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タイトル：	公表特許公報(A)_タンパク質連結用クリックケミストリーハンドルを設置するためのソルターゼの使用
出願番号：	2014519003
年次：	2014
IPC分類：	C07K 19/00,C07K 16/46,C12P 21/08,C12P 21/02,C12N 15/09

特許情報キャッシュ

プローグ，ヒディー エル ウィッテ，マーティン ディー ヨダー，ニコラス シー JP 2014525904 公表特許公報(A) 20141002 2014519003 20120628 タンパク質連結用クリックケミストリーハンドルを設置するためのソルターゼの使用 ホワイトヘッド・インスティテュート・フォー・バイオメディカル・リサーチ 502168404 Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 柳田 征史 100073184 佐久間 剛 100090468 プローグ，ヒディー エル ウィッテ，マーティン ディー ヨダー，ニコラス シー US 61/502,237 20110628 US 61/624,114 20120413 C07K 19/00 20060101AFI20140905BHJP C07K 16/46 20060101ALI20140905BHJP C12P 21/08 20060101ALI20140905BHJP C12P 21/02 20060101ALI20140905BHJP C12N 15/09 20060101ALN20140905BHJP JPC07K19/00C07K16/46C12P21/08C12P21/02 BC12P21/02 CC12N15/00 A AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KM,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC,VN,ZA US2012044584 20120628 WO2013003555 20130103 115 20140227 4B024 4B064 4H045 4B024AA03 4B024BA43 4B024CA02 4B024DA06 4B024EA04 4B024GA11 4B064AG01 4B064AG27 4B064CA02 4B064CA19 4B064CA21 4B064CB06 4B064DA20 4H045AA10 4H045AA11 4H045AA20 4H045AA30 4H045BA10 4H045BA41 4H045CA40 4H045DA76 4H045DA89 4H045EA60 4H045FA33 4H045FA70 4H045FA74関連出願の説明 本発明は、２０１１年６月２８日出願の米国特許仮出願第６１／５０２，２３７号（発明の名称「タンパク質連結のためにクリックケミストリーハンドルを設置するためのソルターゼの使用」）と、２０１２年４月１３日出願の米国特許仮出願第６１／６２４，１１４号（発明の名称「ソルターゼ修飾ＶＨＨドメイン及びその使用」）とに基づく米国特許法第１１９条（ｅ）による優先権を主張し、これらの出願は引用によりそれぞれ本明細書に取り込まれる。 本発明は、タンパク質工学に関し、具体的には、標的タンパク質上にクリックケミストリーハンドルを設置するための方法及び試薬に関する。 政府による支援 本発明は、米国国立衛生研究所グラントＲ０１ Ｕ５４ ＡＩ０５７１５９、Ｒ０１ ＡＩ０３３４５６及びＲ０１ ＡＩ０８７８７９による米国政府の支援で完成された。米国政府は本発明につき一定の権利を有する。 タンパク質工学はタンパク質生化学の多くの領域で広く用いられるツールになってきている。１つの工学的方法は、タンパク質連結の制御である。本来の化学的なタンパク質連結は、合成ペプチドエステルの効率的な調製に依存するが、これは多くのタンパク質について調製が技術的に困難な場合がある。あるタンパク質のＣ末端を別のタンパク質のＮ末端と繋げるタンパク質−タンパク質融合体を生成するために組換え技術が利用される場合がある。インテインを利用するタンパク質連結システムもタンパク質を繋げるために利用できる。このインテインを介する連結方法の前提条件は、標的タンパク質がインテインと正しくフォールディングされた融合体タンパク質として発現することであるが、これはしばしば困難である。従来の本来の連結技術及び組換え連結技術の困難さがタンパク質連結の応用を著しく制限している。 ソルターゼによって触媒されるペプチド転移反応は、さまざまなタイプの修飾でタンパク質を誘導体化するための一般的な方法として浮上してきた。従来のソルターゼ修飾のためには、標的タンパク質はそのＣ末端近傍にソルターゼ認識モチーフ（ＬＰＸＴ）を含むように加工される。１個以上のＮ末端グリシン残基を含む合成ペプチドと組換えソルターゼとをインキュベーションするとき、これらの人工的なソルターゼ基質はアシル基転移反応を起こして合成オリゴグリシンペプチドのスレオニン残基のＣ末端側の残基との交換をもたらし、結果的にタンパク質のＣ末端が前記合成ペプチドのＮ末端と連結される。 本発明の一部の局面は、ソルターゼを介するタンパク質修飾、特に、タンパク質配列上への反応性官能基、例えば、クリックケミストリーハンドルの設置（ｉｎｓｔａｌｌａｔｉｏｎ）に関する。タンパク質上への反応性官能基の設置のための方法及び試薬と、修飾されたタンパク質、例えば、Ｃ末端又はＮ末端のクリックケミストリーハンドルを含むタンパク質とが提供される。さらに、本発明の局面にしたがって修飾される２つのタンパク質をコンジュゲートする方法が提供される。かかる方法は単量体タンパク質を２量体化し、異種の単一タンパク質の特徴を組み合わせるキメラタンパク質、例えば、キメラ抗体、二重特異性抗体を生成するのに有用である。 本発明の一部の局面は、ソルターゼのアシル転移反応を利用してタンパク質のＮ末端又はＣ末端にクリックケミストリーハンドルを付加するための方法、組成物および試薬を提供する。本発明の一部の局面は、Ｃ末端近傍にソルターゼ認識モチーフ（例えば、ＬＰＸＴ）を含むタンパク質のＣ末端又はその近位側にクリックケミストリーハンドルを設置するための方法を提供する。本発明の一部の局面は、１個以上のＮ末端グリシン残基を含むタンパク質のＮ末端にクリックケミストリーハンドルを設置するための方法を提供する。 例えば、一部の実施態様は、標的タンパク質をＣ末端クリックケミストリーハンドルにコンジュゲーションする方法を提供する。一部の実施態様では、前記方法は、Ｃ末端ソルターゼ認識モチーフ（例えば、ＬＰＸＴ）を、例えば、Ｃ末端融合体として、前記標的タンパク質に提供することを含む。一部の実施態様では、前記方法は、１−１０個のＮ末端グリシン残基か、Ｎ末端アルキルアミン基と、前記クリックケミストリーハンドルとを含む試薬、例えば、ペプチド、タンパク質又は化合物と前記標的タンパク質との接触をさせることをさらに含む。一部の実施態様では、前記接触は、ソルターゼ酵素の存在下、該ソルターゼが、前記クリックケミストリーハンドルを含むペプチドと前記標的タンパク質とのアミド転移をして、前記標的タンパク質を前記クリックケミストリーハンドルにコンジュゲーションするのに適当な条件下で行われる。 一部の実施態様は、Ｎ末端クリックケミストリーハンドルに標的タンパク質をコンジュゲーションする方法を提供する。一部の実施態様では、前記方法は、１−１０個のＮ末端グリシン残基か、Ｎ末端アルキルアミン基かを、例えば、Ｎ末端融合体として前記標的タンパク質に提供することを含む。一部の実施態様では、前記方法は、ソルターゼ認識モチーフ（例えば、ＬＰＸＴ）を含むペプチドと前記標的タンパク質との接触をさせることをさらに含む。一部の実施態様では、前記接触は、ソルターゼ酵素の存在下、該ソルターゼが前記標的タンパク質と前記ペプチドとのアミド転移をして、前記標的タンパク質を前記クリックケミストリーハンドルにコンジュゲーションするのに適当な条件下で行われる。 本明細書に説明される方法を用いて、いかなる原子団でもタンパク質上に設置できる。本発明の一部の局面にしたがう特に有用なのはクリックケミストリーハンドルである。クリックケミストリーハンドルは、クリックケミストリー反応に参加できる反応性官能基を提供する原子団である。クリックケミストリー反応と、クリックケミストリー反応に適する官能基は、当業者に周知で、末端アルキン、アジド、ひずみを持つアルキン、ジエン、親ジエン体、アルコキシアミン、カルボニル、ホスフィン、ヒドラジド、チオール及びアルケンを含むが、これらに限られない。例えば、一部の実施態様では、アジド及びアルキンがクリックケミストリー反応に利用される。 本発明の一部の局面は、修飾タンパク質、例えば、Ｃ末端又はＮ末端にクリックケミストリーハンドルを含むタンパク質を提供する。かかるタンパク質は、該タンパク質のクリックケミストリーハンドルと反応できる原子団を含む他の分子、例えば、タンパク質、核酸、ポリマー、脂質又は低分子とコンジュゲーションできる。一部の実施態様では、前記修飾タンパク質は、抗体、例えば、ラクダ抗体、単一ドメイン抗体、ＶＨＨドメイン、ナノボディ又はＳｃＦｖの抗原結合ドメインか、その抗原結合断片かを含む。 本発明の一部の局面は、クリックケミストリーにより２つのタンパク質分子のコンジュゲーション又は連結のための方法を提供する。一部の実施態様では、第１のクリックケミストリーハンドルは第１のタンパク質に設置され、第２のクリックケミストリーハンドルは第２のタンパク質に設置され、第１のクリックケミストリーハンドルが第２のクリックケミストリーハンドルと共有結合を形成できる。例えば、一部の実施態様は、翻訳後に２つのタンパク質をコンジュゲーションしてキメラタンパク質を形成する方法を提供する。一部の実施態様では、前記方法は、第１のクリックケミストリーハンドルが第２のクリックケミストリーハンドルと反応するのに適当な条件下で、第１のクリックケミストリーハンドルにコンジュゲーションされた第１のタンパク質を第２のクリックケミストリーハンドルにコンジュゲーションされた第２のタンパク質に接触させて、共有結合でこれら２つのタンパク質を含むキメラタンパク質を生成することを含む。本発明に提供される方法は、タンパク質のＮ末端のＮ末端へのコンジュゲーションと、Ｃ末端のＣ末端へのコンジュゲーションとの精製を可能にするが、これらは、組換えの手段（例えばタンパク質融合体の発現）によっては達成できない。例えば、一部の実施態様では、第１のクリックケミストリーハンドルは第１のタンパク質のＮ末端とコンジュゲーションされ、第２のクリックケミストリーハンドルは第２のタンパク質のＮ末端にコンジュゲーションされ、キメラタンパク質は、これら２つのタンパク質のＮ末端のＮ末端へのコンジュゲーションである。別の実施態様では、第１のクリックケミストリーハンドルは第１のタンパク質のＣ末端にコンジュゲーションされ、第２のクリックケミストリーハンドルは第２のタンパク質のＣ末端にコンジュゲーションされ、キメラタンパク質はこれら２つのタンパク質のＣ末端のＣ末端へのコンジュゲーションである。一部の実施態様では、例えば、組換え技術で融合タンパク質を作製することの代替策として、クリックハンドルが第１及び第２のポリペプチドのＣ末端及びＮ末端を結合するために用いられる。例えば、融合タンパク質が非常に大きいか、精製困難か、クローン化が困難な核酸配列にコード化されるか、クローン化を回避するためかの場合には、これは特に有用である。 本発明の一部の実施態様は、キメラタンパク質、例えば、本発明の局面にしたがう２つのタンパク質の翻訳後コンジュゲーションにより生成されたキメラタンパク質を提供する。一部の実施態様は、クリックケミストリーによりコンジュゲーションされる２つの抗原結合タンパク質、例えば、単一ドメイン抗体を含むキメラ二重特異性抗体を提供する。一部の実施態様は、ソルターゼ認識配列を含む第１の抗体又は抗原結合抗体断片と、ソルターゼ認識配列を含む第２の抗体又は抗原結合抗体断片とを含む二重特異性キメラ抗体を提供し、第１及び第２の抗体又は抗原結合断片はクリックケミストリーによりコンジュゲーションされる。 本発明は抗原結合タンパク質コンジュゲーションに限られず、適当なクリックケミストリーハンドルを含むか、かかるハンドルが本明細書に説明される方法又は当業者に知られた方法にしたがって設置できる、いかなる分子とコンジュゲーションがいかなるタンパク質でもできることに留意すべきである。したがって、一部の実施態様は、ソルターゼ認識モチーフ（例えば、ＬＰＸＴ）を有する標的タンパク質と、該タンパク質にクリックケミストリーでコンジュゲーションされる第２の分子とを含むキメラタンパク質を提供する。一部の実施態様では、前記キメラタンパク質は、前記標的タンパク質上にクリックケミストリーハンドルを翻訳後に設置すること、及び、前記標的タンパク質のクリックケミストリーハンドルと反応できる第２のクリックケミストリーハンドルを含む第２の分子に、該クリックケミストリーハンドルを含む標的タンパク質を接触させることによって生成される。 一部の実施態様は、修飾タンパク質、例えば、ソルターゼ認識モチーフ（例えば、ＬＰＸＴ）と、例えば、該ソルターゼ認識モチーフのアミノ酸の１つに直接か、リンカーを介してかでコンジュゲーションされるクリックケミストリーハンドルとを含むタンパク質を提供する。一部の実施態様では、前記修飾タンパク質は、抗原結合ドメイン、例えば、抗体又は抗原結合抗体断片を含む。代表的には、本発明に提供される修飾タンパク質は、ラクダ抗体又はその抗原結合断片、ＶＨＨドメイン、単一ドメイン抗体、ナノボディ、ｓｃＦｖ、アフィボディ、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ又はアドネクチンを含むが、これらに限られない。一部の実施態様では、クリックケミストリーハンドルはタンパク質のＣ末端に配置されるが、他の実施態様では、クリックケミストリーハンドルはタンパク質のＮ末端に配置される。一部の実施態様では、クリックケミストリーハンドルは、末端のアルキン、アジド、ひずみのあるアルキン、ジエン、親ジエン体、アルコキシアミン、カルボニル、ホスフィン、ヒドラジド、チオール及びアルケンからなる群から選択される。 本発明の一部の実施態様は、本発明に提供される方法を実施するのに有用な１種類以上の試薬を含むキットを提供する。例えば、一部の実施態様では、本発明は、１−１０個のグリシン残基か、第１のクリックケミストリーハンドルにコンジュゲーションされる末端アルキルアミンを含む第１のペプチドと、第２のクリックケミストリーハンドルにコンジュゲーションされるソルターゼ認識モチーフを含む第２のペプチドとを含み、第１及び第２のペプチドのクリックケミストリーハンドルが反応可能である、キットを提供する。一部の実施態様では、前記キットは、１−１０個のグリシン残基か、第１のクリックケミストリーハンドルにコンジュゲーションされる末端アルキルアミンかを含む第１のペプチドと、１−１０個のグリシン残基か、第２のクリックケミストリーハンドルにコンジュゲーションされる末端アルキルアミンかを含む第２のペプチドとを含み、第１及び第２のペプチドのクリックケミストリーハンドルが反応可能である。一部の実施態様では、前記キットは、第１のクリックケミストリーハンドルにコンジュゲーションされるソルターゼ認識モチーフを含む第１のペプチドと、第２のクリックケミストリーハンドルにコンジュゲーションされるソルターゼ認識モチーフを含む第２のペプチドを含み、第１及び第２のペプチドのクリックケミストリーハンドルは互いに反応可能である。一部の実施態様では、前記キットは、ソルターゼ酵素をさらに含む。一部の実施態様では、前記キットは、使用指示書、触媒、例えば、金属触媒、及び／又は、反応バッファーをさらに含む。 以上の概要は本発明の一部の局面にわたる概説を行うことを意図するものであって、いかなるやり方であれ、本発明の限定するものと解釈されるべきではない。本発明のさらなる局面、利点及び実施態様は本明細書に説明され、さらなる実施態様は本開示に基づいて当業者には自明であろう。上記及び本明細書に引用される全ての文献の全内容は引用により本明細書に取り込まれる。ソルターゼ及びクリックケミストリーを利用するＣ−Ｃタンパク質２量体及びＮ−Ｎタンパク質２量体の生成。上のパネルでは、「ＬＥＰＴＧＧ」との文言はソルターゼ認識モチーフを指す。配列は上から下に、それぞれ、配列番号ＸＸ−ＸＸに対応する。ソルターゼで触媒されるアシル転移反応代表的なクリックケミストリーハンドルと、コンジュゲーションされたタンパク質の生成に適する反応抗体１及び２へのＣ末端ハンドルＡ及びＢの設置抗体１及び２の２量体化。配列は上から下に、それぞれ、配列番号ＸＸ−ＸＸに対応する。クリックケミストリーを利用してタンパク質に取り込まれる場合がある、代表的な追加の官能基ＰＥＧ化二重特異性抗体及びタンパク質３量体の合成Ｎ末端標識ユビキチン類似体を利用するクリックケミストリーの最適化。Ａ）クリックハンドルによるＧ３Ｕｂ−ＶＭＥの標識。Ｂ）形成されたコンストラクトの活性測定。ＵｂＶＭＥ単量体及び２量体がＵＣＨＬ３とインキュベーションされた。ＤＵＢの標識は分子量のシフトをもたらした。配列は上から下に、それぞれ、配列番号ＸＸ−ＸＸに対応する。ユビキチンをモデルタンパク質として用いるＮ末端ソルタギング。配列は上から下に、それぞれ、配列番号ＸＸ−ＸＸに対応する。ユビキチンをモデルタンパク質として用いるＮ末端ソルタギング。配列は上から下に、それぞれ、配列番号ＸＸ−ＸＸに対応する。ユビキチンをモデルタンパク質として用いるＮ末端ソルタギング。配列は上から下に、それぞれ、配列番号ＸＸ−ＸＸに対応する。ユビキチンをモデルタンパク質として用いるＮ末端ソルタギング。配列は上から下に、それぞれ、配列番号ＸＸ−ＸＸに対応する。アジド−Ｕｂ及びシクロオクチン−ＵｂのクリックケミストリーＮ−Ｎ２量体化の反応速度論抗β２Ｍ抗体及び抗ＧＦＰ抗体のＣ−Ｃ２量体化の模式図。「ＬＥＰＴＧＧ」との文言はソルターゼ認識モチーフを指す。配列は上から下に、それぞれ、配列番号ＸＸ−ＸＸに対応する。サイズ排除クロマトグラフィーによる精製サイズ排除クロマトグラフィーによる精製抗ＧＦＰナノボディのソルタギング抗ＧＦＰナノボディのソルタギングインターフェロンアルファ及び抗ＧＦＰ（抗ｅＧＦＰ）ナノボディのソルタギング。３７：Ｃ末端アジド；５７：Ｃ末端シクロオクチン；４０：Ｎ末端シクロオクチン；４１：Ｎ末端アジド；ＬＰＥＴＧＧ：配列番号１。ＩＮＦＡ及び抗ＧＦＰのソルタギング。ＬＰＥＴＧＧ：配列番号１。本アプローチの概念図。配列は上から下に、それぞれ、配列番号ＸＸ−ＸＸに対応する。ユビキチン２量体化の要件 概念的アプローチユビキチン２量体化の要件 ユビキチンは１又は２で３時間ソルタグ化され、ＬＣ／ＭＳで解析される。ユビキチンの２量体化。アジド修飾ユビキチン（２ｎｍｏｌ）が１３μＬのＨ２Ｏ中でシクロオクチン付加ユビキチン等モルとインキュベーションされる。２量体は１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離され、タンパク質はクーマジー染色により検出された。ユビキチンの２量体化。アジド修飾ユビキチン（２ｎｍｏｌ）が１３μＬのＨ２Ｏ中でシクロオクチン付加ユビキチン等モルとインキュベーションされる。２量体は１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離され、タンパク質はユビキチンについて免疫ブロッティングにより検出された。表示された時間ＤＩＢＡＣユビキチン（０．１ｎｍｏｌ）とインキュベーションされたアジドユビキチン（０．１ｎｍｏｌ）は、ＴＲＩＳ／トリシンゲルで分離され、クーマジー染色され、得られたタンパク質はＩｍａｇｅＪにより定量化された。単量体及び２量体のレーンあたりの相対量は以下のとおり決定された。２量体の相対量＝（２量体の吸光度）／（全吸光度）、単量体の相対量＝（単量体の吸光度）／（全吸光度）。ユビキチン又はＵｂＶＭＥのいずれかでのＵＣＨＬ３の標識。左のパネル：クーマジー染色ゲル、右のパネル：ｈｉｓ６タグについての免疫ブロッティング。配列は上から下に、それぞれ、配列番号ＸＸ−ＸＸに対応する。Ｎ−Ｎ融合タンパク質の合成。使用されるＮ末端プローブ１及び２の構造。２量体ＵｂＶＭＥによるｈｉｓタグ化ＵＣＨＬ３の標識。トリス−トリシンゲルのクーマジーブリリアントブルー染色。２量体ＵｂＶＭＥによるｈｉｓタグ化ＵＣＨＬ３の標識。抗Ｈｉｓ抗体を用いる免疫ブロッティング。Ｕｂ−ＵｂＶＭＥ＊：単一のＵＣＨＬ３に結合したユビキチンＵｂＶＭＥ。ＵｂＶＭＥ２＊：単一のＵＣＨＬ３分子に結合した２量体ＵｂＶＭＥ。ＵｂＶＭＥ２＊＊：２個のＵＣＨＬ３分子に結合した２量体ＵｂＶＭＥ。Ｃ−Ｃホモ２量体抗体 プローブ３及び４の構造。抗ＧＦＰの２量体化両方の抗ＧＦＰがＧＦＰと結合することを実証するサイズ排除クロマトグラフィー実験。赤色の線：抗ＧＦＰ２量体、緑色の線：ＧＦＰ、淡青色の線：抗ＧＦＰ２量体＋２．５μＬＧＦＰ、濃青色の線：抗ＧＦＰ＋１０μＬＧＦＰ、黒色の線：抗ＧＦＰ２量体＋２０μＬＧＦＰ（過剰）。プローブ４でソルタグ化された抗ＧＦＰの精製プローブ４で標識された精製抗ＧＦＰのクーマジーブリリアントブルー染色ゲル。プローブ４で標識された精製抗ＧＦＰの質量分析波形図。ａＧＦＰ−３及びａＧＦＰ−４の２量体化。 ＴＩＳ（５０ｍＭ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中のａＧＦＰ−３（２．５μＭ、０．１７ｎｍｏｌ）が、表示された時間室温で等モル量のａＧＦＰ−４とインキュベーションされた。２量体化産物はＴＲＩＳ／トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥで単量体から分離された。タンパク質は、蛍光撮影（λｅｘ＝５３２、λｅｍ＝５８０、左パネル）と、クーマジーブリリアントブルー染色（中央パネル）とにより可視化され、定量された（右パネル）。２量体に対する単量体の相対量は、ユビキチンについて説明されたとおり決定された。