生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公表特許公報(A)_ＲＮＡ分子の送達のための有用なＮ：Ｐ比を有するリポソーム |
| 出願番号： | 2014519084 |
| 年次： | 2014 |
| IPC分類： | A61K 39/00,A61K 9/127,A61P 37/04,A61K 47/44 |
特許情報キャッシュ
ジアール， アンドリュー ベルマ， アユシュ JP 2014520806 公表特許公報(A) 20140825 2014519084 20120706 ＲＮＡ分子の送達のための有用なＮ：Ｐ比を有するリポソーム ノバルティス アーゲー 504389991 山本 秀策 100078282 森下 夏樹 100113413 ジアール， アンドリュー ベルマ， アユシュ US 61/505,088 20110706 A61K 39/00 20060101AFI20140730BHJP A61K 9/127 20060101ALI20140730BHJP A61P 37/04 20060101ALI20140730BHJP A61K 47/44 20060101ALI20140730BHJP JPA61K39/00 GA61K39/00 HA61K9/127A61P37/04A61K47/44 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KM,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC,VN,ZA US2012045829 20120706 WO2013006825 20130110 34 20140221 4C076 4C085 4C076AA19 4C076AA95 4C076CC06 4C076EE23 4C076EE51 4C076FF34 4C085AA03 4C085BA57 4C085EE01 4C085EE07 本出願は、米国仮出願第６１／５０５，０８８号（２０１１年７月６日出願）の利益を主張し、上記米国仮出願の全内容は、全ての目的のために、参考として本明細書に援用される。 （技術分野） 本発明は、免疫化のためのＲＮＡの非ウイルス性送達の分野にある。 （背景技術） 動物を免疫化するための核酸の送達は、数年間にわたり目標であった。種々のアプローチが、試験されてきており、それらとしては、ＤＮＡもしくはＲＮＡの使用、ウイルスもしくは非ウイルス性送達ビヒクルの使用（またはさらには「裸の」ワクチンにおいて、送達ビヒクルなし）、複製もしくは非複製ベクターの使用、またはウイルスもしくは非ウイルス性ベクターの使用が挙げられる。 さらなる改善された核酸ワクチン、特に、核酸ワクチンの送達の改善された方法への必要性が存在している。 （発明の開示） 本発明に従って、核酸免疫化は、カチオン性脂質を含むリポソーム内に被包されたＲＮＡを送達することによって達成され、リポソームおよびＲＮＡが、１：１〜２０：１のＮ：Ｐ比を有する。「Ｎ：Ｐ比」は、カチオン性脂質中の窒素原子の、ＲＮＡ中のホスフェートに対するモル比を指す。リポソームは、脊椎動物細胞への、ＲＮＡのインビボ送達に有用である。 従って、本発明は、ＲＮＡが被包されたリポソームであって、リポソームが、カチオン性脂質を含み、ＲＮＡが、免疫原をコードし、リポソームおよびＲＮＡが、１：１〜２０：１のＮ：Ｐ比を有する、リポソームを提供する。 本発明はまた、免疫原をコードするＲＮＡを被包するリポソームを調製するためのプロセスであって、リポソームが、免疫原をコードするＲＮＡとリポソーム形成成分とを混合することによって形成され、リポソーム形成成分が、カチオン性脂質を含み、カチオン性脂質およびＲＮＡが、１：１〜２０：１のＮ：Ｐ比で混合される、プロセスを提供する。 （リポソーム） 種々の両親媒性脂質は、水性環境中で二重層を形成して、ＲＮＡ含有水性コアを、リポソームとして被包し得る。これら脂質は、アニオン性、カチオン性もしくは両性イオン性の親水性頭部（ｈｅａｄ ｇｒｏｕｐ）を有し得る。アニオン性リン脂質からのリポソームの形成は、１９６０年代にさかのぼり、カチオン性リポソーム形成脂質は、１９９０年代以来研究されてきた。あるリン脂質はアニオン性であるのに対して、他のものは両性イオン性であり、そして他のものはカチオン性である。リン脂質の適切なクラスとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、およびホスファチジルグリセロール。そしていくつかの有用なリン脂質は、表１に列挙される。有用なカチオン性脂質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎジメチル−３−アミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）。両性イオン性脂質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アシル両性イオン性脂質およびエーテル両性イオン性脂質。有用な両性イオン性脂質の例は、以下である：ＤＰＰＣ、ＤＯＰＣおよびドデシルホスホコリン。上記脂質は、飽和であってもよいし、不飽和であってもよい。リポソームを調製するための少なくとも１種の不飽和脂質の使用が好ましい。不飽和脂質が２つのテールを有する場合、両方のテールが不飽和であり得、またはそれは、１つの飽和テールおよび１つの不飽和テールを有し得る。 本発明のリポソーム粒子は、単一の脂質または脂質の混合物から形成することができる。ただし、少なくとも１つのカチオン性脂質が、使用されることとする。混合物が使用される場合、それは、飽和脂質および不飽和脂質の両方を含んでいてもよい。例えば、本発明により有用な混合物は、ＤｌｉｎＤＭＡ（カチオン性、不飽和）、ＤＳＰＣ（両性イオン性、飽和）、および／またはＤＭＧ（アニオン性、飽和）を含んでいてもよい。脂質の混合物が使用される場合、混合物中の成分脂質のすべてが、荷電する必要があるとは限らず、例えば、カチオン性脂質をはじめとする１つ以上の両親媒性脂質を、コレステロールと混合することができる。 本発明のリポソーム粒子は、その頭部が、プロトン化することができる少なくとも１つの窒素原子を含む、少なくとも１つのカチオン性脂質を含む。リポソームにおいてプロトン化することができる、これらの脂質窒素原子の数は、本明細書において使用される「Ｎ：Ｐ比」に寄与する。 好ましいカチオン性脂質は、５．０〜７．６の範囲のｐＫａを有するプロトン化可能な（ｐｒｏｔｏｎａｔａｂｌｅ）窒素を有する。理想的には、この範囲のｐＫａを有する脂質は、第３級アミンを有し、そのような脂質は、第４級アミン基を有するＤＯＴＡＰまたはＤＣ−Ｃｈｏｌなどのような脂質とは異なって挙動する。生理的なｐＨでは、５．０〜７．６の範囲のｐＫａを有するアミンは、中性のまたは低下した表面電荷を有するのに対して、ＤＯＴＡＰなどのような脂質は、強くカチオン性である。本発明者らは、第４級アミン脂質（例えばＤＯＴＡＰ）から形成されるリポソームが、第３級アミン脂質（例えばＤＬｉｎＤＭＡ）から形成されるリポソームほどには、免疫原をコードするＲＮＡの送達に適切でないことを見出した。 このｐＫａ範囲内で、好ましい脂質は、５．５〜６．７、例えば５．６〜６．８、５．６〜６．３、５．６〜６．０、５．５〜６．２、または５．７〜５．９のｐＫａを有する。ｐＫａは、脂質が完全に荷電しているポイントと脂質が完全に荷電していないポイントとの中間に位置する、脂質の５０％が荷電しているｐＨである。それは、様々な方法において測定することができるが、好ましくは、「ｐＫａ測定」と題するセクションにおいて下記に開示される方法を使用して測定される。ｐＫａは、典型的に、他の脂質をも含む混合物の状況における脂質についてではなく（例えば、個々の脂質のものではなくＳＮＡＬＰのｐＫａを調べる参考文献５において実行されるようにではなく）、脂質のみについて測定されるべきである。 この範囲のｐＫａを有する好ましい脂質は、第３級アミンを有する。例えば、それらは、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ；ｐＫａ５．８）および／または１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）を含んでいてもよい。第３級アミンを有する他の適切な脂質は、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎジメチル−３−アミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）である。参考文献１を参照されたい。参考文献３のある種のアミノ脂質を使用することができるように、参考文献２のアミノ酸脂質のうちのいくつかもまた、使用されてもよい。それらの頭部において第３級アミンを有するさらなる有用な脂質は、参考文献４において開示され、この全内容が、参考として本明細書に援用される。 脂質の親水性部分は、ペグ化する（つまり、ポリエチレングリコールの共有結合によって修飾する）ことができる。この修飾は、安定性を増大させ、リポソームの非特異的吸着を妨げることができる。例えば、脂質は、参考文献１および５において開示されるものなどのような技術を使用して、ＰＥＧに結合体化することができる。例えば０．５〜８ｋＤａの様々な長さのＰＥＧを、使用することができる。 リポソームが脂質の混合物から形成される場合、プロトン化可能な窒素を有するそれらの脂質の割合が、脂質の総量の２０〜８０％、例えば３０〜７０％または４０〜６０％とすべきであることが好ましい。脂質含量の残りは、例えばコレステロール（例えば３５〜５０％コレステロール）および／またはＤＭＧ（場合によりペグ化）および／またはＤＳＰＣからなるものとすることができる。そのような混合物は、下記に使用される。これらの％値は、モル百分率である。ＤＳＰＣ、ＤｌｉｎＤＭＡ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、およびコレステロールの混合物は、実施例において使用される。 リポソーム粒子は、通常、３つの群に分けられる：多層小胞（ＭＬＶ）；小さな単層小胞（ＳＵＶ）；および大きな単層小胞（ＬＵＶ）。ＭＬＶは、各小胞において複数の二重層を有し、いくつかの別個の水性区画を形成する。ＳＵＶおよびＬＵＶは、水性コアを被包する単一の二重層を有する；ＳＵＶは、代表的には、直径≦５０ｎｍを有し、ＬＵＶは、直径＞５０ｎｍを有する。本発明のリポソーム粒子は、理想的には、５０〜２２０ｎｍの範囲の直径を有するＬＵＶである。異なる直径を有するＬＵＶの集団を含む組成物については、（ｉ）数でいって少なくとも８０％は、２０〜２２０ｎｍの範囲の直径を有するべきである、（ｉｉ）集団の平均直径（Ｚａｖ、強度による）は、理想的には、４０〜２００ｎｍの範囲にある、および／または（ｉｉｉ）直径は、多分散指数＜０．２を有するべきである。 脂質ＤＬｉｎＤＭＡは、本明細書においてＲＶ０１と呼ばれることがある。これは、本発明での使用に好ましいカチオン性脂質であるが、いくつかの実施形態において、リポソームは、ＤＬｉｎＤＭＡを含まない。 参考文献４において開示される別の有用な脂質は、本明細書においてＲＶ０５と呼ばれることがある。 脂質ＤＯＴＡＰは、本明細書においてＲＶ１３と呼ばれることがあるが、それは、好ましい脂質ではない。 （混合プロセス） 適切なリポソームを調製するための技術は、当該分野で周知である（例えば、参考文献６〜８を参照のこと）。１つの有用な方法は、参考文献９に記載され、（ｉ）上記脂質のエタノール性溶液、（ｉｉ）上記核酸の水性溶液、および（ｉｉｉ）緩衝液を混合する工程、その後の、混合、平衡化、希釈および精製を包含する。好ましい本発明のリポソームは、この混合プロセスによって得られ得る。 ＲＮＡ含有リポソームを調製するための有用なプロセスは、（ａ）脂質のｐＫａ未満であるが、４．５を上回るｐＨでＲＮＡと脂質とを混合する工程、次いで、（ｂ）脂質のｐＫａを上回るまでｐＨを上昇させる工程を含む。従って、カチオン性脂質は、工程（ａ）においてリポソーム形成の間に正に荷電するが、その後のｐＨ変化は、正に荷電した基の大多数（またはすべて）が、中性になることを意味する。このプロセスは、本発明のリポソームを調製するのに有利であり、工程（ａ）中の４．５未満のｐＨを回避することによって、被包されたＲＮＡの安定性が改善される。 