも約６分の１、または少なくとも約８分の１、または少なくとも約１０分の１である。 ＸＴＥＮを含む融合タンパク質の薬物動態特性に関する実施例においてより詳細に記載されている通り、長さが増大したＸＴＥＮ配列により、ＸＴＥＮを含む融合タンパク質の終末相半減期の不均衡な増大が付与されることが観察された。したがって、本発明は、ＸＴＥＮを含むＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質であって、被験体に投与されるＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物に標的化半減期がもたらされるようにＸＴＥＮが選択されている融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＸＴＥＮを含む単量体ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質であって、同等の用量で投与した、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較して、被験体に投与されるＧＬＰ２−ＸＴＥＮの終末相半減期が増大するようにＸＴＥＮが選択されており、増大が、ＸＴＥＮと連結していないＧＬＰ−２と比較して少なくとも約２倍長い、または少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約６倍、または少なくとも約７倍、または少なくとも約８倍、または少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍、または少なくとも約１５倍、または少なくとも２０倍、または少なくとも４０倍またはそれ以上の終末相半減期の増大である、融合タンパク質を提供する。別の実施形態では、治療有効量のＧＬＰ２−ＸＴＥＮをそれを必要とする被験体に投与することにより、同等の用量のＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較して少なくとも１２時間長い、または少なくとも約２４時間長い、または少なくとも約４８時間長い、または少なくとも約７２時間長い、または少なくとも約９６時間長い、または少なくとも約１４４時間長い、または少なくとも約７日長い、または少なくとも約１４日長い、または少なくとも約２１日長い終末相半減期がもたらされる。別の実施形態では、治療有効用量のＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質をそれを必要とする被験体に投与することにより、融合タンパク質の治療的に有効な血中レベルを維持するために必要な連続投薬間の時間が、同等の用量で投与した、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較して少なくとも４８時間、または少なくとも７２時間、または少なくとも約９６時間、または少なくとも約１２０時間、または少なくとも約７日、または少なくとも約１４日、または少なくとも約２１日増大し得る。「治療的に有効な血中レベル」を維持するための連続投薬間の時間は、被験体の生理的な状態に応じて著しく変動することが当技術分野では理解され、また、クローン病の患者には、短腸症候群に対して同じ調製物を受けている患者と比較して、ＧＬＰ−２調製物をより頻繁に、より長く投薬する必要がある場合があることが理解されよう。それにもかかわらず、本発明のＧＬＰ２−ＸＴＥＮにより、上記の通り、ＸＴＥＮと連結していないＧＬＰ−２と比較してより頻度の少ない投薬が可能になると考えられる。一実施形態では、治療有効量を用いて被験体に投与したＧＬＰ２−ＸＴＥＮにより、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質の血中濃度が、少なくとも約２４時間、または少なくとも約４８時間、または少なくとも約７２時間、または少なくとも約９６時間、または少なくとも約１２０時間、または少なくとも約１４４時間にわたって、少なくとも５００ｎｇ／ｍｌ超、または少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌ超、または少なくとも約２０００ｎｇ／ｍｌ超、または少なくとも約３０００ｎｇ／ｍｌ超、または少なくとも約４０００ｎｇ／ｍｌ超、または少なくとも約５０００ｎｇ／ｍｌ超、または少なくとも約１００００ｎｇ／ｍｌ超、または少なくとも約１５０００ｎｇ／ｍｌ超、または少なくとも約２００００ｎｇ／ｍｌ超、または少なくとも約３００００ｎｇ／ｍｌ超、または少なくとも約４００００ｎｇ／ｍｌにとどまる。 一実施形態では、本発明は、同等の用量で被験体に投与した、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較して少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％、または少なくとも約１５０％、または少なくとも約２００％、または少なくとも約３００％、または少なくとも約５００％、または少なくとも約１０００％、または少なくとも約２０００％のＡＵＣの増大を示すＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。別の実施形態では、適切な用量で被験体に投与したＧＬＰ２−ＸＴＥＮにより、単回投薬後に、少なくとも１０００００ｈｒ＊ｎｇ／ｍＬ、または少なくとも約２０００００ｈｒ＊ｎｇ／ｍＬ、または少なくとも約４０００００ｈｒ＊ｎｇ／ｍＬ、または少なくとも約６０００００ｈｒ＊ｎｇ／ｍＬ、または少なくとも約８０００００ｈｒ＊ｎｇ／ｍＬ、または少なくとも約１００００００ｈｒ＊ｎｇ／ｍＬ、または少なくとも約２００００００ｈｒ＊ｎｇ／ｍＬのＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質の濃度の曲線下面積がもたらされる。ＧＬＰ２−ＸＴＥＮの薬物動態パラメータは、投薬、複数の時間間隔で血液試料を取得すること、およびＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣ、ラジオアッセイ、または当技術分野で公知のまたは本明細書に記載の他の方法を用いてタンパク質をアッセイし、その後データを標準的に算出して、半減期および他のＰＫパラメータを導き出すことを伴う標準の方法によって決定することができる。 ＰＫパラメータの増強により、特に胃腸の状態の常套的な予防法または慢性の治療のために投薬を受けている被験体について、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物の投薬を、ＸＴＥＮと連結していないＧＬＰ−２と比較して減少させることが可能になる。一実施形態では、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較して約２分の１、または約３分の１、または約４分の１、または約５分の１、または約６分の１、または約８分の１、または約１０分の１、またはそれよりも少ないモル当量の融合タンパク質を、対応する量のＸＴＥＮと連結していないＧＬＰ−２と同等の曲線下面積を維持するために必要な用量レジメンの下で投与する。別の実施形態では、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較して約２分の１、または約３分の１、または約４分の１、または約５分の１、または約６分の１、または約８分の１、または約１０分の１、またはそれよりも少ないモルの融合タンパク質を、対応する量のＸＴＥＮと連結していないＧＬＰ−２と比較して少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ超、少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌ超、または少なくとも約２０００ｎｇ／ｍｌ超、または少なくとも約３０００ｎｇ／ｍｌ超、または少なくとも約４０００ｎｇ／ｍｌ超、または少なくとも約５０００ｎｇ／ｍｌ超、または少なくとも約１００００ｎｇ／ｍｌ超、または少なくとも約１５０００ｎｇ／ｍｌ超、または少なくとも約２００００ｎｇ／ｍｌ超、または少なくとも約３００００ｎｇ／ｍｌ超、または少なくとも約４００００ｎｇ／ｍｌ超の血中濃度を少なくとも約２４時間、または少なくとも約４８時間、または少なくとも７２時間、または少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間にわたって維持するために必要な用量レジメンの下で投与する。別の実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、胃腸の状態を有する被験体を処置するためにより頻度の低い投与を必要とし、用量は、約４日おき、約７日おき、約１０日おき、約１４日おき、約２１日おきに投与される、またはおよそ月に１回の融合タンパク質が被験体に投与され、融合タンパク質ではＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と同等の曲線下面積が実現される。さらに他の実施形態では、対応する量のＸＴＥＮと連結していないＧＬＰ−２と比較して約５％、または約１０％、または約２０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％少ない、累積的により少ないモル量の融合タンパク質を、治療転帰または臨床的パラメータを実現するために必要な用量レジメンの下で被験体に投与し、それでも融合タンパク質では少なくとも、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と同等の曲線下面積が実現される。累積的により少量とは、少なくとも約１週間、または約１４日、または約２１日、または約１カ月の期間にわたる測定である。 （ｂ）ＧＬＰ２−ＸＴＥＮの薬理学的性質および薬学的性質 本発明は、ＸＴＥＮと連結していないＧＬＰ−２と比較して性質が増強されている可能性がある、ＸＴＥＮと共有結合で連結したＧＬＰ−２を含むＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物、ならびに組成物の２つのＧＬＰ−２構成成分のそれぞれの治療的および／または生物学的活性または効果を増強するための方法を提供する。さらに、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質により、ＧＬＰ−２のペグ化構築物などの化学的コンジュゲートを超える有意な利点、特に、組換えＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、宿主細胞の発現系において作出することができ、それにより、製品の研究開発段階および製造段階の両方において時間および費用が減少するとともに、ペグ化コンジュゲートと比較してＧＬＰ２−ＸＴＥＮの製品および代謝産物の両方の毒性が低いより均一な定義済みの製品がもたらされるという事実がもたらされる。 治療剤として、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮは、以下の非限定的な性質の増強の１つまたは複数を含めた、ＸＴＥＮを含まない治療薬を超えるいくつもの利点を有する：溶解度の増大、熱的安定性の増大、免疫原性の低下、見かけの分子量の増大、腎臓クリアランスの低下、タンパク質分解の減少、代謝の低下、治療効率の増強、有効な治療量がより低いこと、生物学的利用能の増大、被験体を大腸炎、腸炎、またはクローン病の症状の増大を伴わずに維持することができる投薬間の時間の増大、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物を静脈内、皮下、または筋肉内に投与することができること、静脈内、皮下、または筋肉内に投与された際の「調整された」吸収の速度、凍結乾燥安定性の増強、血清／血漿安定性の増強、終末相半減期の増大、血流中での溶解度の増大、中和性抗体による結合の減少、活性なクリアランスの減少、副作用の減少、免疫原性の低下、基質結合親和性の保持、分解に対する安定性、凍結融解に対する安定性、プロテアーゼに対する安定性、ユビキチン化に対する安定性、投与の容易さ、他の医薬賦形剤または担体との適合性、被験体における持続、貯蔵における安定性の増大（例えば、貯蔵寿命の増大）、生物体または環境における毒性の低下など。本明細書に開示されている実施形態のＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、本明細書において詳述されている改善された性質および／または実施形態の１つまたは複数、またはその任意の組合せを示す。性質が増強されることの正味の効果は、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物を使用することにより、ＸＴＥＮと連結していないＧＬＰ−２と比較して、治療効果および／または生物学的効果を増強することができ、その結果、より頻度の低い投薬に付随する経済的利益がもたらされる、または、ＧＬＰ−２に関連する状態を有する被験体に投与した際の患者のコンプライアンスが改善される。 一実施形態では、融合パートナーとしてのＸＴＥＮにより、ＧＬＰ−２ペイロードの溶解度が増大する。したがって、ＧＬＰ−２の薬学的性質または物理化学的性質、例えば、水溶性または安定性の程度などが増強されることが望ましい場合、融合タンパク質に組み入れられるＸＴＥＮ配列の長さおよび／またはモチーフファミリー組成は、それぞれ、それぞれの融合タンパク質に異なる程度の溶解度および／または安定性が付与され、したがって、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物の全体的な薬学的性質が増強されるように選択する。ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を、本明細書に記載の方法を用いて構築し、アッセイして、物理化学的性質を確認し、必要に応じてＸＴＥＮを調整して所望の性質をもたらすことができる。一実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮの水溶性は、融合タンパク質と連結していないＧＬＰ−２と比較して少なくとも約２５％大きい、または、融合タンパク質と連結していない対応するＧＬＰ−２よりも少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％、または少なくとも約２００％、または少なくとも約３００％、または少なくとも約４００％、または少なくとも約５００％、または少なくとも約１０００％大きい。 本発明は、ＸＴＥＮと連結していないＧＬＰ−２と比較して溶解度が増強されており、回収が容易である発現されたＧＬＰ２−ＸＴＥＮを作製し、宿主細胞から回収するための方法を提供する。一実施形態では、該方法は、累積的な配列の長さが約１００超、または約２００超、または約４００超、または約８００超のアミノ酸残基である１つまたは複数のＸＴＥＮ構成成分を有するＧＬＰ２−ＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチドを用いて宿主細胞を形質転換するステップと、宿主細胞においてＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を発現させるステップと、発現された融合タンパク質を可溶性の形態で回収するステップとを含む。前述の実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮは、表４から選択される１つまたは複数のＸＴＥＮと比較して少なくとも約８０％の配列同一性、または約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％、約１００％までの配列同一性を有してよく、ＧＬＰ−２は、表１から選択されるＧＬＰ−２と比較して少なくとも約８０％の配列同一性、または約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％、または１００％の配列同一性を有してよく、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ構成成分は、式Ｉ〜ＶＩのいずれか１つから選択されるＮ末端からＣ末端への配置であってよい。 本発明は、それを必要とする被験体に投与すると、同等の投与量のＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較して少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍長い期間にわたってＧＬＰ−２構成成分を治療的なレベルで維持することができるＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物を作製するための方法を提供する。「同等の投与量」のＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質とは、ＸＴＥＮと連結していないＧＬＰ−２の用量と比較して作用剤の重量は大きいが、融合タンパク質の用量中のＧＬＰ−２のおおよそのモルが同じであり、かつ／またはおおよそのｎｍｏｌ／ｋｇ濃度が同じであることを示すことが当技術分野では理解されよう。ＧＬＰ−２構成成分を治療的なレベルで維持することができる組成物を作製する方法は、所与の用量および用量レジメンを考慮して所望の薬物動態的性質をもたらすためにＧＬＰ−２とコンジュゲートするために適したＸＴＥＮを選択するステップと、本明細書に記載の配置を用いて、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮをコードする発現構築物を創出するステップと、コード遺伝子を含む発現ベクターを用いて適切な宿主細胞を形質転換するステップと、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮを発現させ、それを回収するステップと、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮを被験体に投与し、その後、アッセイして薬物動態的性質、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質の活性（例えば、受容体に結合する能力）、および投与された組成物の安全性を検証するステップとを含む。被験体は、マウス、ラット、サルおよびヒトから選択することができる。該方法により、本明細書において提供されるＧＬＰ２−ＸＴＥＮにより、増強された期間にわたってＧＬＰ−２の循環濃度が治療的なレベルで維持されることによって、投与された組成物の有効性が増大する。 別の態様では、本発明のＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物は、腸栄養効果をもたらすことができる。本明細書で使用される場合、「腸栄養効果」とは、被験体、例えば、マウス、ラット、サルまたはヒトが、ＧＬＰ−２を含有する組成物を投与した後に以下の少なくとも１つを示すことを意味する：腸の成長、絨毛上皮の肥厚の増大、陰窩の細胞の増殖の増大、陰窩および絨毛軸の高さの増大、腸吻合後の治癒の増大、小腸の重量の増大、小腸の長さの増大、小腸上皮アポトーシスの減少、または腸機能の増強。ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物は、内分泌的に作用して、腸の成長および代謝と栄養摂取を結びつけることができる。ＧＬＰ−２および関連する類似体は、短腸症候群、クローン病、骨粗鬆症に対して、および本明細書に記載の他の胃腸の状態の中でも癌の化学療法の間のアジュバント療法として治療になり得る。一実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮは、有効量を用いて被験体に投与すると、少なくとも１つ、または２つ、または３つ以上の腸栄養効果をもたらすことができる。 結果として生じる機能特性または生物学的および薬理学的活性およびパラメータを含めた本発明のＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物の特性は、所望の特性を測定するための当技術分野で公知の任意の適切なスクリーニングアッセイによって決定することができる。本発明は、組成または配置が異なるＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質をアッセイして、所望の程度の生物学的活性および／または治療的活性、ならびに安全性プロファイルを有するＧＬＰ２−ＸＴＥＮをもたらすための方法を提供する。これだけに限定されないが、実施例のアッセイ、表３２のアッセイ、炎症性サイトカインレベルの決定、ＧＬＰ−２血中濃度、ＥＬＩＳＡアッセイ、または腸の機能の試験、ならびに臨床的なエンドポイント、例えば、当技術分野で公知のものの中でも、出血、炎症、大腸炎、下痢、糞便の湿重量、体重減少、ナトリウム損失、腸潰瘍、腸閉塞症、瘻孔、および膿瘍、生存などを含めた、特定のｉｎ ｖｉｔｒｏバイオアッセイ、ｉｎ ｖｉｖｏバイオアッセイおよびｅｘ ｖｉｖｏ生物検定を用いて、各配置のＧＬＰ２−ＸＴＥＮおよび／またはＧＬＰ２−ＸＴＥＮに組み入れられるＧＬＰ−２構成成分の活性を評価する。前述のアッセイまたはエンドポイントを前臨床的なアッセイにおいて用いて、ＧＬＰ−２配列変異体を評価する（単一の構成成分として、またはＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質としてアッセイする）こともでき、ネイティブなヒトＧＬＰ−２と比較して、それらの生物学的活性の程度がネイティブなＧＬＰ−２またはそのいくつかの画分と同じかどうか、したがって、それらが、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮに含めるために適しているかどうかを決定することができる。一実施形態では、本発明は、同等の用量を用いて被験体に投与した、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較して少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％または少なくとも約１２０％または少なくとも約１５０％または少なくとも約２００％の腸栄養効果を示すＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。 用量最適化は、全ての薬物のために重要である。ＧＬＰ２−ＸＴＥＮの治療有効用量または治療有効量は、個体の病態、年齢、性別、および体重、ならびに投与される融合タンパク質の、個体における所望の応答を引き出す能力などの因子に応じて変動する。例えば、多様な肺の状態または異常な臨床的パラメータ（例えば、中和性抗体）を示している患者全てに対するＧＬＰ−２の標準化された単回投薬が常に有効であるとは限らない。これらの因子の考察は、不十分な効力がもたらされ、したがって臨床的改善が実現されない量に対して治療的または薬理学的に有効な量のＧＬＰ２−ＸＴＥＮおよび適切な投薬スケジュールを決定する目的で、十分に、通常の技術を有する臨床医の権限の範囲内である。 本発明の方法は所望のパラメータまたは臨床効果を達成し、かつ／または維持するために十分な期間にわたって、治療有効量のＧＬＰ２−ＸＴＥＮを連続して投与することを含み、そのような治療有効量の連続投薬により、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮについての治療有効用量レジメン、すなわち、継続的に投与される融合タンパク質組成物の投薬についてのスケジュールが確立され、用量は、これだけに限定されないが、本明細書に記載のものを含めた、ＧＬＰ−２に関連する病態または状態の任意の臨床徴候または症状、態様、測定パラメータまたは特性に対する持続性の有益な効果がもたらされる量で示される。予防的に有効な量とは、生理的または臨床的な結果または事象、例えば、腸間膜血流の減少、出血、炎症、大腸炎、下痢、糞便の湿重量、体重減少、ナトリウム損失、腸潰瘍、腸閉塞症、瘻孔、および膿瘍、便通の頻度の変化、ぶどう膜炎、ならびに小児の成長不全を予防するため、または、閾値レベルを上回るＧＬＰ−２の血中濃度、例えば、１００ｎｇ／ｍｌのＧＬＰ−２当量（またはおよそ２２００ｎｇ／ｍｌのＧＬＰ−２−２Ｇ＿ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４）または３０ｐｍｏｌ／Ｌを維持するために必要な期間にわたって必要になるＧＬＰ２−ＸＴＥＮの量を指す。治療方法では、被験体に投与するＧＬＰ２−ＸＴＥＮの投薬量は、被験体に対して約０．２ｍｇ／ｋｇ／用量から５００ｍｇ／ｋｇ／用量（２．５ｎｍｏｌ／ｋｇ〜６２５０ｎｍｏｌ／ｋｇ）まで、または約２ｍｇ／ｋｇ／用量から３００ｍｇ／ｋｇ／用量（２５ｎｍｏｌ／ｋｇ〜３７５０ｎｍｏｌ／ｋｇ）まで、または約６ｍｇ／ｋｇ／用量〜約１００ｍｇ／ｋｇ／用量（７５ｎｍｏｌ／ｋｇ／用量〜１２５０ｎｍｏｌ／ｋｇ／用量）まで、または約１０ｍｇ／ｋｇ／用量から約６０ｍｇ／ｋｇ／用量（１２５ｎｍｏｌ／ｋｇ／用量〜７５０ｎｍｏｌ／ｋｇ／用量）までにわたる。適切な投与量は、薬物に対する応答に影響を及ぼす可能性がある他の因子にも左右される場合があり、例えば、腸が外科的に切除された被験体には、一般に、過敏性腸症候群と比較して高用量が必要とされる。いくつかの実施形態では、該方法は、１つまたは複数のＸＴＥＮ配列と連結したＧＬＰ−２を含むＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質組成物および少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を治療有効量でそれを必要とする被験体に投与することを含み、それにより、開示されているパラメータまたは生理的条件の少なくとも１つがより大きく改善される、または、同等の用量で投与した、ＸＴＥＮと連結していないＧＬＰ−２を含む医薬組成物を投与することによって媒介されるパラメータ、状態または臨床転帰に対する効果と比較して、より好都合な臨床転帰がもたらされる。前述の一実施形態では、改善は、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ医薬組成物を治療有効用量で投与することによって実現される。前述の別の実施形態では、改善は、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ医薬組成物を、治療有効用量レジメン（本明細書で定義されている）を用いて投薬期間の長さにわたって多数回連続して投与することによって実現される。 多くの場合、年齢および疾患の程度が異なる被験体におけるＧＬＰ−２の治療的なレベルは、公開された文献において確立されており、利用可能である、または、ＧＬＰ−２を含有する認可された製品については薬物のラベル上に規定されている。他の場合では、本開示のＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を含めた新しい組成物について治療的なレベルを確立することができる。所与の組成物についての治療的なレベルおよび投薬スケジュールを確立するための方法は、当業者に公知である（例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第１１版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（２００５年）を参照されたい）。例えば、標的疾患または状態を有する被験体において用量漸増試験を用いて有効性または望ましい薬理効果、有害事象の出現、および循環血中レベルを決定することによって、所与の被験体または被験体の集団に対する所与の薬物または生物製剤についての治療的な血中レベルを決定することができる。用量漸増試験では、ＧＬＰ−２に関連する状態に関連付けられる１つまたは複数のパラメータ、または特定の適応症についての有益な転帰に関連する臨床的パラメータについての当技術分野で公知または本明細書に記載の生理的または生化学的なパラメータをモニターする、被験体または被験体の群における代謝試験を通じて、効果のない用量、有害事象、最小の有効用量などを決定するための知見および／または測定パラメータと一緒に、決定または導出された循環血中レベルを確立する薬物動態パラメータの測定値と一緒に、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮの活性を評価することができる。次いで、結果を、前述の決定されたパラメータまたは効果レベルと一致する治療薬の投与用量および血中濃度と相関させることができる。これらの方法により、種々の用量および血中濃度を、最小の有効用量ならびに最大用量および所望の効果が生じる血中濃度、およびそれを維持することができる期間と相関させ、それにより、組成物についての治療的な血中レベルおよび投薬スケジュールを確立することができる。したがって、前述の方法により、それを下回るとＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質が所望の薬理効果を有さないＣｍｉｎ血中レベルおよびそれを上回ると副作用が起こり得るＣｍａｘ血中レベルが確立される。 当業者は、本明細書に開示されている手段によって、または当技術分野で公知の他の方法によって、投与されたＧＬＰ２−ＸＴＥＮが治療的な血中レベルにとどまり、それでも適切な安全性が保持されていることを確認して（それにより、「治療域」を確立する）、所望の間隔にわたって生物学的活性を維持すること、またはＸＴＥＮの用量または長さまたは配列の調整を要求することができる。さらに、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮを治療域内に保つための適切な用量および投薬頻度を決定することにより、治療有効濃度を上回ったままの連続したＣｍａｘピークおよび／またはＣｍｉｎトラフがもたらされ、標的状態に関連する少なくとも１つの測定パラメータが改善される、治療有効用量の融合タンパク質を使用して、それを必要とする被験体に多数回連続して投与するためのスケジュールである治療有効用量レジメンが確立される。一実施形態では、適切な用量で被験体に投与したＧＬＰ２−ＸＴＥＮにより、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質の血中濃度が、同等の用量で投与した、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較して少なくとも約２倍長い期間、あるいは、同等の用量で投与した、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較して少なくとも約３倍長い、あるいは、少なくとも約４倍長い、あるいは、少なくとも約５倍長い、あるいは、少なくとも約６倍長い、あるいは、少なくとも約７倍長い、あるいは、少なくとも約８倍長い、あるいは、少なくとも約９倍長い、あるいは、少なくとも約１０倍長い、または少なくとも約２０倍長いまたはそれよりも長い期間にわたって、所与の活性または効果を維持するための最小有効濃度を上回ったままになる（実施例のアッセイまたは表３２によって決定したところ）。本明細書で使用される場合、「適切な用量」とは、被験体に投与すると、望ましい治療効果または薬理効果および／または治療域内の血中濃度がもたらされる薬物または生物製剤の用量を意味する。例えば、ＧＬＰ−２またはＧＬＰ−２を含むＸＴＥＮを含有する融合タンパク質の血清レベルまたは血漿レベルは、比濁分析、ＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣ、放射免疫測定法によって、または免疫電気泳動によって測定することができる（Ｊｅｐｐｅｓｅｎ ＰＢ． Ｉｍｐａｉｒｅｄ ｍｅａｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ２ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｉｌｅａｌ ｒｅｓｅｃｔｅｄ ｓｈｏｒｔ ｂｏｗｅｌ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｆａｉｌｕｒｅ． Ｇｕｔ．（１９９９年）４５巻（４号）：５５９〜９６３頁；実施例１８〜２１のアッセイ）。ＧＬＰ−２またはＧＬＰ−２変異体の表現型の同定は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）（Ｊｅｐｐｓｓｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８１巻：５６９０〜９３頁、１９９４年）を含めたいくつもの方法によって、またはＤＮＡ解析（Ｋｉｄｄら、Ｎａｔｕｒｅ． ３０４巻：２３０〜３４頁、１９８３年；Ｂｒａｕｎら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｃｌｉｎ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３４巻：７６１〜６４頁、１９９６年）によって実現することができる。 一実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮを、治療有効用量レジメンを用いて少なくとも２回、または少なくとも３回、または少なくとも４回またはそれ以上投与することにより、同等の用量レジメンで被験体に投与した、ＸＴＥＮと連結していない対応する融合タンパク質の生物学的に活性なタンパク質と比較して、融合タンパク質の血中レベルについての少なくとも２つの連続したＣｍａｘピークおよび／またはＣｍｉｎトラフ間の時間が少なくとも約３倍長く、あるいは、少なくとも約４倍長く、あるいは、少なくとも約５倍長く、あるいは、少なくとも約６倍長く、あるいは、少なくとも約７倍長く、あるいは、少なくとも約８倍長く、あるいは、少なくとも約９倍長く、または少なくとも約１０倍長く増大する。別の実施形態では、ＧＬＰ−２についての治療有効用量レジメンを用いて被験体に投与した、ＸＴＥＮと連結していない対応する生物学的に活性なタンパク質成分（複数可）と比較して頻度の低い投薬または医薬組成物の融合タンパク質のモル単位で少ない総投与量を用いて、治療有効用量レジメンで投与したＧＬＰ２−ＸＴＥＮにより、１つ、または２つ、または３つ以上の測定パラメータの同等の改善がもたらされる。測定パラメータは、本明細書に開示されている臨床的、生化学的、もしくは生理的なパラメータ、または当技術分野で公知の他のＧＬＰ−２に関連する状態を有する被験体を評価するためのもののいずれかを含む。ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質の活性を評価するためにアッセイすることができるパラメータまたは生理的効果の非限定的な例としては、実施例、表３２のアッセイまたは腸間膜血流の減少、出血、炎症、大腸炎、下痢、糞便の湿重量、ナトリウム損失、体重減少、腸潰瘍、腸閉塞症、瘻孔、および膿瘍、便通の頻度の変化、ぶどう膜炎、小児の成長不全を検出するため、または閾値レベルを上回るＧＬＰ−２の血中濃度、例えば、１００ｎｇ／ｍｌのＧＬＰ−２当量（またはおよそ２２００ｎｇ／ｍｌのＧＬＰ−２−２Ｇ＿ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４）を維持するための試験もしくはアッセイ、ならびに腸炎の実験動物モデルから得られるパラメータ、例えば、体重増加、小腸の長さ、小腸のＴＮＦα含有量の減少、粘膜の萎縮の減少、穿孔性潰瘍の発生率の低下、および絨毛の高さなどが挙げられる。 いくつかの実施形態では、ＧＬＰ−２構成成分の生物学的活性は、インタクトなＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質によって現れるが、他の場合では、ＧＬＰ−２構成成分の生物学的活性は、主に、本明細書に記載の配置および配列を使用してＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質に組み入れられた切断配列に作用するプロテアーゼの作用によってＧＬＰ−２が融合タンパク質から切断され、放出すると現れる。前述では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮは、ＧＬＰ−２受容体に対するＧＬＰ−２構成成分の結合親和性がＸＴＥＮと連結している時には低下するが、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ配列に組み入れられた切断配列（複数可）が切断されることによってＸＴＥＮから放出されると親和性が回復または増大するように設計する。前述の一実施形態では、本発明は、切断配列によって少なくとも第１のＸＴＥＮと連結したＧＬＰ−２を含む単離された融合タンパク質であって、ＸＴＥＮと連結していないネイティブなＧＬＰ−２と比較して、切断前の生物学的活性（例えば、受容体結合性）が１０％未満であり、切断配列におけるタンパク質切断によって融合タンパク質から放出されたＧＬＰ−２の生物学的活性が少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％活性である融合タンパク質を提供する。 一態様では、本発明は、融合タンパク質の活性なクリアランスが低下し、それにより、被験体に投与されたＧＬＰ２−ＸＴＥＮの終末相半減期は増大するが、生物学的活性はなお保持されるように設計されたＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物を提供する。いかなる特定の理論にも縛られることなく、本発明のＧＬＰ２−ＸＴＥＮは、非構造化ＸＴＥＮをＧＬＰ−２に付加することにより分子の活性なクリアランスが低下することによって実現される、比較的高く、かつ／または持続性の活性を有すると考えられている。ＧＬＰ−２の取り込み、排除、および不活化は、循環系において、ならびに血管外腔において起こり得る。 ＶＩ）．ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物の使用 別の態様では、本発明は、ＧＬＰ−２によって媒介されるまたは向上する、胃腸の状態における有益な効果を達成するための治療を含めた治療方法において使用するためのＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。本明細書で使用される場合、「胃腸の状態」とは、これだけに限定されないが、胃炎、消化障害、吸収不良症候群、短消化管症候群、短腸症候群、盲管症候群、炎症性腸疾患、小児脂肪便症、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症性スプルー、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸炎、化学療法誘導性腸炎、過敏性腸症候群、小腸損傷、癌化学療法に起因する小腸損傷、胃腸傷害、下痢性疾患、腸管機能不全症、酸誘導性腸管傷害、アルギニン欠乏症、特発性精液減少症、肥満症、異化疾病、発熱性好中球減少症、肥満症、脂肪便、自己免疫疾患、胃腸関門障害、敗血症、細菌性腹膜炎、熱傷誘導性腸管損傷、胃腸運動の低下、腸管不全症、化学療法に付随する菌血症、腸管外傷、腸管虚血、腸間膜虚血、栄養失調、壊死性腸炎、壊死性膵炎、新生児哺乳不耐性、ＮＳＡＩＤ誘導性胃腸損傷、栄養不足、胃腸管に対する完全非経口栄養による損傷、新生児栄養不足、放射線誘導性腸炎、放射線によって誘導される腸への傷害、粘膜炎、回腸嚢炎、および胃腸の誘導性虚血を含むものとする。 本発明は、有益な効果を達成し、終末相半減期が比較的短い、反復投与を必要とする、または好ましくない薬剤経済性を有するＧＬＰ−２調製物を使用した他の治療方法の不都合および／または限界に取り組むために、ＧＬＰ−２に関連する疾患、障害または胃腸の状態を有するヒトなどの被験体を処置するための方法において使用するためのＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。