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５ １０／３０による抗ＧＦＰ２量体の精製濃縮精製タンパク質の１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析ＧＦＰ存在下及び非存在下でインキュベーションされた単量体抗ＧＦＰ−３及び抗ＧＦＰ−４のＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００ １０／３０溶出プロフィール３０μＬのＧＦＰとインキュベーションされた抗ＧＦＰ２量体の１２．５ｍＬ（１）及び１５．５ｍＬ（２）での溶出ピークが濃縮され、非変性ポリアクリルアミドゲルに懸架された。蛍光抗ＧＦＰ−３とＶＨＨ７−３との２量体化及び精製非蛍光ＧＦＰ−４とＶＨＨ７−５との２量体化及び精製プローブ５抗ＭＨＣ ＩＩ抗ＧＦＰ抗体によるマウスリンパ節細胞のＦＡＣＳ解析。上のパネル：野生型細胞での解析結果。下のパネル：ＮＨＣクラスＩＩ欠損細胞の解析結果。ＧＦＰの生体内送達。マウスは５０μＬの二重特異性抗体が注射され、５０μｇのＧＦＰが、直接腹腔内か、１時間後に静脈内にかのいずれかで投与された。染色された細胞はフロー・サイトメトリー法で解析された。抗ＭＨＣ ＩＩ−抗ＧＦＰ抗体によるマウスリンパ節細胞のＦＡＣＳ解析。上のパネル：野生型細胞での解析結果。下のパネル：ＭＨＣクラスＩＩ欠損細胞での解析結果。ＶＨＨ７、ＩＬ２及びＩＦＮαと抗ＧＦＰとのヘテロ２量体の作製 定義 具体的な官能基及び化学術語の定義は以下により詳しく説明される。本発明の目的には、化学元素は、Handbook of Chemistry and Physics第７５版表紙裏の元素周期律表ＣＡＳ版にしたがって同定され、具体的な官能基は当該書籍に説明のとおり一般的に定義される。さらに、有機化学の一般原理と、具体的な官能基及び反応性とは、Organic Chemistry, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito, 1999と、Smith and March March’s Advanced Organic Chemistry, 5th Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2001と、Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Inc., New York, 1989と、Carruthers, Some Modern Methods of Organic Synthesis, 3rd Edition, Cambridge University Press, Cambridge, 1987とに説明される。 本明細書で用いられる用語「脂肪族」は、飽和及び不飽和の両方の、非芳香族の直鎖（すなわち、非分岐型）、分岐型、非環状型、環状型（すなわち、炭素環）炭化水素を含み、任意的に１個以上の官能基で置換される。当業者は理解するであろうが、「脂肪族」は、本明細書では、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、及びシクロアルキニル基を含むが、これらに限定されないことを意図する。したがって、本明細書で用いられる用語「アルキル」は、直鎖型、分岐型及び環状型のアルキル基を含む。類似のやり方が、「アルケニル」、「アルキニル」等の他の一般的な用語にも適用される。さらに、本明細書に用いられる用語「アルキル」、「アルケニル」等は、置換基及び非置換基の両方を含む。本明細書で用いられる一部の実施態様では、「脂肪族」は、炭素原子１−２０個を有する（環状型、非環状型、置換型、非置換型、分岐型又は非分岐型の）脂肪族基（Ｃ１−２０脂肪族）を示すのに用いられる。一部の実施態様では、「脂肪族」は、炭素原子１−１０個を有する脂肪族基（Ｃ１−１０脂肪族）を示すのに用いられる。一部の実施態様では、「脂肪族」は、炭素原子１−６個を有する脂肪族基（Ｃ１−６脂肪族）を示すのに用いられる。一部の実施態様では、「脂肪族」は、炭素原子１−５個を有する脂肪族基（Ｃ１−５脂肪族）を示すのに用いられる。一部の実施態様では、「脂肪族」は、炭素原子１−４個を有する脂肪族基（Ｃ１−４脂肪族）を示すのに用いられる。一部の実施態様では、「脂肪族」は、炭素原子１−３個を有する脂肪族基（Ｃ１−３脂肪族）を示すのに用いられる。一部の実施態様では、「脂肪族」は、炭素原子１−２個を有する脂肪族基（Ｃ１−２脂肪族）を示すのに用いられる。脂肪族基置換体は、安定的な原子団の形成につながる本明細書に説明される置換体のいずれかを含むが、これらに限定されない。 本明細書に用いられる用語「アルキル」は、１個ないし２０個の間の炭素原子を含む炭化水素原子団から１個の水素原子を除去することにより誘導される、飽和、直鎖又は分岐鎖の炭化水素ラジカルを指す。一部の実施態様では、本発明に用いられるアルキル基は、１−２０個の炭素原子を含む（Ｃ１−２０アルキル）。別の実施態様では、前記アルキル基は、１−１５個の炭素原子を含む（Ｃ１−１５アルキル）。別の実施態様では、前記アルキル基は、１−１０個の炭素原子を含む（Ｃ１−１０アルキル）。別の実施態様では、前記アルキル基は、１−８個の炭素原子を含む（Ｃ１−８アルキル）。別の実施態様では、前記アルキル基は、１−６個の炭素原子を含む（Ｃ１−６アルキル）。別の実施態様では、前記アルキル基は、１−５個の炭素原子を含む（Ｃ１−５アルキル）。別の実施態様では、前記アルキル基は、１−４個の炭素原子を含む（Ｃ１−４アルキル）。別の実施態様では、前記アルキル基は、１−３個の炭素原子を含む（Ｃ１−３アルキル）。別の実施態様では、前記アルキル基は、１−２個の炭素原子を含む（Ｃ１−２アルキル）。アルキルラジカルの例は、１個以上の置換を含む場合がある、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｓｅｃ−ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、ｓｅｃ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−デシル、ｎ−ウンデシル、ドデシル等を含むが、これらに限定されない。アルキル基置換体は、安定的な原子団の形成につながる本明細書に説明される置換体のいずれかを含むが、これらに限定されない。本明細書に用いられる用語「アルキレン」は、本明細書に定義されるとおり、アルキル基から２個の水素原子を除去することにより誘導されるビラジカルを指す。アルキレン基は、環状型又は非環状型、分岐型又は非分岐型、置換型又は非置換型の場合がある。アルキレン基置換体は、安定的な原子団の形成につながる本明細書に説明される置換体のいずれかを含むが、これらに限定されない。 本明細書に用いられる用語「アルケニル」は、少なくとも１個の炭素−炭素２重結合を有する直鎖型又は分岐鎖型炭化水素原子団から１個の水素を除去することにより誘導される１価の官能基を指す。一部の実施態様では、本発明に用いられるアルケニル基は２−２０個の炭素原子を含む（Ｃ２−２０アルケニル）。一部の実施態様では、本発明に用いられるアルケニル基は２−１５個の炭素原子を含む（Ｃ２−１５アルケニル）。別の実施態様では、本発明に用いられるアルケニル基は２−１０個の炭素原子を含む（Ｃ２−１０アルケニル）。さらに別の実施態様では、前記アルケニル基は２−８個の炭素原子を含む（Ｃ２−８アルケニル）。また別の実施態様では、前記アルケニル基は２−６個の炭素原子を含む（Ｃ２−６アルケニル）。また別の実施態様では、前記アルケニル基は２−５個の炭素原子を含む（Ｃ２−５アルケニル）。また別の実施態様では、前記アルケニル基は２−４個の炭素原子を含む（Ｃ２−４アルケニル）。また別の実施態様では、前記アルケニル基は２−３個の炭素原子を含む（Ｃ２−３アルケニル）。また別の実施態様では、前記アルキニル基は２個の炭素原子を含む（Ｃ２アルケニル）。アルケニル基は、例えば、１個以上の置換体を含む場合がある、エテニル、プロペニル、ブテニル、１−メチル−２−ブテン−１−イル等を含む。アルケニル基置換体は、安定的な原子団の形成につながる本明細書に説明される置換体のいずれかを含むが、これらに限定されない。本明細書に用いられる用語「アルケニレン」は、本明細書に定義されるアルケニル基から２個の水素原子を除去することにより誘導されるビラジカルを指す。アルケニレン基は、環状型又は非環状型、分岐型又は非分岐型、置換型又は非置換型の場合がある。アルケニレン基置換体は、安定的な原子団の形成につながる本明細書に説明される置換体のいずれかを含むが、これらに限定されない。 本明細書に用いられる用語「アルキニル」は、少なくとも１個の炭素−炭素３重結合を有する直鎖型又は分岐鎖型炭化水素原子団から１個の水素を除去することにより誘導される１価の官能基を指す。一部の実施態様では、本発明に用いられるアルキニル基は２−２０個の炭素原子を含む（Ｃ２−２０アルキニル）。一部の実施態様では、本発明に用いられるアルキニル基は２−１５個の炭素原子を含む（Ｃ２−１５アルキニル）。別の実施態様では、本発明に用いられるアルキニル基は２−１０個の炭素原子を含む（Ｃ２−１０アルキニル）。さらに別の実施態様では、前記アルキニル基は２−８個の炭素原子を含む（Ｃ２−８アルキニル）。また別の実施態様では、前記アルキニル基は２−６個の炭素原子を含む（Ｃ２−６アルキニル）。また別の実施態様では、前記アルキニル基は２−５個の炭素原子を含む（Ｃ２−５アルキニル）。また別の実施態様では、前記アルキニル基は２−４個の炭素原子を含む（Ｃ２−４アルキニル）。また別の実施態様では、前記アルキニル基は２−３個の炭素原子を含む（Ｃ２−３アルキニル）。また別の実施態様では、前記アルキニル基は２個の炭素原子を含む（Ｃ２アルキニル）。代表的なアルキニル基は、１個以上の置換体を含む場合がある、エテニル、２−プロピニル（プロパルジル）、１−プロピニル等を含むが、これらに限定されない。アルキニル基置換体は、安定的な原子団の形成につながる本明細書に説明される置換体のいずれかを含むが、これらに限定されない。本明細書に用いられる用語「アルキニレン」は、本明細書に定義されるアルキニレン基から２個の水素原子を除去することにより誘導されるビラジカルを指す。アルキニレン基は、環状型又は非環状型、分岐型又は非分岐型、置換型又は非置換型の場合がある。アルキニレン基置換体は、安定的な原子団の形成につながる本明細書に説明される置換体のいずれかを含むが、これらに限定されない。 本明細書に用いられる用語「炭素環」又は「カルボシクリル（ｃａｒｂｏｃｙｃｌｙｌ）」は、３−１０個の炭素環原子を含む環状脂肪族基（Ｃ３−１０炭素環）を指す。炭素環基置換体は、安定的な原子団の形成につながる本明細書に説明される置換体のいずれかを含むが、これらに限定されない。 本明細書に用いられる用語「ヘテロ脂肪族（ｈｅｔｅｒｏａｌｉｐｈａｔｉｃ）」は、飽和及び不飽和の両方の、非芳香族、直鎖型（すなわち非分岐型）、分岐型、非環状型、環状型（すなわち複素環型）又は多環式の炭化水素を含み、任意的に１個以上の官能基で置換され、炭素原子の間に１個以上のヘテロ原子（例えば、酸素、イオウ、窒素、リン又はシリコン原子）をさらに含む。一部の実施態様では、ヘテロ脂肪族原子団は、そのうちの水素原子１個以上が１個以上の置換基で独立に入れ替わることにより置換される。当業者は理解するであろうが、「ヘテロ脂肪族」は、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル及びヘテロシクロアルキニル原子団を含むが、これらに限定されない。したがって、用語「ヘテロ脂肪族」は、用語「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」、「ヘテロアルキニル」等を含む。さらに、本明細書で用いられる用語「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」、「ヘテロアルキニル」等は、置換基及び非置換基の両方を含む。本明細書に説明されるとおり、一部の実施態様では、「ヘテロ脂肪族」は、１−２０個の炭素原子と、１−６個のヘテロ原子とを有する（環状型、非環状型、置換型、非置換型、分岐型又は非分岐型の）ヘテロ脂肪族基（Ｃ１−２０ヘテロ脂肪族）を示すために用いられる。一部の実施態様では、前記ヘテロ脂肪族は、１−１０個の炭素原子と、１−４個のヘテロ原子とを含む（Ｃ１−１０ヘテロ脂肪族）。一部の実施態様では、前記ヘテロ脂肪族は、１−６個の炭素原子と、１−３個のヘテロ原子とを含む（Ｃ１−６ヘテロ脂肪族）。一部の実施態様では、前記ヘテロ脂肪族は、１−５個の炭素原子と、１−３個のヘテロ原子とを含む（Ｃ１−５ヘテロ脂肪族）。一部の実施態様では、前記ヘテロ脂肪族は、１−４個の炭素原子と、１−２個のヘテロ原子とを含む（Ｃ１−４ヘテロ脂肪族）。一部の実施態様では、前記ヘテロ脂肪族は、１−３個の炭素原子と、１個のヘテロ原子とを含む（Ｃ１−３ヘテロ脂肪族）。一部の実施態様では、前記ヘテロ脂肪族は、１−２個の炭素原子と、１個のヘテロ原子とを含む（Ｃ１−２ヘテロ脂肪族）。ヘテロ脂肪族基置換体は、安定的な原子団の形成につながる本明細書に説明される置換体のいずれかを含むが、これらに限定されない。 本明細書に用いられる用語「ヘテロアルキル」は、炭素原子の間に１個以上のヘテロ原子（例えば、酸素、イオウ、窒素、リン又はシリコン原子）を含む、本明細書に定義されるアルキル原子団を指す。一部の実施態様では、前記ヘテロアルキル基は、２−２０個の炭素原子と、１−６個のヘテロ原子とを含む（Ｃ２−２０ヘテロアルキル）。一部の実施態様では、前記ヘテロアルキルは、２−１０個の炭素原子と、１−４個のヘテロ原子とを含む（Ｃ２−１０ヘテロアルキル）。一部の実施態様では、前記ヘテロアルキルは、２−６個の炭素原子と、１−３個のヘテロ原子とを含む（Ｃ２−６ヘテロアルキル）。一部の実施態様では、前記ヘテロアルキルは、２−５個の炭素原子と、１−３個のヘテロ原子とを含む（Ｃ２−５ヘテロアルキル）。一部の実施態様では、前記ヘテロアルキルは、２−４個の炭素原子と、１−２個のヘテロ原子とを含む（Ｃ２−４ヘテロアルキル）。一部の実施態様では、前記ヘテロアルキルは、２−３個の炭素原子と、１個のヘテロ原子とを含む（Ｃ２−３ヘテロアルキル）。本明細書に用いられる用語「ヘテロアルキレン」は、本明細書に定義されるヘテロアルキル基から２個の水素原子を除去することにより誘導されるビラジカルを指す。ヘテロアルキレン基は、環状型又は非環状型、分岐型又は非分岐型、置換型又は非置換型の場合がある。ヘテロアルキレン基置換体は、安定的な原子団の形成につながる本明細書に説明される置換体のいずれかを含むが、これらに限定されない。 本明細書に用いられる用語「ヘテロアルケニル」は、炭素原子の間に１個以上のヘテロ原子（例えば、酸素、イオウ、窒素、リン又はシリコン原子）を含む、本明細書に定義されるアルケニル原子団を指す。一部の実施態様では、前記ヘテロアルケニル基は、２−２０個の炭素原子と、１−６個のヘテロ原子とを含む（Ｃ１−２０ヘテロアルケニル）。一部の実施態様では、前記ヘテロアルケニルは、２−１０個の炭素原子と、１−４個のヘテロ原子とを含む（Ｃ２−１０ヘテロアルケニル）。一部の実施態様では、前記ヘテロアルケニルは、２−６個の炭素原子と、１−３個のヘテロ原子とを含む（Ｃ２−６ヘテロアルケニル）。一部の実施態様では、前記ヘテロアルケニルは、２−５個の炭素原子と、１−３個のヘテロ原子とを含む（Ｃ２−５ヘテロアルケニル）。一部の実施態様では、前記ヘテロアルケニルは、２−４個の炭素原子と、１−２個のヘテロ原子とを含む（Ｃ２−４ヘテロアルケニル）。一部の実施態様では、前記ヘテロアルケニルは、２−３個の炭素原子と、１個のヘテロ原子とを含む（Ｃ２−３ヘテロアルケニル）。本明細書に用いられる用語「ヘテロアルケニレン」は、本明細書に定義されるヘテロアルケニル基から２個の水素原子を除去することにより誘導されるビラジカルを指す。ヘテロアルケニレン基は、環状型又は非環状型、分岐型又は非分岐型、置換型又は非置換型の場合がある。ヘテロアルケニレン基置換体は、安定的な原子団の形成につながる本明細書に説明される置換体のいずれかを含むが、これらに限定されない。 本明細書に用いられる用語「ヘテロアルキニル」は、炭素原子の間に１個以上のヘテロ原子（例えば、酸素、イオウ、窒素、リン又はシリコン原子）を含む、本明細書に定義されるアルキニル原子団を指す。一部の実施態様では、前記ヘテロアルキニル基は、２−２０個の炭素原子と、１−６個のヘテロ原子とを含む（Ｃ１−２０ヘテロアルキニル）。一部の実施態様では、前記ヘテロアルキニルは、２−１０個の炭素原子と、１−４個のヘテロ原子とを含む（Ｃ２−１０ヘテロアルキニル）。一部の実施態様では、前記ヘテロアルキニルは、２−６個の炭素原子と、１−３個のヘテロ原子とを含む（Ｃ２−６ヘテロアルキニル）。一部の実施態様では、前記ヘテロアルキニルは、２−５個の炭素原子と、１−３個のヘテロ原子とを含む（Ｃ２−５ヘテロアルキニル）。一部の実施態様では、前記ヘテロアルキニルは、２−４個の炭素原子と、１−２個のヘテロ原子とを含む（Ｃ２−４ヘテロアルキニル）。一部の実施態様では、前記ヘテロアルキニルは、２−３個の炭素原子と、１個のヘテロ原子とを含む（Ｃ２−３ヘテロアルキニル）。本明細書に用いられる用語「ヘテロアルキニレン」は、本明細書に定義されるヘテロアルキニル基から２個の水素原子を除去することにより誘導されるビラジカルを指す。ヘテロアルキニレン基は、環状型又は非環状型、分岐型又は非分岐型、置換型又は非置換型の場合がある。ヘテロアルキニレン基置換体は、安定的な原子団の形成につながる本明細書に説明される置換体のいずれかを含むが、これらに限定されない。 本明細書に用いられる用語「複素環」、「ヘテロシクル（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ）」、「ヘテロシクリル（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｙｌ）」は、環状ヘテロ脂肪族基をさす。複素環基は、非芳香族の、部分的に不飽和か、完全に飽和かの３員ないし１０員環システムを指し、非芳香族環と融合した芳香族５員又は６員アリール基又はヘテロアリール基を含む場合がある、３個ないし８個の原子のサイズの単環と、２環及び３環システムとを含む。これらの複素環は、酸素、イオウ及び窒素から独立に選択される１個から３個までのヘテロ原子を有するものを含み、該窒素及びイオウヘテロ原子は、任意的に酸化される場合があり、窒素ヘテロ原子は任意的に４級化される場合がある。一部の実施態様では、複素環という用語は、少なくとも１個の環原子が酸素、イオウ及び窒素から選択されるヘテロ原子（該窒素及びイオウヘテロ原子は任意的に酸化される場合がある）であり、残りの環原子は炭素で、ラジカルは前記環原子のいずれかを介して分子の残りに連結される、非芳香族５員、６員又は７員環又は多環式基を指す。複素環基は、酸素、イオウ及び窒素から独立に選択される１個ないし３個のヘテロ原子を有する融合５員、６員又は７員環を含む、２環又は３環式基を含むが、これらに限定されない。ここで、（ｉ）各５員環は０個ないし２個の２重結合を有し、各６員環は０個ないし２個の２重結合を有し、各７員環は０個ないし３個の２重結合を有し、（ｉｉ）前記窒素及びイオウヘテロ原子は任意的に酸化される場合があり、（ｉｉｉ）前記窒素ヘテロ原子は任意的に４級化される場合があり、（ｉｖ）上記の複素環のいずれかがアリール又はヘテロアリール環と融合する場合がある。代表的な複素環は、アザシクロプロパニル、アザシクロブタニル、１，３−ジアザチジニルピペリジニル、ピペラジニル、アゾカニル、チアラニル、チエタニル、テトラヒドロチオフェニル、ジチオラニル、チアシクロヘキサニル、オキシラニル（ｏｘｉｒａｎｙｌ）、オキセタニル（ｏｘｅｔａｎｙｌ）、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロプラニル、ジオキサニル、オキサチオラニル、モルフォリニル、チオキサニル（ｔｈｉｏｘａｎｙｌ）、テトラヒドロナフチル等を含み、これらは１個以上の置換基を含む場合がある。置換体は、安定的な原子団の形成につながる本明細書に説明される置換体のいずれかを含むが、これらに限定されない。 本明細書に用いられる用語「アリール」は、３−２０個の環原子を有し、該環原子の全てが炭素であり、置換型又は非置換型の場合がある、芳香族単環又は多環式システムを指す。本発明の一部の実施態様では、「アリール」は、１個以上の置換基を含む場合がある、フェニル、ビフェニル、ナフチル等を含むが、これらに限定されない、１個、２個又は３個の芳香族環を有する、単環、２環又は３環式のＣ４−Ｃ２０芳香族環システムを指す。アリール置換体は、安定的な原子団の形成につながる本明細書に説明される置換体のいずれかを含むが、これらに限定されない。本明細書に用いられる用語「アリーレン」は、本明細書に定義されるアリール基から２個の水素原子を除去することにより誘導されるビラジカルを指す。アリーレン基は置換型又は非置換型の場合がある。アリーレン基置換体は、安定的な原子団の形成につながる本明細書に説明される置換体のいずれかを含むが、これらに限定されない。さらにアリーレン基は、本明細書に定義される、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、ヘテロアルキレン基、ヘテロアルケニレン基又はヘテロアルキニレン基にリンカー基として取り込まれる場合がある。 本明細書で用いられる用語「ヘテロアリール」は、３−２０個の環原子を有する芳香族単環又は多環式システムを指し、該システムの１個の環原子が、イオウ、酸素及び窒素から選択され、０、１又は２個の環原子はイオウ、酸素及び窒素から独立に選択され、残りの環原子は炭素で、本ラジカルは前記環原子のいずれかを介して分子の残りと結合される。