工程（ａ）におけるｐＨは、４．５を上回り、理想的には４．８を上回る。５．０〜６．０の範囲、または５．０〜５．５の範囲のｐＨを使用することにより、適切なリポソームをもたらすことができる。 工程（ｂ）における上昇したｐＨは、脂質のｐＫａを上回る。ｐＨは、理想的には、９未満、好ましくは８未満のｐＨまで上昇させられる。脂質のｐＫａに応じて、工程（ｂ）におけるｐＨは、従って、６〜８の範囲内まで、例えばｐＨ６．５±０．３まで上昇させてもよい。工程（ｂ）のｐＨ上昇は、適切な緩衝液、例えばリン酸緩衝食塩水の中にリポソームを移すことによって達成することができる。工程（ｂ）のｐＨ上昇は、理想的には、リポソーム形成が起こった後に実行される。 工程（ａ）において使用されるＲＮＡは、脂質の有機溶液（例えば、参考文献９におけるような、エタノール性溶液）と混合するために、水性溶液中のものとすることができる。混合物は、次いで、リポソームを形成するように希釈することができ、その後、ｐＨを、工程（ｂ）において上昇させることができる。 （ＲＮＡ） 本発明のリポソームは、免疫原をコードするＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡとは異なる）を含む。上記リポソームのインビボ投与後、ＲＮＡは、放出され、上記免疫原をインサイチュで提供するように、細胞の中で翻訳される。 上記ＲＮＡは、プラス鎖であるので、いかなる介在複製工程（例えば、逆転写）をも必要とすることなく、翻訳され得る。好ましいプラス鎖ＲＮＡは、参考文献１０とは異なり、自己複製性である。自己複製ＲＮＡ分子（レプリコン）は、あらゆるタンパク質なしで細胞に送達される場合でも、上記自己複製ＲＮＡ分子自体からの転写によって（上記自己複製ＲＮＡ分子自体から生成するアンチセンスコピーを介して）、複数の娘ＲＮＡの生成をもたらし得る。自己複製ＲＮＡ分子は、従って、代表的には、細胞へ送達された後に直接翻訳され得るプラス鎖分子であり、この翻訳は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを提供し、次いで、これは、上記送達されたＲＮＡからアンチセンス転写物およびセンス転写物の両方を生成する。従って、上記送達されたＲＮＡは、複数の娘ＲＮＡの生成をもたらす。これら娘ＲＮＡ、ならびに同一線上（ｃｏｌｌｉｎｅａｒ）のサブゲノム転写物は、それ自体が翻訳されて、コードされた免疫原のインサイチュ発現を提供し得るか、または転写されて、上記送達されたＲＮＡと同じセンスのさらなる転写物（上記免疫原のインサイチュ発現を提供するように翻訳される）を提供し得る。この一連の転写の全体的な結果は、上記導入されたレプリコンＲＮＡの数における非常に多くの増幅であり、よって、上記コードされた免疫原は、上記細胞の主なポリペプチド生成物になる。 このようにして自己複製を達成するための１つの適切なシステムは、アルファウイルスベースのレプリコンを使用することである。これらのレプリコンは、細胞への送達後に、レプリカーゼ（もしくはレプリカーゼ−転写酵素）の翻訳をもたらすプラス鎖ＲＮＡである。上記レプリカーゼは、上記送達されたプラス鎖ＲＮＡのゲノムマイナス鎖コピーを作り出す複製複合体を提供するように自己切断するポリプロテインとして翻訳される。これらマイナス鎖転写物は、これ自体が、上記プラス鎖親ＲＮＡのさらなるコピーを与え、そしてまた、免疫原をコードするサブゲノム転写物を与えるように転写され得る。従って、上記サブゲノム転写物の翻訳は、上記感染した細胞による上記免疫原のインサイチュ発現をもたらす。適切なアルファウイルスレプリコンは、シンドビス・ウイルス、セムリキ森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスなどに由来するレプリカーゼを使用し得る。変異型ウイルスもしくは野生型ウイルスの配列が使用され得る（例えば、ＶＥＥＶの弱毒化ＴＣ８３変異体は、レプリコンにおいて使用されてきた［１１］）。 好ましい自己複製ＲＮＡ分子は、従って、（ｉ）上記自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写し得るＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、および（ｉｉ）免疫原をコードする。上記ポリメラーゼは、アルファウイルスレプリカーゼ（例えば、アルファウイルスタンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４のうちの１種以上を含む）であり得る。 天然のアルファウイルスゲノムが、上記非構造レプリカーゼポリプロテインに加えて、構造的ビリオンタンパク質をコードするのに対して、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルス構造タンパク質をコードしないことが好ましい。従って、好ましい自己複製ＲＮＡは、細胞においてそれ自体のゲノムＲＮＡコピーの生成をもたらし得るが、ＲＮＡ含有ビリオンの生成はもたらさない。これらのビリオンを生成できないことは、野生型アルファウイルスとは異なり、上記自己複製ＲＮＡ分子が、感染性形態においてそれ自体を永続させられないことを意味する。野生型ウイルスにおいて永続に必要な上記アルファウイルス構造タンパク質は、本発明の自己複製ＲＮＡには存在せず、それらの位置は、上記目的の免疫原をコードする遺伝子によってしめられている。その結果、上記サブゲノム転写物は、上記構造的アルファウイルスビリオンタンパク質ではなく、上記免疫原をコードする。 従って、本発明で有用な自己複製ＲＮＡ分子は、２個のオープンリーディングフレームを有し得る。第１の（５’側）オープンリーディングフレームは、レプリカーゼをコードし；第２の（３’側）オープンリーディングフレームは、免疫原をコードする。いくつかの実施形態において、上記ＲＮＡは、例えば、さらなる免疫原（以下を参照のこと）をコードするために、もしくは補助ポリペプチドをコードするために、さらなる（例えば、下流の）オープンリーディングフレームを有し得る。 好ましい自己複製ＲＮＡ分子は、５’キャップ（例えば７−メチルグアノシン）を有する。このキャップは、ＲＮＡのインビボ翻訳を増強することができる。いくつかの実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子の５’配列が、コードされたレプリカーゼとの適合性を確実にするように選択されなければならない。 自己複製ＲＮＡ分子は、３’ポリＡテールを有していてもよい。それはまた、その３’末端の近くにポリＡポリメラーゼ認識配列（例えばＡＡＵＡＡＡ）を含んでいてもよい。 自己複製ＲＮＡ分子は、種々の長さを有し得るが、それらは、代表的には、５０００〜２５０００ヌクレオチド長（例えば、８０００〜１５０００ヌクレオチド、もしくは９０００〜１２０００ヌクレオチド）である。従って、上記ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ送達において認められるものより長い。 自己複製ＲＮＡ分子は、代表的には、一本鎖である。一本鎖ＲＮＡは、一般に、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＲＮＡヘリカーゼおよび／もしくはＰＫＲへの結合によって、アジュバント効果を開始し得る。二本鎖形態において送達されるＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、ＴＬＲ３に結合し得、このレセプターはまた、一本鎖ＲＮＡの複製の間もしくは一本鎖ＲＮＡの二次構造内のいずれかで形成されるｄｓＲＮＡによって誘発され得る。 自己複製ＲＮＡ分子は、インビトロ転写（ＩＶＴ）によって便利に調製され得る。ＩＶＴは、細菌においてプラスミド形態において作られ、増やされたか、または合成で作製された（例えば、遺伝子合成および／もしくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）操作法によって）（ｃＤＮＡ）テンプレートを使用し得る。例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、バクテリオファージＴ７、Ｔ３もしくはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）は、ＤＮＡテンプレートから自己複製ＲＮＡを転写するために使用され得る。適切なキャッピングおよびポリＡ付加反応は、必要時に使用され得る（しかし、上記レプリコンのポリＡは、通常、上記ＤＮＡテンプレート内にコードされる）。これらＲＮＡポリメラーゼは、転写される５’ヌクレオチドについてストリンジェントな要件を有し得、いくつかの実施形態において、これらの要件は、上記ＩＶＴ転写ＲＮＡが、自己がコードするレプリカーゼの基質として効率的に機能し得ることを確実にするために、上記コードされたレプリカーゼの要件とマッチしなければならない。 参考文献１２において考察されるように、上記自己複製ＲＮＡは、（任意の５’キャップ構造に加えて）改変された核酸塩基を有する１個以上のヌクレオチドを含み得る。例えば、自己複製ＲＮＡは、１つ以上の改変されたピリミジン核酸塩基（例えば、シュードウリジンおよび／もしくは５−メチルシトシン残基）を含み得る。しかし、いくつかの実施形態において、上記ＲＮＡは、改変された核酸塩基を含まず、改変されたヌクレオチドを含まなくてもよい（すなわち、上記ＲＮＡ中のヌクレオチドのすべては、標準的なＡ、Ｃ、ＧおよびＵというリボヌクレオチドである（任意の５’キャップ構造を除く。これは、７’−メチルグアノシンを含み得る））。他の実施形態において、上記ＲＮＡは、７’−メチルグアノシンを含む５’キャップを含み得、最初の１個、２個もしくは３個の５’リボヌクレオチドは、リボースの２’位においてメチル化され得る。 本発明で使用されるＲＮＡは、理想的には、ヌクレオチド間にホスホジエステル結合のみを含むが、いくつかの実施形態において、それは、ホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合、および／もしくはメチルホスホネート結合を含み得る。 理想的には、リポソームは、１０より少ない種の異なるＲＮＡ（例えば、異なる５種、４種、３種、もしくは２種）を含み；最も好ましくは、リポソームは、単一のＲＮＡ種を含み、すなわち、上記リポソーム中の全てのＲＮＡ分子は、同じ配列および同じ長さを有する。 （Ｎ：Ｐ比） 本発明は、１：１〜２０：１のＮ：Ｐ比を有するように調製されたリポソームを使用する。上述のように、「Ｎ：Ｐ比」は、リポソームのカチオン性脂質中の（典型的にもっぱら脂質の頭部中の）プロトン化可能な窒素原子の、ＲＮＡ中のホスフェートに対するモル比を指す。 有用なＮ：Ｐ比は、約２：１〜約１８：１、約４：１〜１６：１、約６：１〜約１４：１、約８：１〜約１２：１である。好ましいＮ：Ｐ比は、３：１〜１１：１である。下記に例証されるとおりの有用なＮ：Ｐ比は、２：１、４：１、８：１、および１０：１を含む。 下記に示されるように、Ｎ：Ｐ比は、免疫原性に影響を与えることができ、より小さい比、例えば８：１より小、７：１より小、６：１より小、５：１より小、または≦４：１、例えば２：１以上４：１以下が好ましい。 いくつかの実施形態では、Ｎ：Ｐ比が、７：１〜９：１ではない。いくつかの実施形態では、Ｎ：Ｐ比が、７．５：１〜８．５：１ではない。いくつかの実施形態では、Ｎ：Ｐ比が、８：１ではない。 Ｎ：Ｐ比は、リポソーム形成の間にカチオン性脂質およびＲＮＡの割合を変化させることによって修正することができる。これは、リポソーム形成成分の適切な組み合わせからのリポソームの形成の間に使用される水性物質中のＲＮＡ濃度を修正することによって最も便利に達成される。例えば、上述の方法において、水性溶液中のＲＮＡの濃度を変化させながらも、リポソーム形成脂質のエタノール性溶液を一定に維持することができる。より高いＲＮＡ濃度は、Ｎ：Ｐ比を減少させるのに対して、より低いＲＮＡ濃度は、Ｎ：Ｐ比を上昇させる。 ある目的のために、Ｎ：Ｐ比は、仮定に基づくものとすることができる。例えば、ＲＮＡ分子のμｇが、３ｎｍｏｌのアニオン性ホスフェートを含有すると仮定され、ＤｌｉｎＤＭＡのμｇがそれぞれ、１．６ｎｍｏｌのカチオン性窒素を含有すると仮定される場合、計算は、便宜上、単純化することができる。 （免疫原） 本発明で使用されるＲＮＡ分子は、ポリペプチド免疫原をコードする。