ＧＬＰ−２のネイティブな、組換えまたは合成のタンパク質の半減期が短く、臨床的利益を実現するためには頻繁な投薬が必要であるという事実により、そのような患者の管理が困難になる。 一実施形態では、治療方法は、治療有効量のＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物を、胃腸の状態を有する被験体に投与することを含む。治療方法の別の実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物を投与することにより、胃腸の状態に関連する生化学的、生理的または臨床的なパラメータの１つ、２つ、３つ、またはそれ以上が改善される。前述の方法では、投与されるＧＬＰ２−ＸＴＥＮは、表４および表８〜１２のいずれか１つから選択されるＸＴＥＮに対して少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する少なくとも第１のＸＴＥＮと連結した表１のＧＬＰ−２に対して少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するＧＬＰ−２を含む。前述の方法の別の実施形態では、投与されるＧＬＰ２−ＸＴＥＮは、表１３、表３２、または表３３の配列に対して少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を有する。一実施形態では、治療方法は、治療有効量のＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物を胃腸の状態を有する被験体に１回または複数回投与することを含み、投与により、状態に関連する生化学的、生理的または臨床的なパラメータの１つ、２つ、３つ、またはそれ以上または治療効果が、同等の量を用いて投与した、ＸＴＥＮと連結していないＧＬＰ−２と比較して少なくとも２倍長い、または少なくとも４倍長い、または少なくとも５倍長い、または少なくとも６倍長い期間にわたって改善される。別の実施形態では、治療方法は、治療有効量のＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物をＧＬＰ−２欠乏に罹患している被験体に投与することを含み、投与により、臨床的に関連性のあるパラメータまたは症状の発症が予防される、または、臨床的に関連性のある血中濃度がＸＴＥＮと連結していないＧＬＰ−２と比較して少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも４倍長い持続時間にわたって降下する。別の実施形態では、治療方法は、治療有効量のＧＬＰ２−ＸＴＥＮを胃腸の状態を有する被験体に投与することを含み、投与により、同等のｎｍｏｌ／ｋｇ量を使用して投与した、ＸＴＥＮと連結していないＧＬＰ−２と比較して、胃腸の状態に関連する少なくとも１つ、２つ、または３つのパラメータが少なくとも５％、または１０％、または２０％、または３０％、または４０％、または５０％、または６０％、または７０％、または８０％、または９０％大きく改善される。治療方法の前述の実施形態では、投与は皮下投与、筋肉内投与、または静脈内投与である。治療方法の前述の実施形態では、被験体が、マウス、ラット、サル、およびヒトからなる群より選択される。治療方法の前述の実施形態では、治療効果またはパラメータは、これだけに限定されないが、とりわけ、ＧＬＰ−２の血中濃度、腸間膜血流の増大、炎症の減少、体重増加の増大、下痢の減少、糞便の湿重量の減少、腸の創傷治癒、血漿シトルリン濃度の上昇、ＣＲＰレベルの低下、ステロイド療法の必要性の減少、粘膜完全性の増強または刺激、ナトリウム損失の減少、腸内への細菌のトランスロケーションの最小化、緩和、または予防、外科手術後の腸の回復の増強、刺激または加速；炎症性腸疾患の再発の予防；またはエネルギー恒常性の実現または維持を含む。 一実施形態では、治療方法を用いて、例えば、これだけに限定されないが、５−ＦＵ、アルトレタミン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クリサンタスパーゼ（ｃｒｉｓａｎｔａｓｐａｓｅ）、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、リポソーム化ドキソルビシン、ロイコボリン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、ストレプトゾシン、テガフール−ウラシル、テモゾロミド、チオテパ、チオグアニン、チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビンなどの化学療法剤に起因する小腸損傷を有する被験体を処置する。 記載されている方法によって治療を施す前に、胃腸の状態の診断を得ることができる。胃腸の状態は、当技術分野で公知の標準のケア手段によって診断することができる。例えば、潰瘍は、食道、胃、および腸のバリウムＸ線によって、内視鏡検査によって、血液、呼吸、および胃の組織生検（例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉの存在を検出するために）によって診断することができる。吸収不良症候群は、吸収不良症候群の診断に役立つ血液中の栄養分のレベルまたは便中の脂肪のレベルをモニターする血液検査または検便によって診断することができる。セリアックスプルーは、抗筋内膜抗体（ＩｇＡ）、抗トランスグルタミナーゼ（ＩｇＡ）、抗グリアジン（ＩｇＡおよびＩｇＧ）、ならびに総血清ＩｇＡについて検査することを含んでよい抗体検査によって診断することができる。内視鏡検査または小腸生検を用いて、セリアックスプルーの診断に役立つ、絨毛が平らになることなどの症状の異常な腸の内層を検出することができる。熱帯性スプルーは、小腸生検または化学療法に対する応答を用いて吸収不良または感染症を検出することによって診断することができる。炎症性腸疾患は、結腸内視鏡検査によって、またはバリウム注腸後のＸ線によって、臨床症候と組み合わせて検出することができ、結腸壁の炎症、出血、または潰瘍が潰瘍性大腸炎またはクローン病などの炎症性腸疾患の診断に役立つ。 治療方法のいくつかの実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮを被験体に投与することにより、生化学的、生理的、または臨床的なパラメータのうちの１つまたは複数が、同じアッセイを用いて、または測定された臨床的パラメータに基づいて決定した、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２構成成分の該パラメータよりも大きく改善される。前述の一実施形態では、治療有効量のＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物をそれを必要とする被験体に投与することにより、成人短腸症候群（ＳＢＳ）の患者における非経口栄養（ＰＮ）依存が、同等の量のＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較して、投与の２〜７日後の被験体において約１０％、または約２０％、または約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、またはそれ以上大きく低下する。別の実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮをそれを必要とする被験体に治療有効用量レジメンを用いて投与することにより、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２の同等の治療有効用量レジメンと比較して、投与開始後７日目、１０日目、１４日目、２１日目または３０日目に被験体において１０％、または約２０％、または約３０％、または約４０％、または約５０％またはそれ以上体重が増大する。別の実施形態では、治療有効量のＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物をそれを必要とする被験体に投与することにより、成人短腸症候群（ＳＢＳ）の患者における糞便の湿重量が、同等の量のＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較して、投与の２〜７日後に被験体において約１０％、または約２０％、または約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、またはそれ以上大きく減少する。別の実施形態では、治療有効量のＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物をそれを必要とする被験体に投与することにより、成人短腸症候群（ＳＢＳ）の患者におけるナトリウム損失が、同等の量のＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較して、投与の２〜７日後に被験体において約１０％、または約２０％、または約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、またはそれ以上が大きく低下する。 治療方法のいくつかの実施形態では、（ｉ）その他の点では同じ用量レジメンの下でＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較して約２分の１、または約３分の１、または約４分の１、または約５分の１、または約６分の１、または約８分の１、または約１０分の１のモル量のＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質をそれを必要とする被験体に投与し、融合タンパク質ではＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と同等の曲線下面積および／または同等の治療効果が達成される；（ｉｉ）ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を、その他の点では同じ投薬量の下でＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較して少ない頻度で（例えば、３日おき、約７日おき、約１０日おき、約１４日おき、約２１日おき、またはおよそ月に１回）投与し、融合タンパク質ではＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と同等の曲線下面積および／または同等の治療効果が達成される、または（ｉｉｉ）少なくとも約２０％、または約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％累積的に少ないモル量の融合タンパク質を、その他の点では同じ用量レジメンの下でＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較して投与し、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質ではＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と同等の曲線下面積および／または同等の治療効果が達成される。累積的に少ない量は、少なくとも約１週間、または約１４日、または約２１日、または約１カ月の期間にわたって測定する。治療方法の前述の実施形態では、治療効果は、これだけに限定されないが、ＧＬＰ−２の血中濃度、表３２のアッセイ、または、ＧＬＰ−２に関連する状態に関して当技術分野で公知のものの中でも、腸間膜血流の減少、出血、炎症、大腸炎、下痢、糞便の湿重量、体重減少、ナトリウム損失、腸潰瘍、腸閉塞症、瘻孔、および膿瘍、便通の頻度の変化、ぶどう膜炎、小児の成長不全を検出するため、または閾値レベルを上回るＧＬＰ−２の血中濃度、例えば、１００ｎｇ／ｍｌのＧＬＰ−２当量（またはおよそ２２００ｎｇ／ｍｌのＧＬＰ−２−２Ｇ ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４）を維持するためのアッセイを含めた本明細書に記載の測定パラメータのいずれかによって決定することができる。 本発明は、胃腸の状態を有する被験体を処置するための医薬レジメンにおいて使用するためのＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。一実施形態では、レジメンは、本明細書に記載のＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を含む医薬組成物を含む。別の実施形態では、医薬レジメンは、被験体における治療効果を達成するために必要な医薬組成物の量を決定するステップをさらに含む。別の実施形態では、胃腸の状態を有する被験体を処置するための医薬レジメンは、有効量の医薬組成物を２回以上連続して被験体に投与することを含み、投与により、同等のｎｍｏｌ／ｋｇ量を使用して投与した、ＸＴＥＮと連結していないＧＬＰ−２と比較して、胃腸の状態に関連する少なくとも１つ、２つ、または３つのパラメータが少なくとも５％、または１０％、または２０％、または３０％、または４０％、または５０％、または６０％、または７０％、または８０％、または９０％大きく改善される。医薬レジメンの別の実施形態では、有効量は、少なくとも約５ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約２５ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約２００ｎｍｏｌ／ｋｇ、または前述の間の任意の量である。別の実施形態では、胃腸の状態を有する被験体を処置するための医薬レジメンは、治療有効量の医薬組成物を、約３日に１回、６日に１回、７日に１回、１０日に１回、１４日に１回、２１日に１回、２８日に１回またはそれ以上の日数ごとに１回投与することを含む。別の実施形態では、胃腸の状態を有する被験体を処置するための医薬レジメンは、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ医薬組成物を投与することを含み、前記投与は皮下投与、筋肉内投与、または静脈内投与である。別の実施形態では、胃腸の状態を有する被験体を処置するための医薬レジメンは、治療有効量の医薬組成物を投与することを含み、治療有効量により、同等量を被験体に投与した、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較して、融合タンパク質の治療域内の融合タンパク質の血中濃度が少なくとも３倍長く維持される。 本発明は、さらに、本明細書において提供される方法に従って使用されるＧＬＰ２−ＸＴＥＮを、ＧＬＰ−２に関連する状態、またはＧＬＰ−２が補助的療法であるまたは補助的療法になり得る状態を治療するために有用な他の治療方法および組成物（例えば、ステロイドまたはＮＳＡＩＤＳなどの抗炎症性作用剤）と併せて投与することができることを意図している。 別の態様では、本発明は、ＧＬＰ−２に関連する状態を治療するための医薬品を調製する方法において使用するためのＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。一実施形態では、医薬品を調製する方法は、表１のＧＬＰ−２に対して少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するＧＬＰ−２配列と、表４および表８〜１２のいずれか１つから選択されるＸＴＥＮに対して少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する少なくとも第１のＸＴＥＮを連結するステップであって、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮがネイティブなＧＬＰ−２の生物学的活性の少なくとも一部分を保持するステップと、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮを少なくとも１つの薬学的に許容される担体とさらに組み合わせるステップとを含む。別の実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮは、表１３、表３２または表３３のいずれか１つから選択される配列と比較して少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を有する。 別の態様では、本発明は、所望の薬物動態的性質、薬理的性質または薬学的性質が実現されるようにＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物を設計する方法を提供する。一般に、図４〜６に例示されている融合タンパク質および本発明の組成物の設計および作製におけるステップとしては、（１）特定の状態を治療するためのＧＬＰ−２（例えば、ネイティブなタンパク質、表１の配列、活性を有する類似体または誘導体）を選択するステップと、（２）生じるＧＬＰ２−ＸＴＥＮに所望のＰＫ特性および物理化学特性を付与する（例えば、被験体にＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物を投与することにより、融合タンパク質が、ＸＴＥＮと連結していないＧＬＰ−２と比較して長い期間にわたって治療域内に維持される）ＸＴＥＮを選択するステップと、（３）ＧＬＰ２−ＸＴＥＮの所望のＮ末端からＣ末端への配置を確立して、所望の有効性またはＰＫパラメータを実現するステップと、（４）配置されたＧＬＰ２−ＸＴＥＮをコードする発現ベクターの設計を確立するステップと、（５）発現ベクターを用いて適切な宿主を形質転換するステップと、（６）生じた融合タンパク質を発現させ、回収するステップとが挙げられる。半減期の増大または最小有効濃度を上回っている期間の増大が望まれるこれらのＧＬＰ２−ＸＴＥＮに関して、組み込むために選択されるＸＴＥＮは、一般に、少なくとも約２８８、または約４３２、または約５７６、または約８６４、または約８７５、または約９１２、または約９２３アミノ酸残基を有し、単一のＸＴＥＮがＧＬＰ２−ＸＴＥＮに組み入れられる。別の実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮは、前述の長さの第１のＸＴＥＮと、約３６、または約７２、または約１４４、または約２８８、または約５７６、または約８６４、または約８７５、または約９１２、または約９２３、または約１０００またはそれ以上のアミノ酸残基の少なくとも第２のＸＴＥＮとを含む。 別の態様では、本発明は、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物を作出して、製造の容易さを改善し、それにより、ネイティブなＧＬＰ−２と比較して安定性の増大、水溶性の増大、および／または製剤化の容易さをもたらす方法を提供する。一実施形態では、本発明は、ＧＬＰ−２の水溶性を増大させる方法であって、生理的条件下で、融合していない状態のＧＬＰ−２と比較して、生じるＧＬＰ２−ＸＴＥＮの可溶性の形態の高濃度を実現することができるようにＧＬＰ−２を１つまたは複数のＸＴＥＮと連結するステップを含む方法を包含する。いくつかの実施形態では、該方法により、水溶性が、生理的条件下で、融合していないＧＬＰ−２と比較して少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％大きい、または少なくとも約５０％大きい、または少なくとも約７５％大きい、または少なくとも約９０％大きい、または少なくとも約１００％大きい、または少なくとも約１５０％大きい、または少なくとも約２００％大きい、または少なくとも約４００％大きい、または少なくとも約６００％大きい、または少なくとも約８００％大きい、または少なくとも約１０００％大きい、または少なくとも約２０００％大きいＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質がもたらされる。融合タンパク質に組み入れた場合にＧＬＰ−２の水溶性を増大させるＸＴＥＮの性質に寄与する因子としては、ＸＴＥＮ融合パートナーの溶解度が高いこと、および溶液中のＸＴＥＮの分子間の自己凝集（ｓｅｌｆ−ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）の程度が低いことが挙げられる。前述の一実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮは、少なくとも約３６、または約４８、または約９６、または約１４４、または約２８８、または約５７６、または約８６４アミノ酸残基を有するＸＴＥＮと連結したＧＬＰ−２を含み、融合タンパク質の溶解度は、生理的条件下で、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２の少なくとも３倍である、あるいは、ＸＴＥＮと連結していないＧＬＰ−２の少なくとも４倍、または５倍、または６倍、または７倍、または８倍、または９倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍、または少なくとも３０倍、または少なくとも５０倍、または少なくとも６０倍またはそれを超える。前述の一実施形態では、ＧＬＰ−２は、表４および表８〜１２のいずれか１つから選択されるＸＴＥＮに対して少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する少なくとも１つのＸＴＥＮと連結した表１のＧＬＰ−２に対して少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。 別の実施形態では、本発明は、ＧＬＰ−２の貯蔵寿命を増大させる方法であって、ＧＬＰ−２を、生じるＧＬＰ２−ＸＴＥＮの貯蔵寿命が融合していない状態のＧＬＰ−２と比較して延長されるように選択された１つまたは複数のＸＴＥＮと連結するステップを含む方法を包含する。本明細書で使用される場合、貯蔵寿命とは、溶液中またはいくつかの他の貯蔵製剤中のＧＬＰ−２またはＧＬＰ２−ＸＴＥＮの機能活性が、活性を過度に失うことなく安定なままである期間を指す。本明細書で使用される場合、「機能活性」とは、受容体もしくはリガンド、または基質に結合する能力、または活性の上方制御を誘発する能力、または当技術分野で公知のＧＬＰ−２に付随する１つまたは複数の公知の機能活性を示す能力などの薬理効果または生物学的活性を指す。分解されるまたは凝集するＧＬＰ−２は、一般に、溶液中にとどまっているものと比較して機能活性が低下している、または生物学的利用能が低下している。該方法により、融合タンパク質に組み入れた時にＧＬＰ−２の貯蔵寿命を延長させることができることに寄与する因子としては、水溶性の増大、溶液中での自己凝集の減少、およびＸＴＥＮ融合パートナーの熱安定性の増大が挙げられる。特に、ＸＴＥＮが凝集する傾向が低いことにより、より高い薬物濃度のＧＬＰ−２を含有する医薬調製物を製剤化する方法が容易になり、また、ＸＴＥＮの熱安定性が、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質の、延長された期間にわたって可溶性かつ機能的に活性なままである性質に寄与する。一実施形態では、該方法により、同じ貯蔵および取扱い条件に供された標準物質と比較して大きな活性を示す、貯蔵寿命が「引き伸ばされた」または「延長された」ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質がもたらされる。標準物質は、融合していない全長のＧＬＰ−２であってよい。一実施形態では、該方法は、単離されたＧＬＰ２−ＸＴＥＮを、ＸＴＥＮがその非構造化コンフォメーションを保持することができること、およびＧＬＰ２−ＸＴＥＮについては対応する融合していないＧＬＰ−２を超える期間にわたって製剤中で可溶性のままであることができることを増強する１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と一緒に製剤化するステップを含む。一実施形態では、該方法は、ＧＬＰ−２と、表４から選択される１つまたは複数のＸＴＥＮを連結して、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を創出し、それにより、所与の時点で比較した場合および標準物質と同じ貯蔵および取扱い条件に供した場合に、標準物質の機能活性の約１００超％、または標準物質の機能活性の約１０５％超、約１１０％超、約１２０％超、約１３０％超、約１５０％超または約２００％超を保持し、それにより、その貯蔵寿命が増大している溶液をもたらすことを含む。 貯蔵寿命は、貯蔵を開始した時の機能活性に対して正規化した、貯蔵後に残っている機能活性に関して評価することもできる。引き延ばされたまたは延長された機能活性によって示される通り、貯蔵寿命が引き延ばされたまたは延長された本発明のＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、同じ期間にわたって同じ条件に供した場合の同等のＸＴＥＮと連結していないＧＬＰ−２の機能活性の約５０％超の機能活性、または約６０％、７０％、８０％、または９０％超を保持する。例えば、表４から選択される１つまたは複数のＸＴＥＮ配列と融合したＧＬＰ−２を含む本発明のＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、種々の温度上昇条件下で、最大２週間、または４週間、または６週間、または１２週間またはそれよりも長い期間にわたって、溶液中でのその元の活性の約８０％以上を保持する。いくつかの実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮは、８０℃で１０分加熱した場合に、溶液中でのその元の活性の少なくとも約５０％、または約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％またはそれ以上を保持する。他の実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮは、３７℃で約７日間加熱または維持した場合に、溶液中でのその元の活性の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、あるいは、少なくとも約９０％またはそれ以上を保持する。別の実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、約１時間〜約１８時間にわたって約３０℃〜約７０℃の温度に曝露した後、その機能活性の少なくとも約８０％以上を保持する。本段落の上文に記載されている前述の実施形態では、保持されるＧＬＰ２−ＸＴＥＮの活性は、所与の時点で、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２の活性の少なくとも約２倍、または少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約６倍である。 ＶＩＩ）．本発明の核酸配列 本発明は、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮキメラ融合タンパク質をコードする単離されたポリ核酸およびその相同な変異形を含めた、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮキメラ融合タンパク質をコードするポリ核酸分子と相補的な配列を提供する。別の態様では、本発明は、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮキメラ融合タンパク質をコードするポリ核酸およびその相同な変異形を含めたＧＬＰ２−ＸＴＥＮキメラ融合タンパク質をコードするポリ核酸分子と相補的な配列を作製するための方法を包含する。一般に、また、図４〜６において例示されているように、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を作製し、生じた遺伝子産物を発現させる方法は、ＧＬＰ−２をコードするヌクレオチドおよびＸＴＥＮをコードするヌクレオチドを組み立てるステップと、構成成分をインフレームでライゲーションするステップと、コード遺伝子を宿主細胞に適した発現ベクターに組み入れるステップと、発現ベクターを用いて適切な宿主細胞を形質転換するステップと、宿主細胞を、形質転換された宿主細胞において融合タンパク質の発現が引き起こされるまたはそれが可能になる条件下で培養し、それにより、生物学的に活性なＧＬＰ２−ＸＴＥＮポリペプチドを作製し、それを当技術分野で公知の標準のタンパク質の精製方法によって単離された融合タンパク質として回収するステップとを含む。分子生物学における標準の組換え技法を用いて、本発明のポリヌクレオチドおよび発現ベクターを作出する。 本発明によると、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮをコードする核酸配列（またはその相補配列）を使用して、適切な宿主細胞においてＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質の発現を導く組換えＤＮＡ分子を生成する。いくつかのクローニング戦略が本発明を実施するために適しており、その多くは、本発明のＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物の融合タンパク質をコードする遺伝子、またはその相補配列を含む構築物を生成するために用いられる。いくつかの実施形態では、クローニング戦略を用いて、少なくとも第１のＧＬＰ−２および少なくとも第１のＸＴＥＮポリペプチドを含む単量体ＧＬＰ２−ＸＴＥＮをコードする遺伝子、またはそれらの相補配列を創出する。前述の一実施形態では、遺伝子は、ＧＬＰ−２または配列変異体をコードする配列を含む。他の実施形態では、クローニング戦略を用いて、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物の融合タンパク質を発現させるために宿主細胞を形質転換するために使用する、少なくとも第１のＧＬＰ−２の分子またはその相補配列および第１のおよび少なくとも第２のＸＴＥＮまたはそれらの相補配列をコードするヌクレオチドを含む、単量体ＧＬＰ２−ＸＴＥＮをコードする遺伝子を創出する。本段落の上文に記載されている前述の実施形態では、遺伝子は、切断配列（複数可）もコードするスペーサー配列をコードするヌクレオチドをさらに含んでよい。 所望のＸＴＥＮ配列の設計において、ＸＴＥＮをコードする配列の創出において「構成単位」分子手法を使用したにもかかわらず、本発明の組成物のＸＴＥＮの非反復性が実現されることが発見された。これは、上記のペプチド配列モチーフをコードするポリヌクレオチドのライブラリーを使用し、次いでそれをライゲーションし、かつ／または多量体化して、ＸＴＥＮ配列をコードする遺伝子を創出することによって実現された（図４、図５、図８、図９および実施例を参照されたい）。したがって、発現された融合タンパク質のＸＴＥＮ（複数可）は、モチーフ自体は非反復性アミノ酸配列からなるのでわずか４つの異なる配列モチーフの多数の単位からなり得るが、その一方でＸＴＥＮ配列全体は非反復性になる。したがって、一実施形態では、ＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチドは、インフレームで作動可能に連結した非反復配列、またはモチーフをコードする多数のポリヌクレオチドを含み、生じる発現されたＸＴＥＮアミノ酸配列は非反復性である。 １つの手法では、まず、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質に対応するＤＮＡ配列を含有する構築物を調製する。哺乳動物のネイティブなＧＬＰ−２配列を融合タンパク質に使用するこれらの実施形態では、組織または単離された細胞から標準の方法を用いて調製したｃＤＮＡライブラリーから得られる組成物のＧＬＰ−２をコードするＤＮＡは、ＧＬＰ−２ ｍＲＮＡを保有し、検出可能なレベルで発現されると考えられる。ライブラリーを、例えば、従来の分子生物学技法を用いたハイブリダイゼーションによって対象のＧＬＰ−２遺伝子を同定するために設計した約２０〜１００塩基を含有するプローブを用いてスクリーニングする。プローブの最良の候補は、ＧＬＰ−２と高度に相同な配列を示すものであり、また、十分な長さであり、偽陽性が最小限になることが十分に明白であるべきであるが、１つまたは複数の位置において変性させることができる。必要であれば、ｃＤＮＡに逆転写されていない可能性があるｍＲＮＡの前駆体およびプロセシング中間体を検出するために、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記に記載の従来のプライマー伸長手順を用いてコード配列を得ることができる。次いで、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法体系を用いて標的のＤＮＡコード配列またはＲＮＡコード配列を増幅して、ＧＬＰ−２遺伝子を含有するＧＬＰ２−ＸＴＥＮ構築物を調製するために十分な材料を得ることができる。次いで、アッセイを行って、ハイブリダイズしている全長の遺伝子が所望のＧＬＰ−２遺伝子（複数可）であることを確認することができる。これらの従来の方法により、そのような供給源から調製したｃＤＮＡライブラリーからＤＮＡを都合よく得ることができる。ＧＬＰ−２類似体（１つまたは複数のアミノ酸置換を伴う、例えば、表１の配列など）のこれらの実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ構築物を調製するために、ＧＬＰ−２をコードする遺伝子（複数可）を、当技術分野で公知の標準の合成手順（例えば、Ｅｎｇｅｌｓら（Ａｇｎｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．、２８巻：７１６〜７３４頁、１９８９年）に記載の方法のうちの１つを用いた自動核酸合成）によって、公的に利用可能なデータベース、特許、または参考文献から得られるＤＮＡ配列を使用して創出する。そのような手順は、当技術分野で周知であり、科学文献および特許文献において十分に説明されている。例えば、配列は、対象のタンパク質のアミノ酸配列またはタンパク質の断片もしくは変異体のアミノ酸配列を含有するＣｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（ＣＡＳ）ＲｅｇｉｓｔｒｙまたはＧｅｎＢａｎｋデータベースへのエントリーに対応する、ワールドワイドウェブ上でｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで利用可能なＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウェブサイトを通じて入手可能なＣＡＳ登録番号（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙにより公開されている）および／またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号（例えば、Ｌｏｃｕｓ ＩＤ、ＮＰ＿ＸＸＸＸＸ、およびＸＰ＿ＸＸＸＸＸ）モデルタンパク質識別子から入手することができる。本明細書において提供されるそのような配列識別子に関して、これらのＣＡＳおよびＧｅｎＢａｎｋ受託番号およびＧｅｎＳｅｑ受託番号のそれぞれに関連する概要頁ならびに引用された学術刊行物（例えば、ＰｕｂＭｅｄ ＩＤ番号（ＰＭＩＤ））は、それぞれ、特に、そこに記載されているアミノ酸配列に関して、その全体が参照により組み込まれる。一実施形態では、ＧＬＰ−２をコードする遺伝子は、表１のいずれか１つのタンパク質またはその断片もしくは変異体をコードする。 単一のＧＬＰ−２を含む発現された融合タンパク質の場合では、対象ＧＬＰ２−ＸＴＥＮタンパク質のＧＬＰ−２部分をコードする遺伝子またはポリヌクレオチドを、次いで、生物系において高レベルのタンパク質を発現させるための適切な転写配列および翻訳配列の制御下にあるプラスミドまたは他のベクターである構築物にクローニングする。後のステップにおいて、ＸＴＥＮをコードする第２の遺伝子またはポリヌクレオチドを、ＧＬＰ−２をコードする遺伝子（複数可）と近接し、インフレームにある構築物にクローニングすることによって、ＧＬＰ−２遺伝子のＮ末端および／またはＣ末端をコードするヌクレオチドと遺伝子融合する。この第２のステップは、ライゲーションまたは多量体化ステップによって起こる。本段落の上文に記載されている前述の実施形態では、創出される遺伝子構築物は、代わりに、それぞれの融合タンパク質をコードするそれぞれの遺伝子の相補配列であってよいことが理解されるべきである。 ＸＴＥＮをコードする遺伝子は、完全に合成によって、または合成と酵素的プロセスの組合せによってのいずれか、例えば、実施例においてより詳細に記載さている方法を含めた制限酵素媒介性クローニング、ＰＣＲおよびオーバーラップ伸長などで、１つまたは複数のステップで作出することができる。本明細書に開示されている方法を用いて、例えば、ＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチドの短い配列をライゲーションして、所望の長さおよび配列のより長いＸＴＥＮ遺伝子にすることができる。一実施形態では、該方法により、約９〜１４アミノ酸、または約１２〜２０アミノ酸、または約１８〜３６アミノ酸、または約４８〜約１４４アミノ酸、または約１４４〜約２８８またはそれよりもより長いＸＴＥＮモチーフまたはセグメント配列、または前述の範囲のモチーフまたはセグメントの長さの任意の組合せをコードするコドン最適化オリゴヌクレオチドを２つ以上ライゲーションする。 あるいは、開示されている方法を用いて、ＸＴＥＮをコードする配列を多量体化して、より長い、所望の長さの配列にする。例えば、ＸＴＥＮの３６アミノ酸をコードする遺伝子を二量体化して、７２アミノ酸をコードする遺伝子にし、次いで１４４アミノ酸をコードする遺伝子にし、次いで２８８アミノ酸をコードする遺伝子にすることなどができる。多量体化を用いてさえも、形質転換された宿主におけるコード遺伝子の組換えを減少させ安定性を増大させることができる、使用される最も短い単位のモチーフに選択されるコドンを設計することを通じて、ＸＴＥＮをコードする遺伝子の反復性が低いまたは実質的に非反復性になるようにＸＴＥＮポリペプチドを構築することができる。 非反復配列を有するＸＴＥＮをコードする遺伝子は、遺伝子合成の標準の技法を用いてオリゴヌクレオチドから組み立てる。遺伝子設計は、コドンの使用およびアミノ酸組成を最適化するアルゴリズムを使用して実施することができる。本発明の１つの方法では、比較的短いＸＴＥＮコードポリヌクレオチド構築物のライブラリーを創出し、次いで、上記の通り組み立てる。次いで、生じた遺伝子を、図５および図８において例示されている通り、ＧＬＰ−２またはＧＬＰ−２の領域をコードする遺伝子を用いて組み立て、生じた遺伝子を使用して宿主細胞を形質転換し、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮを、本明細書に記載の通り、その性質を評価するために作製し、回収する。 いくつかの実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ配列を、最適化された発現のために、当技術分野で公知のリーダー配列を使用するのではなく、Ｎ末端配列（ＮＴＳ）ＸＴＥＮを含めることによって設計する。一実施形態では、ＮＴＳを、融合タンパク質をコードする遺伝子とつないだ際に最適化された発現がもたらされるように決定されたＸＴＥＮ遺伝子にコードヌクレオチドを含めることによって創出する。一実施形態では、発現されるＧＬＰ２−ＸＴＥＮのＮ末端ＸＴＥＮ配列は、例えば、これだけに限定されないが、ＣＨＯ、ＨＥＫ、酵母、および当技術分野で公知の他の細胞型などの真核細胞において発現させるために最適化されている。 