代表的なヘテロアリールは、１個以上の置換基を含む場合がある、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、ピリジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピリダジニル、トリジニル、テトラジニル、ピロリジニル（ｐｙｙｒｏｌｉｚｉｎｙｌ）、インドリル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾイミダゾリル、インダゾリル、キノリニル、イソキノリニル、キノリジニル、シノリニル（ｃｉｎｎｏｌｉｎｙｌ）、キナゾリニル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノサリニル、チオフェニル、チアナフチニル、フラニル、ベンゾフラニル、ベンゾチアゾリル、チアゾリニル、イソチアゾリル、チアジアゾリニル、オキサゾリニル、イソサゾリル（ｉｓｏｘａｚｏｌｙｌ）、オキサジアジオリル（ｏｘａｄｉａｚｉｏｌｙｌ）、オキサジアジオリル（ｏｘａｄｉａｚｉｏｌｙｌ）等を含むが、これらに限定されない。ヘテロアリール置換体は、安定的な原子団の形成につながる本明細書に説明される置換体のいずれかを含むが、これらに限定されない。さらにヘテロアリーレン基は、本明細書に定義される、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、ヘテロアルキレン基、ヘテロアルケニレン基又はヘテロアルキニレン基にリンカー基として取り込まれる場合がある。ヘテロアリーレン基置換体は、安定的な原子団の形成につながる本明細書に説明される置換体のいずれかを含むが、これらに限定されない。 本明細書で用いられる用語「アシル」は、置換アルキル基であり、一般式−Ｃ（＝Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲＡ、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲＡ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＡ）２、−Ｃ（＝Ｓ）ＲＡ、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（ＲＡ）２、ａｎｄ −Ｃ（＝Ｓ）Ｓ（ＲＡ）、−Ｃ（＝ＮＲＡ）ＲＡ、−Ｃ（＝ＮＲＡ）ＯＲＡ、−Ｃ（＝ＮＲＡ）ＳＲＡ、ａｎｄ −Ｃ（＝ＮＲＡ）Ｎ（ＲＡ）２を有する基を指す。ここでＲＡは、水素、ハロゲン、置換又は非置換ヒドロキシル、置換又は非置換チオール、置換又は非置換アミノ、アシル、任意的に置換された脂肪族、任意的に置換されたヘテロ脂肪族、任意的に置換されたアルキル、任意的に置換されたアルケニル、任意的に置換されたアルキニル、任意的に置換されたアリール、任意的に置換されたヘテロアリール、脂肪族オキシ、ヘテロ脂肪族オキシ、アルキルオキシ、ヘテロアルキルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、脂肪族チオキシ、ヘテロ脂肪族チオキシ、アルキルチオキシ、ヘテロアルキルチオキシ、アリールチオキシ、ヘテロアリールチオキシ、モノ又はジ−脂肪族アミノ、モノ又はジ−ヘテロ脂肪族アミノ、モノ又はジ−ヘテロアルキルアミノ、モノ又はジ−ヘテロアルキルアミノ、モノ又はジ−アリールアミノ、又は、モノ又はジ−ヘテロアリールアミノであるか、又は、ＲＡ基２個がいっしょになって５員又は６員複素環を形成する。代表的なアシル基は、アルデヒド（−ＣＨＯ）、カルボン酸（−ＣＯ２Ｈ）、ケトン、ハロゲン化アシル、エステル、アミド、イミン、炭酸塩、カルバマート及び尿素を含む。アシル置換体は、安定的な原子団の形成につながる本明細書に説明される置換体のいずれかを含むが、これらに限定されない。 本明細書で用いられる用語「アシレン」は、置換アルキレン、置換アルケニレン、置換アルキニレン、置換ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルケニレン、又は置換ヘテロアルキニレン基のサブセットであり、一般式−Ｒ０−（Ｃ＝Ｘ１）−Ｒ０−、−Ｒ０−Ｘ２（Ｃ＝Ｘ１）−Ｒ０−又は−Ｒ０−Ｘ２（Ｃ＝Ｘ１）Ｘ３−Ｒ０−を有するアシル基を指す。ここで、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は、独立に、酸素、イオウ又はＮＲｒであり、ここで、Ｒｒは、水素又は任意的に置換された脂肪族基であり、Ｒ０は、本明細書で定義される、任意的に置換されたアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、ヘテロアルキニレン基である。Ｒ０がアルキレンである代表的なアシレン基は、−（ＣＨ２）Ｔ−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）Ｔ−； −（ＣＨ２）Ｔ−ＮＲｒ（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）Ｔ−；−（ＣＨ２）Ｔ−Ｏ（Ｃ＝ＮＲｒ）−（ＣＨ２）Ｔ−；−（ＣＨ２）Ｔ−ＮＲｒ（Ｃ＝ＮＲｒ）−（ＣＨ２）Ｔ−；−（ＣＨ２）Ｔ−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）Ｔ−；−（ＣＨ２）Ｔ−（Ｃ＝ＮＲｒ）−（ＣＨ２）Ｔ−；−（ＣＨ２）Ｔ−Ｓ（Ｃ＝Ｓ）−（ＣＨ２）Ｔ−；−（ＣＨ２）Ｔ−ＮＲｒ（Ｃ＝Ｓ）−（ＣＨ２）Ｔ−；−（ＣＨ２）Ｔ−Ｓ（Ｃ＝ＮＲｒ）−（ＣＨ２）Ｔ−；−（ＣＨ２）Ｔ−Ｏ（Ｃ＝Ｓ）−（ＣＨ２）Ｔ−；−（ＣＨ２）Ｔ−（Ｃ＝Ｓ）−（ＣＨ２）Ｔ−又は−（ＣＨ２）Ｔ−Ｓ（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）Ｔ−等を含み、これらは１個以上の置換基を含む場合がある。ここでそれぞれのＴは、独立に、０なし２０の整数である。アシレン置換体は、安定的な原子団の形成につながる本明細書に説明される置換体のいずれかを含むが、これらに限定されない。 本明細書で用いられる用語「アミノ」は、式（−ＮＨ２）を指す。「置換アミノ」は、１個だけ置換されたアミン（−ＮＨＲｈ）か、２重置換アミン（−ＮＲｈ２）かのいずれかを指す。ここで、Ｒｈ置換基は、安定的な原子団の形成につながる本明細書に説明される置換体のいずれか（例えば、アミノ保護基：脂肪族、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロ脂肪族、複素環、アリール、ヘテロアリール，アシル、アミノ、ニトロ、ヒドロキシル、チオール、ハロ、脂肪族アミノ、ヘテロ脂肪族アミノ、アルキルアミノ、ヘテロアルキルアミノ、アリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、アルキルアリール、アリールアルキル、脂肪族オキシ、ヘテロ脂肪族オキシ、ヘテロアルキルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、脂肪族チオキシ、ヘテロ脂肪族チオキシ、アルキルチオキシ、ヘテロアルキルチオキシ、アリールチオキシ、ヘテロアリールチオキシ、アシルオキシ等で、これらのそれぞれはさらに置換されたり、されなかったりの場合がある）である。一部の実施態様では、前記２重置換アミン（−ＮＲｈ２）のＲｈ置換基は、５員ないし６員の複素環を形成する。 本明細書で用いられる用語「ヒドロキシ」又は「ヒドロキシル」は、式（−ＯＨ）の基を指す。「置換ヒドロキシル「は、式（−ＯＲｉ）の基を指し、ここでＲｉは、安定的な原子団（例えば、ヒドロキシル保護基：脂肪族、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロ脂肪族、複素環、アリール、ヘテロアリール、アシル、ニトロ、アルキルアリール、アリールアルキル等で、これらのそれぞれはさらに置換されたり、されなかったりする場合がある。）の形成につながるいずれかの置換基の場合がある。 本明細書で用いられる用語「チオ」又は「チオール」は、式（−ＳＨ）の基を指す。「置換チオール」は、式（−ＳＲｒ）の基を指し、ここでＲｒは、安定的な原子団（例えば、チオール保護基：脂肪族、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロ脂肪族、複素環、アリール、ヘテロアリール、アシル、スルフィニル、スルホニル、シアノ、ニトロ、アルキルアリール、アリールアルキル等で、これらのそれぞれはさらに置換されたり、されなかったりする場合がある。）の形成につながるいずれかの置換基の場合がある。 本明細書で用いられる用語「イミノ」は、式（＝ＮＲｒ）の基を指し、ここでＲｒは、水素又は安定的な原子団（例えば、アミノ保護基：脂肪族、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロ脂肪族、複素環、アリール、ヘテロアリール、アシル、スルフィニル、スルホニル、シアノ、ニトロ、アルキルアリール、アリールアルキル等で、これらのそれぞれはさらに置換されたり、されなかったりする場合がある。）の形成につながるいずれかの置換基の場合がある。 本明細書で用いられる用語「アジ化物」又は「アジゾ」は、式（−Ｎ３）の基を指す。 本明細書で用いられる用語「ハロ」又は「ハロゲン」は、フッ素（フルオロ、―Ｆ）、塩素（クロロ、―Ｃｌ）、臭素（−Ｂｒ）及びヨウ素（ヨード、―Ｉ）から選択される原子を指す。 「脱離基」は、不均等開裂において１対の電子とともに解離する分子の断片を指す当業者に理解される用語である。ここで前記分子の断片はアニオン又は中性の分子である。例えば、Smith, March’s Advanced Organic Chemistry 6th ed. (501−502)を参照せよ。代表的な脱離基は、ハロ（例えば、クロロ、ブロモ、ヨード）と、例えば式−ＯＣ（＝Ｏ）ＳＲａａ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＯＣＯ２Ｒａａ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−ＯＣ（＝ＮＲｂｂ）Ｒａａ、−ＯＣ（＝ＮＲｂｂ）ＯＲａａ、−ＯＣ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−ＯＳ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＯＳＯ２Ｒａａ、−ＯＰ（Ｒｃｃ）２、−ＯＰ（Ｒｃｃ）３、−ＯＰ（＝Ｏ）２Ｒａａ、−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲｃｃ）２、−ＯＰ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒｂｂ）２又は−ＯＰ（＝Ｏ）（ＮＲｂｂ）２の活性化置換ヒドロキシル基とを含むが、これらに限定されない。ここで、Ｒａａは、任意的に置換された脂肪族、任意的に置換されたヘテロ脂肪族、任意的に置換されたアリール又は任意的に置換されたヘテロアリールであり、Ｒｂｂは、水素、か、アミノ保護基、任意的に置換された脂肪族、任意的に置換されたヘテロ脂肪族、任意的に置換されたアリール又は任意的に置換されたヘテロアリールであり、Ｒｃｃは、水素、任意的に置換された脂肪族、任意的に置換されたヘテロ脂肪族、任意的に置換されたアリール又は任意的に置換されたヘテロアリールである。 本明細書で用いられる用語「Ｘａａ」は、アミノ酸、例えば、以下の表Ａの標準的なａａか、表Ｂの非標準的なアミノ酸かをさす。一部の実施態様では、用語Ｘａａは、例えば以下の化学式の化合物を指す。 ここで、Ｒ及びＲ’は、独立に、水素、任意的に置換された脂肪族、任意的に置換されたヘテロ脂肪族、任意的に置換されたアリール又は任意的に置換されたヘテロアリールからなる群から選択され、Ｒｄは水素又はアミノ保護基である。上記２つの化学式に含まれるａａは、ポリペプチド及びタンパク質に存在する２０種類の一般的な天然のアルファ−アミノ酸（例えば、以下の表Ａに記載のＡ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖ、標準的なアミノ酸ともよばれる）のＤ−及びＬ−異性体のような天然アルファ−アミノ酸と、非標準的なアルファ−アミノ酸（その例は、以下の表Ｂに記載される）と、ベータ−アミノ酸（標準的又は非標準的、例えば、ベータ−アラニン）とを含むが、これらに限られない。 多くの公知の非天然型アミノ酸が存在し、そのどれもが、本発明のポリペプチドに含まれてもよい。たとえば、Ｓ．Ｈｕｎｔ、Ｔｈｅ Ｎｏｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ：Ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ、Ｇ．Ｃ．Ｂａｒｒｅｔｔ、ＣｈａｐｍａｎおよびＨａｌｌ編集、１９８５年を参照。非天然型アミノ酸のいくつかの例示として、４−ヒドロキシプロリン、デスモシン、γ−アミノ酪酸、β−シアノアラニン、ノルバリン、４−（Ｅ）−ブテニル−４（Ｒ）−メチル−Ｎ−メチル−Ｌ−スレオニン、Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン、１−アミノ−シクロプロパンカルボン酸、１−アミノ−２−フェニル−シクロプロパンカルボン酸、１−アミノ−シクロブタンカルボン酸、４−アミノ−シクロペンテンカルボン酸、３−アミノ−シクロヘキサンカルボン酸、４−ピペリジル酢酸、４−アミノ−１−メチルピロール−２−カルボン酸、２，４−ジアミノ酪酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、２，４−ジアミノ酪酸、２−アミノヘプタン二酸、４−（アミノメチル）安息香酸、４−アミノ安息香酸、オルソ−、メタ−およびパラ−置換フェニルアラニン類（たとえば、−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ６Ｈ５、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ハロ、−ＮＯ２、−ＣＨ３で置換されたもの）、二置換フェニルアラニン類、置換チロシン類（たとえば、さらに、−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ６Ｈ５、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ハロ、−ＮＯ２、−ＣＨ３で置換されたもの）およびスタチンがある。 用語「クリックケミストリー」は、スクリプス研究所のＫ．Ｂａｒｒｙ Ｓｈａｒｐｌｅｓｓによって導入された化学原理であり、反応性基を含む小さな単位どうしを結合することにより、共有結合を素早く、確実に創り出すように仕立てる化学を言う。クリックケミストリーは、具体的な反応は言わないが、自然界でみられる反応を模倣する反応を含む概念を言う。いくつかの実施形態では、クリックケミストリー反応は、モジュール方式で、範囲が広く、高い化学収率を提供し、生成される副産物には害がなく、立体特性があり、８４ｋＪ／ｍｏｌを超える大きな熱力学的駆動力を発揮し、単一反応生成物との反応を有利に行いおよび／または生理的条件下で行うことができる。別の発熱反応は、反応物を「ばね仕掛け」とする。いくつかの実施形態では、クリックケミストリー反応は、高い原子効率を発揮し、簡単な反応条件下で行うことができ、簡単に入手可能な出発原料及び試薬を使用し、毒性のない溶剤を使用しまたは良性もしくは簡単に除去される溶剤（好ましくは水）を使用し、および／またはクロマトグラフではない方法（結晶化または蒸留）による簡単な生成物単離を提供する。 本明細書で使用される用語「クリックケミストリーハンドル」は、クリックケミストリー反応に参加することができる反応物または反応性基を言う。たとえば、ひずみのあるアルキン、たとえばシクロオクチンは、ひずみ促進環化付加に参加することができるので（たとえば、表１参照）、クリックケミストリーハンドルである。一般的に、クリックケミストリー反応には、互いに反応することができるクリックケミストリーハンドルを含む分子が少なくとも２個必要である。本明細書では、互いに反応するそのようなクリックケミストリーハンドルペアを、パートナークリックケミストリーハンドルと言う場合もある。たとえば、アジドは、シクロオクチンまたは他のアルキンに対するパートナークリックケミストリーハンドルである。本発明のいくつかの態様による使用に適切な代表的なクリックケミストリーハンドルを、本明細書、たとえば、表１および２、ならびに図２Ｂに記載する。他の適切なクリックケミストリーハンドルは、当業者に公知である。 用語「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」は、本明細書では交換可能に使用され、ペプチド（アミド）結合によって互いに結合するアミノ酸残基のポリマーを言う。該用語は、任意のサイズ、構造または機能のタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドを言う。普通、タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも３個のアミノ酸長さであろう。タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドは、独立したタンパク質またはタンパク質の収集物を言う場合もある。タンパク質、ペプチドまたはポリペプチド中の１個以上のアミノ酸は、たとえば、炭水化物基、水酸基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーション、官能基化または他の修飾用のリンカーのような化学成分の付加によって修飾してもよい。また、タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドは、単分子であってもよく、多分子複合体であってもよい。タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドは、天然のタンパク質またはペプチドの断片であってもよい。タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドは、天然であっても、組換え体または合成物であっても、これらの任意の組合せであってもよい。 用語「コンジュゲーションされた」または「コンジュゲーション」は、直接または間接的な共有または非共有結合反応で結合される方法による、２個の分子、たとえば２個のタンパク質どうしの会合を言う。クリックケミストリーによるコンジュゲーションにおいては、コンジュゲーションは、クリックケミストリーハンドルの反応により形成される共有結合によるものである。ある実施形態では、会合は共有結合であり、成分は、互いに「コンジュゲーションされている」と言われる。いくつかの実施形態ではタンパク質は、該タンパク質が翻訳された後に、およびいくつかの実施形態ではタンパク質が単離された後に、タンパク質と他の分子との間で共有結合を形成することによって、他の分子、たとえば第二タンパク質に、翻訳後にコンジュゲーションされる。いくつかの実施形態では、タンパク質と第二分子、たとえば第二タンパク質との後翻訳コンジュゲーションは、タンパク質上にクリックケミストリーハンドルが設置され、および第二分子上に前記第一クリックケミストリーハンドルに反応することができる第二クリックケミストリーハンドルが設置され、クリックケミストリーハンドルが反応し、タンパク質と第二分子との間で共有結合を形成するクリックケミストリーを行うことによって達成され、このようにしてキメラタンパク質を生成する。いくつかの実施形態では、２個のタンパク質は、それぞれ、それらのＣ末端でコンジュゲーションされ、Ｃ−Ｃコンジュゲーションされたキメラタンパク質が生成される。いくつかの実施形態では、２個のタンパク質は、それぞれ、それらのＮ末端でコンジュゲーションされ、Ｎ−Ｎコンジュゲーションされたキメラタンパク質が生成される。 本明細書で使用される「検出可能な標識」は、標識が結合されている、タンパク質、ポリペプチドまたは他の成分のような分子の検出を可能にする原子団に導入されている元素、同位体または官能基の少なくとも１個を有する原子団を言う。標識は、直接結合（すなわち結合によって）することができ、または鎖（たとえば、場合によっては置換されているアルキレン、場合によっては置換されているアルケニレン、場合によっては置換されているアルキニレン、場合によっては置換されているヘテロアルキレン、場合によっては置換されているヘテロアルケニレン、場合によっては置換されているヘテロアルキニレン、場合によっては置換されているアリーレン、場合によっては置換されているヘテロアリーレン、または場合によっては置換されているアシレン、またはこれらの任意の組合せであって鎖を創り出すことができるもの）によって結合することができる。標識は、分子、たとえばタンパク質、ポリペプチドまたは他の成分の任意の位置で、結合または導入してもよいことは理解されるだろう。 一般的に、標識は、５つの群、ａ）放射性または重同位体であってもよい、同位体原子団を含む標識であって、ここで、該同位体原子団として、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｆ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、６７Ｇａ、７６Ｂｒ、９９ｍＴｃ（Ｔｃ−９９ｍ）、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂおよび１８６Ｒｅが挙げられるが、これらに限定されない、ｂ）免疫性原子団を含む標識であって、ここで、該免疫性原子団は、抗体または抗原であってもよく、また酵素（たとえば、ホースラディッシュパーオキシダーゼ）に結合してもよい、ｃ）着色された、発光性、燐光性または蛍光性原子団（たとえば、蛍光性標識フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）である標識、ｄ）１個以上の光親和性原子団を有する標識、およびｅ）１個以上の公知の結合パートナー（たとえば、ビオチン−ストレプトアビジン、ＦＫ５０６−ＦＫＢＰ）用のリガンドである標識のいずれか１つ（またはそれ以上）に分類されうる。