上記リポソームの投与後に、上記免疫原は、インビボで翻訳され、レシピエントにおける免疫応答を誘発し得る。上記免疫原は、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物に対して（あるいは、いくつかの実施形態において、アレルゲンに対して；および他の実施形態において、腫瘍抗原に対して）免疫応答を誘発し得る。上記免疫応答は、抗体応答（通常は、ＩｇＧを含む）および／もしくは細胞媒介性免疫応答を含み得る。上記ポリペプチド免疫原は、代表的には、対応する細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物（またはアレルゲンもしくは腫瘍）ポリペプチドを認識する免疫応答を誘発するが、いくつかの実施形態において、上記ポリペプチドは、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物のサッカリドを認識する免疫応答を誘発するように、ミモトープとして作用し得る。上記免疫原は、代表的には、表面ポリペプチド（例えば、アドヘシン、ヘマグルチニン、エンベロープ糖タンパク質、スパイク糖タンパク質など）である。 ＲＮＡ分子は、単一のポリペプチド免疫原もしくは複数のポリペプチドをコードし得る。複数の免疫原は、単一のポリペプチド免疫原（融合ポリペプチド）として、または別個のポリペプチドとして提示され得る。免疫原が、別個のポリペプチドとして発現される場合、これらのうちの１種以上は、上流のＩＲＥＳもしくはさらなるウイルスプロモーターエレメントとともに提供され得る。あるいは、複数の免疫原は、短い自己触媒性プロテアーゼ（例えば、口蹄疫ウイルス２Ａタンパク質）に融合された個々の免疫原をコードするポリプロテインから、またはインテインとして発現され得る。 上記ＲＮＡは、免疫原をコードする。不確かさを避けるために、本発明は、ホタルルシフェラーゼをコードするＲＮＡ、Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼの融合タンパク質をコードするＲＮＡ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＲＮＡを含まない。また、上記ＲＮＡは、全マウス胸腺ＲＮＡではない。また、本発明は、分泌アルカリホスファターゼをコードするＲＮＡを包含しない。 いくつかの実施形態において、上記免疫原は、これら細菌のうちの１種に対して免疫応答を誘発する： Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ：有用な免疫原としては、膜タンパク質、例えば、アドヘシン、オートトランスポーター、毒素、鉄獲得タンパク質、およびＨ因子結合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。３種の有用なポリペプチドの組み合わせが、参考文献１３に開示される。 Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：有用なポリペプチド免疫原は、参考文献１４に開示される。これらとしては、ＲｒｇＢ線毛サブユニット、β−Ｎ−アセチル−ヘキソサミニダーゼ前駆体（ｓｐｒ００５７）、ｓｐｒ００９６、一般的なストレスタンパク質（ｇｅｎｅｒａｌ ｓｔｒｅｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）ＧＳＰ−７８１（ｓｐｒ２０２１、ＳＰ２２１６）、セリン／スレオニンキナーゼＳｔｋＰ（ＳＰ１７３２）、および肺炎球菌表面アドヘシンＰｓａＡが挙げられるが、これらに限定されない。 Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ：有用な免疫原としては、参考文献１５および１６に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。 Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ。 Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ：有用な百日咳免疫原としては、百日咳毒素もしくはトキソイド（ＰＴ）、線維状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）、ペルタクチン、ならびに凝集原２および３が挙げられるが、これらに限定されない。 Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ：有用な免疫原としては、参考文献１７に開示されるポリペプチド（例えば、溶血素、ｅｓｘＡ、ｅｓｘＢ、フェリクロム結合タンパク質（ｓｔａ００６）および／もしくはｓｔａ０１１リポプロテイン）が挙げられるが、これらに限定されない。 Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ：代表的な免疫原は、破傷風トキソイドである。 Ｃｏｒｎｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ：代表的な免疫原は、ジフテリアトキソイドである。 Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ：有用な免疫原としては、参考文献１８および１９に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ：有用な免疫原としては、参考文献１５に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。 Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ：有用な免疫原としては、ＰｅｐＡ、ＬｃｒＥ、ＡｒｔＪ、ＤｎａＫ、ＣＴ３９８、ＯｍｐＨ様、Ｌ７／Ｌ１２、ＯｍｃＡ、ＡｔｏＳ、ＣＴ５４７、Ｅｎｏ、ＨｔｒＡおよびＭｕｒＧ（例えば、参考文献２０に開示されるとおり）が挙げられるが、これらに限定されない。ＬｃｒＥ［２１］およびＨｔｒＡ［２２］は、２つの好ましい免疫原である。 Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：有用な免疫原としては、参考文献２３に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。 Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ：有用な免疫原としては、ＣａｇＡ、ＶａｃＡ、ＮＡＰ、および／もしくはウレアーゼ［２４］が挙げられるが、これらに限定されない。 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：有用な免疫原としては、腸毒素産生性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）、腸管凝集性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＡｇｇＥＣ）、分散接着性（ｄｉｆｆｕｓｅｌｙ ａｄｈｅｒｉｎｇ）Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＡＥＣ）、腸病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）、腸管外病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥｘＰＥＣ）および／もしくは腸管出血性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ）に由来する免疫原が挙げられるが、これらに限定されない。ＥｘＰＥＣ株としては、尿路病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＵＰＥＣ）および髄膜炎／敗血症関連Ｅ．ｃｏｌｉ（ＭＮＥＣ）が挙げられる。有用なＵＰＥＣポリペプチド免疫原は、参考文献２５および２６に開示される。有用なＭＮＥＣ免疫原は、参考文献２７に開示される。いくつかのＥ．ｃｏｌｉタイプに有用な免疫原は、ＡｃｆＤである［２８］。 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ：有用な免疫原としては、参考文献２９および３０に開示されるものが挙げられるが、これらに限定されない。 いくつかの実施形態において、上記免疫原は、これらウイルスのうちの１種に対して免疫応答を誘発する： オルソミクソウイルス：有用な免疫原は、インフルエンザＡ、ＢもしくはＣウイルスに由来し得る（例えば、ヘマグルチニン、ノイラミニダーゼもしくはマトリクスＭ２タンパク質）。上記免疫原がインフルエンザＡウイルスヘマグルチニンである場合、それは、任意のサブタイプ（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５もしくはＨ１６）に由来し得る。 パラミクソウイルス科のウイルス：ウイルス免疫原としては、肺炎ウイルス（例えば、ＲＳウイルス、ＲＳＶ）、ルブラウイルス（例えば、ムンプスウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、パラインフルエンザ・ウイルス）、メタニューモウイルスおよびモルビリウイルス（例えば、麻疹）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。しかし、一部の実施形態では、上記免疫原は、ＲＳＶタンパク質ではない。 ポックスウイルス科：ウイルス免疫原としては、オルトポックスウイルス（例えば、真正痘瘡（大痘瘡および小痘瘡が挙げられるが、これらに限定されない））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。 ピコルナウイルス：ウイルス免疫原としては、ピコルナウイルス（例えば、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパルナウイルス、カルジオウイルスおよびアフトウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、上記エンテロウイルスは、ポリオウイルス（例えば、１型、２型、および／もしくは３型のポリオウイルス）である。別の実施形態において、上記エンテロウイルスは、ＥＶ７１エンテロウイルスである。別の実施形態において、上記エンテロウイルスは、コクサッキーＡもしくはＢウイルスである。 ブンヤウイルス：ウイルス免疫原としては、オルソブンヤウイルス（例えば、カリフォルニア脳炎ウイルス）、フレボウイルス（例えば、リフトバレー熱ウイルス）、もしくはナイロウイルス（例えば、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。 ヘパルナウイルス：ウイルス免疫原としては、ヘパルナウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。 フィロウイルス：ウイルス免疫原としては、フィロウイルス（例えば、エボラウイルス（ザイールエボラウイルス、アイボリーコーストエボラウイルス、レストンエボラウイルスもしくはスーダンエボラウイルスを含む））またはマールブルグウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。 トガウイルス：ウイルス免疫原としては、トガウイルス（例えば、ルビウイルス、アルファウイルス、もしくはアルテリウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。これは、風疹ウイルスを含む。 フラビウイルス：ウイルス免疫原としては、フラビウイルス（例えば、ダニ媒介脳炎（ＴＢＥ）ウイルス、デング（１、２、３もしくは４型）ウイルス、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、キャサヌール森林ウイルス、ウエストナイル脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、ポワッサン脳炎ウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。 