ポリヌクレオチドライブラリー 別の態様では、本発明は、所望の長さおよび配列のＸＴＥＮをコードする遺伝子を組み立てるために使用する、ＸＴＥＮ配列をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを提供する。 ある特定の実施形態では、ＸＴＥＮをコードするライブラリー構築物は、長さが固定されたポリペプチドセグメントをコードするポリヌクレオチドを含む。最初のステップとして、９〜１４アミノ酸残基のモチーフをコードするオリゴヌクレオチドのライブラリーを組み立てることができる。好ましい実施形態では、１２アミノ酸のモチーフをコードするオリゴヌクレオチドのライブラリーを組み立てる。 ＸＴＥＮをコードする配列セグメントを二量体化または多量体化して、より長いコード配列にすることができる。二量体化または多量体化は、ライゲーション、オーバーラップ伸長、ＰＣＲ組立てまたは当技術分野で公知の同様のクローニング技法によって実施することができる。このプロセスを、生じたＸＴＥＮをコードする配列が配列の組織化および所望の長さに到達するまで多数回繰り返し、ＸＴＥＮをコードする遺伝子をもたらすことができる。理解される通り、例えば、１２アミノ酸モチーフをコードするポリヌクレオチドのライブラリーを二量体化し、かつ／またはライゲーションして、３６アミノ酸をコードするポリヌクレオチドのライブラリーにすることができる。長さが異なるモチーフ、例えば、９〜１４アミノ酸モチーフをコードするライブラリーにより、本発明により意図されている２７〜４２アミノ酸のライブラリーがもたらされる。今度は、２７〜４２アミノ酸、好ましくは３６アミノ酸（実施例に記載の通り）をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを段階的に二量体化して、連続的に長さが長くなる、本明細書に開示されているＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質をコードする遺伝子に組み込むための所望の長さのＸＴＥＮ配列をコードするポリヌクレオチドを含有するライブラリーにすることができる。 ＸＴＥＮをコードするＤＮＡ配列を最適化するためのより効率的なやり方は、コンビナトリアルライブラリーに基づく。ＸＴＥＮをコードする遺伝子は、各セグメントについて多数のコドン型が得られるように、セグメントに設計し、合成することができる。これらのセグメントを無作為に組み立てて遺伝子のライブラリーにすることができ、したがって、各ライブラリーメンバーは同じアミノ酸配列をコードするが、ライブラリーメンバーは多数のコドン型を含む。そのようなライブラリーを、高レベルの発現および／または切断産物の存在量が少ないことをもたらす遺伝子についてスクリーニングすることができる。コンビナトリアル遺伝子組立てのプロセスは図１０に例示されている。図１０の遺伝子は６つの基本断片から組み立てられ、各断片は、４つの異なるコドン型で利用可能である。これにより、４０９６種の理論的多様性が可能になる。 いくつかの実施形態では、特異的な配列ＸＴＥＮファミリー、例えば、表３のＡＤ配列、ＡＥ配列、ＡＦ配列、ＡＧ配列、ＡＭ配列、またはＡＱ配列に限られているアミノ酸をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを組み立てる。他の実施形態では、ライブラリーは、表３のモチーフファミリー配列の２つ以上をコードする配列を含む。３６ｍｅｒをコードする、ライブラリーの代表的な非限定的なポリヌクレオチド配列の名称および配列が表８〜１１に示されており、それらを創出するために用いる方法はそれぞれの実施例においてより詳細に記載されている。他の実施形態では、ＸＴＥＮをコードするライブラリーを、無作為の順番で連結した、アミノ酸をコードするポリヌクレオチドコドンのセグメントから構築し、コドンの少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）アミノ酸のコドンからなる群より選択される。今度は、そのライブラリーを段階的な二量体化またはライゲーションに使用して、例えば、４８アミノ酸、７２アミノ酸、１４４アミノ酸、２８８アミノ酸、５７６アミノ酸、８６４アミノ酸、８７５アミノ酸、９１２アミノ酸、９２３アミノ酸、１３１８アミノ酸、または全長の約３０００アミノ酸に至るまで、ならびに中間の長さのＸＴＥＮ配列をコードするポリヌクレオチド配列ライブラリーを実現することができ、コードされるＸＴＥＮは、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質の構成成分として発現された際に、本明細書に開示されている性質のうちの１つまたは複数を有し得る。いくつかの場合には、ポリヌクレオチドライブラリー配列は、下でより詳細に記載されている、「配列決定島（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉｓｌａｎｄ）」として使用される追加的な塩基も含んでよい。 図５は、代表的な、本発明の実施形態における、ＸＴＥＮポリヌクレオチド構築物およびＧＬＰ２−ＸＴＥＮポリヌクレオチド構築物の組立ての非限定的なステップの概略フローチャートである。個々のオリゴヌクレオチド５０１をアニーリングして１２アミノ酸モチーフ（「１２−ｍｅｒ」）などの配列モチーフ５０２にし、それを、ライブラリー由来の追加的な配列モチーフとライゲーションして、所望の長さのＸＴＥＮ５０４を包含するプールを創出するとともに、より低濃度の、ＢｂｓＩ制限部位、およびＫｐｎＩ制限部位を含有するオリゴ５０３にライゲーションする。生じたライゲーション産物のプールをゲル精製し、ＸＴＥＮの所望の長さのバンドをカットし、ストッパー配列５０５を有する単離されたＸＴＥＮ遺伝子をもたらす。ＸＴＥＮ遺伝子をスタッファーベクターにクローニングする。この場合、ベクターは、任意選択のＣＢＤ配列５０６およびＧＦＰ遺伝子５０８をコードする。次いで、ＢｂｓＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いた消化を行って、５０７および５０８を除去し、終止コドンを置く。次いで、生じた産物を、ＢｓａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化した、ＧＬＰ−２をコードする遺伝子を含有するベクターにクローニングし、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質をコードする遺伝子５００をもたらす。ＸＴＥＮおよび前駆体をコードするポリヌクレオチド配列の網羅的ではない一覧が表７〜１２において提供される。 ＸＴＥＮをコードする遺伝子のライブラリーを、当技術分野で公知の１つまたは複数の発現ベクターにクローニングすることができる。十分に発現されているライブラリーメンバーの同定を容易にするために、レポータータンパク質との融合物としてライブラリーを構築することができる。適切なレポーター遺伝子の非限定的な例は、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｃｅ）、アルカリホスファターゼ、およびベータガラクトシダーゼである。スクリーニングすることにより、選択された宿主生物体において高濃度で発現させることができる短いＸＴＥＮ配列を同定することができる。その後、無作為なＸＴＥＮ二量体のライブラリーを生成し、高レベルの発現についてスクリーニングを繰り返すことができる。その後、生じた構築物を、発現のレベル、プロテアーゼ安定性、または抗血清との結合性などのいくつもの性質についてスクリーニングすることができる。 本発明の１つの態様は、融合タンパク質の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列を提供することであり、配列の創出にはコドン最適化が行われている。ポリペプチド組成物の発現を改善する目的、および産生宿主におけるコード遺伝子の遺伝的安定性を改善する目的でのコドン最適化が特に興味深い。例えば、コドン最適化には、グリシンに富むまたはアミノ酸配列が非常に反復性であるＸＴＥＮ配列に対して特定の重要性がある。コドン最適化は、コンピュータプログラム（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ， Ｃ．ら（２００４年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２２巻：３４６〜５３頁）を使用して実施し、そのいくつかにより、リボソーム休止（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐａｕｓｉｎｇ）（Ｃｏｄａ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ．）が最小限になる。一実施形態では、ライブラリーの全てのメンバーが同じアミノ酸配列をコードするが、コドンの使用は変動するコドンライブラリーを構築することによってコドン最適化を実施することができる。そのようなライブラリーを、ＸＴＥＮを含有する製品を大規模生産するために特に適した、高度に発現されており、遺伝的に安定なメンバーについてスクリーニングすることができる。ＸＴＥＮ配列を設計する際、いくつもの性質を考慮することができる。コードＤＮＡ配列の反復性を最小限にすることができる。さらに、産生宿主によってめったに使用されないコドン（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉではアルギニンコドンであるＡＧＧおよびＡＧＡおよび１つのロイシンコドン）の使用を回避するまたは最小限にすることができる。Ｅ．ｃｏｌｉの場合では、２つのグリシンコドン、ＧＧＡおよびＧＧＧは高度に発現されるタンパク質においてめったに使用されない。したがって、ＸＴＥＮをコードする遺伝子配列のコドン最適化が非常に望ましい場合がある。グリシンのレベルが高いＤＮＡ配列はＧＣ含量が高い傾向があり、それにより、不安定になるまたは発現レベルが低くなる。したがって、可能な場合には、ＸＴＥＮをコードする配列のＧＣ含量が、ＸＴＥＮを製造するために使用する産生生物体に適するようにコドンを選択することが好ましい。 場合によって、全長のＸＴＥＮをコードする遺伝子は、１つまたは複数の配列決定島を含む。この場合、配列決定島とは、ＸＴＥＮライブラリー構築物配列とは別個であり、全長のＸＴＥＮをコードする遺伝子には存在しないまたは存在することが予測されない制限部位を含む短いひと続きの配列である。一実施形態では、配列決定島は配列５’−ＡＧＧＴＧＣＡＡＧＣＧＣＡＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＣＡＡＧＣＡＣＧＧＧＡＧＧＴ−３’である。別の実施形態では、配列決定島は配列５’−ＡＧＧＴＣＣＡＧＡＡＣＣＡＡＣＧＧＧＧＣＣＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＧＧＡＧＧＴ−３’である。 一実施形態では、ライブラリーの全てのメンバーが同じアミノ酸配列をコードするが、配列内のそれぞれのアミノ酸のコドンの使用は変動するポリヌクレオチドライブラリーを、開示されている方法を用いて構築する。そのようなライブラリーを、ＸＴＥＮを含有する製品を大規模生産するために特に適した、高度に発現されており、遺伝的に安定なメンバーについてスクリーニングすることができる。 場合によって、ライブラリーに配列をクローニングして、望ましくない配列を含有する単離体を排除することができる。最初の短いＸＴＥＮ配列のライブラリーでは、アミノ酸配列にいくらかの変動が許容される。例えば、いくつもの親水性アミノ酸が特定の位置に出現し得るように、いくつかのコドンを無作為化することができる。反復的な多量体化のプロセスの間に、生じたライブラリーメンバーを、高レベルの発現についてスクリーニングすることに加えて、溶解度またはプロテアーゼ抵抗性のような他の特性についてスクリーニングすることができる。 所望の長さおよび性質のＸＴＥＮをコードする遺伝子を選択したら、それを、所望の場所で、ＧＬＰ−２をコードする遺伝子と近接し、インフレームである構築物、あるいは、末端ＸＴＥＮと連結したスペーサー／切断配列をコードするヌクレオチドとインフレームである構築物にクローニングすることによって、ＧＬＰ−２遺伝子（複数可）をコードするヌクレオチドと遺伝子融合する。本発明は、コードされるＧＬＰ２−ＸＴＥＮに応じて、前述の種々の順列を提供する。例えば、上記の式ＩＩＩによって具体化されるものなどのＧＬＰ−２および２つのＸＴＥＮを含むＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質をコードする遺伝子では、遺伝子は、ＧＬＰ−２をコードするポリヌクレオチド、および、組成および配列の長さが同一であっても異なってもよい２つのＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチドを有する。前述の非限定的な一実施形態では、ＧＬＰ−２ポリヌクレオチドはネイティブなＧＬＰ−２をコードし、Ｃ末端ＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチドはＡＥ８６４をコードし、Ｎ末端ＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチドはＡＥ９１２をコードする。ＧＬＰ−２遺伝子をＸＴＥＮ構築物にクローニングするステップは、図５において、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮポリヌクレオチド構築物の組立ての代表的なステップの概略フローチャートに示されている通り、ライゲーションまたは多量体化ステップを通じて起こり得る。個々のオリゴヌクレオチド５０１をアニーリングして１２アミノ酸モチーフ（「１２−ｍｅｒ」）などの配列モチーフ５０２にし、それを、多量体化することができるライブラリー由来の追加的な配列モチーフとライゲーションして、所望の長さのＸＴＥＮ５０４を包含するプールを創出するとともに、より低濃度の、ＢｂｓＩ制限部位、およびＫｐｎＩ制限部位を含有するオリゴ５０３にライゲーションする。モチーフライブラリーは、特異的な配列ＸＴＥＮファミリー、例えば、表３のＡＤ配列、ＡＥ配列、ＡＦ配列、ＡＧ配列、ＡＭ配列、またはＡＱ配列に限定することができる。図５において例示されているように、ＸＴＥＮポリヌクレオチドはこの場合は３６アミノ酸残基の長さをコードするが、それよりも長い長さを、このプロセスによって実現することができる。例えば、多量体化は、ライゲーション、オーバーラップ伸長、ＰＣＲ組立てまたは当技術分野で公知の同様のクローニング技法によって実施することができる。生じたライゲーション産物のプールをゲル精製し、ＸＴＥＮの所望の長さのバンドをカットし、ストッパー配列５０５を有する単離されたＸＴＥＮ遺伝子をもたらす。ＸＴＥＮ遺伝子をスタッファーベクターにクローニングすることができる。この場合、ベクターは、任意選択のＣＢＤ配列５０６およびＧＦＰ遺伝子５０８をコードする。次いで、ＢｂｓＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いた消化を行って、５０７および５０８を除去し、終止コドンを置く。次いで、生じた産物を、ＢｓａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化した、ＧＬＰ−２をコードする遺伝子を含有するベクターにクローニングし、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質をコードする遺伝子５００をもたらす。当業者には明らかになる通り、該方法は、代替の配置にあり、ＸＴＥＮの長さが変動する構築物の創出に適用することができる。 ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質をコードする構築物は、構成成分であるＸＴＥＮ、ＧＬＰ−２、およびスペーサー配列の種々の配置、例えば、図８に示されているものなどで設計することができる。一実施形態では、構築物は、以下の順序（５’から３’）、ＧＬＰ−２およびＸＴＥＮの構成成分の単量体ポリペプチドと相補的なポリヌクレオチド配列、またそれをコードするポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、構築物は、構成成分がＸＴＥＮおよびＧＬＰ−２の順序（５’から３’）にある単量体ポリペプチドと相補的なポリヌクレオチド配列、またそれをコードするポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、構築物は、構成成分がＸＴＥＮ、ＧＬＰ−２、および第２のＸＴＥＮの順序（５’から３’）にある単量体ポリペプチドと相補的なポリヌクレオチド配列、またそれをコードするポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、構築物は、構成成分がＧＬＰ−２、スペーサー配列、およびＸＴＥＮの順序（５’から３’）にある単量体ポリペプチドと相補的なポリヌクレオチド配列、またそれをコードするポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、構築物は、構成成分がＸＴＥＮ、スペーサー配列、およびＧＬＰ−２の順序（５’から３’）にある単量体ポリペプチドと相補的なポリヌクレオチド配列、またそれをコードするポリヌクレオチド配列を含む。スペーサーポリヌクレオチドは、切断配列をコードする配列を場合によって含んでよい。当業者には明らかになる通り、前述の他の順列または多量体が可能である。 本発明は、（ａ）表７のポリヌクレオチド配列、または（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドと相補的な配列と比較して配列同一性の百分率が高い、ＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチド変異体を含むポリヌクレオチドも包含する。配列同一性の百分率が高いポリヌクレオチドとは、前述の（ａ）または（ｂ）と比較して少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８１％、あるいは、少なくとも約８２％、あるいは、少なくとも約８３％、あるいは、少なくとも約８４％、あるいは、少なくとも約８５％、あるいは、少なくとも約８６％、あるいは、少なくとも約８７％、あるいは、少なくとも約８８％、あるいは、少なくとも約８９％、あるいは、少なくとも約９０％、あるいは、少なくとも約９１％、あるいは、少なくとも約９２％、あるいは、少なくとも約９３％、あるいは、少なくとも約９４％、あるいは、少なくとも約９５％、あるいは、少なくとも約９６％、あるいは、少なくとも約９７％、あるいは、少なくとも約９８％、あるいは、少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有するポリヌクレオチド、または標的ポリヌクレオチドまたはその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドである。 ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の相同性、配列類似性または配列同一性は、ＢｅｓｔＦｉｔまたはＧａｐペアワイズ比較プログラム（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．５３７１１）などの公知のソフトウェアまたはコンピュータプログラムを使用することによって慣習的に決定することもできる。ＢｅｓｔＦｉｔでは、２つの配列間の同一性または類似性の最良のセグメントを見つけるためにＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（ｌｏｃａｌ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ． １９８１年、２巻：４８２〜４８９頁）が使用される。Ｇａｐでは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの方法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． １９７０年、４８巻：４４３〜４５３頁）を用いて、１つの配列の全てと別の同様の配列の全てのグローバルアラインメントが実施される。配列相同性、類似性または同一性の程度を決定するためにＢｅｓｔＦｉｔなどの配列アラインメントプログラムを使用する場合、初期設定を用いることもでき、適切なスコアリング行列を選択して、同一性、類似性または相同性スコアを最適化することもできる。 「相補的な」核酸配列とは、標準のワトソン−クリックの相補性規則に従って塩基対合することができる核酸配列である。本明細書で使用される場合、「相補配列」という用語は、上記と同じヌクレオチド比較によって評価することができる、または、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ配列をコードするポリヌクレオチドと、本明細書に記載のものなどのストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができると定義される、実質的に相補的な核酸配列を意味する。 次いで、生じたＧＬＰ２−ＸＴＥＮキメラ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを個々に発現ベクターにクローニングすることができる。核酸配列を種々の手順によってベクターに挿入する。一般に、ＤＮＡは、当技術分野で公知の技法を使用して適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（複数可）に挿入する。一般に、ベクター構成成分としては、これだけに限定されないが、シグナル配列、複製開始点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列のうちの１つまたは複数（図９）が挙げられる。これらの構成成分のうちの１つまたは複数を含有する適切なベクターの構築には、当業者に公知の標準のライゲーション技法を用いる。そのような技法は、当技術分野で周知であり、科学文献および特許文献において十分に説明されている。 種々のベクターは公的に入手可能である。ベクターは、例えば、組換えＤＮＡ手順に都合よく供することができるプラスミド、コスミド、ウイルス粒子、またはファージの形態であってよく、ベクターの選択は、多くの場合、それを導入する宿主細胞に左右される。したがって、ベクターは、複製が染色体複製とは独立している自己複製性ベクター、すなわち、染色体外実体として存在するベクター、例えば、プラスミドであってよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入すると、宿主細胞のゲノム内に組み込まれ、それが組み込まれた染色体（複数可）と一緒に複製されるものであってよい。 本発明は、宿主細胞と適合し、それによって認識され、また、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質の発現を制御するためにＧＬＰ２−ＸＴＥＮ遺伝子に作動可能に連結した複製配列および制御配列を含有するプラスミドベクターの使用を提供する。ベクターは通常、複製部位、ならびに形質転換された細胞において表現型の選択をもたらすことができるタンパク質をコードする配列を有する。そのようなベクター配列は、種々の細菌、酵母、およびウイルスに関して周知である。使用することができる有用な発現ベクターとしては、例えば、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列および合成ＤＮＡ配列のセグメントが挙げられる。「発現ベクター」とは、適切な宿主における融合タンパク質をコードするＤＮＡの発現に影響を及ぼすことができる適切な制御配列に作動可能に連結したＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ構築物を指す。ベクターは選択された宿主細胞において複製可能であり、生存可能であることが必要である。低コピー数ベクターまたは高コピー数ベクターを所望の通りに使用することができる。 適切なベクターとしては、これだけに限定されないが、ＳＶ４０およびｐｃＤＮＡの誘導体および公知の細菌性プラスミド、例えば、ｃｏｌ ＥＩ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、Ｓｍｉｔｈら、Ｇｅｎｅ ５７巻：３１〜４０頁（１９８８年）に記載されているｐＧＥＸ、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体など、ＲＰ４などのプラスミド、ＮＭ９８９などのファージＩの多数の誘導体などのファージＤＮＡ、ならびにＭ１３および繊維状一本鎖ファージＤＮＡなどの他のファージＤＮＡ；酵母プラスミド、例えば、２ミクロンプラスミドまたは２ｍプラスミドの誘導体、ならびにセントロメアおよび組み込み酵母シャトルベクターなど；昆虫または哺乳動物の細胞において有用なベクターなどの真核細胞において有用なベクター；プラスミドＤＮＡとファージＤＮＡの組合せから得られるベクター、例えば、ファージＤＮＡまたは発現制御配列を使用するように改変されたプラスミドなどが挙げられる。同様に本発明において用いることができる酵母発現系としては、これだけに限定されないが、非融合ｐＹＥＳ２ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、融合ｐＹＥＳＨｉｓＡ、ｐＹＥＳＨｉｓＢ、ｐＹＥＳＨｉｓＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＳベクターが挙げられる。 ベクターの制御配列としては、転写に影響を及ぼすためのプロモーター、そのような転写を制御するための任意選択のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が挙げられる。プロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であってよく、宿主細胞に対して相同または異種性のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子から得ることができる。 哺乳動物の細胞においてＧＬＰ２−ＸＴＥＮをコードするＤＮＡの転写を導くための適切なプロモーターの例は、ＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １巻（１９８１年）、８５４〜８６４頁）、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２巻（１９８３年）、８０９〜８１４頁）、ＣＭＶプロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１巻：５２１〜５３０頁、１９８５年）またはアデノウイルス２型主要後期プロモーター（ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｉ、２巻：１３０４〜１３１９頁、１９８２年）である。ベクターは、ＵＣＯＥ（遍在性クロマチンオープニングエレメント（ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｏｐｅｎｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ））などの配列も有してよい。 糸状菌宿主細胞において使用するための適切なプロモーターの例は、例えば、ＡＤＨ３プロモーターまたはｔｐｉＡプロモーターである。他の有用なプロモーターの例は、Ａ．ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉのアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒの中性α−アミラーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒの酸安定性α−アミラーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒまたはＡ．ａｗａｍｏｒｉのグルコアミラーゼ（ｇｌｕＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉのリパーゼ、Ａ．ｏｒｙｚａｅのアルカリ性プロテアーゼ、Ａ．ｏｒｙｚａｅのトリオースリン酸イソメラーゼまたはＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓのアセトアミダーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーターである。ＴＡＫＡ−アミラーゼおよびｇｌｕＡプロモーターが好ましい。同様に本発明において用いることができる酵母発現系としては、これだけに限定されないが、非融合ｐＹＥＳ２ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、融合ｐＹＥＳＨｉｓＡ、ｐＹＥＳＨｉｓＢ、ｐＹＥＳＨｉｓＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＳベクターなどが挙げられる。 原核生物宿主を用いて、発現ベクターにおいて使用するために適したプロモーターとしては、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系［Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、２７５巻：６１５頁（１９７８年）；Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ、２８１巻：５４４頁（１９７９年）］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系［Ｇｏｅｄｄｅｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、８巻：４０５７頁（１９８０年）；ＥＰ３６，７７６］、およびｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーター［ｄｅＢｏｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａ ｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８０巻：２１〜２５頁（１９８３年）］が挙げられ、これらは全て、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結している。細菌系において使用するためのプロモーターは、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結したシャイン−ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列も含有してよい。 本発明は、例えば、バキュロウイルスの発現系を含めた他の発現系を、例えば、これだけに限定されないが、ｐＶＬ９４１（Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８４巻：３９０〜４０２頁（１９７８年））、ｐＶＬ１３９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＶＬ１３９２（Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８４巻：３９０〜４０２頁（１９７８年）およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの非融合移入ベクターと、例えば、これだけに限定されないが、ｐＡｃ７００（Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８４巻：３９０〜４０２頁（１９７８年））、ｐＡｃ７０１およびｐＡｃ７０−２（ｐＡｃ７００と同じ、読み枠が異なる）、ｐＡｃ３６０ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの融合移入ベクターの両方を用いて使用することを意図しており、また、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＡ、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＢ、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することができる。 ＧＬＰ２−ＸＴＥＮをコードするＤＮＡ配列は、必要であれば、適切なターミネーター、例えば、ｈＧＨターミネーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２巻、１９８３年、８０９〜８１４頁）またはＴＰＩ１ターミネーター（ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎ． １巻、１９８２年、４１９〜４３４頁）またはＡＤＨ３（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ． ４巻、１９８５年、２０９３〜２０９９頁）などに作動可能に接続されていてもよい。発現ベクターは、アデノウイルスから得たスプライス部位を含めた、プロモーターの下流かつＧＬＰ２−ＸＴＥＮ配列自体の挿入部位の上流に位置するＲＮＡスプライス部位のセットも含有してよい。挿入部位の下流に位置するポリアデニル化シグナルも発現ベクターに含有される。特に好ましいポリアデニル化シグナルとしては、ＳＶ４０に由来する初期ポリアデニル化シグナルまたは後期ポリアデニル化シグナル（ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ、ｉｂｉｄ．）、アデノウイルス５Ｅｌｂ領域由来のポリアデニル化シグナル、ｈＧＨターミネーター（ＤｅＮｏｔｏら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ９巻：３７１９〜３７３０頁、１９８１年）が挙げられる。発現ベクターは、プロモーターとＲＮＡスプライス部位の間に位置するアデノウイルス２型３連リーダーなどの非コードウイルス性リーダー配列、ならびに、ＳＶ４０エンハンサーなどのエンハンサー配列も含んでよい。 一実施形態では、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質組成物をコードするポリヌクレオチドは、発現宿主系に適したＮ末端シグナル配列のＣ末端側に融合している。シグナル配列は、一般には、転座および分泌プロセスの間にタンパク質からタンパク質分解により除去され、定義済みのＮ末端が生成する。細菌系、酵母系、昆虫系、および哺乳動物系を含めた大部分の発現系に対して多種多様なシグナル配列が記載されている。各発現系についての好ましい例の非限定的な一覧はこの後に続く。Ｅ．ｃｏｌｉでの発現のために好ましいシグナル配列は、ＯｍｐＡ、ＰｈｏＡ、およびＤｓｂＡである。酵母での発現に好ましいシグナルペプチドは、ｐｐＬ−アルファ、ＤＥＸ４、インベルターゼシグナルペプチド、酸性ホスファターゼ シグナルペプチド、ＣＰＹ、またはＩＮＵ１である。昆虫細胞での発現のために好ましいシグナル配列は、タバコスズメガの脂質動員ホルモン前駆体、ＣＰ１、ＣＰ２、ＣＰ３、ＣＰ４、ＴＰＡ、ＰＡＰ、またはｇｐ６７である。哺乳動物での発現のために好ましいシグナル配列は、ＩＬ２Ｌ、ＳＶ４０、ＩｇＧカッパおよびＩｇＧラムダである。 別の実施形態では、十分に発現される独立したタンパク質ドメインを潜在的に含むリーダー配列を、プロテアーゼ切断部位によって隔てられたＧＬＰ２−ＸＴＥＮ配列のＮ末端と融合することができる。設計されたタンパク質分解部位における切断を阻害しない任意のリーダーペプチド配列を使用することができ、好ましい実施形態では、配列は、安定な、十分に発現された配列を含み、したがって組成物全体の発現および折り畳みが著しく悪影響を受けず、また、発現、溶解度、および／または折り畳み効率が有意に改善されることが好ましい。多種多様な適切なリーダー配列が文献に記載されている。適切な配列の非限定的な一覧は、マルトース結合性タンパク質、セルロース結合ドメイン、グルタチオンＳ転移酵素、６×Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、赤血球凝集素（ｈｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、および緑色蛍光タンパク質を含む。リーダー配列は、特にＡＴＧ開始コドンに続く第２のコドンの位置における、文献および上で十分に説明されている方法によるコドン最適化によってさらに改善することができる。 ＧＬＰ２−ＸＴＥＮをコードするＤＮＡ配列、プロモーターおよび場合によってターミネーターおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれライゲーションするため、およびそれらを、複製に必要な情報を含有する適切なベクターに挿入するために使用される手順は当業者に周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．ら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｍｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１年を参照されたい）。 他の実施形態では、本発明は、翻訳の開始を促進して、ヘルパードメインの存在を伴わずにタンパク質のＮ末端におけるＸＴＥＮ融合物の発現を可能にするためにＸＴＥＮ担体コード配列のＮ末端に含めることができる、ＸＴＥＮ特性を有する少なくとも約２０〜約６０アミノ酸をコードする発現させるために最適化されたポリヌクレオチド配列を含む（言い換えれば、２０〜６０個のコードされる最適化されたアミノ酸をコードするポリヌクレオチドがＧＬＰ−２のＮ末端側にあるＸＴＥＮ構成成分をコードするポリヌクレオチドとインフレームで連結している）構築物および構築物を作出する方法を提供する。前述の利点では、配列は、その後の切断を必要とせず、それにより、ＸＴＥＮを含有する組成物を製造するためのステップの数が減少する。実施例においてより詳細に記載されている通り、最適化されたＮ末端配列は非構造化タンパク質の属性を有するが、翻訳の開始を促進する能力および発現の増強について選択されるアミノ酸をコードするヌクレオチド塩基を含んでよい。前述の一実施形態では、最適化されたポリヌクレオチドは、ＡＥ９１２と比較して少なくとも約９０％の配列同一性を有するＸＴＥＮ配列をコードする。前述の別の実施形態では、最適化されたポリヌクレオチドは、ＡＭ９２３と比較して少なくとも約９０％の配列同一性を有するＸＴＥＮ配列をコードする。前述の別の実施形態では、最適化されたポリヌクレオチドは、ＡＥ４８と比較して少なくとも約９０％の配列同一性を有するＸＴＥＮ配列をコードする。前述の別の実施形態では、最適化されたポリヌクレオチドは、ＡＭ４８と比較して少なくとも約９０％の配列同一性を有するＸＴＥＮ配列をコードする。一実施形態では、最適化されたポリヌクレオチドＮＴＳは、から選択される配列またはその相補配列と比較して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、配列同一性を示す配列を含む。 このように、単量体ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を生成する。場合によって、このキメラＤＮＡ分子を、より適切な発現ベクターである別の構築物に移行またはクローニングすることができる。この時点で、キメラＤＮＡ分子を発現することができる宿主細胞を、キメラＤＮＡ分子で形質転換することができる。