ある実施形態では、標識は、放射性同位体、好ましくは、β粒子のような検出可能な粒子を発する同位体を含む。ある実施形態では、標識は、蛍光性原子団を含む。ある実施形態では、標識は、蛍光性標識フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）である。ある実施形態では、標識は、１個以上の公知の結合パートナーを持つリガンド原子団を含む。ある実施形態では、標識は、ビオチンを含む。いくつかの実施形態では、標識は、蛍光性ポリペプチド（たとえば、ＧＦＰまたはその誘導体、たとえば、改良ＧＦＰ（ＥＧＦＰ））またはルシフェラーゼ（たとえば、ホタル、レニラまたはガウシアルシフェラーゼ）である。ある実施形態では、標識は、適切な基質（たとえば、ルシフェリン）と反応して、検出可能な信号を発生してもよいことが理解されるだろう。蛍光性タンパク質の限定ではない例示として、ＧＦＰおよびその誘導体、赤や黄色等の異なる色の光を発する発色団を含むタンパク質、およびシアン蛍光性タンパク質などが挙げられる。代表的な蛍光性タンパク質として、たとえば、シリウス、アズライト、ＥＢＦＰ２、タグＢＦＰ、ｍターコイズ、ＥＣＦＰ、セルリアン、タグＣＦＰ、ｍＴＦＰ１、ｍＵｋＧ１、ｍＡＧ１、ＡｃＧＦＰ１、タグＧＦＰ２、ＥＧＦＰ、ｍワサビ、ＥｍＧＦＰ、タグＹＰＦ、ＥＹＦＰ、トバーズ、ＳＹＦＰ２、ビーナス、シトリン、ｍＫＯ、ｍＫＯ２、ｍオレンジ、ｍオレンジ２、タグＲＦＰ、タグＲＦＰ−Ｔ、ｍストロベリー、ｍルビー、ｍチェリー、ｍラズベリー、ｍＫａｔｅ２、ｍプラム、ｍネプチューン、Ｔ−サファイア、ｍアメトリン、ｍケイマが挙げられる。たとえば、Ｃｈａｌｆｉｅ，Ｍ．およびＫａｉｎ，ＳＲ（ｅｄｓ．）Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ａｎｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ，第４７巻）、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．，２００６年および／またはＣｈｕｄａｋｏｖ，ＤＭ，ら、Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ． ９０（３）：１１０３−６３，２０１０ ｆｏｒ ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ｏｆ ＧＦＰ ａｎｄ ｎｕｍｅｒｏｕｓ ｏｔｈｅｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｏｒ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓを参照。いくつかの実施形態では、標識は、ダーククエンチャー、たとえば、フルオロフォアからの励起エネルギーを吸収し、該エネルギーを熱として散逸する物質を含む。 本明細書で使用される用語「抗体」は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する糖タンパク質を言う。用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、交換可能に使用される。例外もあるが、哺乳類の抗体は、主として、それぞれ、２つのＨ鎖と２つの小さなＬ鎖を持つ基本構造で造られている。数種の異なるタイプの抗体Ｈ鎖、およびそれらが持つＨ鎖に基づいた異なるアイソタイプに分類される数種の異なる抗体がある。哺乳類においては、５種類の異なる抗体アイソタイプ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよびＩｇＭが公知であり、これらは、異なる役割を果たし、それらが遭遇する異物の異なるタイプそれぞれに関する適切な免疫応答を直接助ける。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体、たとえば、ＩｇＧ１、２、３または４ヒトサブクラスの抗体である。哺乳類ではない種（たとえば、トリ類、爬虫類、両生類）の抗体も、該用語、たとえば、ＩｇＹ抗体の範囲内に入る。 抗体の一部だけが、抗原の結合に関与し、抗原結合抗体断片、それらの製造および用途は、当業者に周知である。当該分野で周知のように、抗体分子の小部分、パラトープのみが、抗体のエピトープへの結合に関与する（一般的に、Ｃｌａｒｋ，Ｗ．Ｒ．（１９８６年）Ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｏｄｅｒｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ社、ニューヨーク；Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．（１９９１年）Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第７編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，オックスフォードを参照）。たとえば、ｐＦｃ’およびＦｃ領域は、補体カスケードのエフェクターであるが、抗原結合には関与していない。ｐＦｃ’領域が酵素的に切断されている抗体、またはｐＦｃ’領域なしに生成されている抗体であって、Ｆ（ａｂ’）断片（またはＦ（ａｂ’）２断片）を指定している抗体は、完全な抗体の抗原結合部位の両方を保持する。同様に、Ｆｃ領域が酵素的に切断されている抗体、またはＦｃ領域なしに製造されている抗体であって、Ｆａｂ断片を指定している抗体は、完全な抗体分子の抗原結合部位の１つを保持する。Ｆａｂ断片は、共有結合型抗体Ｌ鎖および抗体Ｈ鎖で示されるＦｄの部分で構成される。Ｆｄ断片は、抗体特異性の主な決定因子（単一のＦｄ断片は、代わりの抗体特性のない１０個までの異なるＬ鎖を伴ってもよい）であり、およびＦｄ断片は、単離において、エピトープ結合能を保持する。 当該分野では周知のように、抗体の抗原結合部分内には、抗原のエピトープと直接相互作用する、相補性を決定する領域（ＣＤＲ）と、パラトープの三次構造を維持するフレームワーク領域（ＦＲ）とが存在する（一般的に、Ｃｌａｒｋ，Ｗ．Ｒ．（１９８６）Ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｏｄｅｒｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ社、ニューヨーク；Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．（１９９１）Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第７編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、オックスフォード参照）。免疫グロブリンのＨ鎖Ｆｄ断片およびＬ鎖のどちらにも、それぞれ３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）によって分離される、４つのフレームワーク領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）が存在する。ＣＤＲ、特にＣＤＲ３領域、さらにはＨ鎖ＣＤＲ３が、抗体特異性に大きく貢献する。 哺乳類の抗体の非ＣＤＲ領域は、始めの抗体のエピトープ特異性を保持しながら、非特異性または異種特異性抗体の類似する領域で置き換えてもよいことは当該分野で定着している。これは、非ヒトＣＤＲを共有結合でヒトＦＲおよび／またはＦｃ／ｐＦｃ’領域に結合し、機能的な抗体を生成する「ヒト化」抗体の開発および使用において、最も明確に証明されている。たとえば、米国特許第４，８１６，５６７号、第５，２２５，５３９号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６２号および第５，８５９，２０５号の各明細書参照。 また、完全ヒトモノクローナル抗体も、広範囲のヒト免疫グロブリンＨおよびＬ鎖座に関し、マウスを免疫し遺伝子導入することによって生成することができる。これらのマウス（たとえば、ゼノマウス（Ａｂｇｅｎｉｘ）、ＨｕＭＡｂマウス（Ｍｅｄａｒｅｘ／ＧｅｎＰｈａｒｍ））の免疫化の後、モノクローナル抗体を、標準のハイブリドーマ技術によって生成することができる。これらのモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を有し、したがって、ヒトに投与した時、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を誘発しないだろう。 したがって、当業者であれば認識するように、本発明は、Ｆ（ａｂ’）、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦｄ断片；Ｆｃおよび／またはＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／またはＬ鎖ＣＤＲ３領域が、相同性ヒトまたは非ヒト配列で置き換えられている抗体；ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／またはＬ鎖ＣＤＲ３領域が、相同性ヒトまたは非ヒト配列で置き換えられている抗体；ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／またはＬ鎖ＣＤＲ３領域が、相同性ヒトまたは非ヒト配列で置き換えられている抗体；およびＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２領域が、相同性ヒトまたは非ヒト配列で置き換えられている抗体も提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、いわゆる一本鎖抗体（たとえば、ＳｃＦｖ）、（単一）ドメイン抗体、および他の抗体を提供し、いくつかの実施形態では、細胞内抗体が提供される。ドメイン抗体、ラクダおよびラクダ化抗体およびその断片、たとえば、ＶＨＨドメインまたはナノボディ、たとえば、Ａｂｌｙｎｘ ＮＶおよびＤｏｍａｎｔｉｓの特許および特許公開公報に記載されているものも、該用語「抗体」に包含される。本明細書で使用される用語「抗原結合抗体断片」は、パラトープを含む抗体の断片または抗原に結合する抗体の断片を言い、抗体は結合し、完全な抗体のように、類似の特異性および親和性を持つ。 抗体、たとえば完全ヒトモノクローナル抗体は、ファージディスプレイ（または酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、細菌ディスプレイのような他のディスプレイ方法）を使用して、同定してもよい。ディスプレイライブラリー、たとえば、ファージディスプレイライブラリーは、入手可能であり（および／または当業者により生成することができ）、これをスクリーニングし、たとえば、パニングを使用して、関心のある抗原に結合する抗体を同定することができる。たとえば、Ｓｉｄｈｕ，Ｓ．（ｅｄ．）Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ；ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；第１編２００５年；Ａｉｔｋｅｎ，Ｒ．（ｅｄ．）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；第２編，２００９年参照。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、適切な宿主細胞、たとえば原核生物または真核生物の宿主細胞中で、組換え方法を使用して生成する。いくつかの実施形態では、微生物の宿主細胞（たとえば、細菌、真菌）を使用する。核酸をエンコードする抗体またはその部分を単離し、それらの配列を決定してもよい。そのような核酸配列は、適切なベクター（たとえば、プラスミド）に挿入し、たとえば、発現用の宿主細胞に導入してもよい。いくつかの実施形態では、昆虫の細胞を使用する。いくつかの実施形態では、哺乳類の細胞、たとえばヒトの細胞を使用する。いくつかの実施形態では、抗体を、それを生成する宿主細胞から分泌し、たとえば、培地から単離してもよい。組換えタンパク質の生成および精製方法は、当業者に周知である。 本明細書で使用される用語「キメラ抗体」は、他の分子、たとえば第二抗体または抗原結合抗体断片にコンジュゲーションする抗体または抗原結合抗体断片を言う。いかなる抗体または抗原結合抗体断片、または抗原結合タンパク質ドメインも、本発明の態様によりキメラ抗体を生成するために使用することができる。いくつかの実施形態では、キメラ抗体は、２個のコンジュゲーション抗体もしくは抗体断片、または抗体断片にコンジュゲーションする１個の抗体を含み、ここで、前記コンジュゲーション分子の抗原結合ドメインは、異なる抗原または同じ抗原の異なるエピトープに結合する。このようなキメラ抗体は、２個の異なる抗原／エピトープに結合するので、本明細書では、「二重特異性」と言う。 本明細書で使用される用語「リンカー」は、分子、たとえばタンパク質、および化学基または原子団、たとえばクリックケミストリーハンドルに共有結合で結合する化学基または分子を言う。いくつかの実施形態では、リンカーは、２個の基、分子または原子団の間または脇に位置し、共有結合を介してそれぞれに結合し、これにより２つを結合する。いくつかの実施形態では、リンカーは１個のアミノ酸または複数のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、リンカーは有機分子、基または化学原子団である。 本明細書で使用される用語「ソルタギング」は、タグ、たとえばクリックケミストリーハンドルを、標的分子、たとえば標的タンパク質に付加するプロセスを言う。なお、該用語は、クリックケミストリーハンドルに限定されるものではなく、他のタグを付加するプロセスも言う。適切なタグの例として、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸、ポリヌクレオチド、糖、炭水化物、ポリマー、脂質、脂肪酸、小分子が挙げられるが、これらに限定されない。他の適切なタグも、当業者には明らかであろう。本発明は、この態様に限定されない。いくつかの実施形態では、タグは、ポリペプチドを精製、発現、可溶化および／または検出するために有用な配列を含む。いくつかの実施形態では、タグは、複数の機能を果たすことができる。タグは比較的小さいものが多く、たとえば、数個のアミノ酸から約１００個までのアミノ酸長さの範囲である。いくつかの実施形態では、タグは、１００個を超えるアミノ酸長さ、たとえば、約５００個までのアミノ酸長さ、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、タグは、いくつかの例を挙げると、ＨＡ、ＴＡＰ、Ｍｙｃ、６ＸＨｉｓ、ＦｌａｇまたはＧＳＴタグを含む。いくつかの実施形態では、タグは、溶解度向上タグ（たとえば、ＳＵＭＯタグ、ＮＵＳ Ａタグ、ＳＮＵＴタグ、またはバクテリオファージＴ７のＯｃｒタンパク質の単量体変異体）を含む。たとえば、Ｅｓｐｏｓｉｔｏ Ｄ ａｎｄ Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ ＤＫ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．；１７（４）：３５３−８（２００６年）を参照。いくつかの実施形態では、たとえばプロテアーゼによって、タグは開裂し、これを除去することができる。いくつかの実施形態では、たとえば、タグの機能的部分の隣接するまたは結合するタグ中に、プロテアーゼ開裂部位を含ませることによってこれを行う。代表的なプロテアーゼとして、たとえば、トロンビン、ＴＥＶプロテアーゼ、ファクターＸａ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼなどが挙げられる。いくつかの実施形態では、「自己開裂」タグを使用する。たとえば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０５／０５７６３号明細書を参照。 実施形態の詳細な説明標準的な遺伝子学的方法により、ヘッドトゥテイル方法でポリペプチドの融合することによって、タンパク質複合体の生成が可能になる。しかし、いくつかの適用は、残っている遊離末端に生物活性が要求される場合、それらのＮ末端またはＣ末端によってタンパク質の部位特異性結合のような遺伝学的に不可能な構造から利益を得るだろう。 キメラタンパク質、たとえば、蛍光性タンパク質による遺伝的融合は、原位置でおよびインビボで、それらの細胞局在化（細胞内局在化）を可視化するために、広く使用される（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｊ，Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ ＧＨ（２００３年）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Ｌｉｖｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３００：８７−９１；この文献の全体は、参照によって本明細書に組込まれる）。たとえば、２個の直交性に標識されたキメラの共発現により、タンパク質共局在化および受容体二量体化の動力学の研究が可能になる。さらに、タンパク質融合は、別種の一時的なタンパク質複合体の生物学的関連性を評価するために使用されている。２個以上の相互作用するタンパク質の融合または架橋により、タンパク質複合体を安定化することができ、該融合または架橋は、Ｇ−タンパク質結合型受容体（Ｓｅｉｆｅｒｔ Ｒ，Ｗｅｎｚｅｌ−Ｓｅｉｆｅｒｔ Ｋ，Ｋｏｂｉｌｋａ ＢＫ（１９９９年）ＧＰＣＲ−Ｇ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｉｎｇ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ２０：３８３−３８９；およびＨａｎ Ｙ，Ｍｏｒｅｉｒａ ＩＳ，Ｕｒｉｚａｒ Ｅ，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｈ，Ｊａｖｉｔｃｈ ＪＡ（２００９年）Ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｒｏｔｏｍｅｒｓ ｏｆ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｃｌａｓｓ Ａ ＧＰＣＲ ｄｉｍｅｒｓ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈ５：６８８−６９５；これらの各文献の全内容は、参照により本明細書に組込まれる）、ケモカインおよびサイトカイン（Ｌｅｏｎｇ ＳＲら（１９９７年）ＩＬ−８ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ：ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ＣＸＣＲ１，ＣＸＣＲ２，ａｎｄ ＤＡＲＣ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ６：６０９−６１７；Ｎａｓｓｅｒ ＭＷら（２００９年）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＸＣＲ１ ａｎｄ ＣＸＣＲ２ ｂｙ ＣＸＣＬ８ ｍｏｎｏｍｅｒ ａｎｄ ｄｉｍｅｒ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８３：３４２５−３４３２；およびＤｒｕｒｙ ＬＪら（２０１１年）Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ａｎｄ ｄｉｍｅｒｉｃ ＣＸＣＬ１２ｉｎｈｉｂｉｔ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ＣＸＣＲ４ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｐ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ１０８：１７６５５−１７６６０；これら各文献の全内容は、参照により本明細書に組込まれる）のシグナル伝達および（ヘテロ）二量体化を調査するために使用されている。 キメラタンパク質は、有用な生物化学ツールである他に、癌、自己免疫疾患、リソソーム蓄積症、および脳障害の治療の選択肢としても期待される。