ペスチウイルス：ウイルス免疫原としては、ペスチウイルス（例えば、牛ウイルス性下痢（ＢＶＤＶ）、豚コレラ（ＣＳＦＶ）もしくはボーダー病（ＢＤＶ））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。 ヘパドナウイルス：ウイルス免疫原としては、ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。組成物は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を含み得る。 他の肝炎ウイルス：組成物は、Ｃ型肝炎ウイルス、デルタ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、もしくはＧ型肝炎ウイルスに由来する免疫原を含み得る。 ラブドウイルス：ウイルス免疫原としては、ラブドウイルス（例えば、リッサウイルス（例えば、狂犬病ウイルス）およびベシクロウイルス（ＶＳＶ））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。 カリシウイルス科：ウイルス免疫原としては、カリシウイルス科（例えば、ノーウォークウイルス（ノロウイルス）、およびノーウォーク様ウイルス（例えば、ハワイウイルスおよびスノーマウンテンウイルス））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。 コロナウイルス：ウイルス免疫原は、ＳＡＲＳコロナウイルス、トリ伝染性気管支炎（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、およびブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。上記コロナウイルス免疫原は、スパイクポリペプチドであり得る。 レトロウイルス：ウイルス免疫原としては、オンコウイルス、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２）またはスプマウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。 レオウイルス：ウイルス免疫原としては、オルトレオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、もしくはコルチウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。 パルボウイルス：ウイルス免疫原としては、パルボウイルスＢ１９に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。 ヘルペスウイルス：ウイルス免疫原としては、ヒトヘルペスウイルス（例えば、例示に過ぎないが、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（例えば、ＨＳＶ１型および２型）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）、およびヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。 パポバウイルス：ウイルス免疫原としては、パピローマウイルスおよびポリオーマウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。上記（ヒト）パピローマウイルスは、血清型１、２、４、５、６、８、１１、１３、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４１、４２、４７、５１、５７、５８、６３もしくは６５のもの（例えば、血清型６、１１、１６および／もしくは１８のうちの１種以上に由来する）であり得る。 アデノウイルス：ウイルス免疫原としては、アデノウイルス血清型３６（Ａｄ−３６）に由来するものが挙げられる。 いくつかの実施形態において、上記免疫原は、魚類に感染するウイルス（例えば：伝染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ）、サケ膵臓病ウイルス（ＳＰＤＶ）、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、アメリカナマズウイルス（ＣＣＶ）、魚類リンホシスチス病ウイルス（ＦＬＤＶ）、伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）、コイヘルペスウイルス、サケピコルナ様ウイルス（大西洋サケピコルナ様ウイルスとしても公知）、ヤマメウイルス（ＬＳＶ）、大西洋サケロタウイルス（ＡＳＲ）、マスイチゴ病ウイルス（ＴＳＤ）、銀ザケ腫瘍ウイルス（ＣＳＴＶ）、もしくはウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ））に対する免疫応答を誘発する。 真菌免疫原は、皮膚糸状菌類（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｒｅｓ）（以下が挙げられる：に由来し得る。 いくつかの実施形態において、上記免疫原は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属（例えば、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅもしくはＰ．ｏｖａｌｅ）に由来する寄生生物に対する免疫応答を誘発する。従って、本発明は、マラリアに対して免疫化するために使用され得る。いくつかの実施形態において、上記免疫原は、Ｃａｌｉｇｉｄａｅ科に由来する寄生生物、特に、Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ属およびＣａｌｉｇｕｓ属に由来する寄生生物（例えば、Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ ｓａｌｍｏｎｉｓもしくはＣａｌｉｇｕｓ ｒｏｇｅｒｃｒｅｓｓｅｙｉのようなフナムシ）に対する免疫応答を誘発する。 いくつかの実施形態において、上記免疫原は、以下に対する免疫応答を誘発する：花粉アレルゲン（樹木花粉、草本花粉、雑草の花粉、および草の花粉のアレルゲン）；昆虫もしくは蛛形類のアレルゲン（吸入、唾液および毒液のアレルゲン、例えば、ダニアレルゲン、ゴキブリアレルゲンおよび小虫アレルゲン、膜翅類毒液アレルゲン（ｈｙｍｅｎｏｐｔｈｅｒａ ｖｅｎｏｍ ａｌｌｅｒｇｅｎ））；動物の毛およびふけのアレルゲン（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、マウスなどに由来する）；ならびに食物アレルゲン（例えば、グリアジン）。樹木、草および草本に由来する重要な花粉アレルゲンは、Ｆａｇａｌｅｓ、Ｏｌｅａｌｅｓ、Ｐｉｎａｌｅｓの分類学上の目およびスズカケノキ科（ｐｌａｔａｎａｃｅａｅ）（カバノキ（Ｂｅｔｕｌａ）、ハンノキ（Ａｌｎｕｓ）、ハシバミ（Ｃｏｒｙｌｕｓ）、シデ（Ｃａｒｐｉｎｕｓ）およびオリーブ（Ｏｌｅａ）、シーダー（ＣｒｙｐｔｏｍｅｒｉａおよびＪｕｎｉｐｅｒｕｓ）、プラタナス（Ｐｌａｔａｎｕｓ）が挙げられるが、これらに限定されない）、Ｐｏａｌｅｓの目（属Ｌｏｌｉｕｍ、Ｐｈｌｅｕｍ、Ｐｏａ、Ｃｙｎｏｄｏｎ、Ｄａｃｔｙｌｉｓ、Ｈｏｌｃｕｓ、Ｐｈａｌａｒｉｓ、Ｓｅｃａｌｅ、およびＳｏｒｇｈｕｍの草が挙げられる）、ＡｓｔｅｒａｌｅｓおよびＵｒｔｉｃａｌｅｓの目（属Ａｍｂｒｏｓｉａ、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ、およびＰａｒｉｅｔａｒｉａの草本が挙げられる）から由来するそのようなものである。他の重要な吸入アレルゲンは、属ＤｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓおよびＥｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓのチリダニ類、コナダニ類（ｓｔｏｒａｇｅ ｍｉｔｅ）（例えば、Ｌｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｙｓ、ＧｌｙｃｙｐｈａｇｕｓおよびＴｙｒｏｐｈａｇｕｓ）、ゴキブリ、小虫およびノミに由来するもの（例えば、Ｂｌａｔｅｌｌａ、Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ、ＣｈｉｒｏｎｏｍｕｓおよびＣｔｅｎｏｃｅｐｐｈａｌｉｄｅｓ）、ならびに哺乳動物（例えば、ネコ、イヌおよびウマ）に由来するもの、毒液のアレルゲン（刺咬昆虫（ｓｔｉｎｇｉｎｇ ｏｒ ｂｉｔｉｎｇ ｉｎｓｅｃｔ）に由来するようなもの、例えば、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａの分類学上の目（蜂（Ａｐｉｄａｅ）、スズメバチ（Ｖｅｓｐｉｄｅａ）、およびアリ（Ｆｏｒｍｉｃｏｉｄａｅ）が挙げられる）が挙げられる）に由来するものである。 いくつかの実施形態において、上記免疫原は、以下から選択される腫瘍抗原である：（ａ）がん−精巣（ｃａｎｃｅｒ−ｔｅｓｔｉｓ）抗原、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ２、ＳＣＰ１ならびにＲＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥおよびＭＡＧＥファミリーのポリペプチド（例えば、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、およびＭＡＧＥ−１２）、これらは、例えば、黒色腫、肺、頭頸部、ＮＳＣＬＣ、乳房、胃腸、および膀胱の腫瘍に対処するために使用され得る；（ｂ）変異した抗原、例えば、ｐ５３（種々の固形腫瘍（例えば、結腸直腸がん、肺がん、頭頸部がん）と関連）、ｐ２１／Ｒａｓ（例えば、黒色腫、膵臓がんおよび結腸直腸がんと関連）、ＣＤＫ４（例えば、黒色腫と関連）、ＭＵＭ１（例えば、黒色腫と関連）、カスパーゼ−８（例えば、頭頸部がんと関連）、ＣＩＡ ０２０５（例えば、膀胱がんと関連）、ＨＬＡ−Ａ２−Ｒ１７０１、β−カテニン（例えば、黒色腫と関連）、ＴＣＲ（例えば、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫と関連）、ＢＣＲ−ａｂｌ（例えば、慢性骨髄性白血病と関連）、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ＫＩＡ ０２０５、ＣＤＣ−２７、およびＬＤＬＲ−ＦＵＴ；（ｃ）過剰発現された抗原、例えば、ガレクチン４（例えば、結腸直腸がんと関連）、ガレクチン９（例えば、ホジキン病と関連）、プロテイナーゼ３（例えば、慢性骨髄性白血病と関連）、ＷＴ １（例えば、種々の白血病と関連）、炭酸脱水酵素（例えば、腎がんと関連）、アルドラーゼＡ（例えば、肺がんと関連）、ＰＲＡＭＥ（例えば、黒色腫と関連）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（例えば、乳がん、結腸がん、肺がんおよび卵巣がんと関連）、マンマグロビン、α−フェトプロテイン（例えば、肝がんと関連）、ＫＳＡ（例えば、結腸直腸がんと関連）、ガストリン（例えば、膵臓がんおよび胃がんと関連）、テロメラーゼ触媒タンパク質、ＭＵＣ−１（例えば、乳がんおよび卵巣がんと関連）、Ｇ−２５０（例えば、腎細胞がんと関連）、ｐ５３（例えば、乳がん、結腸がんと関連）、ならびにがん胎児性抗原（例えば、乳がん、肺がん、および胃腸管のがん（例えば、結腸直腸がん）と関連）；（ｄ）共通抗原（ｓｈａｒｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）、例えば、黒色腫−メラノサイト分化抗原、例えば、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ Ａ、ｇｐ１００、ＭＣ１Ｒ、メラノサイト刺激ホルモンレセプター、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質−１／ＴＲＰ１およびチロシナーゼ関連タンパク質−２／ＴＲＰ２（例えば、黒色腫と関連）；（ｅ）前立腺関連抗原（例えば、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＨ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ２（例えば、前立腺がんと関連））；（ｆ）イムノグロブリンイディオタイプ（例えば、骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫と関連）。