対象のＤＮＡセグメントを含有するベクターを、細胞宿主の種類に応じて、周知の方法によって宿主細胞に移行することができる。例えば、原核細胞に対しては塩化カルシウムトランスフェクションが一般に利用され、一方、他の細胞宿主に対しては、リン酸カルシウム処理、リポフェクション、または電気穿孔を用いることができる。哺乳動物の細胞を形質転換するために用いられる他の方法としては、ポリブレン、プロトプラスト融合、リポソーム、電気穿孔、およびマイクロインジェクションの使用が挙げられる。一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記を参照されたい。 発現ベクターなどの担体を利用して、または利用せずに、形質転換を起こすことができる。次いで、形質転換された宿主細胞を、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮをコードするキメラＤＮＡ分子を発現させるために適した条件下で培養する。 本発明は、本明細書に開示されている単量体融合タンパク質組成物を発現させるための宿主細胞も提供する。本発明において使用するための哺乳動物の細胞系の例は、ＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）、ＢＨＫ−２１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０））およびＢＨＫ−２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３；Ｇｒａｈａｍら、Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ３６巻：５９〜７２頁、１９７７年）、ＢＨＫ−５７０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１０３１４）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、ＣＨＯ−Ｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ１１６１９−０１２）、および２９３−Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｒ７９０−７）である。ｔｋ−ｔｓ１３ＢＨＫ細胞株もＡＴＣＣから受託番号ＣＲＬ１６３２の下で入手可能である。さらに、Ｒａｔ ＨｅｐＩ細胞（ラット肝細胞癌；ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６００）、Ｒａｔ ＨｅｐＩＩ細胞（ラット肝細胞癌；ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５４８）、ＴＣＭＫ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１３９）、ヒト肺細胞（ＡＴＣＣＨＢ ８０６５）、ＮＣＴＣ１４６９細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ９．１）、ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）およびＤＵＫＸ細胞（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７巻：４２１６〜４２２０頁、１９８０年）を含めたいくつもの他の細胞株を本発明の範囲内で使用することができる。 適切な酵母宿主細胞の例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓの種またはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓの種、具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ株の細胞が挙げられる。他の酵母としては、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ、Ｎａｔｕｒｅ、２９０巻：１４０頁［１９８１年］；１９８５年５月２日公開のＥＰ１３９，３８３）；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主（米国特許第４，９４３，５２９号；Ｆｌｅｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９巻：９６８〜９７５頁（１９９１年））例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ（ＭＷ９８−８Ｃ、ＣＢＳ６８３、ＣＢＳ４５７４；Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、７３７巻［１９８３年］）、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ３６，９０６；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８巻：１３５頁（１９９０年））、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、およびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ４０２，２２６）など；Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ１８３，０７０；Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａら、Ｊ． Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２８巻：２６５〜２７８頁［１９８８年］）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ（Ｃａｓｅら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、７６巻：５２５９〜５２６３頁［１９７９年］）；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、例えば、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓなど（１９９０年１０月３１日公開のＥＰ３９４，５３８）が挙げられる。本発明ではメチロトローフ（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｉｃ）酵母が適しており、それらとしては、これだけに限定されないが、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、およびＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａからなる属から選択される、メタノール上で成長することができる酵母が挙げられる。適切な酵母細胞のさらなる例は、ＨａｎｓｅｎｕｌａなどのＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓの株、例えば、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、またはＰｉｃｈｉａの株、例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｇｌｅｅｓｏｎら、Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １３２巻、１９８６年、３４５９〜３４６５頁；米国特許第４，８８２，２７９号を参照されたい）である。このクラスの酵母の例である特定の種の一覧は、Ｃ． Ａｎｔｈｏｎｙ， Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ、２６９巻（１９８２年）において見いだすことができる。酵母細胞を異種ＤＮＡで形質転換し、それに異種ポリペプチドを産生させるための方法は、例えば、その全体がこれによって参照により組み込まれる、米国特許第４，５９９，３１１号、米国特許第４，９３１ ，３７３、米国特許第４，８７０，００８号、同第５，０３７，７４３号、および米国特許第４，８４５，０７５号、に記載されている。 他の真菌細胞の例は、糸状菌の細胞、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの種、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａの種、Ｆｕｓａｒｉｕｍの種またはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａの種、具体的には、Ａ．ｏｒｙｚａｅ株、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ株またはＡ．ｎｉｇｅｒ株である。タンパク質を発現させるためのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの種の使用は、例えば、ＥＰ２７２ ２７７、ＥＰ２３８ ０２３、ＥＰ１８４ ４３８に記載されている。Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍの形質転換は、例えば、Ｍａｌａｒｄｉｅｒら、１９８９年、Ｇｅｎｅ ７８巻：１４７〜１５６頁に記載されている通りに行うことができる。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａの種の形質転換は、例えば、ＥＰ２４４ ２３４に記載の通りに実施することができる。 本発明において使用することができる他の適切な細胞としては、これだけに限定されないが、原核宿主細胞株、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（例えば、ＤＨ５−α株）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の株などが挙げられる。適切な原核生物の非限定的な例としては、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ属；Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ属；Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ属；Ｂｏｒｒｅｌｉａ属；Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ属；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属；Ｌｉｓｔｅｒｉａ属；Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属；Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属；Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ属；およびＶｉｂｒｉｏ属が挙げられる。 形質転換された細胞を、選択マーカー、一般には薬物抵抗性または特定の栄養分、例えば、ロイシンの不在下で成長する能力によって決定される表現型によって選択する。酵母において使用するための好ましいベクターは、米国特許第４，９３１，３７３号に開示されているＰＯＴ１ベクターである。ＧＬＰ２−ＸＴＥＮをコードするＤＮＡ配列の前には、例えば、上記の通り、シグナル配列、および場合によってリーダー配列があってよい。哺乳動物の細胞をトランスフェクトし、その細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法は、例えば、ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５９巻（１９８２年）、６０１〜６２１頁；ＳｏｕｔｈｅｒｎおよびＢｅｒｇ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． １巻（１９８２年）、３２７〜３４１頁；Ｌｏｙｔｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９巻（１９８２年）、４２２〜４２６頁；Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １４巻（１９７８年）、７２５頁；ＣｏｒｓａｒｏおよびＰｅａｒｓｏｎ、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７巻（１９８１年）、６０３頁、Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２巻（１９７３年）、４５６頁；およびＮｅｕｍａｎｎら、ＥＡ１ＢＯＪ． １巻（１９８２年）、８４１〜８４５頁に記載されている。 クローニングされたＤＮＡ配列を、例えば、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクションによって（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １４巻：７２５〜７３２頁、１９７８年；ＣｏｒｓａｒｏおよびＰｅａｒｓｏｎ、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７巻：６０３〜６１６頁、１９８１年；ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２ｄ巻：４５６〜４６７頁、１９７３年）、多くの市販の試薬、例えば、ＦｕＧＥＮＥＧ Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）またはリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などを用いたトランスフェクションによって、または電気穿孔によって（Ｎｅｕｍａｎｎら、ＥＭＢＯ Ｊ． １巻：８４１〜８４５頁、１９８２年）、培養した哺乳動物の細胞に導入する。外因性ＤＮＡを発現する細胞を同定し、選択するために、一般に、選択可能な表現型（選択マーカー）を付与する遺伝子を、対象の遺伝子またはｃＤＮＡと一緒に細胞に導入する。好ましい選択マーカーとしては、薬物、例えば、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ゼオシン、およびメトトレキセートに対する抵抗性を付与する遺伝子などが挙げられる。選択マーカーは、増幅可能な選択マーカーであってよい。好ましい増幅可能な選択マーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）配列である。選択マーカーのさらなる例は、当業者には周知であり、それらとして、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ベータガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などのレポーターが挙げられる。選択マーカーは、Ｔｈｉｌｌｙ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｓｔｏｎｅｈａｍ， Ｍａｓｓ．、参照により本明細書に組み込まれる）によって概説されている。当業者は、適切な選択マーカーを容易に選択することができる。遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現させることができる限りは、任意の公知の選択マーカーを用いることができる。 選択マーカーは、別々のプラスミド上の細胞に対象の遺伝子と同時に導入することもでき、同じプラスミド上に導入することもできる。同じプラスミド上では、選択マーカーと対象の遺伝子は、異なるプロモーターの制御下にあってもよく、同じプロモーターの制御下にあってもよく、後者の並びでは、ジシストロン性メッセージ（ｄｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｍｅｓｓａｇｅ）が生じる。この種類の構築物は当技術分野で公知である（例えば、ＬｅｖｉｎｓｏｎおよびＳｉｍｏｎｓｅｎ、米国特許第４，７１３，３３９号）。「担体ＤＮＡ」として公知の追加的なＤＮＡを細胞に導入する混合物に追加することも有利である場合がある。 細胞がＤＮＡを取り込んだ後、細胞を適切な成長培地で、一般には１〜２日成長させて、対象の遺伝子の発現を開始させる。本明細書で使用される場合、「適切な成長培地」という用語は、細胞を成長させ、対象のＧＬＰ２−ＸＴＥＮを発現させるために必要な栄養分および他の構成成分を含有する培地を意味する。培地は、一般に、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、必須糖、ビタミン、塩、リン脂質、タンパク質および増殖因子を含む。ガンマ−カルボキシル化タンパク質を作製するためには、培地は、ビタミンＫを、好ましくは約０．１μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌの濃度で含有する。次いで、薬物選択を適用して、選択マーカーを安定に発現している細胞の成長について選択する。増幅可能な選択マーカーをトランスフェクトした細胞については、薬物濃度を上昇させて、クローニングされた配列のコピー数の増大について選択し、それにより、発現レベルを上昇させることができる。次いで、安定にトランスフェクトされた細胞のクローンを、対象のＧＬＰ−２ポリペプチド変異体の発現についてスクリーニングする。 次いで、形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質の発現を可能にする適切な栄養培地条件下で培養し、その後、生じたペプチドを培養物から回収することができる。細胞を培養するために使用する培地は、適切な補助物質を含有する最小培地または複合培地などの、宿主細胞を成長させるために適した任意の従来の培地であってよい。適切な培地は、商業的な供給者から入手することも可能であり、公開されたレシピ（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログにおいて）に従って調製することもできる。培養条件、例えば、温度、ｐＨなどは、以前から発現のために選択されている宿主細胞に対して用いられているものであり、当業者には明らかになろう。 遺伝子発現は、例えば、ｍＲＮＡの転写を定量化するための従来のノーザンブロット法［Ｔｈｏｍａｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、７７巻：５２０１〜５２０５頁（１９８０年）］、ドットブロッティング（ＤＮＡ解析）、またはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、本明細書において提供される配列に基づいて適切に標識したプローブを使用して、試料中で直接測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖またはＤＮＡ−タンパク質二重鎖を含めた、特異的な二重鎖を認識することができる抗体を使用することができる。今度はその抗体を標識することができ、二重鎖を表面に結合させ、したがって、表面上で二重鎖が形成されると、二重鎖に結合した抗体の存在を検出することができるアッセイを行うことができる。 あるいは、遺伝子発現は、遺伝子産物の発現を直接定量化するための細胞または組織切片の免疫組織化学的染色および細胞培養物または体液のアッセイまたは選択マーカーの検出などの蛍光免疫学的方法によって測定することができる。試料流体の免疫組織化学的染色および／またはアッセイのために有用な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであってよく、任意の哺乳動物において調製することができる。ネイティブな配列ＧＬＰ−２ポリペプチドに対する、または本明細書において提供されるＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対する、またはＧＬＰ−２と融合しており、特異的な抗体エピトープをコードする外因性の配列に対する抗体を調製することができることが都合よい。選択マーカーの例は、当業者に周知であり、それらとして、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ベータガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などのレポーターが挙げられる。 発現されたＧＬＰ２−ＸＴＥＮポリペプチド産物（複数可）は、当技術分野で公知の方法によって、または本明細書に開示されている方法によって精製することができる。ゲル濾過、アフィニティー精製（例えば、抗ＧＬＰ−２抗体カラムを使用する）、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびゲル電気泳動などの手順を用いることができ、それぞれ、それぞれの宿主細胞によって産生される融合タンパク質を回収し、精製するために調整する。高速液体クロマトグラフィーなどの従来の化学的精製手段によって追加的な精製を実現することができる。いくつかの発現されたＧＬＰ２−ＸＴＥＮは、単離および精製の間にリフォールディングを必要とする場合がある。精製の方法は、Ｒｏｂｅｒｔ Ｋ． Ｓｃｏｐｅｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒ． Ｃａｓｔｏｒ（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ １９９４年、およびＳａｍｂｒｏｏｋら、上記に記載されている。多ステップ精製分離はＢａｒｏｎら、Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １０巻：１７９〜９０頁（１９９０年）およびＢｅｌｏｗら、Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ａ． ６７９巻：６７〜８３頁（１９９４年）にも記載されている。治療目的では、本発明のＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質は実質的に純粋であることが好ましい。したがって、本発明の好ましい実施形態では、本発明のＧＬＰ２−ＸＴＥＮを少なくとも約９０〜９５％の均一性、好ましくは少なくとも約９８％の均一性にまで精製する。純度は、例えば、ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、およびアミノ末端アミノ酸配列決定によって評価することができる。 ＶＩＩＩ）．医薬組成物 本発明は、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮを含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、医薬組成物は、本明細書に開示されているＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質および少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む。本発明のＧＬＰ２−ＸＴＥＮポリペプチドは、薬学的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従って製剤化することができ、それにより、ポリペプチドを、薬学的に許容される担体ビヒクル、例えば、水溶液、緩衝液、溶媒など、および／または薬学的に許容される懸濁剤、乳剤、安定剤または賦形剤と組み合わせて混和物にする。非水系溶媒の例としては、プロピルエチレングリコール、ポリエチレングリコールおよび植物油が挙げられる。医薬組成物の製剤は、貯蔵するために、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 第１６版、Ｏｓｏｌ， Ａ．編（１９８０年）に記載の通り、所望の程度の純度を有する活性なＧＬＰ２−ＸＴＥＮ成分と任意選択の生理的に許容される担体、賦形剤（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム塩、スクロース、またはポリソルベート）または安定剤（例えば、スクロース、トレハロース、ラフィノース、アルギニン、カルシウム塩、グリシンまたはヒスチジン）と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製する。 一実施形態では、医薬組成物は、投与する前に再構成するための凍結乾燥粉末として供給することができる。別の実施形態では、医薬組成物は、患者に直接投与することができる液体の形態で供給することができる。別の実施形態では、組成物は、組成物を投与するための充填済みシリンジに入った液体として供給される。別の実施形態では、組成物は、ポンプに組み入れることができる充填済みバイアルに入った液体として供給される。 医薬組成物は、皮下、注入ポンプによる皮下、筋肉内、静脈内、または肺経路を介するものを含めた、任意の適切な手段または経路によって投与することができる。好ましい経路は、疾患およびレシピエントの年齢、ならびに治療されている状態の重症度により変動することが理解されよう。 一実施形態では、液体の形態または再構成後（凍結乾燥した粉末として供給された場合）のＧＬＰ２−ＸＴＥＮ医薬組成物は、ＸＴＥＮと連結したＧＬＰ−２を含み、組成物により、ＧＬＰ−２関連活性を、ＧＬＰ−２医薬組成物を必要とする被験体に投与した後、少なくとも約７２時間、または少なくとも約９６時間、または少なくとも約１２０時間、または少なくとも約７日、または少なくとも約１０日、または少なくとも約１４日、または少なくとも約２１日にわたって、正常な血液中のＧＬＰ−２血漿レベルの少なくとも１０％まで上昇させることができる。別の実施形態では、被験体に投与した、液体の形態または再構成後（凍結乾燥した粉末として供給された場合）のＧＬＰ２−ＸＴＥＮ医薬組成物により、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ濃度を、ＧＬＰ−２医薬組成物を必要とする被験体に投与した後、少なくとも約２４時間、または少なくとも約４８時間、または少なくとも約７２時間、または少なくとも約９６時間、または少なくとも約１２０時間、または少なくとも約１４４時間にわたって、少なくとも５００ｎｇ／ｍｌ、または少なくとも１０００ｎｇ／ｍｌ、または少なくとも約２０００ｎｇ／ｍｌ、または少なくとも約３０００ｎｇ／ｍｌ、または少なくとも約４０００ｎｇ／ｍｌ、または少なくとも約５０００ｎｇ／ｍｌ、または少なくとも約１００００ｎｇ／ｍｌ、または少なくとも約１５０００ｎｇ／ｍｌ、または少なくとも約２００００ｎｇ／ｍｌ、または少なくとも約３００００ｎｇ／ｍｌ、または少なくとも約４００００ｎｇ／ｍｌに上昇させることができる。本段落の前述の実施形態の医薬組成物は、静脈内経路または皮下経路または筋肉内経路による投与と適合することが当技術分野で公知の１つまたは複数の賦形剤、緩衝液または他の成分を含むように製剤化することができることが明確に意図されている。したがって、本段落の上文に記載されている実施形態では、医薬組成物を皮下、筋肉内、または静脈内に投与する。 本発明の組成物は、種々の賦形剤を使用して製剤化することができる。適切な賦形剤としては、微結晶セルロース（例えば、Ａｖｉｃｅｌ、ＰＨ１０２、Ａｖｉｃｅｌ、ＰＨ１０１）、ポリメタクリレート、ポリ（アクリル酸エチル、メタクリル酸メチル、トリメチルアンモニオエチルメタクリレートクロライド（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ））（例えば、Ｅｕｄｒａｇｉｔ ＲＳ−３０Ｄなど）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（Ｍｅｔｈｏｃｅｌ Ｋ１００Ｍ、Ｐｒｅｍｉｕｍ ＣＲ Ｍｅｔｈｏｃｅｌ Ｋ１００Ｍ、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ ＥＳ、Ｏｐａｄｒｙ（登録商標））、ステアリン酸マグネシウム、タルク、クエン酸トリエチル、エチルセルロース水分散液（Ｓｕｒｅｌｅａｓｅ（登録商標））、および硫酸プロタミンが挙げられる。緩慢放出作用剤は、担体も含んでよく、担体は、例えば、溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ ａｇｅｎｔ）および吸収遅延剤を含んでよい。これらの緩慢放出作用剤には、薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸、または硫酸塩などの無機塩類、ならびに、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、または安息香酸塩などの有機酸の塩も使用することができる。組成物は、水、生理食塩水、グリセロール、およびエタノールなどの液体、ならびに湿潤剤、乳化剤、またはｐＨ緩衝剤などの物質も含有してよい。リポソームも担体として使用することができる。 別の実施形態では、本発明の組成物を、有益な活性薬剤を長時間にわたって制御された様式で送達することにおける有用性が実証されているリポソームに封入する。リポソームは、水性容積が封入された閉じた二分子膜である。リポソームは、単一の膜二分子層またはそれぞれが水層を保有する単層小胞で次の膜二分子層と隔てられた多数の膜二分子層を有する多重膜小胞（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）であってもよい。生じる膜二分子層の構造は、脂質の疎水性（非極性）の尾部が二重層の中心に向き付けられ、親水性（極性）の頭部が水性相に向き付けられるようにする。一実施形態では、リポソームを、単核食細胞系の器官、主に肝臓および脾臓による取り込みを回避する柔軟な水溶性ポリマーでコーティングすることができる。リポソームを取り囲むための適切な親水性ポリマーとしては、限定することなく、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，３１６，０２４号；同第６，１２６，９６６号；同第６，０５６，９７３号；同第６，０４３，０９４号に記載されている、ＰＥＧ、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポオリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリアスパルトアミドおよび親水性のペプチド配列が挙げられる。 リポソームは、当技術分野で公知の任意の脂質または脂質の組み合わせで構成されていてよい。例えば、小胞形成性脂質は、米国特許第６，０５６，９７３号および同第５，８７４，１０４号に開示されているホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、およびスフィンゴミエリンなどのリン脂質を含めた、天然に存在する脂質であっても、合成脂質であってもよい。小胞形成性脂質は、同じく米国特許第６，０５６，９７３号に開示されている糖脂質、セレブロシド、またはカチオン性脂質、例えば、１，２−ジオレイロキシ−３−（トリメチルアミノ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）；Ｎ−［１−（２，３，−ジテトラデシロキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド（ＤＭＲＩＥ）；Ｎ−［１［（２，３，−ジオレイロキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド（ＤＯＲＩＥ）；Ｎ−［１−（２，３−ジオレイロキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）；３［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）；またはジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）などであってもよい。米国特許第５，９１６，５８８号および同第５，８７４，１０４号に開示されている通り、小胞に対する安定性与えるためにコレステロールも適切な範囲内で存在してよい。 追加的なリポソーム技術は、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，７５９，０５７号；同第６，４０６，７１３号；同第６，３５２，７１６号；同第６，３１６，０２４号；同第６，２９４、１９１号；同第６、１２６，９６６号；同第６，０５６，９７３号；同第６，０４３，０９４号；同第５，９６５，１５６号；同第５，９１６，５８８号；同第５，８７４，１０４号；同第５，２１５，６８０号；同第および４，６８４，４７９号に記載されている。これらには、リポソームおよび脂質でコーティングした微小気泡、ならびにそれらを製造するための方法が記載されている。したがって、当業者は、本発明の開示およびこれらの他の特許の開示の両方を考慮して、本発明のポリペプチドの放出を延長するためのリポソームを作製することができる。 液体製剤に関して、所望の特性は、製剤を、静脈内投与、筋肉内投与、関節内投与、または皮下投与するために２５ゲージ、２８ゲージ、３０ゲージ、３１ゲージ、３２ゲージの針を通過させることができる形態で供給することができることである。別の実施形態では、所望の特性は、製剤が、吸入療法のために、霧状にして適切な粒度のエアロゾルにすることができる形態で供給されることである。 錠剤、丸剤、カプセル剤または埋め込み型デバイスの形態の緩慢放出作用剤として浸透性ポンプを使用することができる。浸透性ポンプは、当技術分野で周知であり、当業者は、放出が延長された薬物送達のための浸透性ポンプを提供する経験のある会社から容易に入手可能である。例は、ＡＬＺＡのＤＵＲＯＳ（商標）；ＡＬＺＡのＯＲＯＳ（商標）；Ｏｓｍｏｔｉｃａ、ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌのＯｓｍｏｄｅｘ（商標）ｓｙｓｔｅｍ；Ｓｈｉｒｅ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＥｎＳｏＴｒｏｌ（商標）ｓｙｓｔｅｍ；およびＡｌｚｅｔ（商標）である。浸透性ポンプ技術が記載されている特許は、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，８９０，９１８号；同第６，８３８，０９３号；同第６，８１４，９７９号；同第６，７１３，０８６号；同第６，５３４，０９０号；同第６，５１４，５３２号；同第６，３６１，７９６号；同第６，３５２，７２１号；同第６，２９４，２０１号；同第６，２８４，２７６号；同第６，１１０，４９８号；同第５，５７３，７７６号；同第４，２００，０９８４号；および同第４，０８８，８６４号である。当業者は、本発明の開示およびこれらの他の特許の開示の両方を考慮して、本発明のポリペプチドの放出を延長するための浸透性ポンプを作製することができる。 シリンジポンプも緩慢放出作用剤として使用することができる。そのようなデバイスは、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，９７６，６９６号；同第４，９３３，１８５号；同第５，０１７，３７８号；同第６，３０９，３７０号；同第６，２５４，５７３号；同第４，４３５，１７３号；同第４，３９８，９０８号；同第６，５７２，５８５号；同第５，２９８，０２２号；同第５，１７６，５０２号；同第５，４９２，５３４号；同第５，３１８，５４０号；および同第４，９８８，３３７号に記載されている。当業者は、本発明の開示およびこれらの他の特許開示の両方を考慮して、本発明の組成物の放出を延長するためのシリンジポンプを作製することができる。 ＩＸ）．医薬キット 別の態様では、本発明は、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮポリペプチドの使用を容易にするためのキットを提供する。キットは、本明細書において提供される医薬組成物、医薬組成物を識別するラベル、ならびに医薬組成物の貯蔵、再構成および／または被験体への投与のための説明書を含む。いくつかの実施形態では、キットは、（ａ）それを必要とする被験体に投与すると胃腸の状態を処置するために十分な量のＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質組成物；（ｂ）ある量の薬学的に許容される担体；ならびに（ｃ）滅菌水、緩衝液、またはブドウ糖を用いて注射または再構成する準備ができた製剤を、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ薬物ならびに貯蔵および取扱い条件を識別するラベル、ならびに薬物について認可された適応症のシート、認可された適応症の予防および／または治療に使用するためにＧＬＰ２−ＸＴＥＮ薬物を再構成および／または投与するための説明書、適切な投与量および安全性情報、ならびにロットおよび薬物の有効期限を識別する情報と一緒に含むことが好ましい。前述の別の実施形態では、キットは、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物に適した希釈剤を有してよい第２の容器を含んでよく、それを使用することにより、使用者に、被験体に送達するための適切な濃度のＧＬＰ２−ＸＴＥＮがもたらされる。 （実施例１） ＸＴＥＮ＿ＡＤ３６モチーフセグメントの構築 以下の実施例には、３６アミノ酸のモチーフ配列をコードするコドン最適化した遺伝子の集合の構築が記載されている。第１のステップとして、スタッファーベクターｐＣＷ０３５９をｐＥＴベクターに基づいて構築し、これはＴ７プロモーターを含む。ｐＣＷ０３５９は、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）およびＴＥＶプロテアーゼ認識部位、それに続くＢｓａＩ部位、ＢｂｓＩ部位、およびＫｐｎＩ部位が隣接するスタッファー配列をコードする。消化後に適合するオーバーハングが生成されるようにＢｓａＩ部位およびＢｂｓＩ部位を挿入した。スタッファー配列の次には短縮型のＧＦＰ遺伝子およびＨｉｓタグがある。スタッファー配列は、終止コドンを含有し、したがって、スタッファープラスミドｐＣＷ０３５９を保有するＥ．ｃｏｌｉ細胞は非蛍光性コロニーを形成する。スタッファーベクターｐＣＷ０３５９を、ＢｓａＩおよびＫｐｎＩを用いて消化して、スタッファーセグメントを除去し、生じたベクター断片を、アガロースゲル精製によって単離した。この配列を、モチーフのＡＤファミリーを反映させてＸＴＥＮ＿ＡＤ３６と名付けた。そのセグメントはアミノ酸配列［Ｘ］３を有し、Ｘは、配列：ＧＥＳＰＧＧＳＳＧＳＥＳ、ＧＳＥＧＳＳＧＰＧＥＳＳ、ＧＳＳＥＳＧＳＳＥＧＧＰ、またはＧＳＧＧＥＰＳＥＳＧＳＳを有する１２ｍｅｒペプチドである。リン酸化合成オリゴヌクレオチド対の以下の対をアニーリングさせることによって挿入断片を得た： リン酸化オリゴヌクレオチド３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＦｏｒ：ＡＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣと非リン酸化オリゴヌクレオチドｐｒ＿３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＲｅｖ：ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡもアニーリングさせた。アニーリングしたオリゴヌクレオチド対をライゲーションし、それにより、１つのＢｂｓＩ／ＫｐｎＩセグメントとライゲーションした、さまざまな数の１２ｍｅｒの反復を示すさまざまな長さの産物の混合物がもたらされた。