（Ｂｏａｄｏ ＲＪら（２００８年）Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｖｉｄｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｙｌａｔｅｄ Ｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ１９：７３１−７３９；Ｌｕ ＪＺ，Ｈｕｉ ＥＫ−Ｗ，Ｂｏａｄｏ ＲＪ，Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ ＷＭ（２０１０年）Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａ Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＩｇＧ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ Ｉｄｕｒｏｎａｔｅ−２−Ｓｕｌｆａｔａｓｅ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ２１：１５１−１５６；Ｚｈｏｕ Ｑ−Ｈ，Ｂｏａｄｏ ＲＪ，Ｌｕ ＪＺ，Ｈｕｉ ＥＫ−Ｗ，Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ ＷＭ（２０１０年）Ｒｅ−Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ａｓ ａｎ ＩｇＧ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｈａｔ Ｐｅｎｅｔｒａｔｅｓ ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ ｉｎ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ７：２１４８−２１５５；およびＰａｓｔａｎ Ｉ，Ｈａｓｓａｎ Ｒ，ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ ＤＪ，Ｋｒｅｉｔｍａｎ ＲＪ（２００６年）Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ６：５５９−５６５；これらの文献の全内容は、参照により本明細書に組込まれる）。付帯的損害を最少にしつつ腫瘍細胞を殺すために、融合タンパク質により認識される反構造を発現する悪性細胞に負荷量を送達する方法として、毒素が抗体、成長因子、およびサイトカインにコンジュゲーションされている（Ｐａｓｔａｎ Ｉ，Ｈａｓｓａｎ Ｒ，ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ ＤＪ，Ｋｒｅｉｔｍａｎ ＲＪ （２００６年）Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ６：５５９−５６５；Ｏｓｕｓｋｙ Ｍ，Ｔｅｓｃｈｋｅ Ｌ，Ｗａｎｇ Ｘ，Ｗｏｎｇ Ｋ，Ｂｕｃｋｌｅｙ ＪＴ （２００８年）Ａ ｃｈｉｍｅｒａ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ２およびｂｉｎｄｉｎｇ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ａｅｒｏｌｙｓｉｎ ｉｓ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｔｏｘｉｃ ｔｏ ｃｅｌｌｓ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ２ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２８３：１５７２−１５７９；およびＲａｆｅｉ Ｍら（２０１１年）Ａ ＭＣＰ１ ｆｕｓｏｋｉｎｅ ｗｉｔｈ ＣＣＲ２−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｕｍｏｒｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ１０：１２１；これらの各文献の全内容は、参照により本明細書に組込まれる）。免疫グロブリンの一本鎖可変断片（ｓｃＦＶ）の２本を融合することによって生成される二重特異性抗体は、腫瘍細胞に特異的な抗原結合ドメインを、Ｔ細胞に特異的なＣＤ３受容体結合ドメインに結合しうる（Ｂａｅｕｅｒｌｅ ＰＡ，Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ Ｃ（２００９年）Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｅｎｇａｇｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ６９：４９４１−４９４４；この文献の全内容は、参照により本明細書に組込まれる）。これにより、Ｔ細胞は、局所的に細胞毒性活性またはサイトカイン放出を行い、所望の抗腫瘍応答を起こすことが可能になる。最後に、タンパク質融合方法は、構造的に規定された生体材料を生成するために使用されている（Ｓｉｎｃｌａｉｒ ＪＣ，Ｄａｖｉｅｓ ＫＭ，Ｖｅｎｉｅｎ−Ｂｒｙａｎ Ｃ，Ｎｏｂｌｅ ＭＥＭ （２０１１）Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｌａｔｔｉｃｅｓ ｂｙ ｆｕｓｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｍａｔｃｈｉｎｇ ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ ｓｙｍｍｅｔｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：５５８−５６２；この文献の全内容は、参照により本明細書に組込まれる）。 融合タンパク質の生成および精製には、生物工学的な問題が残っている。活性な生成物を得るためには、キメラの両ドメインが、活性が求められる残渣および領域の修飾なしで、自然の折り畳みを取り入れなければならない。融合タンパク質を生成する標準的な方法は、２つのタンパク質またはタンパク質断片の読み取り枠の遺伝的融合によるものである。部分的に折り畳まれたタンパク質および不完全な折り畳み生成物は、普通、融合タンパク質において観察される。 たとえば、連結タグによる、自然に折り畳まれた精製タンパク質の翻訳後のコンジュゲーションにより、この問題の回避が可能になるだろう。そのような方法は、適切に修飾されたタンパク質基質のＣ末端またはＮ末端での標識化を利用して、関心のある、対応する遺伝的融合を生成するように正確な付加物を生成する。ソルターゼ触媒アシル基転移反応により、タンパク率のそのような部位特異性標識化、および優れた特異性および定量的に近い収率での、自然条件下のヘッドトゥテイルタンパク質−タンパク質融合物の生成が可能になる（Ｐｏｐｐ ＭＷ，Ｐｌｏｅｇｈ ＨＬ（２０１１年）Ｍａｋｉｎｇ ａｎｄ Ｂｒｅａｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂｏｎｄｓ：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ Ｓｏｒｔａｓｅ．Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ ５０：５０２４−５０３２；Ｇｕｉｍａｒａｅｓ ＣＰら（２０１１年）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｉｎｔｏｘｉｃａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｕｓｅ ｏｆ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ１９５：７５１−７６４；およびＰｏｐｐ ＭＷ，Ａｎｔｏｓ ＪＭ，Ｇｒｏｔｅｎｂｒｅｇ ＧＭ，Ｓｐｏｏｎｅｒ Ｅ，Ｐｌｏｅｇｈ ＨＬ（２００７年）Ｓｏｒｔａｇｇｉｎｇ：ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌａｂｅｌｉｎｇ．Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ３：７０７−７０８．；これらの各文献の全内容は、参照により本明細書に組込まれる）。 標準的なソルターゼ連結方法は、二重特異性抗体またはそれらの断片の構築に大きな魅力はあるが、しかしそのような不自然な連結では、遺伝学的に不可能なタンパク質−タンパク質融合（Ｎ末端からＮ末端；Ｃ末端からＣ末端）を得ることはできない。本発明のいくつかの態様は、そのような融合を行うために、化学連結方法に頼らなければならない認識に関する。初期の化学コンジュゲーション方法は、アミンまたはスルフヒドリルによる非特異性架橋に依存していた（Ｋｉｍ ＪＳ，Ｒａｉｎｅｓ ＲＴ（１９９５年）Ｄｉｂｒｏｍｏｂｉｍａｎｅ ａｓ ａ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２２５：１７４−１７６；この文献の全内容は、参照により本明細書に組込まれる）。修飾の部位および化学量論について制御ができないため不均一な生成物の形成となり、この方法の有用性は制限される。部位特異性突然変異誘発、天然型化学連結、インテイン系連結およびアンバー抑制遺伝子ピロリジンｔＲＮＡ技術と組み合わせた生体直交化学の進歩により、２価および多価抗体の生成に適用する場合、非天然型タンパク質融合の合成が可能になっている（Ｓｃｈｅｌｌｉｎｇｅｒ ＪＧら（２０１２年）Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｏｒｇ Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ１０：１５２１−１５２６；Ｎａｔａｒａｊａｎ Ａら（２００７年）Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉ−ｓｃＦｖ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｔｒｉｖａｌｅｎｔ ａｌｋｙｎｅ−ａｚｉｄｅ１，３−ｄｉｐｏｌａｒ ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ．Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ：６９５−６９７；およびＸｉａｏ Ｊ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＢＳ，Ｔｏｌｂｅｒｔ ＴＪ（２０１０年）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ Ｌｉｎｋｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｄｉｍｅｒｓ ｂｙ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ２１：１９４３−１９４７；これら各文献の全内容は、参照により本明細書に組込まれる）。ユビキチン二量体の構造類似体は、インテイン系連結、部位特異性突然変異および銅触媒クリックケミストリーの組合せによって製造した（Ｗｅｉｋａｒｔ ＮＤ，Ｓｏｍｍｅｒ Ｓ，Ｍｏｏｔｚ ＨＤ（２０１１年）Ｃｌｉｃｋ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｄｉｍｅｒ ａｎａｌｏｇｓ ｔｏ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅ ｌｉｎｋａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＵＢＡ ｄｏｍａｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ４８：２９６；Ｗｅｉｋａｒｔ ＮＤ，Ｍｏｏｔｚ ＨＤ（２０１０年）Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ Ｓｔａｂｌｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−Ｌｉｋｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ ｂｙ ｔｈｅ Ｃｕ Ｉ−Ｃａｔａｌｙｚｅｄ ａｚｉｄｅ−ａｌｋｙｎｅ ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ．ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ １１：７７４−７７７；これらの各文献の全内容は、参照により本明細書に組込まれる）。プロパルギルオキシフェニルアラニンの部位特異性導入によりＧＦＰ二量体の合成が容易になった（Ｓｃｈｅｌｌｉｎｇｅｒ ＪＧら（２０１２年）Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｏｒｇ Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ１０：１５２１−１５２６；およびＢｕｎｄｙ ＢＣ， Ｓｗａｒｔｚ ＪＲ（２０１０年）Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ−Ｐｒｏｐａｒｇｙｌｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ｉｎ ａ Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｄｉｒｅｃｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｌｉｃｋ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ２１：２５５−２６３；これらの各文献の全内容は、参照により本明細書に組込まれる）。 それでもなお、二重特異性の合成は、公開されている方法とは関係のない、修飾天然タンパク質への簡単な接近を可能にし、およびタンパク質末端の効率的な非天然型コンジュゲーションを可能にする。さらに、直交方法が利用できることにより、より複雑なもの（たとえば、ヘテロ三量体およびより高次複合体）のタンパク質構造体でさえ、その合成が可能になる。本明細書では、Ｎ末端またはＣ末端でのタンパク質の、他のタンパク質を始めとする（ただしこれに限らない）他のものへのコンジュゲーションが可能となる多目的に利用できる方法に関する試薬および方法を開示する。本明細書に記載されるコンジュゲーション方法には、ソルターゼ触媒ペプチド転移反応を使用する、クリックケミストリーハンドルのタンパク質への付加反応を含むものもある。次いで、得られた修飾タンパク質は、反応性クリックケミストリーハンドルを含む分子にコンジュゲーションすることができる。 本発明のいくつかの態様は、ソルターゼアシル基転移反応により、適切に修飾されたタンパク質のＣ末端で全種類の置換基を用意に設置できる認識に関する。効を奏するアシル基転移反応に唯一求められるものは、標的タンパク質において、適切に露出されたソルターゼ認識モチーフ、たとえば、ＬＰＸＴまたはＬＰＸＴＧ（配列番号２）モチーフの存在である。ソルターゼ触媒反応に使用することができる求核試薬の設計は、同様に簡単であり、グリシン残基のショートラン（たとえば、１〜１０）またはアルキルアミンでさえ、該反応を進めるのに充分である。標的タンパク質を修飾するために、ソルターゼアシル基転移方法を使用する重要な利点は、合成の容易さ、および生理的条件下で天然タンパク質において反応を実行できることである。 本発明のいくつかの態様は、ソルターゼ反応において使用される求核試薬は、いくつもの修飾、すなわち、ビオチン、検出可能な標識（たとえばフルオロフォア）、脂肪酸、核酸、脂質、放射性同位体、炭水化物、またはグリシン残基の適切に露出したＮ末端ストレッチを持つタンパク質を含むように修飾することができるという認識に関する。さらに、本発明のいくつかの態様は、求核試薬が、反応性化学原子団、たとえば、クリックケミストリー反応、たとえば、銅を使用しないクリックケミストリー反応に適切な原子団または「ハンドル」を含むソルターゼ反応に使用することができることを提供する。そのような求核試薬、たとえば、１〜１０個のグリシン残基を含むペプチド（たとえば、ＧＧＧ）、またはアルキルアミン基を含む任意の化合物（たとえば、ペプチド）、およびクリックケミストリーハンドルは、Ｃ末端ソルターゼ認識モチーフを含む標的タンパク質上ににおいて、Ｃ末端クリックケミストリーハンドルを設置するために使用することができる。ソルターゼ認識モチーフは、Ｃ最末端に位置する必要はないが、効率的にソルターゼ反応に加わるために、酵素が充分に接近できなければならない。 同様に、クリックケミストリーハンドルは、ソルターゼ認識モチーフおよび目的とするクリックケミストリーハンドルを含むペプチドを使用するソルターゼ反応を行うことによって、短いグリシンランを含むタンパク質、またはアルキルアミン基（たとえば、タンパク質のＮ末端に）を含むタンパク質または任意の化合物のＮ末端に設置することができる。したがって、ソルターゼ認識モチーフ、１〜１０個のグリシン残基、または末端アルキルアミン基のいずれかを含む任意のタンパク質は、本発明の態様に従い、クリックケミストリーハンドルで誘導体化することができる。標的タンパク質上のクリックケミストリーハンドルの設置により、タンパク質に対するクリックケミストリー反応性が提供される。たとえば、本明細書に記載するようなクリックケミストリーハンドルを含むタンパク質は、第二分子、たとえば、第二クリックケミストリーハンドルを含む第二分子と反応し、共有結合を形成し、そのため、２個の分子をコンジュゲーションすることができる。 いくつかの実施形態では、反応性クリックケミストリーハンドルを有するタンパク質どうしが、それぞれクリックケミストリー反応を行うことによって、互いにコンジュゲーションする。これにより、タンパク質は、共有結合を介して互いにコンジュゲーションすることになる。本発明の方法によれば、タンパク質のＣ末端またはＮ末端のいずれかに、クリックケミストリーハンドルを設置することができるので、そのように修飾された２個のタンパク質は、従来のタンパク質融合に酷似した、第一タンパク質のＣ末端から第二タンパク質のＮ末端に共有結合を介してコンジュゲーションすることができる。しかし、両標的タンパク質上にＣ末端反応性クリックケミストリーハンドルを設置することにより、共有結合クリックケミストリー結合を介して、それらのＣ末端（Ｃ末端からＣ末端、Ｃ−Ｃ）でコンジュゲーションされたタンパク質が生成可能となり、一方、両標的タンパク質上にＮ末端反応性クリックケミストリーハンドルを設置することにより、それらのＮ末端（Ｎ末端からＮ末端、Ｎ−Ｎ）でコンジュゲーションされたタンパク質が生成可能となる。共有結合Ｃ−Ｃコンジュゲーションも共有結合Ｎ−Ｎコンジュゲーションも、組換えタンパク質融合技術のような従来のタンパク質工学技術によっては行うことができない。クリックケミストリーハンドルのソルターゼ媒介設置 各種ソルターゼ、ソルターゼ媒介アシル基転移反応、及び、タンパク質工学のためのアシル基転移（これはときにはペプチド転移と呼ばれる）におけるそれらの使用が当業者には広く知られている（例えば、Ｐｌｏｅｇｈ他、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０００２７４号、及び、Ｐｌｏｅｇｈ他、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３３０３号を参照のこと。これらのそれぞれの内容全体が引用により本明細書に組み込まれる）。一般に、ソルターゼによって触媒されるペプチド転移反応は、トランスアミダーゼ認識モチーフを含有する化学種の、１つ又は複数のＮ末端グリシン残基を有する化学種との連結をもたらす。一部の実施態様において、ソルターゼ認識モチーフは、本明細書中に記載されるソルターゼ認識モチーフである。特定の実施態様において、ソルターゼ認識モチーフはＬＰＸＴモチーフ又はＬＰＸＴＧモチーフ（配列番号２）である。この技術分野では知られているように、当該認識配列のＣ末端残基を、ソルターゼからいったん遊離した際には不良な求核性を示す成分により置換することは、より効率的な連結に備えるものである。 ソルターゼのアシル基転移反応は、アシルドナーを求核性アシルアクセプターと効率的につなぐための手段を提供する。この原理は、多くのアシルドナー及び数多くの異なるアシルアクセプターに対して広く適用可能である。以前においては、ソルターゼ反応が、タンパク質及び／又はペプチドを相互に連結するために、合成ペプチドを組換えタンパク質に連結するために、レポーター作用分子をタンパク質又はペプチドつなぐために、核酸をタンパク質又はペプチドに接合するために、タンパク質又はペプチドを固体担体又はポリマーにコンジュゲーションするために、また、タンパク質又はペプチドを標識につなぐために用いられた。そのような生成物及びプロセスは、連結生成物の合成に伴う費用及び時間を節約するものであり、かつ、アシルドナーをアシルアクセプターに都合よくつなぐために有用である。 ソルターゼ媒介アシル基転移反応がソルターゼのトランスアミダーゼ活性によって触媒される。トランスアミダーゼは、アシルドナー化合物と、ＮＨ２−ＣＨ２−成分を含有する求核性アシルアクセプターとの間においてペプチド結合（すなわち、アミド結合）を形成することができる酵素である。一部の実施態様において、ソルターゼはソルターゼＡ（ＳｒｔＡ）である。しかしながら、本発明はソルターゼＡの使用に限定されないので、アシル基転移反応を触媒するソルターゼ又はトランスアミダーゼはどれも本発明の一部の実施態様において使用され得ることには留意しなければならない。ソルターゼは、トランスアミダーゼ活性を有する酵素であり、グラム陽性細菌から単離されてきた。グラム陽性細菌は、それらの細胞壁構造の一部として、ペプチドグリカン、同様にまた、多糖及び／又はテイコ酸を有する。グラム陽性細菌には、下記の属が含まれる：アクチノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロコックス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、スタフィロコックス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコックス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属及びストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属。