特定の実施形態において、腫瘍免疫原としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ｐ１５、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０、Ｈ−Ｒａｓ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタイン・バー・ウイルス抗原、ＥＢＮＡ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原（Ｅ６およびＥ７を含む）、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスの抗原、ヒトＴリンパ球向性ウイルス抗原、（Ｍａｃ−２結合タンパク質／シクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳなど。 （薬学的組成物） 本発明のリポソームは、種々の疾患に対して被験体を免疫化するための薬学的組成物中の成分として有用である。これらの組成物は、代表的には、上記リポソームに加えて、薬学的に受容可能なキャリアを含む。薬学的に受容可能なキャリアの詳細な考察は、参考文献３１において入手可能である。 本発明の薬学的組成物は、１種以上の低分子免疫強化因子を含み得る。例えば、上記組成物は、ＴＬＲ２アゴニスト（例えば、Ｐａｍ３ＣＳＫ４）、ＴＬＲ４アゴニスト（例えば、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート（例えば、Ｅ６０２０））、ＴＬＲ７アゴニスト（例えば、イミキモド）、ＴＬＲ８アゴニスト（例えば、レシキモド）および／もしくはＴＬＲ９アゴニスト（例えば、ＩＣ３１）を含み得る。任意のこのようなアゴニストは、理想的には、分子量＜２０００Ｄａを有する。いくつかの実施形態において、このようなアゴニストもまた、（上記ＲＮＡと一緒に）リポソーム内に被包されるが、他の実施形態において、それらは、被包されない。 本発明の薬学的組成物は、上記粒子を、ただの水（ｐｌａｉｎ ｗａｔｅｒ）（例えば、ｗ．ｆ．ｉ．）もしくは緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、もしくはクエン酸緩衝液）中に含み得る。緩衝塩は、代表的には、５〜２０ｍＭ範囲において含まれる。 本発明の薬学的組成物は、５．０〜９．５（例えば、６．０〜８．０）のｐＨを有し得る。 本発明の組成物は、張度を与えるために、ナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含み得る。１０±２ｍｇ／ｍｌ ＮａＣｌの濃度が代表的である（例えば、約９ｍｇ／ｍｌ）。 本発明の組成物は、金属イオンキレート化剤を含み得る。これらは、ホスホジエステル加水分解を加速し得るイオンを除去することによって、ＲＮＡ安定性を延長し得る。従って、組成物は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＢＡＰＴＡ、ペンテト酸などのうちの１種以上を含み得る。このようなキレート化剤は、代表的には、１０〜５００μＭ（例えば、０．１ｍＭ）で存在する。クエン酸塩（例えば、クエン酸ナトリウム）はまた、キレート化剤として作用し得るのと同時に、有利なことには、緩衝化活性も提供し得る。 本発明の薬学的組成物は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ（例えば、２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、もしくは２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇ）の重量オスモル濃度を有し得る。 本発明の薬学的組成物は、１種以上の保存剤（例えば、チオメルサールもしくは２−フェノキシエタノール）を含み得る。水銀非含有組成物が好ましく、保存剤非含有ワクチンが調製され得る。 本発明の薬学的組成物は、好ましくは、無菌である。 本発明の薬学的組成物は、好ましくは、非発熱性である（例えば、１用量あたり＜１ ＥＵ（エンドトキシンユニット、標準尺度）、および好ましくは、１用量あたり＜０．１ ＥＵを含む）。 本発明の薬学的組成物は、好ましくは、グルテンを含まない。 本発明の薬学的組成物は、単位用量形態において調製され得る。いくつかの実施形態において、単位用量は、０．１〜１．０ｍｌ（例えば、約０．５ｍｌ）の容積を有し得る。 上記組成物は、注射物として調製され得る（溶液もしくは懸濁物のいずれかとして）。上記組成物は、微細スプレーを使用する、肺投与（例えば、吸入器による）のために調製され得る。上記組成物は、鼻、耳もしくは眼への投与（例えば、スプレーもしくは滴剤として）のために調製され得る。筋肉内投与のための注射物が、代表的である。 組成物は、免疫学的に有効量の粒子、ならびに任意の他の成分（必要であれば）を含む。「免疫学的に有効な量」とは、個体への投与量が、単一用量においてもしくはシリーズのうちの一部としてのいずれかで、処置もしくは予防に有効であることを意味する。この量は、処置されるべき個体の健康状態および身体的状態、処置されるべき個体の年齢、分類学上の群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、上記個体が抗体を合成する免疫系の能力、所望される防御の程度、ワクチンの処方、その処置している医師の医学的状況の評価、および他の関連因子に依存して変動する。上記量は、慣用的な治験を通じて決定され得る比較的広い範囲に入ると予測される。本発明の組成物の粒子およびＲＮＡ含有量は、一般に、１用量あたりのＲＮＡの量に関して表される。好ましい用量は、≦１００μｇ ＲＮＡ（例えば、１０〜１００μｇ（例えば、約１０μｇ、２５μｇ、５０μｇ、７５μｇもしくは１００μｇ））を有するが、発現は、より低いレベルにおいてさえ、みられ得る。 本発明はまた、本発明の薬学的組成物を含む送達デバイス（例えば、シリンジ、ネブライザ、噴霧器、吸入器、皮膚パッチなど）を提供する。このデバイスは、上記組成物を脊椎動物被験体に投与するために使用され得る。 本発明の粒子は、リボソームを包含しない。 （処置方法および医学的使用） 本発明のリポソームおよび薬学的組成物は、目的の免疫原に対する免疫応答を誘発するためのインビボでの使用のためのものである。 本発明は、本発明のリポソームもしくは薬学的組成物の有効量を投与する工程を包含する、脊椎動物において免疫応答を惹起するための方法を提供する。上記免疫応答は、好ましくは、防御的であり、好ましくは、抗体および／もしくは細胞媒介性免疫を含む。上記方法は、ブースター応答を惹起し得る。 本発明はまた、脊椎動物における免疫応答を惹起するための方法において使用するための本発明のリポソームもしくは薬学的組成物を提供する。 本発明はまた、脊椎動物における免疫応答を惹起するための医薬の製造における本発明のリポソームの使用を提供する。 これら使用および方法により上記脊椎動物における免疫応答を惹起することによって、上記脊椎動物は、上記で考察されるように、種々の疾患および／もしくは感染から（例えば、細菌疾患および／もしくはウイルス疾患から）防御され得る。上記粒子および組成物は、免疫原性であり、より好ましくは、ワクチン組成物である。本発明に従うワクチンは、予防的である（すなわち、感染を妨ぐ）か、もしくは治療的である（すなわち、感染を処置する）のいずれかであり得るが、代表的には、予防的である。 上記脊椎動物は、好ましくは、哺乳動物、例えば、ヒトもしくは獣医学的哺乳動物（例えば、小型の動物、例えば、イヌまたはネコ；あるいは大型の動物、例えば、ウマ、ウシ、シカ、ヤギ、ブタ）であり、いくつかの実施形態では、上記脊椎動物は、マウスでもコットンラット（ｃｏｔｔｏｎ ｒａｔ）でもウシでもない。上記ワクチンが予防的使用のためのものである場合、上記ヒトは、好ましくは、小児（例えば、幼児もしくは乳児）またはティーンエイジャーである；上記ワクチンが治療的使用のためのものである場合、上記ヒトは、好ましくは、ティーンエイジャーもしくは成人である。小児用に意図されたワクチンはまた、例えば、安全性、投与量、免疫原性などを評価するために、成人に投与され得る。 本発明に従って調製されるワクチンは、小児および成人の両方を処置するために使用され得る。従って、ヒト患者は、１歳未満、５歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、もしくは少なくとも５５歳であってもよい。上記ワクチンを受けるのに好ましい患者は、高齢者（例えば、≧５０歳、≧６０歳、および好ましくは、≧６５歳）、若年者（例えば、≦５歳）、入院患者、ヘルスケアワーカー、軍従事者、および軍職員、妊婦、慢性疾患患者、もしくは免疫不全患者である。しかし、上記ワクチンは、これらの群にのみ適切であるわけではなく、より一般に、集団において使用され得る。 本発明の組成物は、一般に、患者に直接投与される。直接送達は、非経口注射によって達成され得る（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内、もしくは組織の間隙空間に）。代替の送達経路としては、直腸、経口（例えば、錠剤、スプレー）、口内、舌下、膣、局所、経真皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）もしくは経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、鼻内、眼、耳、肺もしくは他の粘膜投与が挙げられる。皮内および筋肉内投与は、２つの好ましい経路である。注射は、針を介してであってもよい（例えば、皮下針）が、針なしの注射が、代わりに使用され得る。代表的な筋肉内用量は、０．５ｍｌである。 本発明は、全身免疫および／もしくは粘膜免疫を誘発するために、好ましくは、増強された全身免疫および／もしくは粘膜免疫を誘発するために、使用され得る。 投与量は、単一用量スケジュールもしくは複数用量スケジュールによってであり得る。複数用量は、一次免疫スケジュールにおいて、および／もしくはブースター免疫スケジュールにおいて使用され得る。複数用量スケジュールにおいて、種々の用量が、同じ経路もしくは異なる経路（例えば、非経口の一次と粘膜のブースト、粘膜の一次と非経口のブーストなど）によって与えられ得る。複数用量は、代表的には、少なくとも１週間間隔を空けて（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）投与される。一実施形態において、複数用量は、生後約６週間、１０週間、および１４週間で（例えば、世界保健機関のＥｘｐａｎｄｅｄ Ｐｒｏｇｒａｍ ｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ（「ＥＰＩ」）においてしばしば使用されるように、６週齢、１０週齢および１４週齢において）投与され得る。代替の実施形態において、２回の一次用量が、約２ヶ月間間隔を空けて（例えば、約７週間、８週間もしくは９週間間隔を空けて）投与され、続いて、１回以上のブースター用量が、２回目の一次用量の約６ヶ月から１年後に（例えば、２回目の一次用量の約６ヶ月後、８ヶ月後、１０ヶ月後もしくは１２ヶ月後）投与される。さらなる実施形態において、３回の一次用量が、約２ヶ月間間隔を空けて（例えば、約７週間、８週間もしくは９週間間隔を空けて）投与され、続いて、１回以上のブースター用量が、３回目の一次用量の約６ヶ月後から１年後に（例えば、３回目の一次用量の約６ヶ月後、８ヶ月後、１０ヶ月後もしくは１２ヶ月後）投与される。 （一般） 本発明の粒子は、別段示されなければ、化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の、当該分野の技術内の従来の方法を使用する。このような技術は、文献中に十分に説明されている。