３６アミノ酸の長さに対応する産物を、調製用アガロースゲル電気泳動によって混合物から単離し、ＢｓａＩ／ＫｐｎＩで消化したスタッファーベクターｐＣＷ０３５９にライゲーションした。ＬＣＷ０４０１と称される生じたライブラリー内のクローンの大部分は誘導後に緑色の蛍光を示し、これは、ＸＴＥＮの配列＿ＡＤ３６がＧＦＰ遺伝子とインフレームにライゲーションされたこと、およびＸＴＥＮ＿ＡＤ３６の大部分の配列が良好な発現レベルを有することを示す。 ライブラリーＬＣＷ０４０１由来の９６単離体を、ＩＰＴＧを含有する寒天プレート上にスタンプすることによって、高レベルの蛍光についてスクリーニングした。同じ単離体をＰＣＲによって評価し、３６アミノ酸ならびに強力な蛍光を有するセグメントを含有する４８単離体を同定した。これらの単離体について配列決定し、正確なＸＴＥＮ＿ＡＤ３６セグメントを含有する３９クローンを同定した。これらのセグメントについてのヌクレオチド構築物およびアミノ酸構築物のファイル名が表８に列挙されている。 （実施例２） ＸＴＥＮ＿ＡＥ３６セグメントの構築 ３６アミノ酸長のＸＴＥＮ配列をコードするコドンライブラリーを構築した。ＸＴＥＮ配列をＸＴＥＮ＿ＡＥ３６と名付けた。そのセグメントはアミノ酸配列［Ｘ］３を有し、Ｘは、配列：ＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥ、ＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥ ＴＰ、ＧＴＳＥＳＡ ＴＰＥＳＧＰ、またはＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰを有する１２ｍｅｒペプチドである。リン酸化合成オリゴヌクレオチド対の以下の対をアニーリングさせることによって挿入断片を得た： リン酸化オリゴヌクレオチド３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＦｏｒ：ＡＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣと非リン酸化オリゴヌクレオチドｐｒ＿３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＲｅｖ：ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡもアニーリングさせた。アニーリングしたオリゴヌクレオチド対をライゲーションし、それにより、１つのＢｂｓＩ／ＫｐｎＩセグメントとライゲーションした、さまざまな数の１２ｍｅｒの反復を示すさまざまな長さの産物の混合物がもたらされた。３６アミノ酸の長さに対応する産物を、調製用アガロースゲル電気泳動によって混合物から単離し、ＢｓａＩ／ＫｐｎＩで消化したスタッファーベクターｐＣＷ０３５９にライゲーションした。ＬＣＷ０４０２と称される生じたライブラリー内のクローンの大部分は誘導後に緑色の蛍光を示し、これは、ＸＴＥＮ＿ＡＥ３６の配列がＧＦＰ遺伝子とインフレームにライゲーションされたこと、および大部分のＸＴＥＮ＿ＡＥ３６の配列が良好な発現を示すことを示す。 ライブラリーＬＣＷ０４０２由来の９６単離体を、ＩＰＴＧを含有する寒天プレート上にスタンプすることによって、高レベルの蛍光についてスクリーニングした。同じ単離体をＰＣＲによって評価し、３６アミノ酸ならびに強力な蛍光を有するセグメントを含有する４８単離体を同定した。これらの単離体について配列決定し、正確なＸＴＥＮ＿ＡＥ３６セグメントを含有する３７クローンを同定した。これらのセグメントについてのヌクレオチド構築物およびアミノ酸構築物のファイル名が表９に列挙されている。 （実施例３） ＸＴＥＮ＿ＡＦ３６セグメントの構築 ３６アミノ酸長のコドンライブラリーコード配列を構築した。この配列を、ＸＴＥＮ＿ＡＦ３６と名付けた。そのセグメントはアミノ酸配列［Ｘ］３を有し、Ｘは、配列：ＧＳＴＳＥＳＰＳＧＴＡＰ、ＧＴＳＴＰＥＳＧＳＡＳＰ、ＧＴＳＰＳＧＥＳＳＴＡＰ、またはＧＳＴＳＳＴＡＥＳＰＧＰを有する１２ｍｅｒペプチドである。リン酸化合成オリゴヌクレオチド対の以下の対をアニーリングさせることによって挿入断片を得た： リン酸化オリゴヌクレオチド３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＦｏｒ：ＡＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣと非リン酸化オリゴヌクレオチドｐｒ＿３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＲｅｖ：ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡもアニーリングさせた。アニーリングしたオリゴヌクレオチド対をライゲーションし、それにより、１つのＢｂｓＩ／ＫｐｎＩセグメントとライゲーションした、さまざまな数の１２ｍｅｒの反復を示すさまざまな長さの産物の混合物がもたらされた。３６アミノ酸の長さに対応する産物を、調製用アガロースゲル電気泳動によって混合物から単離し、ＢｓａＩ／ＫｐｎＩで消化したスタッファーベクターｐＣＷ０３５９にライゲーションした。ＬＣＷ０４０３と称される生じたライブラリー内のクローンの大部分は誘導後に緑色の蛍光を示し、これは、ＸＴＥＮの配列＿ＡＦ３６がＧＦＰ遺伝子とインフレームにライゲーションされたこと、および大部分のＸＴＥＮの配列＿ＡＦ３６が良好な発現を示すことを示す。 ライブラリーＬＣＷ０４０３由来の９６単離体を、ＩＰＴＧを含有する寒天プレート上にスタンプすることによって、高レベルの蛍光についてスクリーニングした。同じ単離体をＰＣＲによって評価し、３６アミノ酸ならびに強力な蛍光を有するセグメントを含有する４８単離体を同定した。これらの単離体について配列決定し、正確なＸＴＥＮ＿ＡＦ３６セグメントを含有する４４クローンを同定した。これらのセグメントについてのヌクレオチド構築物およびアミノ酸構築物のファイル名が表１０に列挙されている。 （実施例４） ＸＴＥＮ＿ＡＧ３６セグメントの構築 ３６アミノ酸長のコドンライブラリーコード配列を構築した。この配列を、ＸＴＥＮ＿ＡＧ３６と名付けた。そのセグメントはアミノ酸配列［Ｘ］３を有し、Ｘは、配列：ＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰ、ＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰ、ＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰ、またはＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰを有する１２ｍｅｒペプチドである。リン酸化合成オリゴヌクレオチド対の以下の対をアニーリングさせることによって挿入断片を得た： リン酸化オリゴヌクレオチド３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＦｏｒ：ＡＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣと非リン酸化オリゴヌクレオチドｐｒ＿３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＲｅｖ：ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡもアニーリングさせた。アニーリングしたオリゴヌクレオチド対をライゲーションし、それにより、１つのＢｂｓＩ／ＫｐｎＩセグメントとライゲーションした、さまざまな数の１２ｍｅｒの反復を示すさまざまな長さの産物の混合物がもたらされた。３６アミノ酸の長さに対応する産物を、調製用アガロースゲル電気泳動によって混合物から単離し、ＢｓａＩ／ＫｐｎＩで消化したスタッファーベクターｐＣＷ０３５９にライゲーションした。ＬＣＷ０４０４と称される生じたライブラリー内のクローンの大部分は誘導後に緑色の蛍光を示し、これは、ＸＴＥＮの配列＿ＡＧ３６がＧＦＰ遺伝子とインフレームにライゲーションされたこと、および大部分のＸＴＥＮの配列＿ＡＧ３６が良好な発現を示すことを示す。 ライブラリーＬＣＷ０４０４由来の９６単離体を、ＩＰＴＧを含有する寒天プレート上にスタンプすることによって、高レベルの蛍光についてスクリーニングした。同じ単離体をＰＣＲによって評価し、３６アミノ酸ならびに強力な蛍光を有するセグメントを含有する４８単離体を同定した。これらの単離体について配列決定し、正確なＸＴＥＮ＿ＡＧ３６セグメントを含有する４４クローンを同定した。これらのセグメントについてのヌクレオチド構築物およびアミノ酸構築物のファイル名が表１１に列挙されている。 （実施例５） ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の構築 ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４を、ＸＴＥＮ＿ＡＥ３６からＡＥ７２、ＡＥ１４４、ＡＥ２８８、ＡＥ５７６およびＡＥ８６４への連続的な二量体化により構築した。ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２セグメントの集合を、３７の異なるＸＴＥＮ＿ＡＥ３６のセグメントから構築した。３７の異なる３６アミノ酸セグメントを全て有するＥ．ｃｏｌｉの培養物を混合し、プラスミドを単離した。このプラスミドプールを、ＢｓａＩ／ＮｃｏＩを用いて消化して、挿入断片として小さな断片を生成した。同じプラスミドプールを、ＢｂｓＩ／ＮｃｏＩを用いて消化して、ベクターとして大きな断片を生成した。挿入断片とベクター断片をライゲーションし、それにより長さを倍加し、ライゲーション混合物を、ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）細胞に導入してそれを形質転換して、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２のコロニーを得た。 このＸＴＥＮ＿ＡＥ７２セグメントのライブラリーをＬＣＷ０４０６と名付けた。ＬＣＷ０４０６由来の全てのクローンを合わせ、上記と同じプロセスを用いて再度二量体化し、ＸＴＥＮ＿ＡＥ１４４のライブラリーＬＣＷ０４１０を得た。ＬＣＷ０４１０由来の全てのクローンを合わせ、上記と同じプロセスを用いて再度二量体化し、ＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８のライブラリーＬＣＷ０４１４を得た。２つの単離体、ＬＣＷ０４１４．００１およびＬＣＷ０４１４．００２をライブラリーから無作為に選び取り、配列決定して、同一性を検証した。ＬＣＷ０４１４由来の全てのクローンを合わせ、上記と同じプロセスを用いて再度二量体化し、ＸＴＥＮ＿ＡＥ５７６のライブラリーＬＣＷ０４１８を得た。ライブラリーＬＣＷ０４１８由来の９６単離体を、高レベルのＧＦＰ蛍光についてスクリーニングした。ＰＣＲによる正しい挿入断片のサイズおよび強力な蛍光を有する８単離体について配列決定し、配列決定および発現のデータに基づいて、２単離体（ＬＣＷ０４１８．０１８およびＬＣＷ０４１８．０５２）をその後の使用ために選択した。 ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の特異的なクローンｐＣＷ０４３２を、上記と同じ二量体化プロセスを用いてＸＴＥＮ＿ＡＥ５７６のＬＣＷ０４１８．０１８とＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８のＬＣＷ０４１４．００２を組み合わせることによって構築した。 （実施例６） ＸＴＥＮ＿ＡＭ１４４の構築 ＸＴＥＮ＿ＡＥ３６の３７の異なるセグメント、ＸＴＥＮ＿ＡＦ３６の４４セグメント、およびＸＴＥＮ＿ＡＧ３６の４４セグメントから出発するＸＴＥＮ＿ＡＭ１４４セグメントの集合を構築した。 １２５の異なる３６アミノ酸セグメントを全て有するＥ．ｃｏｌｉの培養物を混合し、プラスミドを単離した。このプラスミドプールを、ＢｓａＩ／ＮｃｏＩを用いて消化して、挿入断片として小さな断片を生成した。同じプラスミドプールを、ＢｂｓＩ／ＮｃｏＩを用いて消化して、ベクターとして大きな断片を生成した。挿入断片とベクター断片をライゲーションし、それにより長さを倍加し、ライゲーション混合物を、ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）細胞に導入してそれを形質転換して、ＸＴＥＮ＿ＡＭ７２のコロニーを得た。 このＸＴＥＮ＿ＡＭ７２セグメントのライブラリーをＬＣＷ０４６１と名付けた。ＬＣＷ０４６１由来の全てのクローンを合わせ、上記と同じプロセスを用いて再度二量体化し、ライブラリーＬＣＷ０４６２をもたらした。ライブラリーＬＣＷ０４６２由来の１５１２単離体をタンパク質の発現についてスクリーニングした。個々のコロニーを９６ウェルプレートに移し、発端培養物として一晩培養した。これらの発端培養物を新鮮な自己誘導培地中に希釈し、２０〜３０時間培養した。発現を、蛍光プレートリーダーを使用し、３９５ｎｍにおける励起および５１０ｎｍにおける放出を用いて測定した。１９２単離体が高いレベルの発現を示し、それらをＤＮＡ配列決定にかけた。ライブラリーＬＣＷ０４６２内の大部分のクローンが良好な発現および同様の物理化学的性質を示し、これは、ＸＴＥＮ＿ＡＭ３６セグメントの大部分の組合せにより、有用なＸＴＥＮ配列が提供されることを示唆している。ＬＣＷ０４６２由来の３０単離体を、多数のＸＴＥＮセグメントを含有する多機能性タンパク質を構築するためのＸＴＥＮ＿ＡＭ１４４セグメントの好ましい集合として選択した。これらのセグメントについてのヌクレオチド構築物およびアミノ酸構築物のファイル名が表１２に列挙されている。 （実施例７） ＸＴＥＮ＿ＡＭ２８８の構築 ライブラリーＬＣＷ０４６２全体を実施例６に記載の通り二量体化し、それにより、ＬＣＷ０４６３と称されるＸＴＥＮ＿ＡＭ１２８８クローンのライブラリーをもたらした。ライブラリーＬＣＷ０４６３由来の１５１２単離体を、実施例６に記載のプロトコールを用いてスクリーニングした。１７６の高度に発現されているクローンについて配列決定し、４０の好ましいＸＴＥＮ＿ＡＭ２８８セグメントを、２８８アミノ酸残基を有する多数のＸＴＥＮセグメントを含有する多機能性タンパク質を構築するために選択した。 （実施例８） ＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２の構築 ＸＴＥＮ＿ＡＭ１４４セグメントのライブラリーＬＣＷ０４６２由来のセグメントとＸＴＥＮ＿ＡＭ２８８セグメントのライブラリーＬＣＷ０４６３由来のセグメントを再度組み合わせることによって、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントのライブラリーを生成した。この新規のＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントのライブラリーをＬＣＷ０４６４と名付けた。それぞれＬＣＷ０４６２およびＬＣＷ０４６３を有するＥ．ｃｏｌｉの培養物からプラスミドを単離した。ライブラリーＬＣＷ０４６４由来の１５１２単離体を、実施例６に記載のプロトコールを用いてスクリーニングした。１７６の高度に発現されているクローンについて配列決定し、３９の好ましいＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントを、より長いＸＴＥＮを構築するため、および４３２アミノ酸残基を有する多数のＸＴＥＮセグメントを含有する多機能性タンパク質を構築するために選択した。 並行して、ＸＴＥＮ＿ＡＭ１４４およびＸＴＥＮ＿ＡＭ２８８の好ましいセグメントを使用してＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントのライブラリーＬＭＳ０１００を構築した。このライブラリーをスクリーニングすることにより４単離体を得、それをさらなる構築のために選択した。 （実施例９） ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５の構築 スタッファーベクターｐＣＷ０３５９を、ＢｓａＩおよびＫｐｎＩを用いて消化して、スタッファーセグメントを除去し、生じたベクター断片をアガロースゲル精製によって単離した。 アミノ酸ＧＡＳＡＳＧＡＰＳＴＧをコードし、内部に制限酵素ＡｓｃＩ認識ヌクレオチド配列ＧＧＣＧＣＧＣＣを有する配列決定島Ａ（ＳＩ−Ａ）を導入するために、リン酸化オリゴヌクレオチドＢｓａＩ−ＡｓｃＩ−ＫｐｎＩｆｏｒＰ：ＡＧＧＴＧＣＡＡＧＣＧＣＡＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＣＡＡＧＣＡＣＧＧＧＡＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣと非リン酸化オリゴヌクレオチドＢｓａＩ−ＡｓｃＩ−ＫｐｎＩｒｅｖ：ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡＡＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＴＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣＴＴＧＣＧＣＴＴＧＣをアニーリングさせた。アニーリングしたオリゴヌクレオチド対を、上で調製したＢｓａＩおよびＫｐｎＩで消化したスタッファーベクターｐＣＷ０３５９とライゲーションして、ＳＩ−Ａを含有するｐＣＷ０４６６をもたらした。次いで、実施例８由来の４３の好ましいＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントとｐＣＷ０４６６由来のＳＩ−ＡセグメントをＣ末端において、実施例５に記載のものと同じ二量体化プロセスを用いて再度組み合わせることによって、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリーを生成した。この新規のＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリーをＬＣＷ０４７９と名付けた。 実施例５に記載のものと同じ二量体化プロセスを用いて、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリーＬＣＷ０４７９由来のセグメントと実施例８由来の４３の好ましいＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントを再度組み合わせることによってＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５セグメントのライブラリーを生成した。この新規のＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５セグメントのライブラリーをＬＣＷ０４８１と名付けた。 （実施例１０） ＸＴＥＮ＿ＡＭ１３１８の構築 アミノ酸ＧＰＥＰＴＧＰＡＰＳＧをコードし、内部に制限酵素ＦｓｅＩ認識ヌクレオチド配列ＧＧＣＣＧＧＣＣを有する配列決定島Ｂ（ＳＩ−Ｂ）を導入するために、リン酸化オリゴヌクレオチドＢｓａＩ−ＦｓｅＩ−ＫｐｎＩｆｏｒＰ：ＡＧＧＴＣＣＡＧＡＡＣＣＡＡＣＧＧＧＧＣＣＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＧＧＡＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣと非リン酸化オリゴヌクレオチドＢｓａＩ−ＦｓｅＩ−ＫｐｎＩｒｅｖ：ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡＡＣＣＴＣＣＧＣＴＴＧＧＧＧＣＣＧＧＣＣＣＣＧＴＴＧＧＴＴＣＴＧＧをアニーリングさせた。アニーリングしたオリゴヌクレオチド対を、実施例９において使用したＢｓａＩおよびＫｐｎＩで消化したスタッファーベクターｐＣＷ０３５９とライゲーションして、ＳＩ−Ｂを含有するｐＣＷ０４６７を得た。次いで、実施例８由来の４３の好ましいＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントとｐＣＷ０４６７由来のＳＩ−Ｂセグメントを、Ｃ末端において、実施例５に記載のものと同じ二量体化プロセスを用いて再度組み合わせることによって、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリーを生成した。この新規のＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリーをＬＣＷ０４８０と名付けた。 ＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリーＬＣＷ０４８０由来のセグメントとＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５セグメントのライブラリーＬＣＷ０４８１由来のセグメントを、実施例５の場合と同じ二量体化プロセスを用いて再度組み合わせることによって、ＸＴＥＮ＿ＡＭ１３１８セグメントのライブラリーを生成した。この新規のＸＴＥＮ＿ＡＭ１３１８セグメントのライブラリーをＬＣＷ０４８７と名付けた。 （実施例１１） ＸＴＥＮ＿ＡＤ８６４の構築 実施例１において列挙されているＸＴＥＮ＿ＡＤ３６のセグメントから出発し、何回かの連続した二量体化を用いてＸＴＥＮ＿ＡＤ８６４配列の集合を組み立てた。これらの配列を実施例５に記載の通り組み立てた。ＸＴＥＮ＿ＡＤ８６４由来のいくつかの単離体を評価し、これらが生理的条件下で良好な発現および優れた溶解度を示すことが見いだされた。ＸＴＥＮ＿ＡＤ５７６の１つの中間構築物について配列決定した。このクローンをカニクイザルにおけるＰＫ実験で評価し、約２０時間の半減期が測定された。 （実施例１２） ＸＴＥＮ＿ＡＦ８６４の構築 実施例３において列挙されているＸＴＥＮ＿ＡＦ３６のセグメントから出発し、何回かの連続した二量体化を用いてＸＴＥＮ＿ＡＦ８６４配列の集合を組み立てた。これらの配列を実施例５に記載の通り組み立てた。ＸＴＥＮ＿ＡＦ８６４由来のいくつかの単離体を評価し、これらが生理的条件下で良好な発現および優れた溶解度を示すことが見いだされた。ＸＴＥＮ＿ＡＦ５４０の１つの中間構築物について配列決定した。このクローンをカニクイザルにおけるＰＫ実験で評価し、約２０時間の半減期が測定された。ＸＴＥＮ＿ＡＦ８６４の全長のクローンは、カニクイザルにおいて優れた溶解度を有し、６０時間を超える半減期を示した。ＸＴＥＮ＿ＡＦ配列の第２のセットを、実施例９に記載の通り配列決定島を含めて組み立てた。 （実施例１３） ＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４の構築 実施例４において列挙されているＸＴＥＮ＿ＡＧ３６のセグメントから出発し、何回かの連続した二量体化を用いてＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４配列の集合を組み立てた。これらの配列を実施例５に記載の通り組み立てた。ＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４由来のいくつかの単離体を評価し、これらが生理的条件下で良好な発現および優れた溶解度を示すことが見いだされた。ＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４の全長のクローンは、カニクイザルにおいて優れた溶解度を有し、６０時間を超える半減期を示した。 （実施例１４） ＧＬＰ−２およびＡＥ＿ＸＴＥＮを含有するＧＬＰ２−ＸＴＥＮを作製し、評価する方法 ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物を作製し、評価するための一般的なスキームが図６に示されており、この実施例の一般的な説明に関する基礎が形成される。ＧＬＰ−２ペプチドおよび配列変異体は組換えによって調製することができる。ＧＬＰ−２ペプチドを調製するために用いられる例示的な組換え方法としては、とりわけ、当業者には明らかになる通り、以下が挙げられる。一般には、本明細書において定義され、かつ／または記載されているＧＬＰ−２ペプチドまたは配列変異体は、所望のペプチドをコードする核酸を構築し、核酸を、１つまたは複数のＸＴＥＮをコードする核酸とインフレームで発現ベクターにクローニングし、宿主細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなどの細菌、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母、または、チャイニーズハムスター卵巣細胞またはベビーハムスター腎臓細胞などの哺乳動物の細胞）を形質転換し、核酸を発現させて、所望のＧＬＰ２−ＸＴＥＮを産生させることによって調製する。組換えポリペプチドをｉｎ ｖｉｔｒｏで、および原核宿主細胞および真核宿主細胞で作製し、発現させるための方法は当業者に公知である。例えば、米国特許第４，８６８，１２２号、およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１年）を参照されたい。 開示されている方法および当業者に公知の方法を例示的な実施例で提供される手引きと一緒に用いることにより、当業者は、本明細書に開示されている、またはそうでなければ当技術分野で公知であるＸＴＥＮ、ＧＬＰ−２およびＧＬＰ−２の変異体を含むＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を創出し、評価することができる。したがって、実施例は、ただ単に例示であり、方法をいかなる形でもどんなものでも制限するものではないと解釈されるべきであり、多数の変形が当業者には明らかになろう。本実施例では、モチーフのＡＥファミリーのＸＴＥＮと連結したＧＬＰ−２を含むＧＬＰ２−ＸＴＥＮを創出する。 ＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチドを作製するための一般的なスキームが図４および図５に示されている。図５は、本発明の実施形態のうちの１つにおけるＸＴＥＮポリヌクレオチド構築物の組立てにおける代表的なステップの概略フローチャートである。個々のオリゴヌクレオチド５０１をアニーリングして１２アミノ酸モチーフ（「１２−ｍｅｒ」）などの配列モチーフ５０２にし、それを、多量体化することができるライブラリー由来の追加的な配列モチーフとライゲーションして、所望の長さのＸＴＥＮ５０４を包含するプールを創出するとともに、より低濃度の、ＢｂｓＩ制限部位、およびＫｐｎＩ制限部位を含有するオリゴ５０３にライゲーションする。モチーフライブラリーは、特異的な配列ＸＴＥＮファミリー、例えば、表３のＡＤ配列、ＡＥ配列、ＡＦ配列、ＡＧ配列、ＡＭ配列、またはＡＱ配列に限定することができる。図５において例示されているように、ＸＴＥＮの長さは、この場合には８６４アミノ酸残基であるが、それよりも短いまたはそれよりも長い長さを、このプロセスによって実現することができる。例えば、多量体化は、ライゲーション、オーバーラップ伸長、ＰＣＲ組立てまたは当技術分野で公知の同様のクローニング技法によって実施することができる。生じたライゲーション産物のプールをゲル精製し、ＸＴＥＮの所望の長さのバンドをカットし、ストッパー配列５０５を有する単離されたＸＴＥＮ遺伝子をもたらす。ＸＴＥＮ遺伝子をスタッファーベクターにクローニングすることができる。この場合、ベクターは、任意選択のＣＢＤ配列５０６およびＧＦＰ遺伝子５０８をコードする。次いで、ＢｂｓＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いた消化を行って、５０７および５０８を除去し、終止コドンを置く。次いで、生じた産物を、ＢｓａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化した、ＧＬＰ−２をコードする遺伝子を含有するベクターにクローニングし、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質をコードする遺伝子５００をもたらす。当業者には明らかになる通り、該方法は、代替の配置にあり、ＸＴＥＮの長さが変動する構築物の創出に適用することができる。 ＧＬＰ−２をコードするＤＮＡ配列は、適切な細胞性供給源から調製したｃＤＮＡライブラリーから、ゲノムライブラリーから、当技術分野で公知の標準の手順によって都合よく得ることもでき、特に配列変異体（例えば、ＧＬＰ−２−２Ｇ）を組み入れる場合には、公的に利用可能なデータベース、特許、または参考文献から得られるＤＮＡ配列を使用して合成（例えば、自動核酸合成）によって創出することもできる。本実施例では、ＧＬＰ−２−２Ｇ配列を利用する。次いで、タンパク質のＧＬＰ−２部分をコードする遺伝子もしくはポリヌクレオチドまたはその相補配列を、本明細書に記載のものなどの、生物系において高レベルのタンパク質を発現させるための適切な転写配列および翻訳配列の制御下にあるプラスミドまたは他のベクターであってよい構築物にクローニングすることができる。ＸＴＥＮ部分をコードする第２の遺伝子もしくはポリヌクレオチドまたはその相補配列を、ライゲーションまたは多量体化ステップを通じてＧＬＰ−２をコードする遺伝子と近接し、インフレームである構築物にクローニングすることにより、ＧＬＰ−２遺伝子の末端をコードするヌクレオチドと遺伝子融合することができる。このように、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質をコードする（またはそれと相補的な）キメラＤＮＡ分子を構築物内で生成する。場合によって、第２のＸＴＥＮをコードする遺伝子を、ＧＬＰ−２をコードする領域をコードするヌクレオチドの内部にインフレームで挿入し、ライゲーションする。場合によって、このキメラＤＮＡ分子をより適切な発現ベクターである別の構築物、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核宿主細胞、酵母などの真核宿主細胞、または、ＣＨＯ、ＢＨＫなどの哺乳動物宿主細胞などに適したベクターに移行またはクローニングする。この時点で、キメラＤＮＡ分子を発現することができる宿主細胞をキメラＤＮＡ分子で形質転換する。目的のＤＮＡセグメントを含有するベクターを、上記の通り、細胞宿主の種類に応じて、周知の方法によって適切な宿主細胞に移行することができる。 ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ発現ベクターを含有する宿主細胞を、プロモーターを活性化するために適するように改変した従来の栄養培地で培養する。温度、ｐＨなどの培養条件は、以前から発現のために選択されている宿主細胞に対して用いられているものであり、当業者には明らかになろう。融合タンパク質を発現させた後、培養液を収集し、細胞集団から分離し、生じた粗抽出物を、融合タンパク質を精製するために保持する。 遺伝子発現は、例えば、従来のサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するためのノーザンブロット法［Ｔｈｏｍａｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、７７巻：５２０１〜５２０５頁（１９８０年）］、ドットブロッティング（ＤＮＡ解析）、またはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、本明細書において提供される配列に基づいて適切に標識したプローブを使用して、試料中で直接測定する。あるいは、遺伝子発現は、遺伝子産物の発現を直接定量化するための細胞の免疫組織化学的染色などの蛍光免疫学的方法によって測定する。試料流体の免疫組織化学的染色および／またはアッセイのために有用な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであってよく、任意の哺乳動物において調製することができる。ＧＬＰ−２配列ポリペプチドに対する抗体を本明細書において提供される配列に基づく合成ペプチドを使用して調製すること、またはＧＬＰ−２と融合しており、特異的な抗体エピトープをコードする外因性の配列に対する抗体を調製することができることが都合よい。選択マーカーの例は、当業者に周知であり、それらとして、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ベータガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などのレポーターが挙げられる。 ＧＬＰ２−ＸＴＥＮポリペプチド産物は、当技術分野で公知の方法によって精製する。ゲル濾過、アフィニティー精製、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーまたはゲル電気泳動などの手順は全て、精製に用いることができる技法である。特定の精製の方法は、Ｒｏｂｅｒｔ Ｋ． Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒ． Ｃａｓｔｏｒ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ １９９４年、およびＳａｍｂｒｏｏｋら、上記に記載されており、多ステップ精製分離も、Ｂａｒｏｎら、Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １０巻：１７９〜９０頁（１９９０年）およびＢｅｌｏｗら、Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ａ． ６７９巻：６７〜８３頁（１９９４年）に記載されている。 図６において例示されているように、次いで、単離されたＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を、それらの化学的性質および活性について特徴付ける。単離された融合タンパク質を、例えば、配列、純度、見かけの分子量、溶解度および安定性について、当技術分野で公知の標準の方法を用いて特徴付ける。次いで、予測標準物質に見合う融合タンパク質を活性について評価し、これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、本明細書に記載のＧＬＰ−２関連パラメータのうちの１つを、本明細書に開示されている１つまたは複数のアッセイを用いて、または実施例のアッセイまたは表３２のアッセイを用いて測定することによって測定することができる。 さらに、実施例１８〜２１に記載の通り、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を１つまたは複数の動物種に投与して、標準の薬物動態パラメータおよび薬力学的性質を決定する。 ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ構築物の作製、発現、および回収の反復プロセス、その後の、本明細書に開示されている方法または当技術分野で公知の他の方法を用いたそれらの特徴付けによって、当業者は、予測される性質、例えば、溶解度の増強、安定性の増強、薬物動態の改善および免疫原性の低下などを確認し、それにより、対応する融合していないＧＬＰ−２と比較して治療的活性を全体的に増強するために、ＧＬＰ−２およびＸＴＥＮを含むＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物を作製し、評価することができる。所望の性質を保有しない融合タンパク質については、そのような性質を有する組成物を得るために、異なる配列を構築し、発現させ、単離し、これらの方法によって評価することができる。 （実施例１５） ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ遺伝子およびベクターの構築 オリゴヌクレオチドと、設計された相補的なオーバーハング領域を介してアニーリング温度４８℃の条件下でタイリングし合わせることによってＧＬＰ−２遺伝子全体を組み立てることができるように、オリゴヌクレオチドを設計し、構築した。相補的な領域は一定に保持したが、オリゴヌクレオチドの他の領域は変動させ、したがって、単一のネイティブな遺伝子配列ではなく、約５０％が変動する遺伝子のコドンを有するコドンライブラリーを創出した。ＰＣＲを実施して、典型的なものと同様に、オリゴヌクレオチドの種々の組合せを含有する組合せ遺伝子ライブラリーを創出し、アガロースゲル上にスメアとして示した。ポリッシングＰＣＲを実施し、正確な末端を有する組立て体を、遺伝子の５’末端および３’末端に相補的な増幅プライマーのセットを使用して増幅した。次いで、このＰＣＲの産物をゲル精製し、予測されるＧＬＰ−２最終遺伝子産物の長さである約１００ｂｐのバンドのみを取得した。このゲル精製産物を、ＢｓａＩおよびＮｄｅＩを用いて消化し、同様に消化した、ＣＢＤリーダー配列およびＡＥ８６４ ＸＴＥＮをコードするＤＮＡを含有する構築物にライゲーションして、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４遺伝子を作製し、ＢＬ２１ ｇｏｌｄコンピテント細胞に導入し、それを形質転換した。この形質転換によるコロニーを選び取って９６ディープウェルプレート中のＳＢの培養物５００μｌに入れ、飽和するまで一晩成長させた。これらの培養物の２０μｌを自己誘導培地５００μｌに接種した後、これらの培養物を４℃で貯蔵し、これらの培養物を２６℃で＞２４時間成長させた。成長させた後、これらの自己誘導培地での培養物１００μｌのＧＦＰ蛍光を、蛍光プレートリーダーを使用して測定した。ＧＦＰ蛍光は、作出されたＧＬＰ２−ＸＴＥＮ＿ＡＥ４６４の分子の数に比例し、したがって、全発現の読み取りである。発現が最も高いクローンを同定し、そのクローンの元の飽和した一晩培養物由来のＳＢ中で新しい１ｍｌの一晩を開始した。これらの新しい培養物を用いてミニプレップを実施し、得られたプラスミドについて配列決定して、正確なヌクレオチド組成物を決定した。Ｅ．ｃｏｌｉ分離株をＡＣ４５３株と名付け、所望のＧＬＰ−２＿２Ｇ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４融合タンパク質を産生する株として同定した。予め切断した発現産物（ＣＢＤリーダー配列およびＴＥＶ切断配列を有する）のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列、ならびに最終産物ＧＬＰ−２−２Ｇ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４（ＴＥＶ切断後）のアミノ酸配列が表１３において提供される。 （実施例１６） ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４と融合したＧＬＰ−２−２Ｇを含む融合タンパク質の発現および精製。 発現用の宿主株ＡｍＥ０２５を、Ｋ−１２バックグラウンドを有し、ｆｈｕＡ遺伝子が欠失しており、ラムダＤＥ３プロファージが染色体に組み込まれている株であるＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０から得た。宿主細胞は、ｐＣＷ８１２（ＡＣ４５３）によりコードされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードするプラスミドｐＣＷ１０１０（ＡＣ６１６）を含有した。最終的な構築物は、Ｔ７プロモーターの制御下にある、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来のセルロソームアンカータンパク質粘着領域セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）（受託番号ＡＢＮ５４２７３）、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ認識部位（ＥＮＬＹＦＱ）、ＧＬＰ２−２Ｇ配列、およびＡＥ８６４アミノ酸ＸＴＥＮ配列をコードする遺伝子を含んだ。Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｂｉｏｓｔａｔ Ｂ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒを備えた、５Ｌのガラス被覆発酵容器内でタンパク質を発現させた。簡単に述べると、宿主株ＡｍＥ０２５の発端培養物を２Ｌの発酵バッチ培地に接種した。３７℃で６時間培養した後、５０％グルコースの供給を開始した。２０時間培養した後に、温度を２６℃まで低下させ、１ＭのＩＰＴＧを添加して発現を誘導した。総計４５時間発酵させた後、培養物を遠心分離によって収集して、湿重量約１ｋｇの細胞ペレットを得た。ペレットを、精製を開始するまで−８０℃で凍結貯蔵した。 溶解、熱フロキュレーションおよび清澄化 生じた細胞ペーストを、周囲温度で２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌに、細胞ペースト１ｇ当たり約４ｍｌの比率で再懸濁させた。操作圧８００〜９００バールでＡＰＶ２０００ホモジナイザーを２回通過させることによって細胞を溶解させた。溶解後、ホモジネートを熱交換器内で約８５℃まで加熱し、２０分間保持して、宿主細胞タンパク質を凝固させ、次いで、約１０℃まで急速に冷却した。冷却したホモジネートを、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ−３Ｃ遠心分離機でＳｏｒｖａｌｌ Ｈ６０００Ａローターを使用して、４，０００ｒｐｍで６０分遠心分離することによって清澄化した。上清をデカントし、６０ＳＰ０３Ａ Ｚｅｔａ Ｐｌｕｓ ＥＸＴデプスフィルター（３Ｍ）を通過させ、次に０．２μｍのＬｉｆｅＡＳＳＵＲＥ ＰＤＡ滅菌カプセルを通過させ、４℃で一晩貯蔵した。 Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｍ樹脂を使用した初回陰イオン交換捕捉 清澄化された溶解物から、周囲温度で３カラムステップを用いてＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮを単離した。負に荷電したＸＴＥＮポリペプチド尾部を選択し、宿主細胞タンパク質の大部分を除去するＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｍ（Ｔｏｓｏｈ）陰イオン交換樹脂を使用してＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮを捕捉した。適切な目盛りが付いたＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｍカラムを、５カラム体積の２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌを用いて平衡化し、溶解物を１時間当たり１２０ｃｍの直線的な流速でカラムにローディングした。次いで、カラムを３カラム体積の２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌおよび３カラム体積の２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて、ＵＶ吸収がベースラインに戻るまで洗浄した。ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮタンパク質を、２０ｍＭのＮａＣｌ、トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中、１５０ｍＭのＮａＣｌから３００ｍＭのＮａＣｌまでの直線勾配の７カラム体積を用いて溶出した。２〜８℃でプールし、貯蔵するために、全体を通して画分を採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。Ｓｕｐｅｒ Ｑ捕捉ステップ後の産物の純度は約８０％であると決定された。 ＧＥ ＭａｃｒｏＣａｐ Ｑ樹脂を使用した中間陰イオン交換捕捉 生じたＳｕｐｅｒＱプールを、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５を用いて約４倍に希釈して、伝導率を＜１０ｍＳ／ｃｍまで低下させた。適切な目盛りが付いたＭａｃｒｏＣａｐ Ｑ陰イオン交換カラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、全長のインタクトなＸＴＥＮポリペプチド尾部を選択し、内毒素および任意の残留する宿主細胞タンパク質およびＤＮＡの大部分を除去する。カラムを、５カラム体積の２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌを用いて平衡化した。希釈したＳｕｐｅｒＱプールを１時間当たり１２０ｃｍの直線的な流速でローディングした。次いで、カラムを、３カラム体積の２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、次いで３カラム体積の２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて、ＵＶ吸収がベースラインに戻るまで洗浄した。ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮタンパク質を、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中１５０ｍＭのＮａＣｌから３００ｍＭのＮａＣｌまでの直線勾配の１２カラム体積を用いて溶出した。２〜８℃でプールし、貯蔵するために、全体を通して画分を採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＭａｃｒｏＣａｐ Ｑ中間のステップ後の産物の純度は＞９５％であると決定された。 Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍ樹脂を使用した疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ） 適量の固体ＮａＣｌ塩をＭａｃｒｏＣａｐ Ｑプール中に溶解させて、負荷を４ＭのＮａＣｌに調整し、次いで、０．２μｍのフィルターを通して滅菌濾過した。適切な目盛りが付いたＴｏｙｏｐｅａｒｌ、Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍ（Ｔｏｓｏｈ）カラムにより、ＧＬＰ２ペイロードの疎水性残基を選択し、残留したＸＴＥＮ断片および内毒素を除去する。カラムを、５カラム体積の２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、４ＭのＮａＣｌを用いて平衡化した。ＭａｃｒｏＣａｐ Ｑプールを１時間当たり６０ｃｍの直線的な流速でローディングした。次いで、カラムを３カラム体積の２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、４ＭのＮａＣｌで洗浄した。ＧＬＰ２−２ＧＸＴＥＮタンパク質を、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中１．２ＭのＮａＣｌまでの漸減勾配を用いて溶出した。溶出ピークを分別し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析して、ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮの上首尾の捕捉および溶出を確認した。最終的な研磨ステップ後の産物の純度は＞９５％であると決定された。生じたプールを、３０ＫＤａのＭＷＣＯ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬ５０ Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃａｓｓｅｔｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して約１１ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、緩衝液を２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１３５ｍＭのＮａＣｌ製剤緩衝液に交換した。精製されたロットのＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮをＡＰ６９０と名付け、さらに使用するまで−８０℃で貯蔵した。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、２μｇ、５μｇおよび１０μｇのＡＰ６９０を使用して行い、ＮｕＰＡＧＥ４〜１２％Ｂｉｓ Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上にローディングし、次いで、２００Ｖ一定で３５分間流した。結果（図１１Ａ）により、ＡＰ６９０タンパク質が宿主細胞不純物から離れ、この分子量および組成のペイロード−ＸＴＥＮ融合タンパク質について予測される結果である１６０ｋＤａマーカーの近くに移動したことが示された。 内毒素含量 ロットＡＰ６９０の内毒素レベルを、ＥｎｄｏＳａｆｅ ＰＴＳ試験カートリッジ（Ｃａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を使用して評価し、タンパク質１ｍｇ当たり３．５ＥＵであることが決定され、これにより、ＡＰ６９０ロットは薬物動態試験または薬力学試験のために試験動物に注射するために適するものになった。 分析的サイズ排除ＨＰＬＣ ゲル濾過分析を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＢｉｏＳｃｐ−ＳＥＣ−ｓ４０００（７．８ｍｍ×６００ｍｍ）カラムを使用して実施した。ＡＰ６９０ ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ融合タンパク質２０μｇを、５０ｍＭのリン酸、ｐＨ６．５、３００ｍＭのＮａＣｌである移動相を使用し、１分当たり０．５ｍｌの流速で分析した。ＯＤ２１５ｎｍを用いて溶出をモニターした。Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘのサイズ排除確認標準物質を使用し、以下のマーカー：サイログロブリン（６７０ｋＤａ）、ＩｇＧ（１５６ｋＤａ）、ＢＳＡ（６６ｋＤａ）およびオボアルブミン（１７ｋＤａ）を用いてカラム較正を実施した。結果（図１１Ｂ）により、実際の重量８３．１ｋＤａの融合タンパク質について、見かけの分子量１００２ｋＤａ、見かけの分子量率１２．５が示された。 ＥＳＩ−ＭＳによるインタクトな質量決定 ＡＰ６９０ ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮタンパク質２００μｇを、Ｅｘｔｒａｃｔ−Ｃｌｅａｎ Ｃ１８カラム（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した固相抽出によって脱塩した。０．１％ギ酸、５０％アセトニトリル中脱塩タンパク質溶液をＱＳＴＡＲ ＸＬ質量分光計（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ）に１分当たり４μｌで注入した。多電荷ＴＯＦスペクトルを８００〜１４００ａｍｕの範囲内で獲得した。ゼロ電荷スペクトルをベイズ再構成によって１０〜１００ｋＤａの範囲内で得た（図１２）。全長のインタクトなＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮの実験的質量は８３，１４２Ｄａであると決定され、８３，００３Ｄａの追加的な副次的なピークが検出され、これは、総タンパク質量の＜５％のｄｅｓ−Ｈｉｓ ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮを示す。 （実施例１７） カルシウム流効力アッセイによるＧＬＰ２−ＸＴＥＮ ｉｎ ｖｉｔｒｏ受容体結合性の特徴付け ＧＰＣＲＰｒｏｆｉｌｅｒアッセイ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて受容体結合アッセイを実施して、ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ調製物（ＡＰ６９０を含めた）を評価した。このアッセイでは、ＧＬＰ２ Ｇタンパク質共役受容体およびＧＬＰ２受容体のアゴニズムでカルシウム流を刺激するＧアルファタンパク質で安定にトランスフェクトされたＣｈｅｍ−１１ヒト細胞からなるトランスフェクトされたＧＬＰ２Ｒ細胞株（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃａｔ番号ＨＴＳ１６４Ｃ）を使用した。ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ、合成ＧＬＰ２−２Ｇペプチド（ＸＴＥＮを伴わない）および合成ネイティブＧＬＰ２ペプチドの段階希釈物を添加することによってアッセイを実施し、ＦＬＩＰＲ ＴＥＴＲＡ計器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により、ｎｏ ｗａｓｈ ｃａｌｃｉｕｍ ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してカルシウム流をリアルタイムでモニターした。図１３に示されている結果を使用して、ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮについて３７０ｎＭおよびＧＬＰ２−２Ｇペプチドについて７ｎＭのＥＣＳＯ値を導出した。結果により、ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮが、ＧＬＰ２−２Ｇと比較して約２％の効力でＧＬＰ−２受容体に結合し、それを活性化することができたことが示されている。 （実施例１８） マウスにおけるＧＬＰ２−ＸＴＥＮの薬物動態評価 融合タンパク質ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４を、皮下（ＳＣ）投与後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるその薬物動態的性質について評価した。雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、２ｍｇ／ｋｇ（２５ｎｍｏｌ／ｋｇ）のＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ（ロットＡＰ４９８Ａ）を０．２５ｍｇ／ｍＬ（８ｍＬ／ｋｇ）でＳＣ注射した。以下の時点のそれぞれにおいて３匹のマウスを屠殺した：投薬前、投薬後０．０８時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間および１２０時間。血液試料をマウスから採取し、各間隔で予備冷却（ｐｒｅｃｈｉｌｌ）したヘパリン添加チューブに入れ、遠心分離によって分離して、血漿を回収した。試料を、抗ＸＴＥＮ／抗ＸＴＥＮサンドイッチＥＬＩＳＡ（ＡＳ１４０５）および抗ＧＬＰ２／抗ＸＴＥＮサンドイッチＥＬＩＳＡ（ＡＳ１７１７）の両方によって融合タンパク質濃度について分析し、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎを使用して結果を解析して、ＰＫパラメータを得た。終末相半減期を２４時間から１２０時間まで当てはめた。結果が表１４および図１４に示されており、どちらのアッセイによっても基本的に同等の結果が示されており、終末相半減期が３１．６〜３３．９時間であることが決定された。 （実施例１９） ラットにおけるＧＬＰ２−ＸＴＥＮの薬物動態評価 融合タンパク質ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４を、２つの異なる投与量レベルでＳＣ投与した後のｗｉｓｔａｒラットにおけるその薬物動態的性質について評価した。実験に先立って、雌のｗｉｓｔａｒラットの頸静脈にカテーテルを外科的に埋め込んだ。カテーテル挿入した動物を、それぞれラット３匹を含有する２つの群に無作為に分けた。融合タンパク質ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ（ロットＡＰ５１０）を以下の通り各ラットにＳＣ注射によって投与した：１）低用量２ｍｇ／ｋｇ（２５ｎｍｏｌ／ｋｇ）；または２）高用量１６ｍｇ／ｋｇ（２００ｎｍｏｌ／ｋｇ）。投薬前、試験化合物の投与後０．０８時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間および１６８時間（１０時点）に、各ラットから頸静脈カテーテルを通じて血液試料（約０．２ｍＬ）を採取して予備冷却したヘパリン添加チューブに入れた。ＥＬＩＳＡによる分析のために、血液を遠心分離によって処理して血漿にし、２つの一定分量に分けた。試料を、抗ＸＴＥＮ／抗ＸＴＥＮサンドイッチＥＬＩＳＡ（ＡＳ１６０２）および抗ＧＬＰ２／抗ＸＴＥＮサンドイッチＥＬＩＳＡ（ＡＳ１７０５）の両方によって融合タンパク質濃度について分析し、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎを使用して結果を解析して、ＰＫパラメータを得た。終末相半減期を４８時間から１６８時間まで当てはめた。結果が表１５および図１５に示されており、どちらのアッセイによっても基本的に同等の結果が示されており、終末相半減期が３７．５〜４９．７時間であることが決定され、これは、ＧＬＰ−２およびＧＬＰ２−２Ｇについて報告されている終末相半減期を著しく超えている。さらに、ラットに２５ｎｍｏｌ／ｋｇおよび２００ｎｍｏｌ／ｋｇで単回皮下投与した後のＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮの薬物動態プロファイルは用量に比例し、ＣｍａｘおよびＡＵＣがほぼ直線的に増大した。 （実施例２０） カニクイザルにおけるＧＬＰ２−ＸＴＥＮの薬物動態評価 融合タンパク質ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４を、融合タンパク質を単一の投与量レベルで皮下または静脈内のいずれかに投与した後の雄のカニクイザルにおけるその薬物動態的性質について評価した。時間０において、２ｍｇ／ｋｇ（２５ｎｍｏｌ／ｋｇ）のＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮを、雄のカニクイザル３匹にＩＶ注射し、雄のカニクイザル３匹にＳＣ注射した。試験の第１相については、投薬前および、融合タンパク質の投与後およそ０．０８３時間（５分）、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１６８時間、２１６時間、２６４時間、および３３６時間に各サルから血液試料を採取して予備冷却したヘパリン添加チューブに入れた。６週間（第１相の最後の採取時点後４週間）にわたって動物に「洗い出し」させ、群をクロスオーバーさせ（ＳＣからＩＶへ、およびＩＶからＳＣへ）、同じ用量のＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ融合タンパク質を再度投薬した。試験の第２相では、投薬前、および投薬後およそ０．０８３時間（５分）、１時間、２時間、４時間時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１６８時間、２１６時間、２６４時間、３３６時間、３８４時間、４３２時間、および５０４時間において血液試料を採取した。ＥＬＩＳＡによる分析のために、全ての血液試料を遠心分離によって処理して血漿にし、２つの一定分量に分けた。試料を、抗ＧＬＰ２／抗ＸＴＥＮ ＥＬＩＳＡ（ＡＳ１７０５）によって融合タンパク質濃度について分析し、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎを使用して結果を解析して、ＰＫパラメータを得た。結果が表１６および図１６に示されており、ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４融合タンパク質についての終末相半減期がＩＶに関しては１１０時間であり、ＳＣ投与に関しては１２０時間であることが決定された。生物学的利用能は９６％であり、これは、ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮが皮下投与後に急速かつほぼ完全に吸収されたことを実証している。 ＰＫ分析の累積的な結果を、３つの種（マウス、ラットおよびサル）からのデータを使用したＧＬＰ２−２Ｇ＿ＡＥ８６４の終末相半減期、クリアランスおよび分布容積のアロメトリックスケーリングを実施するために使用した。７０ｋｇのヒトについての薬物動態値を、図１７に示されている通り、体重と各薬物動態パラメータの間の対数直線関係を外挿することによって予測した。終末相半減期、分布容積およびクリアランスデータが表１７に示されている。予測されたヒトにおける終末相半減期は２４０時間であり、これは報告されているヒトにおけるテデュグルチドの終末相半減期３．２時間を著しく超える（Ｍａｒｉｅｒ， Ｊ−Ｆら、Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ， Ｓａｆｅｔｙ， ａｎｄ Ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｄｕｇｌｕｔｉｄｅ， ａ Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ−２ （ＧＬＰ−２） Ａｎａｌｏｇ， Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｓｃｅｎｄｉｎｇ Ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｓｕｂｊｅｃｔｓ．、Ｊ Ｃｌｉｎ， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（２００８年）４８巻：１２８９〜１２９９頁）。ヒトにおける終末相半減期は、クリアランス（Ｃｌ）および分布容積（Ｖｄ）の予測値を使用して、０．６９３×Ｖｄ／Ｃｌとして推定することもできる。この式を適用することにより、ヒトにおける終末相半減期は２３０時間であることが予測され、これは、動物のＴ１／２データの外挿とよく一致し、ネイティブなＧＬＰ−２およびＧＬＰ２−２Ｇについて報告されている終末相半減期を著しく超える。 （実施例２１） 動物モデルにおけるＧＬＰ２−ＸＴＥＮの薬力学的評価 ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏにおける薬理活性を、正常なラットにおける腸栄養性成長およびマウスＤＳＳ−大腸炎およびラットクローン病における有効性の前臨床モデルを使用して評価した。 正常なラットにおけるＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ−ＡＥ８６４のｉｎ ｖｉｖｏ評価 ＧＬＰ２−ＸＴＥＮの腸栄養性を決定するために、ラットにおける小腸の成長を主要な薬力学的エンドポイントとして測定した。ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ−ＡＥ８６４融合タンパク質、ＧＬＰ２−２Ｇペプチド、またはビヒクルを２００〜２２０グラムの雄のスプラーグドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットに皮下注射によって投与した（群当たりラット１０〜１２匹）。ＧＬＰ２−２Ｇペプチドを、以前に公開されたレジメンを用い、１２．５ｎｍｏｌ／ｋｇ（０．０５ｍｇ／ｋｇ）を１日２回、１２日間投薬した。２５ｎｍｏｌ／ｋｇのＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮを１日１回、１２日間投薬した。屠殺後に正中線切開を行い、小腸を取り出し、それらの最大長まで伸ばし、長さを記録した。内腔から糞便材料を洗い流し、小腸の湿重量を記録した。小腸の長さおよび重量のデータを、ペアワイズ比較のためにチューキー／クレーマーポストホック検定をｐ＝０．０５の有意性で用いたＡＮＯＶＡモデルを用いて解析した。 結果：ＧＬＰ２−２Ｇペプチドで１２日間（標準の１日２回投薬レジメンを用いて、１２．５ｎｍｏｌ／ｋｇ／用量）処置することにより、小腸の重量が２４％有意に増大した（図？？？Ａ）。小腸の長さに対する有意な効果はなかった。等モルのＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮを１２日間の試験にわたって投与すること（２５ｎｍｏｌ／ｋｇ／用量、１日１回）により、同様に、小腸の重量が３１％有意に増大した。ＧＬＰ２−２Ｇペプチドで見られた結果とは対照的に、ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮで処置したラットの小腸では、長さに９％（１０ｃｍ）の有意な増大が示され、また、ビヒクルで処置した対照動物由来の組織よりも目に見えて厚かった（図１８）。 結論：試験の結果により、ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮにより、等しいｎｍｏｌ／ｋｇ投薬を使用したＧＬＰ２−２Ｇペプチドと同様に良好な、またはそれよりも良好な小腸の成長が誘導されたことが示されている。 マウス急性ＤＳＳ誘導性大腸炎モデルにおけるＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ−ＡＥ８６４のｉｎ ｖｉｖｏ評価 ＧＬＰ２−ＸＴＥＮの有効性を決定するために、腸炎症性大腸炎（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｏｌｉｔｉｓ）のマウスモデルにおいてＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ−ＡＥ８６４融合タンパク質を評価した。雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（９〜１０週齢）において、マウスに、飲料水に溶解させた４．５％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を、１０日間、約２０％の体重減少が観察されるまで与えることによって大腸炎（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃｏｌｉｔｉｓ）を誘導した。ナイーブな無処置の対照群（群１）には実験の持続時間にわたって普通の飲料水を与えた。ＤＳＳ処置群（群２〜７）を、ビヒクル（群２）、ＧＬＰ２−２Ｇペプチド（ＸＴＥＮなし）（群３）またはＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ（ロットＡＰ５１００（群４〜７）を用いてＳＣ処置した。処置用量およびレジメンは以下の表１８に概説されており、ＧＬＰ−２Ｇペプチドは、１日目〜１０日目に１日２回投与し、一方、融合タンパク質については、１日目〜１０日目に、１日１回朝に投与し、夜にはビヒクル対照を投与した。測定パラメータは、体重（毎日記録した）、ならびに実験の１０日目に決定した以下のターミナルエンドポイントを含んだ：結腸の重量および長さ、小腸の重量および長さ、ならびに胃の重量。組織をホルマリン中に固定し、次いで、染色および病理組織検査のためにエタノールに移した。解剖学的データを、ペアワイズ比較のためにチューキー／クレーマーポストホック検定をｐ＝０．０５の有意性で用いたＡＮＯＶＡモデルを用いて解析した。 結果：体重、結腸の長さおよび重量、小腸の重量および長さ、ならびに胃の重量に対する処置の効果を屠殺日に評価した。ＤＳＳ処置したマウスでは、対照マウスと比較して、体重に予測された有意な減少が示されたが（図１９を参照されたい）、ＧＬＰ２−２Ｇペプチドで処置したマウスにおいても、ＧＬＰ２−２ＧＸＴＥＮのいずれの用量で処置したマウスの群のいずれにおいても、マウスは実験の間に体重減少の減少の低下を示さなかった。結腸、小腸および胃に対する処置の効果に関して、統計的に有意な変化があったパラメータは、対照群１および対照群２と比較したＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ高用量群（６ｍｇ／ｋｇ）における小腸の重量の増大、および群１（データは示していない）と比較したＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ中用量群（２ｍｇ／ｋｇ）における小腸の重量の増大である。目下の試験において、ＧＬＰ２−２Ｇペプチドにより、アッセイした組織の有意な成長は誘導されなかった。群２（ＤＳＳ／ビヒクル処置）および群４（ＤＳＳ／ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ、６ｍｇ／ｋｇ、１日１回処置）に対して病理組織検査を実施した。検査の結果により、ビヒクルで処置したマウス由来の小腸試料が、軽度〜中程度の、および顕著な程度の粘膜の萎縮を示したことが示された（図２０Ａ、Ｂを参照されたい）。粘膜は、発育阻止された絨毛（高さの低下）によって低密度に裏打ちされ、粘膜の厚さが減少した。対照的に、１日１回、６ｍｇ／ｋｇのＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮで処置したマウス由来の小腸試料は、正常な粘膜構成を示し、伸長した絨毛が円柱上皮細胞および杯細胞に高密度に集合していた（図２０Ｃ、Ｄを参照されたい）。この結果により、本実験の条件下で、ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ融合タンパク質で処置することにより、腸がＤＳＳの炎症作用から保護され、正常な絨毛および粘膜構成が維持されるという結論が裏付けられる。 ラットクローン病インドメタシン誘導性炎症モデルにおけるＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮの有効性とＧＬＰ２−２Ｇペプチドの有効性 単回投薬または１日１回投薬を用いたＧＬＰ２−ＸＴＥＮの有効性を決定するために、インドメタシン誘導性小腸炎のクローン病のラットモデルにおいて、３つの別々の試験でＧＬＰ２−２ＧＸＴＥＮ−ＡＥ８６４融合タンパク質を評価した。 試験１：雄のｗｉｓｔａｒラット（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）８０匹において、実験の０日目および１日目にインドメタシンを投与して小腸炎を誘導した。ラットを、表１９よる処置のために７つの処置群に分けた。 全ての処置を実験の−３日目に開始し、スケジュールに従って施した。体重を毎日決定した。群３および群５には、１日当たり等モルを投薬した。２日目（２回目のインドメタシン投薬の２４時間後）に、動物に対して屠殺および分析の準備をした。潰瘍、および炎症の程度を病理組織検査分析によって可視化するために、屠殺する３０分前に、ラットに１％Ｅｖａｎｓ Ｂｌｕｅ色素１ｍｌを静脈内注射した。ラットに麻酔をかけ（ＳＯＰ１８１０）、血液試料を取り出して、抗ＸＴＥＮ／抗ＧＬＰ２ ＥＬＩＳＡ法を用いてＧＬＰ−２−２Ｇ−ＸＴＥＮの濃度を決定した。次いで、ラットを安楽死させ、剖検し、腸の大まかな検査によって癒着の存在に対してスコアをつけた；すなわち、なし＝０、軽度＝１、中程度＝２、または重度＝３。小腸を取り出し、それぞれの長さを記録した。各小腸において、縦切開を行い、内部を検査した。潰瘍が形成された領域の程度および長さをスコア；すなわち、なし＝０、少数＝１、多数＝２、または連続的＝３として記録した。ＴＮＦαを決定するために、腸試料を解凍し、ＤＰＢＳを用いてホモジナイズして合計２０ｍｌにした。上清を室温に対して平衡化し、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ．ＲＴＡＯＯ、ロット２８１６８７、有効期限０７年９月１１日）によってＴＮＦαについてアッセイした。群１についての試料は希釈せずにアッセイした。群２〜７についての試料は１：４希釈した。病理組織検査のために、小腸を生理食塩水で穏やかに洗浄して糞便材料を除去し、過剰な流体を吸い取って除去した。各小腸を秤量し、次いで、炎症の程度；すなわち、．０％＝０、１〜３３％＝１、３４〜６６％＝２、６７〜１００％＝３を定量化するための病理組織検査のために処理した。 結果：体重および種々の小腸パラメータについての値およびスコアは、図２１にグラフで示されている。群２の対照動物についてのパラメータおよびスコアの変化と、それに対する群１の健康な対照についてのパラメータおよびスコアの変化により、このモデルが疾患過程を表していることが示される。体重の結果（図２１Ａ）により、ＧＬＰ２−２Ｇでは疾患対照（群２）と比較して有意な体重の増大がなかったが、ＧＬＰ−２−２Ｇ−ＸＴＥＮ群では有意な増大が実証されたことが示されている。小腸の長さからの結果（図２１Ｂ）では、ＧＬＰ−２−２Ｇペプチド処置とＧＬＰ−２−２Ｇ−ＸＴＥＮ融合タンパク質処置のどちらによっても有意な増大が示され、後者では非疾患対照（群１）と等しい長さがもたらされた。小腸の重量からの結果（図２１Ｃ）では、０．５ｍｇ／ｋｇのＧＬＰ−２−２Ｇペプチド群とＧＬＰ−２−２Ｇ−ＸＴＥＮ融合タンパク質群のどちらにおいても、疾患対照群２と比較して有意な増大が示された。大まかな小腸の病態スコアリングに基づいて、ＧＬＰ−２−２Ｇペプチド処置とＧＬＰ−２−２Ｇ−ＸＴＥＮ融合タンパク質処置のどちらによっても、潰瘍形成が有意に減少し（図２１Ｄ）、６ｍｇ／ｋｇの融合タンパク質により、非疾患対照（群１）と有意に異ならないスコアがもたらされた。癒着およびトランス潰瘍形成のスコアリング（図２１Ｅ）に基づいて、ＧＬＰ−２−２Ｇペプチド処置とＧＬＰ−２−２Ｇ−ＸＴＥＮ融合タンパク質処置のどちらによっても疾患対照（群２）と比較して有意な減少が示され、２ｍｇ／ｋｇおよび６ｍｇ／ｋｇの融合タンパク質により、非疾患対照（群１）と有意に異ならないスコアがもたらされた。小腸の炎症のスコアリング（図２１Ｆ）に基づいて、ＧＬＰ−２−２Ｇペプチド処置でもＧＬＰ−２−２Ｇ−ＸＴＥＮ融合タンパク質処置でも炎症に対する有意な効果は示されなかった。ＴＮＦαアッセイ（図２１Ｇ）に基づいて、ＧＬＰ−２−２Ｇペプチド処置とＧＬＰ−２−２Ｇ−ＸＴＥＮ融合タンパク質処置のどちらによっても、疾患対照群２と比較してサイトカインレベルの有意な減少が示された。 結論：試験の結果により、インドメタシン誘導性小腸損傷の改善において、ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮにより、等しいｎｍｏｌ／ｋｇ投薬を使用したＧＬＰ２−２Ｇペプチドと同様に良好な、またはそれよりも良好な有効性がもたらされたことが示されている。 試験２：雄のｗｉｓｔａｒラット（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）８０匹において、実験の０日目および１日目にインドメタシンを投与することによって小腸炎を誘導した。表２０による処置のために、ラットを８つの処置群に分けた。 全ての処置を実験の−３日目に開始し、スケジュールに従って施した。体重を毎日決定した。２日目（２回目のインドメタシン投薬の２４時間後）に、動物に対して屠殺および分析の準備をした。潰瘍、および炎症の程度を病理組織検査分析によって可視化するために、屠殺する３０分前に、ラットに１％Ｅｖａｎｓ Ｂｌｕｅ色素１ｍｌを静脈内注射した。ラットに麻酔をかけ、血液試料を取り出して、抗ＸＴＥＮ／抗ＧＬＰ２ ＥＬＩＳＡ法を用いてＧＬＰ−２−２Ｇ−ＸＴＥＮの濃度を決定した。次いで、ラットを安楽死させ、剖検し、腸の大まかな検査によって癒着の存在に対してスコアをつけた；すなわち、なし＝０、軽度＝１、中程度＝２、または重度＝３。小腸を取り出し、それぞれの長さを記録した。各小腸において、縦切開を行い、内部を検査した。潰瘍が形成された領域の程度および長さをスコア；すなわち、なし＝０、少数＝１、多数の＝２、または連続的＝３として記録した。生理食塩水を用いて糞便材料を洗い流し、過剰な流体を吸い取って除去し、各小腸を秤量し、次いで、炎症の程度；すなわち、．０％＝０、１〜３３％＝１、３４〜６６％＝２、６７〜１００％＝３を定量化するための病理組織検査のために処理した。 結果：種々のパラメータについてのスコアが図２２にグラフで示されている。ビヒクル陰性対照群では、インドメタシン処置に起因する大まかな病理的変化が回腸および空腸において最も重度であり、この群の評価による総疾患スコアは８．５〜９であった。種々のＧＬＰ−２−２Ｇペプチド処置群およびＧＬＰ−２−２Ｇ−ＸＴＥＮ処置群のうち、ＧＬＰ−２−２Ｇペプチドは１日２回送達し、ＧＬＰ−２−２Ｇ−ＸＴＥＮは１日１回送達し、６ｍｇ／ｋｇまたは２ｍｇ／ｋｇでのＧＬＰ−２−２Ｇ−ＸＴＥＮの単回投薬により、インドメタシンで処置したビヒクル対照群と比較してスコアが有意に改善された。トランス潰瘍形成スコアでは、総疾患スコアと同じ処置群が統計的有意性に達した（図２２Ａ、星印はビヒクル群と比較した統計的有意差を示す）。癒着スコア分析では、インドメタシンで処置したビヒクル対照群は、最大スコア３に近づいた（図２２Ｂ）。１日１回ＧＬＰ−２−２Ｇ−ＸＴＥＮで処置することにより、癒着からほぼ完全に保護され、単回の高用量６ｍｇ／ｋｇｍｐＧＬＰ−２−２Ｇ−ＸＴＥＮ群は、毎日２回投薬したＧＬＰ−２−２Ｇペプチド群と同様に、ビヒクル対照と比較して統計的有意差に達した（図中の星印は統計的有意差を示す）。小腸の長さの分析では（１００％に対して正規化したインドメタシン無処置群を用いた）、１日１回ＧＬＰ−２−２Ｇ−ＸＴＥＮで処置した群および毎日２回投薬したＧＬＰ−２−２Ｇペプチド群は、インドメタシンで処置したビヒクル対照群と比較して統計的有意差に達した。病理組織検査の評価所見は、大まかな病態所見と基本的に同様であった。ビヒクル対照群におけるインドメタシン処置に起因する病理組織学的変化は回腸および空腸において最も重度であった。ビヒクル対照群では、重度の粘膜の萎縮、潰瘍形成および浸潤が示された（図２３Ａ）。毎日２回のＧＬＰ−２−２Ｇペプチド処置および１日１回のＧＬＰ−２−２Ｇ−ＸＴＥＮ処置の保護効果は回腸において最も著しかったが、空腸においても見られた。群３では、１匹のラットが基本的に正常な組織を有したが（図２３Ｂ）、２匹のラットがそれぞれ潰瘍形成および浸潤を示したが萎縮はなく、２匹のラットが、ビヒクル対照疾患群２と同様の病理組織学的変化を有した。群４（図２３Ｄ）では、保護効果が示され、２匹のラットが基本的に正常な組織を有し、１匹のラットが萎縮または潰瘍形成は示さなかったがわずかな浸潤があり、１匹のラットでは萎縮はなかったがわずかな潰瘍形成および浸潤があり、１匹のラットがビヒクル対照疾患群２と同様の病理組織学的変化を有した。群７では保護効果が示され、１匹のラットが基本的に正常な組織を有し、２匹のラットでは潰瘍形成または浸潤はなかったが筋肉の萎縮を示し、２匹のラットがビヒクル対照疾患群２と同様の病理組織学的変化を有した。群８（図２３Ｃ）では保護効果が示され、１匹のラットでは潰瘍形成または浸潤がなく、１匹のラットでは潰瘍形成および浸潤が減少し、３匹のラットがビヒクル対照疾患群２と同様の病理組織学的変化を有した。ＥＬＩＳＡの結果により、群４および群８の全ての動物、および群７の３匹のラットにおいて、２日目にＧＬＰ−２−２Ｇ−ＸＴＥＮ融合タンパク質が検出可能であったことが示されている。 この結果により、本実験の条件下で、ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ融合タンパク質で処置することにより、腸がインドメタシンの炎症作用から有意に保護され、２ｍｇ／ｋｇを毎日投薬することにより最大の有効性が示され、６ｍｇ／ｋｇまたは２ｍｇ／ｋｇを単回投薬することにより、いくつかのパラメータにおいて有意な効力が示されるという結論が裏付けられる。 