Ｃ末端クリックケミストリーハンドルのソルターゼ媒介設置 特定の実施態様において、Ｃ末端クリックケミストリーハンドルをタンパク質上に設置するためのソルターゼ媒介アシル基転移反応は、下記構造のトランスアミダーゼ認識配列を含むタンパク質：（式中、 トランスアミダーゼ認識配列は、トランスアミダーゼ酵素によって認識されるアミノ酸配列モチーフである；トランスアミダーゼ認識配列はどれもまた、本明細書中ではソルターゼ認識配列又はソルターゼ認識モチーフとして示される； Ｘは、−Ｏ−、−ＮＲ−又は−Ｓ−であり、但し、Ｒは、水素、置換又は非置換の脂肪族、或いは、置換又は非置換のヘテロ脂肪族である； Ａ１は、長さにおいて少なくとも３個のアミノ酸のアミノ酸配列であるか、又は、長さにおいて少なくとも３個のアミノ酸のアミノ酸配列を含む； Ｒ１は、アシル、置換又は非置換の脂肪族、置換又は非置換のヘテロ脂肪族、置換又は非置換のアリール、或いは、置換又は非置換のヘテロアリールである）を、下記式の求核性化合物：（式中、 Ｂ１は、アシル、置換又は非置換の脂肪族、置換又は非置換のヘテロ脂肪族、置換又は非置換のアリール、置換又は非置換のヘテロアリール、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、炭水化物、タグ、金属原子、造影剤、触媒、非ポリペプチドポリマー、認識エレメント、小分子、脂質、リンカー及び／又は標識であり、或いは、アシル、置換又は非置換の脂肪族、置換又は非置換のヘテロ脂肪族、置換又は非置換のアリール、置換又は非置換のヘテロアリール、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、炭水化物、タグ、金属原子、造影剤、触媒、非ポリペプチドポリマー、認識エレメント、小分子、脂質、リンカー及び／又は標識を含み、但し、Ｂ１はクリックケミストリーハンドルを含む； ｎは０であるか、又は、１から１００までの整数（１００を含む）である）と、下記式の化合物：を形成するための好適な条件のもと、トランスアミダーゼ酵素（例えば、ソルターゼ）の存在下で接触させるステップを含む。 クリックケミストリーハンドルは、任意の様式で、かつ、当業者によって想定され得る任意の位置においてＢ１に組み込まれるかもしれないことが当業者によって理解されるであろう。例えば、Ｂ１がアミノ酸（例えば、リシン）を含む場合があり、クリックケミストリーハンドルが、例えば、このアミノ酸の中心の炭素に、このアミノ酸の側鎖に、又は、このアミノ酸のカルボキシル基に、或いは、任意の他の位置に結合される場合がある。クリックケミストリーハンドルをＢ１に組み込む他の方法が当業者には明らかであろうし、本発明はこの点において限定されない。 Ｂ１の性質に依存して、クリックケミストリーハンドルが標的タンパク質のまさにＣ末端に設置されるかもしれないこと、又は、例えば、Ｂ１が、クリックケミストリーハンドルを含む第１のアミノ酸と、多数のさらなるアミノ酸とを含むならば、生じた改変タンパク質はクリックケミストリーハンドルをＣ末端において直接に含むのではなく、Ｃ末端の近くに含むであろうことがさらに理解されるであろう。当業者には明らかであろうが、類似する状況が下記のクリックケミストリーハンドルのＮ末端設置について存在する。 当業者は、特定の実施態様において、トランスアミダーゼ認識配列のＣ末端アミノ酸が除かれることを理解するであろう。すなわち、アシル基：により、トランスアミダーゼ認識端列のＣ末端アミノ酸が置き換えられる。一部の実施態様において、アシル基はである。一部の実施態様において、アシル基はである。 一部の実施態様において、ソルターゼ認識配列又はトランスアミダーゼ認識配列はＬＰＸＴ（式中、Ｘは標準的又は非標準的なアミノ酸である）である。一部の実施態様において、Ｘが、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｎ、Ｑ、Ｋ又はＲから選択される。一部の実施態様において、認識配列が、ＬＰＸＴ、ＬＰＸＴ、ＳＰＸＴ、ＬＡＸＴ、ＬＳＸＴ、ＮＰＸＴ、ＶＰＸＴ、ＩＰＸＴ及びＹＰＸＲから選択される。一部の実施態様において、Ｘが、天然に存在するトランスアミダーゼ認識配列と一致するように選択される。一部の実施態様において、トランスアミダーゼ認識配列が、ＬＰＫＴ（配列番号４８）、ＬＰＩＴ（配列番号４９）、ＬＰＤＴ（配列番号５０）、ＳＰＫＴ（配列番号５１）、ＬＡＥＴ（配列番号５２）、ＬＡＡＴ（配列番号５３）、ＬＡＥＴ（配列番号５４）、ＬＡＳＴ（配列番号５５）、ＬＡＥＴ（配列番号５６）、ＬＰＬＴ（配列番号５７）、ＬＳＲＴ（配列番号５８）、ＬＰＥＴ（配列番号５９）、ＶＰＤＴ（配列番号６０）、ＩＰＱＴ（配列番号６１）、ＹＰＲＲ（配列番号６２）、ＬＰＭＴ（配列番号６３）、ＬＰＬＴ（配列番号６４）、ＬＡＦＴ（配列番号６５）、ＬＰＱＴ（配列番号６６）、ＮＳＫＴ（配列番号６７）、ＮＰＱＴ（配列番号６８）、ＮＡＫＴ（配列番号６９）及びＮＰＱＳ（配列番号７０）から選択される。一部の実施態様において、例えば、ソルターゼＡが使用される特定の実施態様（下記参照）において、トランスアミダーゼ認識モチーフは、アミノ酸配列Ｘ１ＰＸ２Ｘ３（式中、Ｘ１は、ロイシン、イソロイシン、バリン又はメチオニンである；Ｘ２は任意のアミノ酸である；Ｘ３は、トレオニン、セリン又はアラニンである；Ｐはプロリンであり、かつ、Ｇはグリシンである）を含む。上記で示されるような具体的な実施態様において、Ｘ１はロイシンであり、かつ、Ｘ３はトレオニンである。特定の実施態様において、Ｘ２は、アスパルタート、グルタマート、アラニン、グルタミン、リシン又はメチオニンである。特定の実施態様において、例えば、ソルターゼＢが利用される場合、認識配列は多くの場合、アミノ酸配列ＮＰＸ１ＴＸ２（式中、Ｘ１はグルタミン又はリシンである；Ｘ２はアスパラギン又はグリシンである；Ｎはアスパラギンである；Ｐはプロリンである；Ｔはトレオニンである）を含む。本発明は、Ｘの選択が、少なくとも部分的には、所望される性質を、上記認識モチーフを含有する化合物に付与するために基づく場合があるという認識を包含する。一部の実施態様において、Ｘが、上記認識モチーフを含有する化合物の性質を改変するために選択され、例えば、特定の溶媒における溶解性を増大又は低下させるためなどのために選択される。一部の実施態様において、Ｘが、上記認識モチーフを含む化合物を合成する際に使用されるための反応条件と適合し得るように選択され、例えば、合成において使用される反応物に対して非反応性であるように選択される。 一部の実施態様において、Ｘは−Ｏ−である。一部の実施態様において、Ｘは−ＮＲ−である。一部の実施態様において、Ｘは−ＮＨ−である。一部の実施態様において、Ｘは−Ｓ−である。 特定の実施態様において、Ｒ１は、置換された脂肪族である。特定の実施態様において、Ｒ１は、非置換の脂肪族である。一部の実施態様において、Ｒ１は、置換されたＣ１−１２脂肪族である。一部の実施態様において、Ｒ１は、非置換のＣ１−１２脂肪族である。一部の実施態様において、Ｒ１は、置換されたＣ１−６脂肪族である。一部の実施態様において、Ｒ１は、非置換のＣ１−６脂肪族である。一部の実施態様において、Ｒ１はＣ１−３脂肪族である。一部の実施態様において、Ｒ１はブチルである。一部の実施態様において、Ｒ１はｎ−ブチルである。一部の実施態様において、Ｒ１はイソブチルである。一部の実施態様において、Ｒ１はプロピルである。一部の実施態様において、Ｒ１はｎ−プロピルである。一部の実施態様において、Ｒ１はイソプロピルである。一部の実施態様において、Ｒ１はエチルである。一部の実施態様において、Ｒ１はメチルである。 特定の実施態様において、Ｒ１は、置換されたアリールである。特定の実施態様において、Ｒ１は、非置換のアリールである。特定の実施態様において、Ｒ１は、置換されたフェニルである。特定の実施態様において、Ｒ１は、非置換のフェニルである。 一部の実施態様において、Ａ１はタンパク質を含む。一部の実施態様において、Ａ１はペプチドを含む。一部の実施態様において、Ａ１は、抗体、抗体鎖、抗体断片、抗体エピトープ、抗体結合性の抗体ドメイン、ＶＨＨドメイン、単一ドメイン抗体、ラクダ抗体、ナノボディ、アフィボディ、アンチカリン、ＤＡＰＰｉｎ又はアドネクチンを含む。一部の実施態様において、Ａ１は、組換えタンパク質、１つ又は複数のＤ−アミノ酸を含むタンパク質、分岐ペプチド、治療用タンパク質、酵素、多サブユニットタンパク質のポリペプチドサブユニット、膜貫通タンパク質、細胞表面タンパク質、メチル化されたペプチド又はタンパク質、アシル化されたペプチド又はタンパク質、脂質付加されたペプチド又はタンパク質、リン酸化されたペプチド又はタンパク質、或いは、グリコシル化されたペプチド又はタンパク質を含む。一部の実施態様において、Ａ１は、少なくとも３個のアミノ酸を含むアミノ酸配列である。一部の実施態様において、Ａ１はタンパク質を含む。一部の実施態様において、Ａ１はペプチドを含む。一部の実施態様において、Ａ１は抗体を含む。一部の実施態様において、Ａ１は抗体断片を含む。一部の実施態様において、Ａ１は抗体エピトープを含む。一部の実施態様において、Ａ１は緑色蛍光タンパク質を含む。一部の実施態様において、Ａ１はユビキチンを含む。 一部の実施態様において、Ｂ１はクリックケミストリーハンドルを含む。一部の実施態様において、Ｂ１は、本明細書中に記載されるクリックケミストリーハンドルを含む。一部の実施態様において、Ｂ１は、表１、表２又は図２Ｂに記載されるクリックケミストリーハンドルを含む。一部の実施態様において、Ｂ１は、Ｋｏｌｂ，Ｆｉｎｎ及びＳｈａｒｐｌｅｓｓ、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）４０：２００４−２０２１；Ｅｖａｎｓ、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００７）６０：３８４−３９５；Ｊｏｅｒｇ Ｌａｈａｎｎ、Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００９、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ、ＩＳＢＮ９７８−０−４７０−６９９７０−６；又は、Ｂｅｃｅｒ、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＳｃｈｕｂｅｒｔ、ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｅｙｏｎｄ Ｍｅｔａｌ−Ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００９）４８：４９００−４９０８に記載されるクリックケミストリーハンドルを含む（これらのそれぞれの内容全体が引用により本明細書に組み込まれる）。例えば、特定の実施態様において、Ｂ１は、末端アルキレン成分、アジド成分、ひずみのあるアルキン成分、ジエン成分、親ジエン体成分、アルコキシアミン成分、カルボニル成分、ホスフィン成分、ヒドラジド成分、チオール成分又はアルケン成分を含む。一部の実施態様において、Ｂ１は、表１又は表２に、或いは、図２Ｂに記載されるクリックケミストリーハンドルを含む。 特定の実施態様において、ｎは、０から５０までの整数（５０を含む）である。特定の実施態様において、ｎは、０から２０までの整数（２０を含む）である。特定の実施態様において、ｎは０である。特定の実施態様において、ｎは１である。特定の実施態様において、ｎは２である。特定の実施態様において、ｎは３である。特定の実施態様において、ｎは４である。特定の実施態様において、ｎは５である。特定の実施態様において、ｎは６である。Ｎ末端クリックケミストリーハンドルのソルターゼ媒介設置 ある実施態様では、タンパク質上へのＮ末端クリックケミストリーハンドルの設置のためのソルターゼ媒介アシル基転移反応は、構造：（式中、ｎは０又は１〜１００の整数であって、両端を含む；そしてＢ１は、少なくとも３つのアミノ酸残基のアミノ酸配列であるか、又は少なくとも３つのアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む）のタンパク質を構造（式中 トランスアミダーゼ認識配列は、トランスアミダーゼ酵素によって認識されるアミノ酸配列モチーフであり；トランスアミダーゼ認識配列は、本明細書中ではソルターゼ認識配列又はソルターゼ認識モチーフとも称される； Ｘは、−Ｏ−、−ＮＲ−、又は−Ｓ−であり；ここで、Ｒは、水素、置換型若しくは非置換型脂肪族、又は置換型若しくは非置換型ヘテロ脂肪族である； Ａ１は、アシル、置換型若しくは非置換型脂肪族、置換型若しくは非置換型ヘテロ脂肪族、置換型若しくは非置換型アリール、置換型若しくは非置換型ヘテロアリール、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、炭水化物、タグ、金属原子、造影剤、触媒、非ポリペプチドポリマー、認識要素、小分子、脂質、リンカー、及び／又はラベルであるか又はこれらを含み；ここで、Ａ１はクリックケミストリーハンドルを含む；そして Ｒ１は、水素、アシル、置換型若しくは非置換型脂肪族、置換型若しくは非置換型ヘテロ脂肪族、置換型若しくは非置換型アリール、又は置換型若しくは非置換型ヘテロアリールである）の分子と、トランスアミダーゼ酵素、たとえばソルターゼの存在下で、式：の化合物を形成するのに適当な条件下で接触させるステップを含む。クリックケミストリーハンドルは、当業者が想定することができる任意の方法及び任意の位置でＡ１に組み入れることができると当業者は理解するであろう。例えば、Ａ１は、アミノ酸（例えばリジン）を含んでもよく、クリックケミストリーハンドルを例えばアミノ酸の中心炭素、アミノ酸の側鎖、若しくはアミノ酸のアミノ基に、又は任意の他の位置に結合させることができる。クリックケミストリーハンドルをＡ１に組み入れる他の方法は、当業者には明らかであり、本発明はこの点で限定されない。 ある実施態様では、トランスアミダーゼ認識配列のＣ末端アミノ酸が除去されることを当業者は理解するであろう。すなわち、アシル基はトランスアミダーゼ認識配列のＣ末端アミノ酸と置換する。一部の実施態様では、アシル基はである。一部の実施態様では、アシル基はである。 一部の実施態様では、ソルターゼ、又はトランスアミダーゼ認識配列はＬＰＸＴであり、ここで、Ｘは標準的又は非標準的アミノ酸である。一部の実施態様では、Ｘは、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｎ、Ｑ、Ｋ、又はＲから選択される。一部の実施態様では、認識配列は、ＬＰＸＴ、ＬＰＸＴ、ＳＰＸＴ、ＬＡＸＴ、ＬＳＸＴ、ＮＰＸＴ、ＶＰＸＴ、ＩＰＸＴ、及びＹＰＸＲから選択される。一部の実施態様では、Ｘは天然に存在するトランスアミダーゼ認識配列と適合するように選択される。一部の実施態様では、トランスアミダーゼ認識配列は：ＬＰＫＴ（配列番号４８）、ＬＰＩＴ（配列番号４９）、ＬＰＤＴ（配列番号５０）、ＳＰＫＴ（配列番号５１）、ＬＡＥＴ（配列番号５２）、ＬＡＡＴ（配列番号５３）、ＬＡＥＴ（配列番号５４）、ＬＡＳＴ（配列番号５５）、ＬＡＥＴ（配列番号５６）、ＬＰＬＴ（配列番号５７）、ＬＳＲＴ（配列番号５８）、ＬＰＥＴ（配列番号５９）、ＶＰＤＴ（配列番号６０）、ＩＰＱＴ（配列番号６１）、ＹＰＲＲ（配列番号６２）、ＬＰＭＴ（配列番号６３）、ＬＰＬＴ（配列番号６４）、ＬＡＦＴ（配列番号６５）、ＬＰＱＴ（配列番号６６）、ＮＳＫＴ（配列番号６７）、ＮＰＱＴ（配列番号６８）、ＮＡＫＴ（配列番号６９）、及びＮＰＱＳ（配列番号７０）から選択される。一部の実施態様では、例えば、ソルターゼＡが用いられるある実施態様では（下記参照）、トランスアミダーゼ認識モチーフは、アミノ酸配列Ｘ１ＰＸ２Ｘ３を含み、ここで、Ｘ１はロイシン、イソロイシン、バリン又はメチオニンであり；Ｘ２は任意のアミノ酸であり；Ｘ３はスレオニン、セリン又はアラニンであり；Ｐはプロリンであり、Ｇはグリシンである。特定の実施態様では、上記のように、Ｘ１はロイシンであり、Ｘ３はスレオニンである。ある実施態様では、Ｘ２はアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、アラニン、グルタミン、リジン又はメチオニンである。例えばソルターゼＢが利用されるある実施態様では、認識配列は多くの場合アミノ酸配列ＮＰＸ１ＴＸ２を含み、ここで、Ｘ１はグルタミン又はリジンであり；Ｘ２はアスパラギン又はグリシンであり；Ｎはアスパラギンであり；Ｐはプロリンであり、Ｔはスレオニンである。本発明は、Ｘの選択が所望の特性を付与するためには、認識モチーフを含有する化合物に少なくとも部分的に基づく可能性があるという認識を包含する。一部の実施態様では、Ｘは、認識モチーフを含有する化合物の特性を修飾するように、例えば特定の溶媒中の溶解度を増加又は減少させるように選択される。一部の実施態様では、Ｘは、認識モチーフを含む化合物を合成するのに用いられる反応条件と適合性であるように、例えば、合成で使用される反応物質に対して反応しないように、選択される。 一部の実施態様では、Ｘは−Ｏ−である。一部の実施態様では、Ｘは−ＮＲ−である。一部の実施態様では、Ｘは−ＮＨ−である。一部の実施態様では、Ｘは−Ｓ−である。 ある実施態様では、Ｒ１は置換型脂肪族である。ある実施態様では、Ｒ１は非置換型脂肪族である。一部の実施態様では、Ｒ１は置換型Ｃ１−１２脂肪族である。一部の実施態様では、Ｒ１は非置換型Ｃ１−１２脂肪族である。一部の実施態様では、Ｒ１は置換型Ｃ１−６脂肪族である。一部の実施態様では、Ｒ１は非置換型Ｃ１−６脂肪族である。一部の実施態様では、Ｒ１はＣ１−３脂肪族である。一部の実施態様では、Ｒ１はブチルである。一部の実施態様では、Ｒ１はｎ−ブチルである。一部の実施態様では、Ｒ１はイソブチルである。一部の実施態様では、Ｒ１はプロピルである。一部の実施態様では、Ｒ１はｎ−プロピルである。一部の実施態様では、Ｒ１はイソプロピルである。一部の実施態様では、Ｒ１はエチルである。一部の実施態様では、Ｒ１はメチルである。 ある実施態様では、Ｒ１は置換型アリールである。ある実施態様では、Ｒ１は非置換型アリールである。ある実施態様では、Ｒ１は置換型フェニルである。ある実施態様では、Ｒ１は非置換型フェニルである。 一部の実施態様では、Ｂ１はタンパク質を含む。一部の実施態様では、Ｂ１はペプチドを含む。一部の実施態様では、Ｂ１は抗体、抗体鎖、抗体断片、抗体エピトープ、抗原結合抗体ドメイン、ＶＨＨドメイン、単一ドメイン抗体、ラクダ抗体、ナノボディ、アフィボディ、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ又はアドネクチンを含む。一部の実施態様では、Ｂ１は、組換えタンパク質、１以上のＤ−アミノ酸を含むタンパク質、分岐型ペプチド、治療用タンパク質、酵素、マルチサブユニットタンパク質のポリペプチドサブユニット、膜貫通タンパク質、細胞表面タンパク質、メチル化ペプチド若しくはタンパク質、アシル化ペプチド若しくはタンパク質、脂質付加ペプチド若しくはタンパク質、リン酸化ペプチド若しくはタンパク質、又はグリコシル化ペプチド若しくはタンパク質を含む。一部の実施態様では、Ｂ１は少なくとも３つのアミノ酸を含むアミノ酸配列である。一部の実施態様では、Ｂ１はタンパク質を含む。一部の実施態様では、Ｂ１はペプチドを含む。一部の実施態様では、Ｂ１は抗体を含む。一部の実施態様では、Ｂ１は抗体断片を含む。一部の実施態様では、Ｂ１は抗体エピトープを含む。一部の実施態様では、Ｂ１は緑色蛍光タンパク質を含む。一部の実施態様では、Ｂ１はユビキチンを含む。 一部の実施態様では、Ａ１はクリックケミストリーハンドルを含む。一部の実施態様では、Ａ１は、本明細書中で記載されるクリックケミストリーハンドルを含む。一部の実施態様では、Ａ１は表１、表２、又は図２Ｂで記載されるクリックケミストリーハンドルを含む。一部の実施態様では、Ａ１は、Ｋｏｌｂ， Ｆｉｎｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ （２００１） ４０： ２００４−２０２１； Ｅｖａｎｓ， Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （２００７） ６０： ３８４−３９５）； Ｊｏｅｒｇ Ｌａｈａｎｎ， ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２００９， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ， ＩＳＢＮ ９７８−０−４７０−６９９７０−６； ｏｒ Ｂｅｃｅｒ， Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ， ａｎｄ Ｓｃｈｕｂｅｒｔ， ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｅｙｏｎｄ Ｍｅｔａｌ−Ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ， Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ （２００９） ４８： ４９００ − ４９０８；（そのそれぞれの内容全体は、引用により本明細書に組み込まれる）に記載されているクリックケミストリーハンドルを含む。例えば、ある実施態様では、Ａ１は、末端アルキン、アジド、ひずみのあるアルキン、ジエン、親ジエン体、アルコキシアミン、カルボニル、ホスフィン、ヒドラジド、チオール又はアルケン部分を含む。一部の実施態様では、Ａ１は、表１若しくは表２、又は図２Ｂで記載されるクリックケミストリーハンドルを含む。 ある実施態様では、ｎは０〜５０の整数であり、両端を含む。ある実施態様では、ｎは０〜２０の整数であり、両端を含む。ある実施態様では、ｎは０である。ある実施態様では、ｎは１である。ある実施態様では、ｎは２である。ある実施態様では、ｎは３である。ある実施態様では、ｎは４である。ある実施態様では、ｎは５である。ある実施態様では、ｎは６である。好適な酵素及び認識モチーフ ある実施態様では、トランスアミダーゼはソルターゼである。グラム陽性菌から「ソルターゼ」として同定される酵素は、タンパク質を切断し、無傷細胞壁中のプロテオグリカン部分に転座させる。