例えば、参考文献３２〜３８などを参照のこと。 用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘから専らなってもよいし、何かさらなるものを含んでいてもよい（例えば、Ｘ＋Ｙ）。 数値ｘに関して用語「約」とは、選択的であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。 語句「実質的に」とは、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まない場合もある。必要な場合、語句「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。 電荷、カチオン、アニオン、両性イオンなどへの言及は、ｐＨ７において取り扱われる。 ＴＬＲ３は、Ｔｏｌｌ様レセプター３である。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす一回膜貫通レセプターである。既知のＴＬＲ３アゴニストは、ポリ（Ｉ：Ｃ）を含む。「ＴＬＲ３」は、このレセプターをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名であり、その特有のＨＧＮＣ ＩＤは、ＨＧＮＣ：１１８４９である。ヒトＴＬＲ３遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：２４５９６２５である。 ＴＬＲ７は、Ｔｏｌｌ様レセプター７である。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす一回膜貫通レセプターである。既知のＴＬＲ７アゴニストは、例えば、イミキモドを含む。「ＴＬＲ７」は、このレセプターをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名であり、その特有のＨＧＮＣ ＩＤは、ＨＧＮＣ：１５６３１である。ヒトＴＬＲ７遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：６７９４４６３８である。 ＴＬＲ８は、Ｔｏｌｌ様レセプター８である。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす一回膜貫通レセプターである。既知のＴＬＲ８アゴニストは、例えば、レシキモドを含む。「ＴＬＲ８」は、このレセプターをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名であり、その特有のＨＧＮＣ ＩＤは、ＨＧＮＣ：１５６３２である。ヒトＴＬＲ８遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：２０３０２１６５である。 ＲＩＧ−Ｉ様レセプター（「ＲＬＲ」）ファミリーは、先天的免疫系において重要な役割を果たす種々のＲＮＡヘリカーゼを含む［３９］。ＲＬＲ−１（ＲＩＧ−Ｉもしくはレチノイン酸誘導性遺伝子Ｉとしても公知）は、そのＮ末端付近にある２つのカスパーゼリクルートドメインを有する。上記ＲＬＲ−１ヘリカーゼをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名は、「ＤＤＸ５８」（ＤＥＡＤ（Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ）ボックスポリペプチド５８（ＤＥＡＤ （Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ） ｂｏｘ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ５８）について）であり、その特有のＨＧＮＣ ＩＤは、ＨＧＮＣ：１９１０２である。ヒトＲＬＲ−１遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：７７７３２５１４である。ＲＬＲ−２（ＭＤＡ５もしくは黒色腫分化関連遺伝子５（ｍｅｌａｎｏｍａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ５）としても公知）はまた、そのＮ末端付近にある２つのカスパーゼリクルートドメインを有する。ＲＬＲ−２ヘリカーゼをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名は、「ＩＦＩＨ１」（ヘリカーゼＣドメイン１で誘導されるインターフェロン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ｈｅｌｉｃａｓｅ Ｃ ｄｏｍａｉｎ １）について）であり、特有のＨＧＮＣ ＩＤは、ＨＧＮＣ：１８８７３である。ヒトＲＬＲ−２遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ： ２７８８６５６７である。ＲＬＲ−３（ＬＧＰ２もしくは遺伝学および生理学研究室２（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２）としても公知）は、カスパーゼリクルートドメインを有さない。ＲＬＲ−３ヘリカーゼをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名は、 「ＤＨＸ５８」（ＤＥＸＨ（Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｈｉｓ）ボックスポリペプチド５８について）であり、特有のＨＧＮＣ ＩＤは、ＨＧＮＣ：２９５１７である。ヒトＲＬＲ−３遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：１４９４０８１２１である。 ＰＫＲは、二本鎖ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼである。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす。「ＥＩＦ２ＡＫ２」（真核生物翻訳開始因子２−αキナーゼ２（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２−ａｌｐｈａ ｋｉｎａｓｅ ２）について）は、この酵素をコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名であり、その特有のＨＧＮＣ ＩＤは、ＨＧＮＣ：９４３７である。ヒトＰＫＲ遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：２０８４３１８２５である。 （発明を実施するための形態） （ＲＮＡレプリコン） 種々のレプリコンは、以下で使用される。一般に、これらは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）に由来する非構造タンパク質、シンドビス・ウイルス由来のパッケージングシグナル、およびシンドビス・ウイルスもしくはＶＥＥＶ変異体に由来する３’ＵＴＲを有するハイブリッドアルファウイルスゲノムに基づく。上記レプリコンは、約１０ｋｂ長であり、ポリＡテールを有する。 アルファウイルスレプリコンをコードするプラスミドＤＮＡ（名称：ｐＴ７−ｍＶＥＥＶ−ＦＬ．ＲＳＶＦもしくはＡ３１７；ｐＴ７−ｍＶＥＥＶ−ＳＥＡＰもしくはＡ３０６；ｐＳＰ６−ＶＣＲ−ＧＦＰもしくはＡ５０）を、インビボでのＲＮＡ合成のテンプレートとして供した。上記レプリコンは、ＲＮＡ複製に必要とされるアルファウイルス遺伝的エレメントを含むが、粒子アセンブリに必要な遺伝子産物をコードするエレメントを欠いている；構造タンパク質は、代わりに、目的のタンパク質（レポーター（例えば、ＳＥＡＰもしくはＧＦＰ）または免疫原（例えば、全長ＲＳＶ Ｆタンパク質）のいずれか）によって置き換えられるので、上記レプリコンは、感染性粒子の生成を誘導できない。上記アルファウイルスｃＤＮＡの上流にあるバクテリオファージ（Ｔ７もしくはＳＰ６）プロモーターは、インビトロで上記レプリコンＲＮＡの合成を促進し、上記ポリ（Ａ）テールの直ぐ下流にあるデルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイムは、その自己切断活性を介して正確な３’末端を生成する。 適切な制限エンドヌクレアーゼで上記ＨＤＶリボザイムの下流で上記プラスミドＤＮＡを直線状にした後に、ランオフ転写物（ｒｕｎ−ｏｆｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）を、Ｔ７もしくはＳＰ６バクテリオファージ由来ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、インビトロで合成した。転写を、製造業者（Ａｍｂｉｏｎ）によって提供される指示書に従って、ヌクレオシドトリホスフェート（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ）の各々の７．５ｍＭ（Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ）もしくは５ｍＭ（ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）の存在下で、３７℃において２時間にわたって行った。転写の後、上記テンプレートＤＮＡを、ＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ）で消化した。上記レプリコンＲＮＡを、ＬｉＣｌで沈殿させ、ヌクレアーゼ非含有水中で再構成した。キャップのないＲＮＡを、ＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｍ７Ｇキャッピングシステム（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ユーザーマニュアルに概説されるとおり、ワクシニアキャッピング酵素（ＶＣＥ）で転写後にキャップした；このようにキャップしたレプリコンに、「ｖ」の接頭文字を付ける（例えば、ｖＡ３１７は、ＶＣＥによってキャップされたＡ３１７レプリコンである）。転写後キャップされたＲＮＡを、ＬｉＣｌで沈殿させ、ヌクレアーゼ非含有水中で再構成した。上記ＲＮＡサンプルの濃度を、ＯＤ２６０ｎｍを測定することによって決定した。上記インビトロ転写物の完全性を、変性アガロースゲル電気泳動によって確認した。 （リポソーム被包） ＲＮＡを、参考文献９および４０の方法によって作製したリポソーム中に被包した。上記リポソームを、１０％ ＤＳＰＣ（両性イオン性）、４０％ ＤｌｉｎＤＭＡ（カチオン性）、４８％ コレステロールおよび２％ ＰＥＧ結合体化ＤＭＧ（２ｋＤａ ＰＥＧ）から作製した。これら割合は、全リポソーム中の％モルに言及する。 ＤｌｉｎＤＭＡ（１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン）を、参考文献５の手順を使用して合成した。ＤＳＰＣ（１，２−ジアステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）を、Ｇｅｎｚｙｍｅから購入した。コレステロールを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た。ＰＥＧ結合体化ＤＭＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール），アンモニウム塩）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン，塩化物塩）およびＤＣ−ｃｈｏｌ（３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロールヒドロクロリド）は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓからであった。 一般に、８つの異なる方法を、本発明に従うリポソームを調製するために使用した。これらは、方法（Ａ）〜（Ｈ）として本文中で言及され、主に濾過およびＴＦＦ工程に関連して異なっている。詳細は、以下のとおりである。 （Ａ）エタノール中の新鮮な脂質ストック溶液を調製した。３７ｍｇのＤｌｉｎＤＭＡ、１１．８ｍｇのＤＳＰＣ、２７．８ｍｇのコレステロールおよび８．