試験３：第３のインドメタシン誘導性炎症試験を実施して、以前の結果を検証し、追加的な用量レジメンについて試験した。雄のｗｉｓｔａｒラット（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）において、表２１に従って実験の０日目および１日目にインドメタシンを投与して小腸炎を誘導した。 全ての処置を実験の−３日目に開始し、スケジュールに従って施した。体重を毎日決定した。２日目（２回目のインドメタシン投薬の２４時間後）に、動物に対して屠殺および分析の準備をした。小腸を取り出し、それぞれの長さを記録した。試料のサブセットに対して定量的病理組織検査を実施した。ラット小腸試料は、幽門からそれぞれ１５ｃｍおよび３０ｃｍで採取した近位空腸（ｐｒｏｘｉｍａｌ ｊｅｊｕｎｕｍ）の３ｃｍの切片および中位空腸（ｍｉｄ−ｊｅｊｕｎｕｍ）の３ｃｍの切片採取からなった。試料を１０％の中性緩衝ホルマリン中に固定した。試料の不要な部分を切り取って、病変の存在または不在に対して偏りのない多数の切片にした。これらの切片をカセットに入れ、パラフィンに包埋し、およそ４ミクロンの厚さにミクロトーム処理し、ヘマトキシリン・エオシンで染色した（Ｈ＆Ｅ）。スライドを専門委員会によって認可された動物病理医が顕微鏡レベルで評価し、絨毛の高さならびに浸潤／炎症、粘膜の萎縮、絨毛／陰窩の外観、膿瘍／潰瘍形成についてスコアをつけた。１＝最小、２＝軽度、３＝中程度、４＝著しい／重度の１〜４重症度分類尺度を使用し、これは、病理組織学的に見られる細胞の反応の組合せを反映する。小腸の長さを、ペアワイズ比較のためにチューキー／クレーマーポストホック検定をｐ＝０．０５の有意性で用いたＡＮＯＶＡモデルを用いて分析した。ノンパラメトリック組織学的検査スコア変数を、全体的なアルファ０．０５を創出するためにｐ値に対してボンフェローニ補正を用いたマン−ホイットニーＵ検定を用いてビヒクル対照と比較した。 結果：最初の試験において見られるように、ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ処置した疾患にかかっているラットの小腸の長さが、ビヒクルで処置した疾患にかかっているラットと比較して増大した（図２４Ａ）。この増大は、絨毛の高さの有意な増大と相関した（図２４Ｂ）。高用量（総用量１２５ｎｍｏｌ／ｋｇ）のＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ処置群および低用量（総用量７５ｎｍｏｌ／ｋｇ）のＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ処置群のどちらにおいても、絨毛の高さの有意な増大が示され、ペプチド処置したラットにおいて見られた絨毛の高さの増大は有意でなかった。高用量のＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮで処置したラットおよび低用量のＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮで処置したラットのどちらでも、ビヒクルで処置した疾患にかかっているラットよりも有意に低い粘膜の萎縮スコアが示されたので、粘膜の萎縮も有意に減少した（図２４Ｃ）。ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ処置後およびＧＬＰ２−２Ｇペプチド処置後に粘膜の潰瘍形成の減少および混合細胞の浸潤が示される傾向があったが、これらの結果は、３つの処置群のいずれに対しても有意ではなかった。 結論：病理組織学的結果により、ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮにより、インドメタシン誘導性小腸損傷の改善において、ＧＬＰ２−２Ｇペプチドと同様に良好なまたはそれよりも良好な有効性がもたらされるという結論が裏付けられる。さらに、７５ｎｍｏｌ／ｋｇのＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮを１回投薬することまたは２５ｎｍｏｌ／ｋｇのＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮを３回投薬することは、１２．５ｎｍｏｌ／ｋｇのＧＬＰ２−２Ｇペプチドを１０回投薬することと有効性が同様である。 （実施例２２） ＧＬＰ−２を含むＧＬＰ２−ＸＴＥＮを評価するためのヒト臨床試験設計 実施例１８〜２０において実証されている通り、ＸＴＥＮをＧＬＰ−２−２グリシンのＣ末端に融合することにより、ＧＬＰ−２またはＧＬＰ−２−２Ｇペプチドのネイティブな形態として公知のものと比較して半減期が改善され、これにより、そのようなＧＬＰ２−ＸＴＥＮを含有する融合タンパク質組成物を用いると、投薬頻度を減少させ、それでもなお臨床的な有効性をもたらすことができると考えられる。ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質とＧＬＰ−２（またはＧＬＰ−２−２Ｇペプチド）製剤を比較するヒトにおける臨床試験を実施して、現行のまたは実験的なモダリティと比較してＧＬＰ２−ＸＴＥＮ結合融合タンパク質組成物の有効性および利点を確立する。そのような試験は、３つの相を含む。最初に、成人患者において第Ｉ相安全性および薬物動態試験を行って、ヒト（例えば、正常な健康なボランティア被験体）における最大耐量ならびに薬物動態的性質および薬力学的性質を決定するとともに、その後の研究においてネックになる潜在的な毒性および有害事象を定義する。第Ｉ相試験は、本明細書に開示されているものなどのＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物を単回漸増投薬で所望の経路によって（例えば、皮下経路、筋肉内経路、または静脈内経路によって）投与し、生化学的パラメータ、ＰＫパラメータ、および臨床的パラメータを定義済みの間隔で測定するとともに有害事象を測定して行う。第Ｉｂ相試験は、複数回投薬し、その後に同様に生化学的パラメータ、ＰＫパラメータ、および臨床的パラメータを定義済みの間隔で測定する。これにより、最小の有効用量および最大耐量を決定し、活性成分の治療域を構成する投与量および循環薬物の閾値および最大濃度を確立することが可能になる。この情報から、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物（ＸＴＥＮと連結していないＧＬＰ−２と比較して）をより低頻度で投与し、それでも薬理的応答を保持することが可能になる用量および投薬スケジュールを得る。その後、ＧＬＰ−２に関連付けられる状態を有する患者において、その投薬条件下でのＧＬＰ２−ＸＴＥＮ組成物の有効性および安全性を検証する第ＩＩ相臨床試験および第ＩＩＩ相臨床試験を行う。臨床試験は、ネイティブなＧＬＰ−２または所与の状態に対する標準治療により臨床的利益がもたらされ得ることが予測される任意の疾患に罹患している患者において行うことができる。例えば、そのような適応症としては、胃炎、消化障害、吸収不良症候群、短消化管症候群、短腸症候群、盲管症候群、炎症性腸疾患、小児脂肪便症、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症性スプルー、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸炎、化学療法誘導性腸炎、過敏性腸症候群、小腸損傷、小腸の粘膜の損傷、癌化学療法に起因する小腸損傷、胃腸傷害、下痢性疾患、腸管機能不全症、酸誘導性腸管傷害、アルギニン欠乏症、特発性精液減少症、肥満症、異化疾病、発熱性好中球減少症、糖尿病、肥満症、脂肪便、自己免疫疾患、食物アレルギー、低血糖症、胃腸関門障害、敗血症、細菌性腹膜炎、熱傷誘導性腸管損傷、胃腸運動の低下、腸管不全症、化学療法に付随する菌血症、腸管外傷、腸管虚血、腸間膜虚血、栄養失調、壊死性腸炎、壊死性膵炎、新生児哺乳不耐性、ＮＳＡＩＤ誘導性胃腸損傷、栄養不足、胃腸管に対する完全非経口栄養による損傷、新生児栄養不足、放射線誘導性腸炎、放射線によって誘導される腸への傷害、粘膜炎、回腸嚢炎、虚血、および脳卒中が挙げられる。試験では、患者を、処置する前、その間またはその後に、それぞれの適応症に関連する生理的パラメータおよび臨床的パラメータ、例えば、体重増加、炎症、サイトカインレベル、疼痛、腸の機能、食欲、熱性エピソード、創傷治癒、グルコースレベル；空腹満腹の増強または加速；プラセボまたは陽性対照群と比較して追跡されるパラメータの変化についてモニターする。標準の統計学的方法を用いて有効性転帰を決定する。毒性および有害事象のマーカーも本試験で追跡して、化合物が、記載されている様式で使用した場合に安全であることを検証する。 （実施例２３） 切断配列を有するＧＬＰ２−ＸＴＥＮ ＦＸＩａによって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ 図７に示されている通り、ＧＬＰ−２構成成分とＸＴＥＮ構成成分の間に位置づけられたＸＴＥＮ放出部位切断配列を有する、ＧＬＰ−２のＣ末端と融合したＸＴＥＮタンパク質からなるＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を創出することができる。例示的な配列が表３４において提供される。この場合、放出部位切断配列は、ＦＸＩａプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．２７、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０３９５１）によって認識され、切断されるアミノ酸配列を含有するＧＬＰ２−ＸＴＥＮに組み入れることができる。具体的には、アミノ酸配列ＫＬＴＲＡＥＴが、その配列のアルギニンの後ろでＦＸＩａプロテアーゼによってカットされる。ＦＸＩは、内因性または接触により活性化された凝固経路内のＦＶＩＩＩの直前に位置する凝血原プロテアーゼである。活性なＦＸＩａはＦＸＩＩａによってチモーゲンがタンパク質切断されることによってＦＸＩから生成する。ＦＸＩａの生成は、しっかりと制御されており、適切な止血のために凝固が必要である場合にのみ起こる。したがって、ＫＬＴＲＡＥＴ切断配列を組み込むことにより、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮに近接する内因性凝固経路の活性化と同時発生的にＧＬＰ−２からＸＴＥＮドメインが取り除かれる。 エラスターゼ−２によって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ 図７に示されている通り、ＧＬＰ−２構成成分とＸＴＥＮ構成成分の間に位置づけられたＸＴＥＮ放出部位切断配列を有する、ＧＬＰ−２のＣ末端と融合したＸＴＥＮタンパク質からなるＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を創出することができる。例示的な配列が表３４において提供される。この場合、放出部位は、エラスターゼ−２プロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．３７、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０８２４６）によって認識され、切断されるアミノ酸配列を含有する。具体的には、配列ＬＧＰＶＳＧＶＰ［Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ．Ｄ．ら（２００８年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３６巻：Ｄ３２０頁］が、その配列内の４位の後ろでカットされる。エラスターゼは、好中球によって構成的に発現され、循環中にいつでも存在するが、特に急性炎症の間に存在する。したがって、長寿命のＧＬＰ２−ＸＴＥＮが循環するにしたがい、特に、炎症応答の間（例えば、腸の炎症）に局所的にその画分が切断され、それにより、例えばクローン病における、ＧＬＰ−２が最も必要とされる炎症部位でより短寿命のＧＬＰ−２のプールが創出される。 ＭＭＰ−１２によって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ 図７に示されている通り、ＧＬＰ−２構成成分とＸＴＥＮ構成成分の間に位置づけられたＸＴＥＮ放出部位切断配列を有する、ＧＬＰ−２のＣ末端と融合したＸＴＥＮタンパク質からなるＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を創出することができる。例示的な配列が表３４において提供される。この場合、放出部位は、ＭＭＰ−１２プロテアーゼ（ＥＣ３．４．２４．６５、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ３９９００）によって認識され、切断されるアミノ酸配列を含有する。具体的には、配列ＧＰＡＧＬＧＧＡ［Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ．Ｄ．ら（２００８年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３６巻：Ｄ３２０頁］が、その配列の４位の後ろでカットされる。ＭＭＰ−１２は、全血中で構成的に発現される。したがって、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮが循環するにしたがい、その画分が切断され、それにより、使用されるより短寿命のＧＬＰ−２のプールが創出される。本発明の組成物の望ましい特徴では、これにより、予防的な量のＧＬＰ−２を絶えず放出し、例えばクローン病における、ＧＬＰ−２が最も必要とされる炎症応答の間にはより多くの量を放出する、循環プロドラッグデポ剤が創出される。 ＭＭＰ−１３によって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ 図７に示されている通り、ＧＬＰ−２構成成分とＸＴＥＮ構成成分の間に位置づけられたＸＴＥＮ放出部位切断配列を有する、ＧＬＰ−２のＣ末端と融合したＸＴＥＮタンパク質からなるＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を創出することができる。例示的な配列が表３４において提供される。この場合、放出部位は、ＭＭＰ−１３プロテアーゼ（ＥＣ３．４．２４．−、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ４５４５２）によって認識され、切断されるアミノ酸配列を含有する。具体的には、配列ＧＰＡＧＬＲＧＡ［Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ．Ｄ．ら（２００８年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３６巻：Ｄ３２０頁］が、４位の後ろでカットされる。ＭＭＰ−１３は、全血中で構成的に発現される。したがって、長寿命のＧＬＰ２−ＸＴＥＮが循環するにしたがい、その画分が切断され、それにより、使用されるより短寿命のＧＬＰ−２のプールが創出される。本発明の組成物の望ましい特徴では、これにより、予防的な量のＧＬＰ−２を絶えず放出し、例えばクローン病における、ＧＬＰ−２が最も必要とされる炎症応答の間にはより多くの量を放出する、循環プロドラッグデポ剤が創出される。 ＭＭＰ−１７によって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ 図７に示されている通り、ＧＬＰ−２構成成分とＸＴＥＮ構成成分の間に位置づけられたＸＴＥＮ放出部位切断配列を有する、ＧＬＰ−２のＣ末端と融合したＸＴＥＮタンパク質からなるＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を創出することができる。例示的な配列が表３４において提供される。この場合、放出部位は、ＭＭＰ−２０プロテアーゼ（ＥＣ．３．４．２４．−、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＵＬＺ９）によって認識され、切断されるアミノ酸配列を含有する。具体的には、配列ＡＰＬＧＬＲＬＲ［Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ．Ｄ．ら（２００８年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３６巻：Ｄ３２０頁］が、その配列内の４位の後ろでカットされる。ＭＭＰ−１７は、全血中で構成的に発現される。したがって、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮが循環するにしたがい、その画分が切断され、それにより、使用されるより短寿命のＧＬＰ−２のプールが創出される。本発明の組成物の望ましい特徴では、これにより、予防的な量のＧＬＰ−２を絶えず放出し、例えばクローン病における、ＧＬＰ−２が最も必要とされる炎症応答の間にはより多くの量を放出する、循環プロドラッグデポ剤が創出される。 ＭＭＰ−２０によって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ 図７に示されている通り、ＧＬＰ−２構成成分とＸＴＥＮ構成成分の間に位置づけられたＸＴＥＮ放出部位切断配列を有する、ＧＬＰ−２のＣ末端と融合したＸＴＥＮタンパク質からなるＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質を創出することができる。例示的な配列が表３４において提供される。この場合、放出部位は、ＭＭＰ−２０プロテアーゼ（ＥＣ．３．４．２４．−、Ｕｎｉｐｒｏｔ ０６０８８２）によって認識され、切断されるアミノ酸配列を含有する。具体的には、配列ＰＡＬＰＬＶＡＱ［Ｒａｖｖｌｉｎｇｓ Ｎ．Ｄ．ら（２００８年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３６巻：Ｄ３２０頁］が、４位の後ろでカットされる（矢印で示されている）。ＭＭＰ−２０は、全血中で構成的に発現される。したがって、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮが循環するにしたがい、その画分が切断され、それにより、使用されるより短寿命のＧＬＰ−２のプールが創出される。本発明の組成物の望ましい特徴では、これにより、予防的な量のＧＬＰ−２を絶えず放出し、例えばクローン病における、ＧＬＰ−２が最も必要とされる炎症応答の間にはより多くの量を放出する、循環プロドラッグデポ剤が創出される。 Ｃ末端ＸＴＥＮの放出速度の最適化 Ｃ末端ＸＴＥＮの放出速度が変更された、実施例の前述の構築物の変異体を創出することができる。ＸＴＥＮ放出プロテアーゼによるＸＴＥＮ放出の速度は、ＸＴＥＮ放出部位の配列に左右され、ＸＴＥＮ放出部位のアミノ酸配列を変動させることにより、ＸＴＥＮ放出の速度を制御することができる。多くのプロテアーゼの配列特異性は当技術分野において周知であり、いくつかのデータベースにおいて実証されている。この場合、プロテアーゼのアミノ酸特異性を、基質のコンビナトリアルライブラリーを用いて［Ｈａｒｒｉｓ， ＪＬら（２０００年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９７巻：７７５４頁］、または、［Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ， Ｖ，ら（１９９３年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３２巻：４３４４頁］において例示されている基質混合物の切断に従うことによってマッピングする。代替法は、最適なプロテアーゼ切断配列をファージディスプレイによって同定することである［Ｍａｔｔｈｅｗｓ， Ｄ．ら（１９９３年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６０巻：１１１３頁］。変異体配列を用いて構築物を作出し、ＸＴＥＮを検出するための標準のアッセイを用いてＸＴＥＮ放出についてアッセイする。 （実施例２４） 大きなＸＴＥＮ分子の体内分布 長いＸＴＥＮ融合物を有する構築物が組織中に浸透することができることを検証するために、蛍光タグを付けた３つの構築物、ａＨｅｒ２−ＸＴＥＮ−８６４−Ａｌｅｘａ６８０、ａＨｅｒ２−ＸＴＥＮ−５７６−Ａｌｅｘａ６８０、およびａＨｅｒ２−ＸＴＥＮ−２８８−Ａｌｅｘａ６８０の体内分布をマウスにおいて蛍光イメージングを用いて試験した。ａＨｅｒ２ペイロードは、Ｈｅｒ２抗原との結合に特異的なｓｃＦｖ断片であり、正常な組織では見いだされない（したがって、正常な動物における体内分布に影響を及ぼさないはずである）。この試験は、対照抗体として、蛍光タグを付けたハーセプチン−Ａｌｅｘａ６８０も包含した。マウスに各作用剤を単回静脈内注射した。７２時間後に、全群を安楽死させ、肝臓、肺、心臓、脾臓および腎臓をｅｘ ｖｉｖｏで蛍光イメージングを用いて画像化した。データが表２２に示されている。 結論：全ての構築物がアッセイした全ての組織への有意な浸透を示した。ＸＴＥＮ＿５７６群およびＸＴＥＮ＿２８８群の全体的な蛍光シグナルが低いことは、７２時間の分布時間にわたってより短いＸＴＥＮ構築物のクリアランスが増大したことに起因する。抗体対照を含めた全群について、総シグナルに対して同様の肺の蛍光の割合が観察され、これにより、これらの条件下で、ＸＴＥＮ融合タンパク質構築物を組織において生物が利用可能であることが裏付けられる。 （実施例２５） 多様なペイロードを有するＸＴＥＮ融合タンパク質の分析的サイズ排除クロマトグラフィー 種々の治療用タンパク質、および長さを次第に増大させた非構造化組換えタンパク質を含有する融合タンパク質に対してサイズ排除クロマトグラフィー分析を実施した。例示的なアッセイでは、ＴＳＫＧｅｌ−Ｇ４０００ＳＷＸＬ（７．８ｍｍ×３０ｃｍ）カラムを使用し、１ｍｇ／ｍｌの濃度の精製グルカゴン融合タンパク質４０μｇを２０ｍＭのリン酸、ｐＨ６．８、１１４ｍＭのＮａＣｌ中、１分当たり０．６ｍｌの流速で分離した。ＯＤ２１４ｎｍおよびＯＤ２８０ｎｍを使用してクロマトグラムプロファイルをモニターした。全てのアッセイについてのカラム較正を、ＢｉｏＲａｄのサイズ排除較正標準物質を使用して実施し、マーカーは、サイログロブリン（６７０ｋＤａ）、ウシガンマ−グロブリン（１５８ｋＤａ）、ニワトリオボアルブミン（４４ｋＤａ）、ウマミオグロビン（１７ｋＤａ）およびビタミンＢ１２（１．３５ｋＤａ）を含む。グルカゴン−Ｙ２８８、グルカゴン−Ｙ１４４、グルカゴン−Ｙ７２、グルカゴン−Ｙ３６の代表的なクロマトグラフィーのプロファイルは、図２５においてオーバーレイとして示されている。データにより、各化合物の見かけの分子量が、付着しているＸＴＥＮ配列の長さに比例することが示されている。しかし、データにより、各構築物の見かけの分子量が、球状タンパク質について予測される分子量よりも有意に大きいことも示されている（同じアッセイにおいて行った標準タンパク質との比較によって示されている通り）。評価した全ての構築物についてのＳＥＣ分析に基づいて、見かけの分子量、見かけの分子量率（見かけの分子量と算出された分子量の比として表される）、および流体力学的半径（ＲＨ、ｎｍ単位）が表２３に示されている。結果により、５７６アミノ酸以上の種々のＸＴＥＮを組み込むことにより、融合タンパク質におよそ３３９〜７６０ｋＤａの見かけの分子量が付与されること、および８６４アミノ酸以上のＸＴＥＮにより、少なくともおよそ８００ｋＤａを超える見かけの分子量が付与されることが示されている。実際の分子量に対して見かけの分子量が比例的に増大するという結果は、いくつかの異なるモチーフファミリー、すなわち、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、およびＡＭ由来のＸＴＥＮを用いて創出した融合タンパク質に一貫しており、少なくとも４倍の増大および約１７倍高い比が伴った。さらに、５７６アミノ酸以上のＸＴＥＮ融合パートナーを種々のペイロードを有する融合タンパク質に組み込むこと（および、Ｙ２８８と融合したグルカゴンの場合では２８８残基）により、７ｎｍ以上の流体力学的半径がもたらされ、これはおよそ３〜５ｎｍである糸球体の孔径を十分に越える。したがって、成長およびＸＴＥＮを含む融合タンパク質の腎臓クリアランスは低下し、これは、対応する融合していない生物学的ペイロードタンパク質と比較して終末相半減期の増大および治療効果または生物学的効果の改善に寄与することが予想される。 （実施例２６） カニクイザルにおけるＧＦＰと融合した延長ポリペプチドの薬物動態 非構造化ポリペプチドの組成および長さのＰＫパラメータに対する影響を決定するために、ＧＦＰ−Ｌ２８８、ＧＦＰ−Ｌ５７６、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿ＡＦ５７６、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿Ｙ５７６およびＸＴＥＮ＿ＡＤ８３６−ＧＦＰの薬物動態をカニクイザルにおいて試験した。注射後の種々の時間において血液試料を分析し、血漿中のＧＦＰの濃度を、捕捉用にＧＦＰに対するポリクローナル抗体、および検出用に同じポリクローナル抗体のビオチン化調製物を使用したＥＬＩＳＡによって測定した。結果が図２６に要約されている。ＸＴＥＮ配列の長さが増大するとともに驚くべき半減期の増大を示す。例えば、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿Ｌ２８８（ＸＴＥＮに２８８アミノ酸残基が伴う）について１０時間の半減期が決定された。非構造化ポリペプチド融合パートナーの長さを５７６アミノ酸に倍加することにより、多数の融合タンパク質構築物、すなわち、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿Ｌ５７６、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿ＡＦ５７６、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿Ｙ５７６について半減期が２０〜２２時間に増大した。非構造化ポリペプチド融合パートナーの長さを８３６残基にさらに増大させることにより、ＸＴＥＮ＿ＡＤ８３６−ＧＦＰの半減期が７２〜７５時間になった。したがって、ポリマーの長さを２８８残基から５７６残基まで２８８残基増大することにより、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期が約１０時間増大した。しかし、ポリペプチドの長さを５７６残基から８３６残基まで２６０残基増大させることにより、半減期は５０時間超増大した。これらの結果により、非構造化ポリペプチドの長さに、比例的増大を超えるｉｎ ｖｉｖｏ半減期がもたらさされる驚くべき閾値があることが示されている。したがって、延長した非構造化ポリペプチドを含む融合タンパク質は、長さがより短いポリペプチドと比較して薬物動態が増強された性質を有することが予測される。 （実施例２７） ＸＴＥＮの血清安定性 ＧＦＰのＮ末端と融合した ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４を含有する融合タンパク質を、サル血漿およびラット腎臓溶解物中、３７℃で最大７日間インキュベートした。図２７に示されている通り、試料を時間０、１日目および７日目に取り出し、ＳＤＳ ＰＡＧＥ、その後、ウェスタン分析を用いた検出およびＧＦＰに対する抗体を用いた検出によって分析した。ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の配列では、血漿中で７日かけて無視できる分解の徴候が示された。しかし、ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４はラット腎臓溶解物中では３日かけて急速に分解された。血漿試料において融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ安定性を試験し、そこでは、ＧＦＰ＿ＡＥ８６４を免疫沈降させ、上記の通りＳＤＳ ＰＡＧＥによって分析した。注射の最大７日後に取り出した試料に分解の徴候はほとんど示されなかった。この結果により、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ融合タンパク質の薬物動態的性質の増強の因子である血清プロテアーゼに起因する分解に対するＧＬＰ２−ＸＴＥＮの抵抗性が実証される。 （実施例２８） ＸＴＥＮと連結することによるペプチドペイロードの溶解度および安定性の増大 物理化学的性質である溶解度および安定性を増強するＸＴＥＮの能力を評価するために、グルカゴンと長さが短いＸＴＥＮの融合タンパク質を調製し、評価した。試験物を中性のｐＨのトリス緩衝生理食塩水中に調製し、逆相ＨＰＬＣおよびサイズ排除クロマトグラフィーによってＧｃｇ−ＸＴＥＮ溶液を特徴付けて、タンパク質が溶液中で均一であり、凝集していないことを確認した。データは表２４に示されている。比較のために、同じ緩衝液中の修飾されていないグルカゴンの溶解限度を６０μＭ（０．２ｍｇ／ｍＬ）で測定し、その結果により、付加した全ての長さのＸＴＥＮについて、溶解度の相当な増大が達成されたことが実証される。ほとんどの場合、標的濃度が実現されるようにグルカゴン−ＸＴＥＮ融合タンパク質を調製し、所与の構築物についての最大の溶解限度を決定するためには評価しなかったことが重要である。しかし、ＡＦ−１４４ＸＴＥＮと連結したグルカゴンの場合では溶解度の限度を決定し、その結果、ＸＴＥＮと連結していないグルカゴンと比較して溶解度の６０倍の増大が実現された。さらに、グルカゴン−ＡＦ１４４ ＧＬＰ２−ＸＴＥＮを安定性について評価し、冷蔵条件下では少なくとも６カ月にわたって、また、３７℃ではおよそ１カ月にわたって液体製剤中で安定であることが見いだされた（データは示していない）。 データにより、長さが短いＸＴＥＮポリペプチドをグルカゴンなどの生物学的に活性なタンパク質と連結することにより、生じた融合タンパク質によるタンパク質の溶解度が著しく増強され得るともに、より高いタンパク質の濃度での安定性が付与されるという結論が裏付けられる。 （実施例２９） 予測アルゴリズムによる二次構造についての配列の解析 二次構造について、特定のコンピュータプログラムまたはアルゴリズム、例えば、周知のＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズム（Ｃｈｏｕ， Ｐ． Ｙ．ら（１９７４年）ＢｉｏＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３巻：２２２〜４５頁）およびＧａｒｎｉｅｒ−Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ−Ｒｏｂｓｏｎ、または「ＧＯＲ」法（Ｇａｒｎｉｅｒ Ｊ， Ｇｉｂｒａｔ ＪＦ， Ｒｏｂｓｏｎ Ｂ．（１９９６年）ＧＯＲ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｆｒｏｍ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２６６巻：５４０〜５５３頁）などによってアミノ酸配列を評価することができる。所与の配列について、アルゴリズムにより、二次構造がいくつか存在するか、または全く存在しないかを予測し、例えば、アルファヘリックスまたはベータシートを形成する配列の残基の総計および／または百分率、またはランダムコイル形成をもたらすことが予測される配列の残基の百分率として表すことができる。 ＸＴＥＮ「ファミリー」由来のいくつかの代表的な配列を、これらの配列における二次構造の程度を評価するためのＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ法およびＧＯＲ法用の２つのアルゴリズムツールを用いて評価した。Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎツールは、Ｗｉｌｌｉａｍ Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎおよびバージニア大学により、２００９年６月１９日に存在したワールドワイドウェブにあるＵＲＬ、．ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ．ｃｇｉ？ｒｍ＝ｍｉｓｃ１の「Ｂｉｏｓｕｐｐｏｒｔ」インターネットサイトにおいて提供された。ＧＯＲツールは、Ｐｏｌｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｑｕｅ Ｌｙｏｎｎａｉｓにより、２００８年６月１９日に存在したワールドワイドウェブにあるＵＲＬ、．ｎｐｓａ−ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｓｅｃｐｒｅｄ＿ｇｏｒ４．ｐｌのＮｅｔｗｏｒｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓインターネットサイトで提供された。 解析の第１のステップとして、単一のＸＴＥＮ配列を２つのアルゴリズムによって解析した。ＡＥ８６４組成物は、アミノ酸Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、およびＡからなる４つの１２アミノ酸配列モチーフの多数のコピーから創出した８６４アミノ酸残基を有するＸＴＥＮである。配列モチーフは、１２アミノ酸モチーフのいずれの１つにおいても、いずれの２つの連続したアミノ酸の配列も３回以上繰り返されないという点、および全長のＸＴＥＮの３つの連続したアミノ酸が同一ではないという点で、モチーフ内、および配列全体内での反復性が限定されているという事実を特徴とする。ＡＦ８６４配列の、Ｎ末端から連続的に長くした部分を、Ｃｈｏｕ−ＦａｓｍａｎアルゴリズムおよびＧＯＲアルゴリズム（後者は、最小長１７アミノ酸を必要とする）で解析した。配列を、ＦＡＳＴＡ形式配列を予測ツールに入力し、解析を実行することによって解析した。解析の結果が表２５に示されている。 結果により、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ算出により、ＡＥファミリーおよびＡＧファミリーの、少なくとも２８８アミノ酸残基までの短いＸＴＥＮはアルファヘリックスまたはベータシートを有さないが、ＧＯＲアルゴリズムによって予測されたランダムコイルの百分率の量は７８〜９９％で変動することが示されている。５０４残基のＸＴＥＮ長さを１３００超に増大させると、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって解析したＸＴＥＮの予測されたアルファヘリックスまたはベータシートの百分率は０〜約２％であったが、算出されたランダムコイルの百分率は９４〜９９％に増大した。アルファヘリックスまたはベータシートを有するＸＴＥＮは、セリン残基が３つ連続する場合が１つまたは複数あり、その結果ベータ−シートの形成が予測される配列である。しかし、これらの配列でさえも、それでもおよそ９９％のランダムコイル形成を有した。 本明細書において提供されるデータにより、１）Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、およびＡの多数の配列モチーフから創出したＸＴＥＮ、および連続したアミノ酸に関して反復性が限定されたＸＴＥＮは、非常に低い量のアルファヘリックスおよびベータシートを有することが予測されること、２）ＸＴＥＮの長さを増大させることにより、アルファヘリックスまたはベータ−シートが形成される確率は目に見えるほどには増大しないこと、および３）アミノ酸Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、およびＡからなる非反復性の１２−ｍｅｒを付加することによってＸＴＥＮ配列の長さを次第に増大させることにより、ランダムコイル形成の百分率が増大することが示唆される。結果により、さらに、反復性が限定された（任意の１つのモチーフ内に２つ以下同一の連続したアミノ酸を有するものを含む）、本明細書において定義されているＸＴＥＮ配列（例えば、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、およびＡの配列モチーフから創出したＸＴＥＮを含む）は、非常に限定された二次構造を有することが予測されることが示される。表３の配列モチーフの任意の順序または組合せを用いて、二次構造を実質的に欠くＸＴＥＮ配列をもたらすＸＴＥＮポリペプチドを創出することができるが、３つの連続したセリンは好ましくない。しかし、３つの連続したセリンの好ましくない性質は、ＸＴＥＮの長さを増大させることによって改善することができる。そのような配列は、本明細書に開示されている本発明のＧＬＰ２−ＸＴＥＮ実施形態に記載されている特性を有することが予測される。 （実施例３０） 反復性についてのポリペプチド配列の解析 本実施例では、いくつかのＸＴＥＮ配列を含めた種々のポリペプチドを、アミノ酸配列内の反復性について評価した。ポリペプチドアミノ酸配列は、短い部分配列がポリペプチド全体の中で出現する回数を分量化することによって反復性について評価することができる。例えば、長さ２００アミノ酸残基のポリペプチドは合計で１６５の重複している３６アミノ酸「ブロック」（または「３６ｍｅｒ」）および１９８の３ｍｅｒ「部分配列」を有するが、唯一の３ｍｅｒ部分配列の数は、配列内の反復性の量に左右される。解析のために、種々のポリペプチド配列を、以下の方程式を適用することによって得られる部分配列スコアを決定することによって反復性について評価した： 式中、ｍ＝（ポリペプチドのアミノ酸長）−（部分配列のアミノ酸長）＋１であり、数値ｉ＝配列ｉ内の唯一の部分配列のそれぞれの出現の累積数である。 本実施例の解析では、表２６のポリペプチドについての部分配列スコアを、図１に示されているアルゴリズムを使用したコンピュータプログラムにおいて前述の方程式を使用して決定し、部分配列長は３アミノ酸に設定した。生じた部分配列スコアは、ポリペプチド内の反復性の程度を反映する。 表２６に示されている結果により、２種類または３種類のアミノ酸からなる非構造化ポリペプチドの部分配列スコアは高いが、６種のアミノ酸Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、およびＡの１２アミノ酸モチーフからなる非構造化ポリペプチドの内部の反復性は低程度であり、部分配列スコアは１０未満、いくつかの場合には５未満であることが示されている。例えば、Ｌ２８８配列は２種類のアミノ酸を有し、短く、反復性の程度が高い配列を有し、その結果、部分配列スコアは５０．０になる。ポリペプチドＪ２８８は３種類のアミノ酸を有するが、短い反復配列も有し、その結果、部分配列スコアは３３．３になる。Ｙ５７６も３種類のアミノ酸を有するが、内部の反復を構成せず、これは最初の２００アミノ酸にわたる部分配列スコア１５．７に反映される。Ｗ５７６は、４種類のアミノ酸からなるが、内部の反復性の程度が高く、例えば、「ＧＧＳＧ」、その結果、部分配列スコアは２３．４になる。ＡＤ５７６は、それぞれが４種類のアミノ酸からなる４種類の１２アミノ酸モチーフからなる。個々のモチーフの内部の反復性の程度が低いので、最初の２００アミノ酸にわたる全体的な部分配列スコアは１３．６である。対照的に、それぞれの内部の反復性が低い６種類のアミノ酸を含有する４モチーフからなるＸＴＥＮの部分配列スコアは低い、すなわち、ＡＥ８６４（６．１）、ＡＦ８６４（７．５）、およびＡＭ８７５（４．５）であるが、５種類のアミノ酸を含有する４モチーフからなるＸＴＥＮは中間、すなわち、ＡＥ８６４、スコア７．２であった。 