黄色ブドウ球菌から単離されたソルターゼには、ソルターゼＡ（ＳｒｔＡ）及びソルターゼＢ（ＳｒｔＢ）が含まれる。したがって、ある実施態様では、本発明にしたがって用いられるトランスアミダーゼは、例えば黄色ブドウ球菌（Ｓ． ａｕｒｅｕｓ）由来のソルターゼＡである。ある実施態様では、トランスアミダーゼは、例えば黄色ブドウ球菌由来のソルターゼＢである。 ソルターゼは、配列アラインメント及びグラム陽性菌ゲノムからの６１のソルターゼの系統学的分析に基づいて、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤと指定される４つのクラスに分類されている（Ｄｒａｍｓｉ Ｓ， Ｔｒｉｅｕ−Ｃｕｏｔ Ｐ， Ｂｉｅｒｎｅ Ｈ， Ｓｏｒｔｉｎｇ ｓｏｒｔａｓｅｓ： ａ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｐｒｏｐｏｓａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｖａｒｉｏｕｓ ｓｏｒｔａｓｅｓ ｏｆ Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ． Ｒｅｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５６（３）：２８９−９７， ２００５）。これらのクラスは、以下のサブファミリー：クラスＡ（サブファミリー１）、クラスＢ（サブファミリー２）、クラスＣ（サブファミリー３）、クラスＤ（サブファミリー４及び５）に相当し、ソルターゼもＣｏｍｆｏｒｔ及びＣｌｕｂｂによってこれらに分類されている（Ｃｏｍｆｏｒｔ Ｄ， Ｃｌｕｂｂ ＲＴ． Ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｓｏｒｔｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．， ７２（５）：２７１０−２２， ２００４）。前記参考文献は、多くのソルターゼ及び認識モチーフを開示する。Ｐａｌｌｅｎ， Ｍ． Ｊ．； Ｌａｍ， Ａ． Ｃ．； Ａｎｔｏｎｉｏ， Ｍ．； Ｄｕｎｂａｒ， Ｋ． ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２００１， ９（３）， ９７−１０１も参照のこと。当業者は、その配列及び／又はＤｒａｍｉ ｅｔ ａｌ．（上出）に記載されているような他の特性に基づいて、ソルターゼを正しいクラスに容易に帰属させることができるであろう。「ソルターゼＡ」という用語は、本明細書中ではクラスＡソルターゼを指すために用いられ、通常、例えば黄色ブドウ球菌由来のＳｒｔＡなど、任意の特定の細菌種のＳｒｔＡと命名される。同様に、「ソルターゼＢ」は、本明細書中ではクラスＢソルターゼを指すために用いられ、通常、例えば黄色ブドウ球菌由来のＳｒｔＢなど、任意の特定の細菌種のＳｒｔＢと命名される。本発明は、任意の細菌種又は株由来のソルターゼＡに関連する実施態様を包含する。本発明は、任意の細菌種又は株由来のソルターゼＢに関連する実施態様を包含する。本発明は、任意の細菌種又は株由来のクラスＣソルターゼに関連する実施態様を包含する。本発明は、任意の細菌種又は株由来のクラスＤソルターゼに関連する実施態様を包含する。 ＳｒｔＡ及びＳｒｔＢのアミノ酸配列並びにそれらをコード化するヌクレオチド配列は当業者に公知であり、本明細書中で記載される多くの参考文献で開示され、その全ての全内容は、引用により本明細書に組み込まれる。黄色ブドウ球菌ＳｒｔＡ及びＳｒｔＢのアミノ酸配列は相同性であり、例えば、２２％の配列同一性及び３７％配列類似性を共有する。黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のアミノ酸配列も、他のグラム陽性菌由来の酵素の配列と実質的な相同性を有し、そのようなトランスアミダーゼは、本明細書中で記載されるライゲーションプロセスで利用することができる。例えば、ＳｒｔＡに関して、化膿性連鎖球菌（Ｓ． ｐｙｏｇｅｎｅｓ）オープンリーディングフレームの配列決定された領域全体にわたり最良のアラインメントで約３１％配列同一性（及び約４４％配列類似性）がある。アクチノミセス・ネスルンディ（Ａ． ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）オープンリーディングフレームの配列決定された領域全体にわたって最良のアラインメントで約２８％配列同一性がある。異なる細菌株は特定のポリペプチドの配列において相違を示す可能性があり、本明細書中の配列は代表的であることが理解されるであろう。 ある実施態様では、ソルターゼをコード化する化膿性連鎖球菌、アクチノミセス・ネスルンディ、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ． ｍｕｔａｎｓ）、フェカリス菌（Ｅ． ｆａｅｃａｌｉｓ）又は枯草菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）オープンリーディングフレームと１８％以上の配列同一性、２０％以上の配列同一性、又は３０％以上の配列同一性を有するトランスアミダーゼをスクリーニングすることができ、黄色ブドウ球菌からのＳｒｔＡ又はＳｒｔＢに匹敵するトランスアミダーゼ活性を有する酵素を利用することができる（例えば、相当する活性は場合によってＳｒｔＡ又はＳｒｔＢ活性の１０％以上である）。 したがって、本発明の一部の実施態様では、ソルターゼはソルターゼＡ（ＳｒｔＡ）である。ＳｒｔＡはモチーフＬＰＸＴＧ（配列番号２）を認識し、共通の認識モチーフは、例えばＬＰＫＴＧ（配列番号７１）、ＬＰＡＴＧ（配列番号９６）、ＬＰＮＴＧ（配列番号９７）である。一部の実施態様では、ＬＰＥＴＧ（配列番号４）が用いられる。しかしながら、このコンセンサスからはずれるモチーフも認識される可能性がある。例えば、一部の実施態様では、モチーフは４位で「Ｔ」よりはむしろ「Ａ」を含み、例えばＬＰＸＡＧ（配列番号９８）、例えばＬＰＮＡＧ（配列番号９９）である。一部の実施態様では、モチーフは５位で「Ｇ」よりはむしろ「Ａ」を含み、例えばＬＰＸＴＡ（配列番号１００）、例えばＬＰＮＴＡ（配列番号１０１）である。一部の実施態様では、モチーフは２位で「Ｐ」よりもむしろ「Ｇ」を含み、例えばＬＧＸＴＧ（配列番号１０２）、例えばＬＧＡＴＧ（配列番号１０２）である。一部の実施態様では、モチーフは１位で「Ｌ」よりはむしろ「Ｉ」を含み、例えば、ＩＰＸＴＧ（配列番号１０４）、例えばＩＰＮＴＧ（配列番号１０５）又はＩＰＥＴＧ（配列番号１０６）である。 トランスアミダーゼ又はソルターゼによって認識される配列に関する用語「認識モチーフ」及び「認識配列」は、同義的に使用されることが理解されるであろう。用語「トランスアミダーゼ認識配列」は、本明細書において「ＴＲＳ」と略記されることがある。 本発明の一部の実施態様では、ソルターゼは、ソルターゼＢ（ＳｒｔＢ）、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、又はリステリア菌（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）のソルターゼＢである。Ｂクラスのソルターゼ（ＳｒｔＢ）によって認識されるモチーフは、コンセンサス配列ＮＰＸＴＸ、例えば、ＮＰＱＴＮ（配列番号１０８）又はＮＰＫＴＧ（配列番号１０９）などのＮＰ［Ｑ／Ｋ］−［Ｔ／ｓ］−［Ｎ／Ｇ／ｓ］（配列番号１０７）に含まれることが多い。例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）又は炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）のソルターゼＢは、それぞれの細菌におけるＩｓｄＣのＮＰＱＴＮ（配列番号１１０）又はＮＰＫＴＧ（配列番号１１１）モチーフを開裂する（例えば、Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，Ｌ．ａｎｄ Ｓｃｈｎｅｅｗｉｎｄ，Ｏ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１８９（１７），ｐ．６４２５−６４３６，２００７を参照）。クラスＢソルターゼの推定基質に見られる他の認識モチーフは、ＮＳＫＴＡ（配列番号１１２）、ＮＰＱＴＧ（配列番号１１３）、ＮＡＫＴＮ（配列番号１１４）、及びＮＰＱＳＳ（配列番号１１５）である。例えば、リステリア菌（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）に由来するＳｒｔＢは、ＮＡＫＴＮ（配列番号１１６）及びＮＰＱＳＳ（配列番号１１７）などの、２位にＰが欠如した及び／又は３位にＱもしくはＫが欠如した特定のモチーフを認識する（Ｍａｒｉｓｃｏｔｔｉ ＪＦ，Ｇａｒｃｉａ−Ｄｅｌ Ｐｏｒｔｉｌｌｏ Ｆ，Ｐｕｃｃｉａｒｅｌｌｉ ＭＧ．Ｔｈｅ ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｓｏｒｔａｓｅ−Ｂ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ ｖａｒｉｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｔ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｔｗｏ ｏｆ ｔｈｅ ｓｏｒｔｉｎｇ ｍｏｔｉｆ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００９ Ｊａｎ ７．［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］）。 一部の実施態様では、ソルターゼは、クラスＣソルターゼである。クラスＣソルターゼは、認識モチーフとしてＬＰＸＴＧ（配列番号２）を用い得る。 一部の実施態様では、ソルターゼは、クラスＤソルターゼである。このクラスのソルターゼは、コンセンサス配列ＮＡ−［Ｅ／Ａ／Ｓ／Ｈ］−ＴＧ（配列番号１１８）を有するモチーフを認識することが予測される（Ｃｏｍｆｏｒｔ Ｄ、上記を参照）。クラスＤソルターゼは、例えば、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）、トロフェリマ・ウィッペリ（Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｌｅｉ）、サーモビフィダ・フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ）、及びビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）において見られた。ＬＰＸＴＡ（配列番号１００）又はＬＡＸＴＧ（配列番号１２０）は、例えば、それぞれ、サブファミリー４及び５のクラスＤソルターゼの認識配列として働くことができ、サブファミリー−４及びサブファミリー−５酵素は、それぞれ、モチーフＬＰＸＴＡ（配列番号１００）及びＬＡＸＴＧ（配列番号１２２）を処理する。例えば、クラスＤソルターゼである炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）ソルターゼＣは、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）ＢａｓＩ及びＢａｓＨにおけるＬＰＮＴＡ（配列番号１２３）モチーフを特異的に開裂することが示されている（Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ、上記を参照）。 ＱＶＰＴＧＶ（配列番号１２４）モチーフを認識するソルターゼの説明についてはＢａｒｎｅｔｔ ａｎｄ Ｓｃｏｔｔを参照されたい（Ｂａｒｎｅｔｔ，ＴＣ ａｎｄ Ｓｃｏｔｔ，ＪＲ，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｂｙ Ｔｗｏ Ｓｏｒｔａｓｅ Ｇｅｎｅ Ｈｏｍｏｌｏｇｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８４，Ｎｏ．８，ｐ．２１８１−２１９１，２００２）。 本発明は、本明細書に及び／又は本明細書に引用される文献（データベースを含む）に記載されるものなどの任意のグラム陽性菌に見られるソルターゼの使用を想定している。本発明は、グラム陰性菌、例えば、コルウェリア・サイクレリスラエ（Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ）、ミクロブルビファー・デグラダンス（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｄｅｇｒａｄａｎｓ）、ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、シェワネラ・オネイデンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ）、及びシュワネラ・プトレファシエンス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）に見られるソルターゼの使用も想定している。これらのソルターゼは、配列モチーフＬＰ［Ｑ／Ｋ］Ｔ［Ａ／Ｓ］Ｔ（配列番号１２１）を認識する。グラム陽性菌に由来するソルターゼの３位における許容される変化に応じて、配列モチーフＬＰＸＴ［Ａ／Ｓ］（配列番号１１９）、例えば、ＬＰＸＴＡ（配列番号１００）又はＬＰＳＴＳ（配列番号１２８）が使用され得る。 本発明は、内容が引用により本明細書に取り込まれるｈｔｔｐ：／／ｂａｍｉｃｓ３．ｃｍｂｉ．ｋｕｎ．ｎｌ／ｊｏｓ／ｓｏｒｔａｓｅ＿ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ／ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ、及び／又は上記の文献のいずれかに挙げられる実験的に確認されたソルターゼ基質又は推定ソルターゼ基質のいずれかに由来するソルターゼ認識モチーフの使用を想定している。一部の実施態様では、ソルターゼ認識モチーフは、ＬＰＫＴＧ（配列番号７１）、ＬＰＩＴＧ（配列番号７２）、ＬＰＤＴＡ（配列番号７３）、ＳＰＫＴＧ（配列番号７４）、ＬＡＥＴＧ（配列番号７５）、ＬＡＡＴＧ（配列番号７６）、ＬＡＨＴＧ（配列番号７７）、ＬＡＳＴＧ（配列番号７８）、ＬＡＥＴＧ（配列番号７９）、ＬＰＬＴＧ（配列番号８０）、ＬＳＲＴＧ（配列番号８１）、ＬＰＥＴＧ（配列番号４）、ＶＰＤＴＧ（配列番号８２）、ＩＰＱＴＧ（配列番号８３）、ＹＰＲＲＧ（配列番号８４）、ＬＰＭＴＧ（配列番号８５）、ＬＰＬＴＧ（配列番号８６）、ＬＡＦＴＧ（配列番号８７）、ＬＰＱＴＳ（配列番号８９）から選択され、本明細書のどこかに記載されるように、本発明のさまざまな実施態様では、第５の残基が置換されることが理解される。例えば、使用される配列は、ＬＰＸＴ、ＬＡＸＴ、ＬＰＸＡ、ＬＧＸＴ、ＩＰＸＴ、ＮＰＸＴ、ＮＰＸＳ、ＬＰＳＴ（配列番号９０）、ＮＳＫＴ（配列番号９１）、ＮＰＱＴ（配列番号９２）、ＮＡＫＴ（配列番号９３）、ＬＰＩＴ（配列番号９４）、ＬＡＥＴ（配列番号９５）、又はＮＰＱＳ（配列番号７０）であり得る。本発明は、本明細書に開示されるか又は当該技術分野において公知の任意のソルターゼ認識モチーフにおける「Ｘ」が、任意の標準的な又は非標準的なアミノ酸である実施態様を含む。各変形例が開示される。一部の実施態様では、Ｘは、生体に見られるタンパク質に最もよく見られる２０種類の標準的なアミノ酸から選択される。一部の実施態様では、例えば、認識モチーフが、ＬＰＸＴＧ（配列番号２）又はＬＰＸＴである場合、Ｘは、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｎ、Ｑ、Ｋ、又はＲである。一部の実施態様では、特定の認識モチーフにおけるＸは、天然のソルターゼ基質の３位における天然のアミノ酸から選択される。例えば、一部の実施態様では、Ｘは、ＬＰＸＴＧ（配列番号２）又はＬＰＸＴモチーフにおけるＫ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ａから選択され、ここで、ソルターゼは、ソルターゼＡである。一部の実施態様では、Ｘは、ＬＰＸＴＧ（配列番号２）又はＬＰＸＴモチーフにおけるＫ、Ｓ、Ｅ、Ｌ、Ａ、Ｎから選択され、クラスＣソルターゼが使用される。 一部の実施態様では、認識配列は、例えば、Ｎ又はＣ末端に１つ以上のさらなるアミノ酸をさらに含む。例えば、天然のソルターゼ基質における５つのアミノ酸認識配列に対する、Ｎ末端、又はＣ末端近傍に見られるアミノ酸の同一性を有する１つ以上のアミノ酸（例えば、最大で５つのアミノ酸）が組み込まれ得る。このようなさらなるアミノ酸により、認識モチーフの認識を向上させる状況が得られる。 用語「トランスアミダーゼ認識配列」は、マスクされた又はマスクされていないトランスアミダーゼ認識配列を指し得る。マスクされていないトランスアミダーゼ認識配列は、トランスアミダーゼによって認識され得る。マスクされていないトランスアミダーゼ認識配列は、例えば、本明細書に説明されるように、以前にマスクされていたかもしれない。一部の実施態様では、「マスクされたトランスアミダーゼ認識配列」は、トランスアミダーゼによって認識されないが、得られる配列がトランスアミダーゼによって認識されるように容易に修飾され得る（「脱マスキングされる（ｕｎｍａｓｋｅｄ）」）配列である。例えば、一部の実施態様では、マスクされたトランスアミダーゼ認識配列の少なくとも１つのアミノ酸が、該当するトランスアミダーゼによる配列の認識を阻害する、例えば、実質的に防止する部分を含む側鎖を有し、この部分の除去により、トランスアミダーゼが配列を認識することができる。マスキングにより、例えば、一部の実施態様では、少なくとも８０％、９０％、９５％、又はそれ以上だけ（例えば、検出不能なレベルまで）認識を減少させることができる。例として、一部の実施態様では、ＬＰＸＴＧ（配列番号２）などのトランスアミダーゼ認識配列におけるスレオニン残基がリン酸化され、それによって、このスレオニン残基はＳｒｔＡによって認識及び開裂されにくくなる。マスクされた認識配列は、ホスファターゼによる処理によって脱マスキングされ得、それによって、ＳｒｔＡで触媒されるアミド基転移反応に使用できるようになる。クリックケミストリーハンドルを含む修飾タンパク質 一部の実施態様は、Ｃ末端クリックケミストリーハンドル（ＣＣＨ）を含む修飾タンパク質（ＰＲＴ）を提供し、ここで、修飾タンパク質は、式（Ｉ）で表される構造を含む： ＰＲＴ−ＬＰＸＴ−［Ｘａａ］ｙ−ＣＣＨ（Ｉ）。 一部の実施態様は、Ｎ末端クリックケミストリーハンドル（ＣＣＨ）を含む修飾タンパク質（ＰＲＴ）を提供し、ここで、修飾タンパク質は、式（ＩＩ）で表される構造を含む： ＣＨＨ−［Ｘａａ］ｙ−ＬＰＸＴ−ＰＲＴ（ＩＩ）。式（Ｉ）及び（ＩＩ）中： ＰＲＴは、少なくとも３つのアミノ酸のアミノ酸配列であり； それぞれのＸａａは、独立に、アミノ酸残基であり； ｙは、０又は１〜１００の整数であり、 ＬＰＸＴは、ソルターゼ認識モチーフであり； ＣＣＨは、クリックケミストリーハンドルである。一部の実施態様では、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表される構造からなる修飾タンパク質が提供される。クリックケミストリー クリックケミストリーハンドルをそれぞれ含む２つのタンパク質（例えば、求核（Ｎｕ）基を提供するクリックケミストリーハンドルを含む第１のタンパク汁及び第１のクリックケミストリーハンドルのＮｕ基と反応し得る求電子（Ｅ）基を含む第２のタンパク質）が、クリックケミストリー反応条件下で共有結合的にコンジュゲーションされ得る。クリックケミストリーは、２００１年にによって紹介された化学の概念であり、小さい単位を結合することによって迅速かつ容易に物質を生成するように適合された化学を説明するものである（例えば、Ｋｏｌｂ，Ｆｉｎｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）４０：２００４−２０２１；Ｅｖａｎｓ，Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００７）６０：３８４−３９５を参照）。本発明の局面に係る有用なさらなる代表的なクリックケミストリーハンドル、反応条件、及び関連する方法が、全内容が引用により本明細書に取り込まれるＪｏｅｒｇ Ｌａｈａｎｎ，Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ，ＩＳＢＮ ９７８−０−４７０−６９９７０−６に記載されている。 クリックケミストリーは、モジュール式（ｍｏｄｕｌａｒ）であり、範囲が広く、高い化学収率を与え、無害な副生成物を生成し、立体特異的であり、生理学的に安定しており、大きい熱力学的駆動力（例えば、単一の反応生成物との反応に有利に働くために８４／より大きい）を示し、及び／又は高い原子経済性を有するべきである。この概念に適合するいくつかの反応が特定されている：（１）ヒュスゲン１，３−双極性環状付加反応（例えば、単に「クリック反応」と呼ばれることが多い、Ｃｕ（Ｉ）で触媒される段階的な変異（ｓｔｅｐｗｉｓｅ ｖａｒｉａｎｔ）；例えば、Ｔｏｒｎｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２）６７：３０５７−３０６４を参照）。銅及びルテニウムが、この反応によく使用される触媒である。触媒として銅を使用すると、１，４−位置異性体が形成される一方、ルテニウムを使用すると、１，５−位置異性体が形成される；（２）ディールス・アルダー反応などの他の環状付加反応；（３）エポキシド及びアジリジンのような小さいひずみのある環への求核付加；（４）活性化カルボニル基への求核付加；及び（５）炭素−炭素二重結合又は三重結合への付加反応。