０７ｍｇのＰＥＧ ＤＭＧ ２０００を秤量し、７．５５ｍＬのエタノール中に溶解した。上記新たに調製した脂質ストック溶液を、３７℃において約１５分間にわたって穏やかに振盪して、均質な混合物を形成した。次いで、上記ストックのうちの７５５μＬを、１．２４５ｍＬ エタノールに添加して、作業脂質ストック溶液２ｍＬを作製した。この量の脂質を使用して、２５０μｇ ＲＮＡとともにリポソームを形成した。ＲＮＡの２ｍＬ 作業溶液をまた、１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）中のストック溶液約１μｇ／μＬから調製した。３つの２０ｍＬ ガラスバイアル（撹拌子有り）を、ＲＮａｓｅ Ａｗａｙ溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）ですすぎ、使用前に多量のＭｉｌｌｉＱ水で洗浄して、上記バイアルのＲＮａｓｅの汚染を除去した。上記バイアルのうちの１つを、上記ＲＮＡ作業溶液に使用し、他のものを脂質およびＲＮＡ混合物を集めるために使用した（後に記載されるとおり）。作業脂質溶液およびＲＮＡ溶液を、３７℃において１０分間にわたって加熱し、その後、３ｃｃ ルーアーロックシリンジに入れた。２ｍＬ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）を、別の３ｃｃ シリンジに入れた。ＲＮＡおよび脂質を含むシリンジを、ＦＥＰチューブ（フッ素化エチレン−プロピレン；すべてのＦＥＰチューブは、２ｍｍ内径×３ｍｍ外径を有した；Ｉｄｅｘ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅによって供給）を使用して、Ｔミキサー（ＰＥＥＫＴＭ ５００μｍ ＩＤ接合部，Ｉｄｅｘ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｏａｋ Ｈａｒｂｏｒ， ＷＡ）に接続した。上記Ｔミキサーからの出口もまた、ＦＥＰチューブであった。上記クエン酸緩衝液を含む第３のシリンジを、別個の１つのＦＥＰチューブに接続した。次いで、すべてのシリンジを、流量７ｍＬ／分においてシリンジポンプを使用して作動させた。上記チューブ出口を、２０ｍＬ ガラスバイアルに上記混合物を集めるように配置した（撹拌しながら）。上記撹拌子を取り出し、上記エタノール／水性溶液を、室温へと１時間にわたって平衡化させた。上記混合物のうちの４ｍｌを、５ｃｃ シリンジに入れ、これを、ＦＥＰチューブの１つに接続し、別の５ｃｃ シリンジを、等しい長さのＦＥＰチューブに接続し、等量の１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）を入れた。上記２本のシリンジを、上記シリンジポンプを使用して７ｍＬ／分の流量において作動させ、最終の混合物を、２０ｍＬ ガラスバイアルに集めた（撹拌しながら）。次に、第２の混合工程（リポソーム）から集めた上記混合物を、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ膜（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， ＡｎｎＡｒｂｏｒ， ＭＩ， ＵＳＡから得られる、結合してアニオン性分子を除去するアニオン交換支持体）を通過させた。上記リポソームを通過させる前に、４ｍＬの１Ｍ ＮａＯＨ、４ｍＬの１Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＬの１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）が、上記Ｍｕｓｔａｎｇ膜を連続して通過した。リポソームを、１０分間にわたって３７℃において加温し、その後、上記膜を通過させた。次に、ＴＦＦを使用して、リポソームを２ｍＬに濃縮し、１０〜１５容積の１×ＰＢＳに対して透析し、その後、最終生成物を収集した。上記ＴＦＦシステムおよび中空ファイバー濾過膜を、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓから購入し、上記製造業者のガイドラインに従って使用した。１００ｋＤ孔サイズカットオフおよび８ｃｍ２ 表面積を有するポリスルホン中空ファイバー濾過膜（部品番号Ｐ／Ｎ： Ｘ１ＡＢ−１００−２０Ｐ）を使用した。インビトロおよびインビボ実験に関しては、処方物を、１×ＰＢＳで、必要とされるＲＮＡ濃度へと希釈した。 （Ｂ）振盪後、上記ストックのうちの２２６．７μＬを、１．７７３ｍＬ エタノールに添加して、作業脂質ストック溶液２ｍＬを作製したこと（従って、上記脂質：ＲＮＡ比を改変）を除いて、方法（Ａ）のとおり。 （Ｃ）上記Ｍｕｓｔａｎｇ濾過を省略したので、リポソームが、上記２０ｍＬ ガラスバイアルから上記ＴＦＦ透析へと向かったことを除いて、方法（Ｂ）のとおり。 （Ｄ）上記ＴＦＦが、１００ｋＤ孔サイズカットオフおよび２０ｃｍ２ 表面積を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）中空ファイバー膜（部品番号 Ｐ−Ｃ１−１００Ｅ−１００−０１Ｎ）を使用したことを除いて、方法（Ｃ）のとおり。 （Ｅ）方法（Ａ）のようにＭｕｓｔａｎｇ膜を使用したことを除いて、方法（Ｄ）のとおり。 （Ｆ）上記Ｍｕｓｔａｎｇ濾過を省略したので、リポソームが、上記２０ｍＬ ガラスバイアルから上記ＴＦＦ透析へと向かったことを除いて、方法（Ａ）のとおり。 （Ｇ）ＲＮＡの４ｍＬ 作業溶液を、１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）中の約１μｇ／μＬのストック溶液から調製したことを除いて、方法（Ｄ）のとおり。次いで、４つの２０ｍＬ ガラスバイアルを、同じ方法で調製した。それらのうちの２本を、上記ＲＮＡ作業溶液（各バイアル中２ｍＬ）に使用し、他のものを、（Ｃ）のように、上記脂質およびＲＮＡ混合物を集めるために使用した。Ｔミキサーを使用するのではなく、ＲＮＡおよび脂質を含むシリンジを、Ｍｉｔｏｓ Ｄｒｏｐｌｅｔ接合チップ（Ｓｙｒｒｉｓから得られるガラス製マイクロ流体（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ）デバイス（部品番号 ３０００１５８））に、ＰＴＦＥチューブ（０．０３インチ内径×１／１６インチ外径）を使用して、４ウェイエッジコネクタ（Ｓｙｒｒｉｓ）を使用して接続した。２つのＲＮＡストリームおよび１つの脂質ストリームを、シリンジポンプによって作動させ、上記エタノールおよび水相の混合を、上記チップのＸ接合部（１００μｍ×１０５μｍ）において行った。３つすべてのストリームの流量を、１．５ｍＬ／分において維持し、従って、全水性の流量 対 エタノールの流量の比は、２：１であった。上記チューブ出口を、２０ｍＬ ガラスバイアルに上記混合物を集めるように配置した（撹拌しながら）。上記撹拌子を取り出し、上記エタノール／水性溶液を、室温へと１時間にわたって平衡化させた。次いで、上記混合物を５ｃｃ シリンジに入れ、これを、上記ＰＴＦＥチューブの別の１つにはめた；等しい長さのＰＴＦＥチューブ付きの別の５ｃｃ シリンジに、等容積の１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）を入れた。上記２本のシリンジを、３ｍＬ／分の流量において、シリンジポンプを使用して作動させ、最終混合物を、２０ｍＬ ガラスバイアルに集めた（撹拌しながら）。次に、（Ｄ）におけるように、ＴＦＦを使用して、リポソームを２ｍＬに濃縮し、１０〜１５容積の１×ＰＢＳに対して透析した。 （Ｈ）上記２ｍＬ作業脂質ストック溶液を、１２０．９μＬの上記脂質ストックと１．８７９ｍＬ エタノールとを混合することによって作製したことを除いて、方法（Ａ）のとおり。また、上記Ｔミキサーにおいて混合した後に、上記２０ｍＬ バイアルからの上記リポソームを、Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，特に強力，０．５〜３ｍＬ 容量）に入れ、オートクレーブしたプラスチック容器中、４００〜５００ｍＬの１×ＰＢＳに対して一晩４℃において透析し、その後、最終生成物を収集した。 上記に開示される方法（Ａ）〜（Ｈ）は、特定の量のＲＮＡについて８：１のＮ：Ｐ比を使用する。この比は、ＲＮＡ作業溶液中のＲＮＡの濃度を変えることによって容易に変化させることができる。 （ｐＫａ測定） 脂質のｐＫａは、以下の技術を使用して、標準温度および圧力の水において測定される。・エタノール中の脂質の２ｍＭ溶液は、脂質を秤量し、エタノール中に溶解することによって調製される。エタノール：メタノール ９：１の蛍光プローブトルエンニトロスルホン酸（ＴＮＳ）の０．３ｍＭ溶液は、メタノール中のＴＮＳの３ｍＭ溶液を最初に作製し、次いで、エタノールにより０．３ｍＭまで希釈することによって調製される。・それぞれ２０ｍＭ、２５ｍＭ、２０ｍＭ、および１５０ｍＭの濃度の、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、および塩化ナトリウムを含有する水性緩衝液を調製する。この緩衝液を８つの部分に分け、ｐＨを、１２Ｎ ＨＣｌまたは６Ｎ ＮａＯＨのいずれかにより、４．４４〜４．５２、５．２７、６．１５〜６．２１、６．５７、７．１０〜７．２０、７．７２〜７．８０、８．２７〜８．３３、および１０．４７〜１１．１２に調整する。４００μＬの２ｍＭ脂質溶液および８００μＬの０．３ｍＭ ＴＮＳ溶液を混合する。・７．５μＬのプローブ／脂質ミックスを、１ｍＬの９６ウェルプレート中の２４２．５μＬの緩衝液に追加する。これを８つすべての緩衝液で行う。混合の後に、１００μＬの各プローブ／脂質／緩衝液混合物を、２５０μＬのクリアボトムで黒色の９６ウェルプレート（ｂｌａｃｋ ｗｉｔｈ ｃｌｅａｒ ｂｏｔｔｏｍ ９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）（例えばモデルＣＯＳＴＡＲ ３９０４、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移す。この混合を実行するための好都合な方法は、Ｔｅｃａｎ Ｇｅｎｅｓｉｓ ＲＳＰ１５０ ハイスループット液体ハンドラー（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｌｉｑｕｉｄ ｈａｎｄｌｅｒ）およびＧｅｍｉｎｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用することである。・各プローブ／脂質／緩衝液混合物の蛍光は、３２２ｎｍの励起、４３１ｎｍの発光（４２０ｎｍの自動カットオフ）により測定する（例えばＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５分光光度計およびＳｏｆｔＭａｘ ｐｒｏ ５．２ソフトウェアによる）。・測定の後に、９６ウェルプレートの空のウェルのバックグラウンド蛍光値を、各プローブ／脂質／緩衝液混合物から引く。次いで、蛍光強度値を最も低いｐＨでの値に対して標準化する。次いで、標準化蛍光強度を、ｐＨに対してプロットし、最良適合のラインがもたらされる。・標準化蛍光強度が０．５に等しい最良適合のライン上のポイントが見出される。０．５に等しい標準化蛍光強度に対応するｐＨが見出され、その脂質のｐＫａと見なされる。 この方法は、本発明による使用に好ましいカチオン性脂質であるＤＬｉｎＤＭＡについて５．８というｐＫａを示す。 （免疫原送達のためのＮ：Ｐ比の変化） ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする自己複製レプリコン（ｖＡ３１７）。１群当たり４匹または８匹の動物のＢＡＬＢ／ｃマウスに、レプリコン（１μｇ）のみまたはＲＶ０１、ＲＶ０５、もしくはＲＶ１３によりリポソームとして製剤したレプリコン（１μｇ）を、０日目および２１日目に、両側筋肉内ワクチン接種（片脚当たり５０μＬ）により与えた。ＲＶ０１リポソームは、４０％ＤｌｉｎＤＭＡ、１０％ＤＳＰＣ、４８％コレステロール、および２％ＰＥＧ−ＤＭＧを有した。ＲＶ０５（０１）リポソームは、４０％カチオン性脂質、４８％コレステロール、１０％ＤＳＰＣ、および２％ＰＥＧ−ＤＭＧを有し、ＲＶ０５（０２）リポソームは、６０％カチオン性脂質、３８％コレステロール、および２％ＰＥＧ−ＤＭＧを有した。