結論：結果により、それぞれ４〜６種類のアミノ酸からなる非反復性の１２アミノ酸部分配列モチーフを組み合わせてより長いＸＴＥＮポリペプチドにすることにより、全体的な平均部分配列スコアが１０未満であり、多くの場合５未満であることによって示される通り、配列全体が実質的に非反復性になることが示されている。これは、各部分配列モチーフを配列全体にわたって多数回用いることができるという事実に反する。対照的に、より小数のアミノ酸の種類から創出したポリマーでは、平均部分配列スコアがより高くなり、２種類のアミノ酸からなるポリペプチドのスコアは３種類のアミノ酸からなるポリペプチドのスコアよりも高かった。 （実施例３１） ＴＥＰＩＴＯＰＥスコアの算出 ９ｍｅｒペプチド配列のＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを、Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ［Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ， Ｔ．ら（１９９９年）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１７巻：５５５頁］に記載されている通り、ポケットポテンシャル（ｐｏｃｋｅｔ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を加えることによって算出することができる。本実施例では、個々のＨＬＡ対立遺伝子について別々のＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを算出した。表２７には、例として、白人の集団において高頻度で出現するＨＬＡ＊０１０１Ｂについてのポケットポテンシャルが示されている。配列Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−Ｐ４−Ｐ５−Ｐ６−Ｐ７−Ｐ８−Ｐ９を有するペプチドのＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを算出するために、表２７の対応する個々のポケットポテンシャルを加えた。配列ＦＤＫＬＰＲＴＳＧを有する９ｍｅｒペプチドのＨＬＡ＊０１０１Ｂスコアは、０、−１．３、０、０．９、０、−１．８、０．０９、０、０の合計である。 長いペプチドについてのＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを評価するために、配列の９ｍｅｒ部分配列の全てについてプロセスを繰り返すことができる。他のＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるタンパク質についてこのプロセスを繰り返すことができる。表２８〜３１には、白人の集団において高頻度で出現するＨＬＡ対立遺伝子のタンパク質産物についてのポケットポテンシャルが示されている。 この方法によって算出されるＴＥＰＩＴＯＰＥスコアはおよそ−１０〜＋１０にわたる。しかし、Ｐ１位に疎水性アミノ酸が欠如している９ｍｅｒペプチド（ＦＫＬＭＶＷＹ）については、−１００９〜−９８９にわたるＴＥＰＩＴＯＰＥスコアが算出される。この値は生物学的には無意味であり、疎水性アミノ酸がＨＬＡ結合のアンカー残基としての機能を果たし、Ｐ１に疎水性残基が欠如しているペプチドは、ＨＬＡに結合するものではないと考えられるという事実を反映する。大部分のＸＴＥＮ配列は疎水性残基が欠如しているので、９ｍｅｒ部分配列の全ての組合せが−１００９〜−９８９にわたるＴＥＰＩＴＯＰＥを有することになる。この方法により、ＸＴＥＮポリペプチドが予測されるＴ細胞エピトープをほとんどまたは全く有さない可能性があることが確認される。 グルカゴン様タンパク質−２（ＧＬＰ−２）および延長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）を含む組換え融合タンパク質であって、前記ＸＴＥＮが、 （ａ）前記ＸＴＥＮが少なくとも３６アミノ酸残基を含むこと、 （ｂ）グリシン（Ｇ）残基、アラニン（Ａ）残基、セリン（Ｓ）残基、トレオニン（Ｔ）残基、グルタミン酸（Ｅ）残基およびプロリン（Ｐ）残基の合計が前記ＸＴＥＮの全アミノ酸残基の約８０％超を構成すること、 （ｃ）前記ＸＴＥＮが実質的に非反復性であり、したがって、（ｉ）前記ＸＴＥＮが、アミノ酸がセリンでない限り、同一のアミノ酸を３つ連続して含有しない、（ｉｉ）前記ＸＴＥＮ配列の少なくとも約８０％が重複していない配列モチーフからなり、前記配列モチーフのそれぞれがグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択される４〜６アミノ酸からなる約９〜約１４アミノ酸残基を含み、いかなる２つの連続したアミノ酸残基も重複していない配列モチーフのそれぞれにおいて２回を超えて出現しない、または、（ｉｉｉ）前記ＸＴＥＮ配列の部分配列スコアが１０未満であること、 （ｄ）前記ＸＴＥＮがＧＯＲアルゴリズムによって決定したところ９０％超のランダムコイル形成を有すること、 （ｅ）前記ＸＴＥＮが、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定したところ２％未満のアルファへリックスおよび２％のベータシートを有すること、および （ｆ）前記ＸＴＥＮが、ＴＥＰＩＴＯＰＥアルゴリズムによって解析した場合、予測Ｔ細胞エピトープを欠き、前記アルゴリズムによる前記予測についてのＴＥＰＩＴＯＰＥ閾値スコアの閾値が−９であり、前記融合タンパク質が少なくとも約４の見かけの分子量率を示し、治療有効量を用いて被験体に投与すると腸栄養効果を示すことを特徴とする組換え融合タンパク質。 前記腸栄養効果が、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２を同等の用量を用いて被験体に投与した場合の前記対応するＧＬＰ−２と比較して少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％または少なくとも約１２０％または少なくとも約１５０％または少なくとも約２００％の腸栄養効果である、請求項１に記載の組換え融合タンパク質。 前記被験体が、マウス、ラット、サル、およびヒトからなる群より選択される、請求項１に記載の組換え融合タンパク質。 前記投与が皮下投与、筋肉内投与、または静脈内投与である、前記請求項のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 前記腸栄養効果が、１用量、または３用量、または６用量、または１０用量、または１２用量またはそれより多くの用量の前記融合タンパク質を投与した後に決定される、前記請求項のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 前記腸栄養効果が、腸の成長、絨毛上皮の肥厚の増大、陰窩の細胞の増殖の増大、陰窩および絨毛軸の高さの増大、腸吻合後の治癒の増大、小腸の重量の増大、小腸の長さの増大、小腸上皮アポトーシスの減少、および腸機能の増強からなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 前記投与により、小腸の重量が少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％増大する、請求項６に記載の組換え融合タンパク質。 前記投与により、小腸の長さが少なくとも約５％、または少なくとも約６％、または少なくとも約７％、または少なくとも約８％、または少なくとも約９％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％増大する、請求項６に記載の組換え融合タンパク質。 ＧＬＰ−２配列が、最適にアラインメントすると、表１の配列からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 前記ＧＬＰ−２がヒトＧＬＰ−２を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 前記ＧＬＰ−２が、ウシＧＬＰ−２、ブタＧＬＰ−２、ヒツジＧＬＰ−２、ニワトリＧＬＰ−２、およびイヌＧＬＰ−２からなる群より選択される、請求項９から１１のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 前記ＧＬＰ−２がＡｌａ２の代わりにアミノ酸置換を有し、前記置換がグリシンである、前記請求項のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 前記ＧＬＰ−２が配列ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤを有する、請求項１から９のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 前記ＸＴＥＮが前記ＧＬＰ−２のＣ末端と連結している、前記請求項のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 前記ＧＬＰ−２と前記ＸＴＥＮとを連結する１〜約５０アミノ酸残基のスペーサー配列をさらに含む、請求項１４に記載の組換え融合タンパク質。 前記スペーサー配列がグリシン残基を含む、請求項１５に記載の組換え融合タンパク質。 前記ＸＴＥＮが、 （ａ）全ＸＴＥＮアミノ酸残基が少なくとも３６〜約３０００アミノ酸残基であること、 （ｂ）グリシン（Ｇ）残基、アラニン（Ａ）残基、セリン（Ｓ）残基、トレオニン（Ｔ）残基、グルタミン酸（Ｅ）残基およびプロリン（Ｐ）残基の合計が前記ＸＴＥＮの全アミノ酸残基の少なくとも約９０％を構成することを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 前記ＸＴＥＮが、アスパラギン残基とグルタミン残基の合計が前記ＸＴＥＮの全アミノ酸配列の１０％未満であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 前記ＸＴＥＮが、メチオニン残基とトリプトファン残基の合計が前記ＸＴＥＮの全アミノ酸残基の２％未満であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 前記ＸＴＥＮが、最適にアラインメントすると、表４、表８、表９、表１０、表１１、および表１２のいずれか１つから選択される同等の長さの配列と比較して少なくとも９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 前記ＸＴＥＮが、最適にアラインメントすると、表４のＡＥ８６４配列と比較して少なくとも９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 前記融合タンパク質の配列が、図２８に記載の配列に対して少なくとも９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を有する、請求項１〜９または請求項１３のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 被験体に投与すると、少なくとも約３０時間の終末相半減期を示す、前記請求項のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 前記融合タンパク質が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＧＬＰ２Ｒ細胞アッセイを用いてアッセイすると、約３０ｎＭ未満、または約１００ｎＭ未満、または約２００ｎＭ未満、または約３００ｎＭ未満、または約３７０ｎＭ未満、または約４００ｎＭ未満、または約５００ｎＭ未満、または約６００ｎＭ未満、または約７００ｎＭ未満、または約８００ｎＭ未満、または約１０００ｎＭ未満、または約１２００ｎＭ未満、または約１４００ｎＭ未満のＥＣ５０でＧＬＰ−２受容体に結合し、前記ＧＬＰ２Ｒ細胞がヒト組換えＧＬＰ−２グルカゴンファミリー受容体カルシウム最適化細胞である、前記請求項のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 前記融合タンパク質が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＧＬＰ２Ｒ細胞アッセイを用いてアッセイすると、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２の効力の少なくとも約１％、または約２％、または約３％、または約４％、または約５％、または約１０％、または約２０％、または約３０％を保持し、前記ＧＬＰ２Ｒ細胞が、ヒト組換えＧＬＰ−２グルカゴンファミリー受容体カルシウム最適化細胞である、前記請求項のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 （ａ）ｎｍｏｌ／ｋｇ単位の当量の前記融合タンパク質および前記ＸＴＥＮが欠如している対応するＧＬＰ−２を同等の被験体にそれぞれ投与すると、前記融合タンパク質では前記ＸＴＥＮが欠如している対応するＧＬＰ−２と比較して少なくとも約３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも１５倍、または少なくとも２０倍長い、前記被験体における終末相半減期が達成されること、 （ｂ）前記ＸＴＥＮが欠如している対応するＧＬＰ−２およびｎｍｏｌ／ｋｇ単位でその２分の１、または３分の１、または４分の１、または５分の１、または６分の１の量の前記融合タンパク質を胃腸の状態を有する同等の被験体にそれぞれ投与すると、前記融合タンパク質により、前記ＸＴＥＮが欠如している対応するＧＬＰ−２と同等の、前記被験体における治療効果が達成されること、 （ｃ）前記融合タンパク質を、被験体に、同等の被験体にその他の点では等価なｎｍｏｌ／ｋｇ量を用いて投与した前記ＸＴＥＮが欠如している対応するＧＬＰ−２の投薬間隔と比較して、少なくとも約２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも１５倍、または少なくとも２０倍長い投薬間隔を用いた連続用量で投与すると、前記融合タンパク質では前記ＸＴＥＮが欠如している対応するＧＬＰ−２と同様の、前記被験体における血中濃度が達成されること、または （ｄ）前記融合タンパク質を、被験体に、同等の被験体にその他の点では等価なｎｍｏｌ／ｋｇ量を用いて投与した前記ＸＴＥＮが欠如している対応するＧＬＰ−２の投薬間隔と比較して少なくとも約３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍、または少なくとも１０倍または少なくとも１５倍、または少なくとも２０倍長い投薬間隔を用いた連続用量で投与すると、前記融合タンパク質では前記ＸＴＥＮが欠如している対応するＧＬＰ−２と同等の、前記被験体における治療効果が達成されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 前記被験体が、マウス、ラット、サル、およびヒトからなる群より選択される、請求項２６に記載の組換え融合タンパク質。 前記被験体がラットである、請求項２７に記載の組換え融合タンパク質。 前記投与により、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２で観察される効果と比較して、より大きな薬理効果がもたらされる、請求項２６から２８のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 有効量の前記融合タンパク質を投与することにより、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２を同等の被験体に同等のｎｍｏｌ／ｋｇ量を用いて投与することと比較して、より大きな、腸炎の被験体における治療効果がもたらされる、請求項２６から２９のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 前記被験体が、マウス、ラット、サル、およびヒトからなる群より選択される、請求項２６から３０のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 前記被験体がヒトであり、前記腸炎がクローン病である、請求項３１に記載の組換え融合タンパク質。 前記被験体がラット被験体であり、前記腸炎がインドメタシンを用いて誘導される、請求項３１に記載の組換え融合タンパク質。 前記より大きな治療効果が、体重増加、小腸の長さ、小腸組織のＴＮＦα含有量の減少、粘膜の萎縮の減少、穿孔性潰瘍の発生率の低下、および絨毛の高さからなる群より選択される、請求項２９から３３のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 前記投与により、小腸の重さが、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２によるものと比較して少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％大きく増大する、請求項３４に記載の組換え融合タンパク質。 前記投与により、小腸の長さが、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２によるものと比較して少なくとも約５％、または少なくとも約６％、または少なくとも約７％、または少なくとも約８％、または少なくとも約９％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％大きく増大する、請求項３４に記載の組換え融合タンパク質。 前記投与により、体重が、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２によるものと比較して少なくとも約５％、または少なくとも約６％、または少なくとも約７％、または少なくとも約８％、または少なくとも約９％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％大きく増大する、請求項３４に記載の組換え融合タンパク質。 前記ＴＮＦα含有量の減少が、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２によるものと比較して小腸組織１ｇ当たり少なくとも約０．５ｎｇ、または少なくとも約０．６ｎｇ、または少なくとも約０．７ｎｇ、または少なくとも約０．８ｎｇ、または少なくとも約０．９ｎｇ、または少なくとも約１．０ｎｇ、または少なくとも約１．１ｎｇ、または少なくとも約１．２ｎｇ、または少なくとも約１．３ｎｇ、または少なくとも約１．４ｎｇ、またはそれを超える、請求項３４に記載の組換え融合タンパク質。 前記絨毛の高さが、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２によるものと比較して少なくとも約５％、または少なくとも約６％、または少なくとも約７％、または少なくとも約８％、または少なくとも約９％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約１１％、または少なくとも約１２％高い、請求項３４に記載の組換え融合タンパク質。 １回、または２回、または３回、または４回、または５回、または６回、または１０回、または１２回またはそれを超える連続用量で投与される、請求項２９から３９のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 前記有効量が少なくとも約５ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約２５ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約２００ｎｍｏｌ／ｋｇである、請求項３０から４０のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 前記ＧＬＰ−２が前記ＸＴＥＮに、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、カリクレイン、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＩＩａ因子（トロンビン）、エラスターゼ−２、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ−１７およびＭＭＰ−２０からなる群より選択される哺乳動物のプロテアーゼによって切断可能な切断配列を介して連結しており、前記切断配列における前記哺乳動物のプロテアーゼによる切断により、前記ＸＴＥＮ配列から前記ＧＬＰ−２配列が放出され、放出された前記ＧＬＰ−２配列が、切断されていない前記融合タンパク質と比較して少なくとも約３０％の受容体結合活性の増大を示す、前記請求項のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 １つまたは複数の延長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）と融合したＧＬＰ−２を含む融合タンパク質を作製する方法であって、 （ａ）請求項１〜４２のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする組換え核酸を含む宿主細胞を提供するステップと、 （ｂ）前記宿主細胞を、前記融合タンパク質の発現を可能にする条件下で培養するステップと、 （ｃ）前記融合タンパク質を回収するステップとを含む、方法。 （ａ）前記宿主細胞が原核細胞である、または （ｂ）前記融合タンパク質を、前記宿主細胞の細胞質から実質的に可溶性の形態で回収する、請求項４３に記載の方法。 前記組換え核酸分子が、最適にアラインメントすると、表１３に記載のＤＮＡ配列からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する配列、またはその相補配列を有する、請求項４３に記載の方法。 （ａ）表１３から選択されるＤＮＡ配列に対して少なくとも７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸配列、またはその相補配列、または （ｂ）請求項１〜４２のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはその相補配列を含む単離された核酸。 請求項４３から４６のいずれか一項に記載の核酸を含む発現ベクターまたは単離された宿主細胞。 請求項４７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。 請求項１〜４２のいずれか一項に記載の融合タンパク質、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。 式Ｖ：（ＧＬＰ−２）−（Ｓ）ｘ−（ＸＴＥＮ）（Ｖ）に従って構成された、請求項１に記載の組換え融合タンパク質であって、 式中、各出現に対してそれぞれ独立に、 ＧＬＰ−２は、最適にアラインメントすると、表１の配列からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する配列であり、 Ｓは、表６の切断配列または制限部位と適合するアミノ酸を場合によって含んでよい、１〜約５０アミノ酸残基を有するスペーサー配列であり、 ｘは０または１のいずれかである、組換え融合タンパク質。 前記ＧＬＰ−２がヒトＧＬＰ−２を含む、請求項５０に記載の組換え融合タンパク質。 前記ＧＬＰ−２が、ウシＧＬＰ−２、ブタＧＬＰ−２、ヒツジＧＬＰ−２、ニワトリＧＬＰ−２、およびイヌＧＬＰ−２からなる群より選択される、請求項５０に記載の組換え融合タンパク質。 前記ＧＬＰ−２がＡｌａ２の代わりにアミノ酸置換を有し、前記置換がグリシンである、請求項５１または５２に記載の組換え融合タンパク質。 前記ＧＬＰ−２が配列ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤを有する、請求項５０に記載の組換え融合タンパク質。 グリシン残基を含むスペーサー配列を含む、請求項５０から５４のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 前記ＸＴＥＮが、最適にアラインメントすると、表４、表８、表９、表１０、表１１、および表１２のいずれか１つから選択される同等の長さの配列と比較して少なくとも９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する、請求項５０から５５のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 前記ＸＴＥＮが、最適にアラインメントすると、表４のＡＥ８６４配列と比較して少なくとも９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する、請求項５０から５５のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 胃腸の状態を有する被験体に治療有効量の前記医薬組成物を投与することにより、前記ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２を被験体に同等量で投与することと比較して、前記融合タンパク質の血中濃度が少なくとも３倍長く前記融合タンパク質の治療域内で維持される、請求項４９に記載の医薬組成物。 胃腸の状態を有する被験体に、治療有効用量レジメンを用いて３回またはそれより多い用量の前記医薬組成物を投与することにより、前記ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２を被験体に同等の用量レジメンを用いて投与することと比較して、前記融合タンパク質の血中レベルについての少なくとも２つの連続したＣｍａｘピークおよび／またはＣｍｉｎトラフ間の時間が少なくとも４倍増大する、請求項４９に記載の医薬組成物。 前記胃腸の状態が、胃炎、消化障害、吸収不良症候群、短消化管症候群、短腸症候群、盲管症候群、炎症性腸疾患、小児脂肪便症、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症性スプルー、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸炎、化学療法誘導性腸炎、過敏性腸症候群、小腸損傷、癌化学療法に起因する小腸損傷、胃腸傷害、下痢性疾患、腸管機能不全症、酸誘導性腸管傷害、アルギニン欠乏症、特発性精液減少症、肥満症、異化疾病、発熱性好中球減少症、糖尿病、肥満症、脂肪便、自己免疫疾患、食物アレルギー、低血糖症、胃腸関門障害、敗血症、細菌性腹膜炎、熱傷誘導性腸管損傷、胃腸運動の低下、腸管不全症、化学療法に付随する菌血症、腸管外傷、腸管虚血、腸間膜虚血、栄養失調、壊死性腸炎、壊死性膵炎、新生児哺乳不耐性、ＮＳＡＩＤ誘導性胃腸損傷、栄養不足、胃腸管に対する完全非経口栄養による損傷、新生児栄養不足、放射線誘導性腸炎、放射線によって誘導される腸への傷害、粘膜炎、回腸嚢炎、および胃腸虚血からなる群より選択される請求項５９または６０に記載の医薬組成物。 少なくとも約５ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約２５ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約２００ｎｍｏｌ／ｋｇの前記融合タンパク質を含む前記医薬組成物を被験体に静脈内投与、皮下投与、または筋肉内投与した後、前記融合タンパク質の血中レベルが少なくとも７２時間にわたって１０００ｎｇ／ｍｌ超で維持される、請求項４９に記載の医薬組成物。 前記被験体がマウス、ラット、サルおよびヒトから選択される、請求項６１に記載の医薬組成物。 胃腸の状態を処置するための医薬品の製造において使用するための、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 前記胃腸の状態が、胃炎、消化障害、吸収不良症候群、短消化管症候群、短腸症候群、盲管症候群、炎症性腸疾患、小児脂肪便症、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症性スプルー、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸炎、化学療法誘導性腸炎、過敏性腸症候群、小腸損傷、癌化学療法に起因する小腸損傷、胃腸傷害、下痢性疾患、腸管機能不全症、酸誘導性腸管傷害、アルギニン欠乏症、特発性精液減少症、肥満症、異化疾病、発熱性好中球減少症、糖尿病、肥満症、脂肪便、自己免疫疾患、食物アレルギー、低血糖症、胃腸関門障害、敗血症、細菌性腹膜炎、熱傷誘導性腸管損傷、胃腸運動の低下、腸管不全症、化学療法に付随する菌血症、腸管外傷、腸管虚血、腸間膜虚血、栄養失調、壊死性腸炎、壊死性膵炎、新生児哺乳不耐性、ＮＳＡＩＤ誘導性胃腸損傷、栄養不足、胃腸管に対する完全非経口栄養による損傷、新生児栄養不足、放射線誘導性腸炎、放射線によって誘導される腸への傷害、粘膜炎、回腸嚢炎、および胃腸虚血からなる群より選択される、請求項６３に記載の組換え融合タンパク質。 被験体に治療有効量の融合タンパク質を投与することを含む、前記被験体における胃腸の状態を処置する方法において使用するための、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 前記胃腸の状態が、胃炎、消化障害、吸収不良症候群、短消化管症候群、短腸症候群、盲管症候群、炎症性腸疾患、小児脂肪便症、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症性スプルー、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸炎、化学療法誘導性腸炎、過敏性腸症候群、小腸損傷、癌化学療法に起因する小腸損傷、胃腸傷害、下痢性疾患、腸管機能不全症、酸誘導性腸管傷害、アルギニン欠乏症、特発性精液減少症、肥満症、異化疾病、発熱性好中球減少症、糖尿病、肥満症、脂肪便、自己免疫疾患、食物アレルギー、低血糖症、胃腸関門障害、敗血症、細菌性腹膜炎、熱傷誘導性腸管損傷、胃腸運動の低下、腸管不全症、化学療法に付随する菌血症、腸管外傷、腸管虚血、腸間膜虚血、栄養失調、壊死性腸炎、壊死性膵炎、新生児哺乳不耐性、ＮＳＡＩＤ誘導性胃腸損傷、栄養不足、胃腸管に対する完全非経口栄養による損傷、新生児栄養不足、放射線誘導性腸炎、放射線によって誘導される腸への傷害、粘膜炎、回腸嚢炎、および胃腸虚血からなる群より選択される、請求項６５に記載の使用のための組換え融合タンパク質。 被験体に、治療有効用量レジメンを用いて２回またはそれより多くの連続用量の前記融合タンパク質を投与することにより、ＧＬＰ−２に対して確立された治療有効用量レジメンを用いて投与した、ＸＴＥＮが欠如している対応するＧＬＰ−２と比較して前記融合タンパク質の血中レベルについての連続したＣｍａｘピークおよび／またはＣｍｉｎトラフの間の時間が延長される、請求項６５に記載の使用のための組換え融合タンパク質。 ＸＴＥＮが欠如している対応するＧＬＰ−２をその他の点では等価な用量レジメンの下で被験体に投与することと比較して、ｎｍｏｌ／ｋｇ単位でより少量の前記融合タンパク質を被験体に投与し、前記融合タンパク質により前記ＸＴＥＮが欠如している対応するＧＬＰ−２と同等の治療効果が達成される、請求項６５に記載の使用のための組換え融合タンパク質。 前記治療効果が、ＧＬＰ−２の血中濃度、腸間膜血流の増大、炎症の減少、体重増加の増大、下痢の減少、糞便の湿重量の減少、腸の創傷治癒、血漿シトルリン濃度の上昇、ＣＲＰレベルの低下、ステロイド療法の必要性の減少、粘膜完全性の増強または刺激、ナトリウム損失の減少、腸内への細菌のトランスロケーションの最小化、緩和、または予防、外科手術後の腸の回復の増強、刺激または加速、炎症性腸疾患の再発の予防、およびエネルギー恒常性の維持からなる群より選択される、請求項６８に記載の使用のための組換え融合タンパク質。 被験体における胃腸の状態を処置するための、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物を含む医薬レジメンにおいて使用するための組換え融合タンパク質。 前記医薬レジメンが、前記被験体における治療効果を達成するために必要な医薬組成物の量を決定するステップをさらに含み、前記治療効果が、腸間膜血流の増大、炎症の減少、体重増加の増大、下痢の減少、糞便の湿重量の減少、腸の創傷治癒、血漿シトルリン濃度の上昇、ＣＲＰレベルの低下、ステロイド療法の必要性の減少、粘膜完全性の増強、ナトリウム損失の減少、腸内への細菌のトランスロケーションの予防、外科手術後の腸の回復の加速、炎症性腸疾患の再発の予防、およびエネルギー恒常性の維持からなる群より選択される、請求項７０に記載の組換え融合タンパク質。 前記胃腸の状態が、胃炎、消化障害、吸収不良症候群、短消化管症候群、短腸症候群、盲管症候群、炎症性腸疾患、小児脂肪便症、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症性スプルー、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸炎、化学療法誘導性腸炎、過敏性腸症候群、小腸損傷、癌化学療法に起因する小腸損傷、胃腸傷害、下痢性疾患、腸管機能不全症、酸誘導性腸管傷害、アルギニン欠乏症、特発性精液減少症、肥満症、異化疾病、発熱性好中球減少症、糖尿病、肥満症、脂肪便、自己免疫疾患、食物アレルギー、低血糖症、胃腸関門障害、敗血症、細菌性腹膜炎、熱傷誘導性腸管損傷、胃腸運動の低下、腸管不全症、化学療法に付随する菌血症、腸管外傷、腸管虚血、腸間膜虚血、栄養失調、壊死性腸炎、壊死性膵炎、新生児哺乳不耐性、ＮＳＡＩＤ誘導性胃腸損傷、栄養不足、胃腸管に対する完全非経口栄養による損傷、新生児栄養不足、放射線誘導性腸炎、放射線によって誘導される腸への傷害、粘膜炎、回腸嚢炎、および胃腸虚血からなる群より選択される、請求項７０に記載の組換え融合タンパク質。 胃腸の状態を有する被験体を処置するための前記医薬レジメンが、有効量での２回またはそれより多い連続用量の前記医薬組成物を前記被験体に投与することを含み、前記投与により、同等のｎｍｏｌ／ｋｇ量を使用して投与した、ＸＴＥＮと連結していないＧＬＰ−２と比較して、前記胃腸の状態に関連する少なくとも１つ、２つ、または３つのパラメータが少なくとも５％、または１０％、または２０％、または３０％、または４０％、または５０％、または６０％、または７０％、または８０％、または９０％大きく改善される、請求項７０に記載の組換え融合タンパク質。 改善される前記パラメータがＧＬＰ−２の血中濃度の上昇、腸間膜血流の増大、炎症の減少、体重増加の増大、下痢の減少、糞便の湿重量の減少、腸の創傷治癒、血漿シトルリン濃度の上昇、ＣＲＰレベルの低下、ステロイド療法の必要性の減少、粘膜完全性の増強、ナトリウム損失の減少、腸内への細菌のトランスロケーションの予防、外科手術後の腸の回復の加速、炎症性腸疾患の再発の予防、およびエネルギー恒常性の維持から選択される、請求項７３に記載の組換え融合タンパク質。 前記レジメンが、治療有効量の請求項４９に記載の医薬組成物を７日、または１０日、または１４日、または２１日、または２８日またはそれより多い日数ごとに１回投与することを含む、請求項７０に記載の組換え融合タンパク質。 前記有効量が少なくとも約５ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約２５ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約２００ｎｍｏｌ／ｋｇである、請求項７５に記載の組換え融合タンパク質。 前記投与が皮下投与、筋肉内投与、または静脈内投与である、請求項７３から７６のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。 被験体における胃腸の状態を処置する方法であって、前記被験体に、請求項４９に記載の医薬組成物を有効量で含む組成物を投与することを含む、方法。 前記有効量が少なくとも約５ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約２５ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約２００ｎｍｏｌ／ｋｇである、請求項７８に記載の方法。 前記融合タンパク質が前記被験体において約３０時間超の終末相半減期を示す、請求項７９に記載の方法。 前記胃腸の状態が、胃炎、消化障害、吸収不良症候群、短消化管症候群、短腸症候群、盲管症候群、炎症性腸疾患、小児脂肪便症、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症性スプルー、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸炎、化学療法誘導性腸炎、過敏性腸症候群、小腸損傷、癌化学療法に起因する小腸損傷、胃腸傷害、下痢性疾患、腸管機能不全症、酸誘導性腸管傷害、アルギニン欠乏症、特発性精液減少症、肥満症、異化疾病、発熱性好中球減少症、糖尿病、肥満症、脂肪便、自己免疫疾患、食物アレルギー、低血糖症、胃腸関門障害、敗血症、細菌性腹膜炎、熱傷誘導性腸管損傷、胃腸運動の低下、腸管不全症、化学療法に付随する菌血症、腸管外傷、腸管虚血、腸間膜虚血、栄養失調、壊死性腸炎、壊死性膵炎、新生児哺乳不耐性、ＮＳＡＩＤ誘導性胃腸損傷、栄養不足、胃腸管に対する完全非経口栄養による損傷、新生児栄養不足、放射線誘導性腸炎、放射線によって誘導される腸への傷害、粘膜炎、回腸嚢炎、および胃腸虚血からなる群より選択される、請求項７８から８０のいずれか一項に記載の方法。 前記胃腸の状態がクローン病である、請求項８１に記載の方法。 前記被験体が、マウス、ラット、サル、およびヒトからなる群より選択される、請求項７８から８２のいずれか一項に記載の方法。 前記投与が皮下投与、筋肉内投与、または静脈内投与である、請求項７８から８３のいずれか一項に記載の方法。 前記投与により、前記被験体において腸栄養効果がもたらされる、請求項７８から８４のいずれか一項に記載の方法。 前記腸栄養効果が、同等の用量を用いて被験体に投与した、ＸＴＥＮと連結していない対応するＧＬＰ−２と比較して少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％または少なくとも約１２０％または少なくとも約１５０％または少なくとも約２００％の腸栄養効果である、請求項８５に記載の方法。 前記腸栄養効果が、１用量、または３用量、または６用量、または１０用量、または１２用量またはそれより多くの用量の前記融合タンパク質を投与した後に決定される、請求項８５または８６に記載の方法。 前記腸栄養効果が、腸の成長、絨毛上皮の肥厚の増大、陰窩の細胞の増殖の増大、陰窩および絨毛軸の高さの増大、腸吻合後の治癒の増大、小腸の重量の増大、小腸の長さの増大、小腸上皮アポトーシスの減少、および腸機能の増強からなる群より選択される、請求項８５〜８７のいずれか一項に記載の方法。 請求項１〜４２のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物を含む包装材料および少なくとも第１の容器、ならびに前記医薬組成物を再構成し、かつ／または前記医薬組成物を被験体に投与するための説明書を含む、キット。 本発明は、延長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）と連結したＧＬＰ−２タンパク質またはその変異形を含む組成物、組成物をコードする単離された核酸およびベクターならびにそれを含有する宿主細胞、ならびにＧＬＰ−２に関連する状態の処置におけるそのような組成物の作出および使用方法に関する。このＸＴＥＮは、一般には、生じる融合タンパク質の性質が増強されるという点でＧＬＰ−２ペプチドに対する融合パートナーとして有用な非反復配列および非構造化コンフォメーションを有するポリペプチドである。 20140731A16330配列表1配列表

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