ＲＶ１３リポソームは、４０％ＤＯＴＡＰ、１０％ＤＰＥ、４８％コレステロール、および２％ＰＥＧ−ＤＭＧを有した。比較のために、同じＲＳＶ−Ｆ抗原を発現する裸のプラスミドＤＮＡ（２０μｇ）を、エレクトロポレーションを使用してまたはＲＶ０１（１０）リポソーム（０．１μｇ ＤＮＡ）により送達した。４匹のマウスを、ナイーブコントロール群として使用した。 これらのリポソームは、方法（Ｂ）を使用したＲＶ０１（０５）を除いて、方法（Ｄ）によって調製した。ＲＮＡ濃度は、下記の表において示されるように様々なＮ：Ｐ比を示すように変化させた。 リポソームのＺ平均粒径、多分散指数、および被包効率は、以下のとおりとした。Ｎ：Ｐ比もまた示す。 血清を、１４日目、３６日目および４９日目に抗体分析のために集めた。脾臓を、４９日目に、Ｔ細胞分析のためにマウスから採取した。 Ｆ特異的血清ＩｇＧ力価（ＧＭＴ）は、以下のとおりであった： サイトカイン陽性であり、かつＲＳＶ Ｆ５１−６６ペプチドに対して特異的なＴ細胞の割合は、以下のとおりであり、統計的に有意にゼロを上回る数字のみを示す： 従って、上記リポソーム処方物は、増大したＦ特異的ＩｇＧ力価およびＴ細胞頻度によって決定される場合、上記裸のＲＮＡコントロールと比較して免疫原性を顕著に増大した。リポソームとともに処方したか、またはエレクトロポレーションを使用して裸で送達されたプラスミドＤＮＡは、リポソーム処方された自己複製ＲＮＡより顕著に免疫原性が低かった。 ＲＶ０１ ＲＮＡワクチンおよびＲＶ０５ ＲＮＡワクチンは、ＲＶ１３（ＤＯＴＡＰ）ワクチンよりも免疫原性が高かった。これらの製剤は、同等の物理的特性を有し、同じ自己複製ＲＮＡにより製剤したが、それらは、様々なカチオン性脂質を含有する。ＲＶ０１およびＲＶ０５の両方は、約５．８のｐＫａを有する頭部における第３級アミンを有し、また不飽和アルキルテールをも含む。ＲＶ１３は、不飽和アルキルテールを有するが、その頭部は、第４級アミンを有し、非常に強くカチオン性である。これらの結果は、５．０〜７．６の範囲のｐＫａを有する第３級アミンを有する脂質が、ＲＮＡのリポソーム送達系において使用される場合、強くカチオン性であるＤＯＴＡＰなどのような脂質より優れていることを示唆する。 Ｎ：Ｐ比は、免疫原性に影響を与え、４：１（ＲＶ０１（０９））＞８：１（ＲＶ０１（１０））＞１６：１（ＲＶ０１（０８））であった。 本発明は、例示によって記載されてきたに過ぎず、本発明の範囲および趣旨内に留まりながら、改変が行われ得ることは、理解される。 表１：有用なリン脂質ＤＤＰＣ １，２−ジデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリンＤＥＰＡ １，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェートＤＥＰＣ １，２−エルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリンＤＥＰＥ １，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミンＤＥＰＧ １，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）ＤＬＯＰＣ １，２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリンＤＬＰＡ １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェートＤＬＰＣ １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリンＤＬＰＥ １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミンＤＬＰＧ １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）ＤＬＰＳ １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリンＤＭＧ １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンＤＭＰＡ １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェートＤＭＰＣ １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリンＤＭＰＥ １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミンＤＭＰＧ １，２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）ＤＭＰＳ １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリンＤＯＰＡ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェートＤＯＰＣ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリンＤＯＰＥ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミンＤＯＰＧ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）ＤＯＰＳ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリンＤＰＰＡ １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェートＤＰＰＣ １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリンＤＰＰＥ １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミンＤＰＰＧ １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）ＤＰＰＳ １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリンＤＰｙＰＥ １，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンＤＳＰＡ １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェートＤＳＰＣ １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリンＤＳＰＥ １，２−ジステアロイル（Ｄｉｏｓｔｅａｒｐｙｌ）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミンＤＳＰＧ １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）ＤＳＰＳ １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリンＥＰＣ 卵−ＰＣＨＥＰＣ 水素化卵ＰＣＨＳＰＣ 高純度水素化ダイズＰＣＨＳＰＣ 水素化ダイズＰＣＬＹＳＯＰＣ ＭＹＲＩＳＴＩＣ １−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリンＬＹＳＯＰＣ ＰＡＬＭＩＴＩＣ １−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリンＬＹＳＯＰＣ ＳＴＥＡＲＩＣ １−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリンミルクスフィンゴミエリンＭＰＰＣ １−ミリストイル，２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ ３−ホスファチジルコリンＭＳＰＣ １−ミリストイル，２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリンＰＭＰＣ １−パルミトイル，２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリンＰＯＰＣ １−パルミトイル，２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリンＰＯＰＥ １−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミンＰＯＰＧ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール）．．．］ＰＳＰＣ １−パルミトイル，２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリンＳＭＰＣ １−ステアロイル，２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリンＳＯＰＣ １−ステアロイル，２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリンＳＰＰＣ １−ステアロイル，２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン参考文献免疫原をコードするＲＮＡが被包されたリポソームであって、該リポソームが、カチオン性脂質を含み、該リポソームおよびＲＮＡが、１：１〜２０：１のＮ：Ｐ比を有する、リポソーム。５０〜２２０ｎｍの範囲の直径を有する、請求項１に記載のリポソーム。前記ＲＮＡが、自己複製ＲＮＡである、任意の先行する請求項に記載のリポソーム。前記自己複製ＲＮＡが、（ｉ）該自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写することができるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび（ｉｉ）免疫原をコードする、請求項３に記載のリポソーム。前記ＲＮＡが、２つのオープンリーディングフレームを有し、第１のオープンリーディングフレームが、アルファウイルスレプリカーゼをコードし、第２のオープンリーディングフレームが、前記免疫原をコードする、請求項４に記載のリポソーム。前記ＲＮＡが、９０００〜１２０００ヌクレオチド長である、任意の先行する請求項に記載のリポソーム。前記免疫原が、細菌、ウイルス、真菌、または寄生生物に対してインビボにおいて免疫応答を誘発することができる、任意の先行する請求項に記載のリポソーム。前記免疫原が、ＲＳウイルス糖タンパク質Ｆに対してインビボにおいて免疫応答を誘発することができる、請求項７に記載のリポソーム。前記リポソームおよびＲＮＡが、２：１〜１８：１のＮ：Ｐ比を有する、任意の先行する請求項に記載のリポソーム。前記リポソームおよびＲＮＡが、３：１〜１１：１のＮ：Ｐ比を有する、任意の先行する請求項に記載のリポソーム。前記リポソームおよびＲＮＡが、４：１〜１６：１のＮ：Ｐ比を有する、任意の先行する請求項に記載のリポソーム。前記リポソームおよびＲＮＡが、６：１〜１４：１のＮ：Ｐ比を有する、任意の先行する請求項に記載のリポソーム。前記リポソームおよびＲＮＡが、８：１〜１２：１のＮ：Ｐ比を有する、任意の先行する請求項に記載のリポソーム。前記リポソームおよびＲＮＡが、２：１、４：１、８：１、または１０：１のＮ：Ｐ比を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のリポソーム。任意の先行する請求項に記載のリポソームを含む薬学的組成物。脊椎動物における防御免疫応答を惹起するための方法であって、有効量の請求項１〜１４に記載のリポソームまたは請求項１５に記載の薬学的組成物を該脊椎動物に投与する工程を含む、方法。 核酸免疫化は、カチオン性脂質を含むリポソーム内に被包されたＲＮＡを送達することによって達成され、リポソームおよびＲＮＡが、１：１〜２０：１のＮ：Ｐ比を有する。例えば、本発明により、免疫原をコードするＲＮＡが被包されたリポソームであって、該リポソームが、カチオン性脂質を含み、該リポソームおよびＲＮＡが、１：１〜２０：１のＮ：Ｐ比を有する、リポソームが提供される。本発明のリポソームを含む薬学的組成物もまた提供される。