クリックケミストリーハンドルを介したタンパク質のコンジュゲーション クリックケミストリーを介してコンジュゲーションされる２つのタンパク質では、タンパク質のクリックケミストリーハンドルは、例えば、クリックケミストリーハンドルのうちの１つの反応性部分が第２のクリックケミストリーハンドルの反応性部分と反応して、共有結合を形成し得る点で、互いに反応性である必要がある。クリックケミストリーハンドルのこのような反応性の対は、当業者に周知であり、表Ｉに記載されるものを含むが、これらに限定されない：表Ｉ： 代表的なクリックケミストリーハンドル及び反応。式（Ｉ）および（ＩＩ）にしたがって、それぞれのＲ１、Ｒ２は、独立に、ＰＲＴ−ＬＰＸＴ−［Ｘａａ］ｙ−、または−［Ｘａａ］ｙ−ＬＰＸＴ−ＰＲＴである。 一部の好ましい実施態様では、金属触媒の非存在下で反応して共有結合を形成し得るクリックケミストリーハンドルが使用される。このようなクリックケミストリーハンドルは、当業者に周知であり、Ｂｅｃｅｒ，Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，ａｎｄ Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｅｙｏｎｄ Ｍｅｔａｌ−Ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００９）４８：４９００−４９０８に記載されるクリックケミストリーハンドルを含む。表２： Ｂｅｃｅｒ， Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ， ａｎｄ Ｓｃｈｕｂｅｒｔ， Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｅｙｏｎｄ Ｍｅｔａｌ−Ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ， Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ （２００９） ４８： ４９００−４９０８からの代表的なクリックケミストリーハンドル及び反応。 本明細書に説明されるタンパク質コンジュゲーションの方法に使用するのに適したさらなるクリックケミストリーハンドルが、当業者に周知であり、このようなクリックケミストリーハンドルは、［１］Ｈ．Ｃ．Ｋｏｌｂ，Ｍ．Ｇ．Ｆｉｎｎ，Ｋ．Ｂ．Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．２００１，１１３，２０５６−２０７５；Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００１，４０，２００４−２０２１．［２］ａ）Ｃ．Ｊ．Ｈａｗｋｅｒ，Ｋ．Ｌ．Ｗｏｏｌｅｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００５，３０９，１２００−１２０５；ｂ）Ｄ．Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ｒ．Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｕ．Ｓ．Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．２００７，３６，１３６９−１３８０；ｃ）Ｗ．Ｈ．Ｂｉｎｄｅｒ，Ｒ．Ｓａｃｈｓｅｎｈｏｆｅｒ，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．２００７，２８，１５−５４；ｄ）Ｈ．Ｃ．Ｋｏｌｂ，Ｋ．Ｂ．Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ２００３，８，１１２８−１１３７；ｅ）Ｖ．Ｄ．Ｂｏｃｋ，Ｈ．Ｈｉｅｍｓｔｒａ，Ｊ．Ｈ．ｖａｎ Ｍａａｒｓｅｖｅｅｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００６，５１−６８．［３］ａ）Ｖ．Ｏ．Ｒｏｄｉｏｎｏｖ，Ｖ．Ｖ．Ｆｏｋｉｎ，Ｍ．Ｇ．Ｆｉｎｎ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．２００５，１１７，２２５０−２２５５；Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００５，４４，２２１０−２２１５；ｂ）Ｐ．Ｌ．Ｇｏｌａｓ，Ｎ．Ｖ．Ｔｓａｒｅｖｓｋｙ，Ｂ．Ｓ．Ｓｕｍｅｒｌｉｎ，Ｋ．Ｍａｔｙｊａｓｚｅｗｓｋｉ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００６，３９，６４５１−６４５７；ｃ）Ｃ．Ｎ．Ｕｒｂａｎｉ，Ｃ．Ａ．Ｂｅｌｌ，Ｍ．Ｒ．Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｍ．Ｊ．Ｍｏｎｔｅｉｒｏ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００８，４１，１０５７−１０６０；ｄ）Ｓ．Ｃｈａｓｓａｉｎｇ，Ａ．Ｓ．Ｓ．Ｓｉｄｏ，Ａ．Ａｌｉｘ，Ｍ．Ｋｕｍａｒｒａｊａ，Ｐ．Ｐａｌｅ，Ｊ．Ｓｏｍｍｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２００８，１４，６７１３−６７２１；ｅ）Ｂ．Ｃ．Ｂｏｒｅｎ，Ｓ．Ｎａｒａｙａｎ，Ｌ．Ｋ．Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，Ｌ．Ｚｈａｎｇ，Ｈ．Ｚｈａｏ，Ｚ．Ｌｉｎ，Ｇ．Ｊｉａ，Ｖ．Ｖ．Ｆｏｋｉｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８，１３０，８９２３−８９３０；ｆ）Ｂ．Ｓａｂａ，Ｓ．Ｓｈａｒｍａ，Ｄ．Ｓａｗａｎｔ，Ｂ．Ｋｕｎｄｕ，Ｓｙｎｌｅｔｔ ２００７，１５９１−１５９４．［４］Ｊ．Ｆ．Ｌｕｔｚ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．２００８，１２０，２２１２−２２１４；Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００８，４７，２１８２−２１８４．［５］ａ）Ｑ．Ｗａｎｇ，Ｔ．Ｒ．Ｃｈａｎ，Ｒ．Ｈｉｌｇｒａｆ，Ｖ．Ｖ．Ｆｏｋｉｎ，Ｋ．Ｂ．Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｍ．Ｇ．Ｆｉｎｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，３１９２−３１９３；ｂ）Ｊ．Ｇｉｅｒｌｉｃｈ，Ｇ．Ａ．Ｂｕｒｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．Ｅ．Ｇｒａｍｌｉｃｈ，Ｄ．Ｍ．Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｔ．Ｃａｒｅｌｌ，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００６，８，３６３９−３６４２．［６］ａ）Ｊ．Ｍ．Ｂａｓｋｉｎ，Ｊ．Ａ．Ｐｒｅｓｃｈｅｒ，Ｓ．Ｔ．Ｌａｕｇｈｌｉｎ，Ｎ．Ｊ．Ａｇａｒｄ，Ｐ．Ｖ．Ｃｈａｎｇ，Ｉ．Ａ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｌｏ，Ｊ．Ａ．Ｃｏｄｅｌｌｉ，Ｃ．Ｒ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００７，１０４，１６７９３−１６７９７；ｂ）Ｓ．Ｔ．Ｌａｕｇｈｌｉｎ，Ｊ．Ｍ．Ｂａｓｋｉｎ，Ｓ．Ｌ．Ａｍａｃｈｅｒ，Ｃ．Ｒ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００８，３２０，６６４−６６７；ｃ）Ｊ．Ａ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．Ｂａｓｋｉｎ，Ｃ．Ｒ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｊ．Ｆ．Ｋｏｂｅｒｓｔｅｉｎ，Ｎ．Ｊ．Ｔｕｒｒｏ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００８，３０６４−３０６６；ｄ）Ｊ．Ａ．Ｃｏｄｅｌｌｉ，Ｊ．Ｍ．Ｂａｓｋｉｎ，Ｎ．Ｊ．Ａｇａｒｄ，Ｃ．Ｒ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８，１３０，１１４８６−１１４９３；ｅ）Ｅ．Ｍ．Ｓｌｅｔｔｅｎ，Ｃ．Ｒ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００８，１０，３０９７−３０９９；ｆ）Ｊ．Ｍ．Ｂａｓｋｉｎ，Ｃ．Ｒ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，ＱＳＡＲ Ｃｏｍｂ．Ｓｃｉ．２００７，２６，１２１１−１２１９．［７］ａ）Ｇ．Ｗｉｔｔｉｇ，Ａ．Ｋｒｅｂｓ，Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．Ｒｅｃｌ．１９６１，９４，３２６０−３２７５；ｂ）Ａ．Ｔ．Ｂｌｏｍｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｈ．Ｌｉｕ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９５３，７５，２１５３−２１５４．［８］Ｄ．Ｈ．Ｅｓｓ，Ｇ．Ｏ．Ｊｏｎｅｓ，Ｋ．Ｎ．Ｈｏｕｋ，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００８，１０，１６３３−１６３６．［９］Ｗ．Ｄ．Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｐ．Ｗｕ，Ｔ．Ｖ．Ｈａｎｓｅｎ，Ｊ．Ｇ．Ｌｉｎｄｂｅｒｇ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄｕｃ．２００５，８２，１８３３−１８３６．［１０］Ｙ．Ｚｏｕ，Ｊ．Ｙｉｎ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２００８，１８，５６６４−５６６７．［１１］Ｘ．Ｎｉｎｇ，Ｊ．Ｇｕｏ，Ｍ．Ａ．Ｗｏｌｆｅｒｔ，Ｇ．Ｊ．Ｂｏｏｎｓ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．２００８，１２０，２２８５−２２８７；Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００８，４７，２２５３−２２５５．［１２］Ｓ．Ｓａｗｏｏ，Ｐ．Ｄｕｔｔａ，Ａ．Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ，Ｒ．Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ，Ｏ．Ｂｏｕｌｏｕｓｓａ，Ａ．Ｓａｒｋａｒ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００８，５９５７−５９５９．［１３］ａ）Ｚ．Ｌｉ，Ｔ．Ｓ．Ｓｅｏ，Ｊ．Ｊｕ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２００４，４５，３１４３−３１４６；ｂ）Ｓ．Ｓ．ｖａｎ Ｂｅｒｋｅｌ，Ａ．Ｊ．Ｄｉｒｋｅｓ，Ｍ．Ｆ．Ｄｅｂｅｔｓ，Ｆ．Ｌ．ｖａｎ Ｄｅｌｆｔ，Ｊ．Ｊ．Ｌ．Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ，Ｒ．Ｊ．Ｍ．Ｎｏｌｔｅ，Ｆ．Ｐ．Ｊ．Ｒｕｔｊｅｓ，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ２００７，８，１５０４−１５０８；ｃ）Ｓ．Ｓ．ｖａｎ Ｂｅｒｋｅｌ，Ａ．Ｊ．Ｄｉｒｋｓ，Ｓ．Ａ．Ｍｅｅｕｗｉｓｓｅｎ，Ｄ．Ｌ．Ｌ．Ｐｉｎｇｅｎ，Ｏ．Ｃ．Ｂｏｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｌａｖｅｒｍａｎ，Ｆ．Ｌ．ｖａｎ Ｄｅｌｆｔ，Ｊ．Ｊ．Ｌ．Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ，Ｆ．Ｐ．Ｊ．Ｒｕｔｊｅｓ，ＣｈｅｍＢｉｏ− Ｃｈｅｍ ２００８，９，１８０５−１８１５．［１４］Ｆ．Ｓｈｉ，Ｊ．Ｐ．Ｗａｌｄｏ，Ｙ．Ｃｈｅｎ，Ｒ．Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００８，１０，２４０９−２４１２．［１５］Ｌ．Ｃａｍｐｂｅｌｌ−Ｖｅｒｄｕｙｎ，Ｐ．Ｈ．Ｅｌｓｉｎｇａ，Ｌ．Ｍｉｒｆｅｉｚｉ，Ｒ．Ａ．Ｄｉｅｒｃｋｘ，Ｂ．Ｌ．Ｆｅｒｉｎｇａ，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００８，６，３４６１−３４６３．［１６］ａ）Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｉｏｌ Ｇｒｏｕｐ（Ｅｄ．：Ｓ．Ｐａｔａｉ），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７４；ｂ）Ａ．Ｆ．Ｊａｃｏｂｉｎｅ，Ｉｎ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｃｕｒｉｎｇ ｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩＩＩ（Ｅｄｓ．：Ｊ．Ｄ．Ｆｏｕａｓｓｉｅｒ，Ｊ．Ｆ．Ｒａｂｅｋ），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９９３，Ｃｈａｐ．７，ｐｐ．２１９−２６８．［１７］Ｃ．Ｅ．Ｈｏｙｌｅ，Ｔ．Ｙ．Ｌｅｅ，Ｔ．Ｒｏｐｅｒ，Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｔ Ａ ２００８，４２，５３０１−５３３８．［１８］Ｌ．Ｍ．Ｃａｍｐｏｓ，Ｋ．Ｌ．Ｋｉｌｌｏｐｓ，Ｒ．Ｓａｋａｉ，Ｊ．Ｍ．Ｊ．Ｐａｕｌｕｓｓｅ，Ｄ．Ｄａｍｉｒｏｎ，Ｅ．Ｄｒｏｃｋｅｎｍｕｌｌｅｒ，Ｂ．Ｗ．Ｍｅｓｓｍｏｒｅ，Ｃ．Ｊ．Ｈａｗｋｅｒ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００８，４１，７０６３−７０７０．［１９］ａ）Ｒ．Ｌ．Ａ．Ｄａｖｉｄ，Ｊ．Ａ．Ｋｏｒｎｆｉｅｌｄ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００８，４１，１１５１−１１６１；ｂ）Ｃ．Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｎ．Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｍ．Ｍａｌｋｏｃｈ，Ｍ．Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｅ．Ｍａｌｍｓｔｒｏｍ，Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｔ Ａ ２００８，４６，１３３９−１３４８；ｃ）Ａ．Ｄｏｎｄｏｎｉ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．２００８，１２０，９１３３−９１３５；Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００８，４７，８９９５−８９９７；ｄ）Ｊ．Ｆ．Ｌｕｔｚ，Ｈ．Ｓｃｈｌａａｄ，Ｐｏｌｙｍｅｒ ２００８，４９，８１７−８２４．［２０］Ａ．Ｇｒｅｓｓ，Ａ．Ｖｏｅｌｋｅｌ，Ｈ．Ｓｃｈｌａａｄ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００７，４０，７９２８−７９３３．［２１］Ｎ．ｔｅｎ Ｂｒｕｍｍｅｌｈｕｉｓ，Ｃ．Ｄｉｅｈｌ，Ｈ．Ｓｃｈｌａａｄ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００８，４１，９９４６−９９４７．［２２］Ｋ．Ｌ．Ｋｉｌｌｏｐｓ，Ｌ．Ｍ．Ｃａｍｐｏｓ，Ｃ．Ｊ．Ｈａｗｋｅｒ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８，１３０，５０６２−５０６４．［２３］Ｊ．Ｗ．Ｃｈａｎ，Ｂ．Ｙｕ，Ｃ．Ｅ．Ｈｏｙｌｅ，Ａ．Ｂ．Ｌｏｗｅ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００８，４９５９−４９６１．［２４］ａ）Ｇ．Ｍｏａｄ，Ｅ．Ｒｉｚｚａｒｄｏ，Ｓ．Ｈ．Ｔｈａｎｇ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２００８，４１，１１３３−１１４２；ｂ）Ｃ．Ｂａｒｎｅｒ−Ｋｏｗｏｌｌｉｋ，Ｍ．Ｂｕｂａｃｋ，Ｂ．Ｃｈａｒｌｅｕｘ，Ｍ．Ｌ．Ｃｏｏｔｅ，Ｍ．Ｄｒａｃｈｅ，Ｔ．Ｆｕｋｕｄａ，Ａ．Ｇｏｔｏ，Ｂ．Ｋｌｕｍｐｅｒｍａｎ，Ａ．Ｂ．Ｌｏｗｅ，Ｊ．Ｂ．ＭｃＬｅａｒｙ，Ｇ．Ｍｏａｄ，Ｍ．Ｊ．Ｍｏｎｔｅｒｉｏ，Ｒ．Ｄ．Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｐ．Ｔｏｎｇｅ，Ｐ．Ｖａｎａ，Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｔ Ａ ２００６，４４，５８０９−５８３１．［２５］ａ）Ｒ．Ｊ．Ｐｏｕｎｄｅｒ，Ｍ．Ｊ．Ｓｔａｎｆｏｒｄ，Ｐ．Ｂｒｏｏｋｓ，Ｓ．Ｐ．Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ａ．Ｐ．Ｄｏｖｅ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００８，５１５８−５１６０；ｂ）Ｍ．Ｊ．Ｓｔａｎｆｏｒｄ，Ａ．Ｐ．Ｄｏｖｅ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００９，４２，１４１−１４７．［２６］Ｍ．Ｌｉ，Ｐ．Ｄｅ，Ｓ．Ｒ．Ｇｏｎｄｉ，Ｂ．Ｓ．Ｓｕｍｅｒｌｉｎ，Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｔ Ａ ２００８，４６，５０９３−５１００．［２７］Ｚ．Ｊ．Ｗｉｔｃｚａｋ，Ｄ．Ｌｏｒｃｈａｋ，Ｎ．Ｎｇｕｙｅｎ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２００７，３４２，１９２９−１９３３．［２８］ａ）Ｄ．Ｓａｍａｒｏｏ，Ｍ．Ｖｉｎｏｄｕ，Ｘ．Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｍ．Ｄｒａｉｎ，Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．２００７，９，９９８−１０１１；ｂ）Ｘ．Ｃｈｅｎ，Ｄ．Ａ．Ｆｏｓｔｅｒ，Ｃ．Ｍ．Ｄｒａｉｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００４，４３，１０９１８−１０９２９；ｃ）Ｄ．Ｓａｍａｒｏｏ，Ｃ．Ｅ．Ｓｏｌｌ，Ｌ．Ｊ．Ｔｏｄａｒｏ，Ｃ．Ｍ．Ｄｒａｉｎ，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００６，８，４９８５−４９８８．［２９］Ｐ．Ｂａｔｔｉｏｎｉ，Ｏ．Ｂｒｉｇａｕｄ，Ｈ．Ｄｅｓｖａｕｘ，Ｄ．Ｍａｎｓｕｙ，Ｔ．Ｇ．Ｔｒａｙｌｏｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９９１，３２，２８９３−２８９６．［３０］Ｃ．Ｏｔｔ，Ｒ．Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｕ．Ｓ．Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００８，３５１６−３５１８．［３１］ａ）Ｖ．Ｌａｄｍｉｒａｌ，Ｇ．Ｍａｎｔｏｖａｎｉ，Ｇ．Ｊ．Ｃｌａｒｋｓｏｎ，Ｓ．Ｃａｕｅｔ，Ｊ．Ｌ．Ｉｒｗｉｎ，Ｄ．Ｍ．Ｈａｄｄｌｅｔｏｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００６，１２８，４８２３−４８３０；ｂ）Ｓ．Ｇ．Ｓｐａｉｎ，Ｍ．Ｉ．Ｇｉｂｓｏｎ，Ｎ．Ｒ．Ｃａｍｅｒｏｎ，Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｔ Ａ ２００７，４５，２０５９−２０７２．［３２］Ｃ．Ｒ．Ｂｅｃｅｒ，Ｋ．Ｂａｂｉｕｃｈ，Ｋ．Ｐｉｌｚ，Ｓ．Ｈｏｒｎｉｇ，Ｔ．Ｈｅｉｎｚｅ，Ｍ．Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｄｔ，Ｕ．Ｓ．Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００９，４２，２３８７−２３９４．［３３］Ｏｔｔｏ Ｐａｕｌ Ｈｅｒｍａｎｎ Ｄｉｅｌｓ ａｎｄ Ｋｕｒｔ Ａｌｄｅｒ ｆｉｒｓｔ ｄｏｃｕｍｅｎｔｅｄ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ １９２８．Ｔｈｅｙ ｒｅｃｅｉｖｅｄ ｔｈｅ Ｎｏｂｅｌ Ｐｒｉｚｅ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ １９５０ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ｗｏｒｋ ｏｎ ｔｈｅ ｅｐｏｎｙｍｏｕｓ ｒｅａｃｔｉｏｎ．［３４］ａ）Ｈ．Ｌ．Ｈｏｌｍｅｓ，Ｒ．Ｍ．Ｈｕｓｂａｎｄ，Ｃ．Ｃ．Ｌｅｅ，Ｐ．Ｋａｗｕｌｋａ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９４８，７０，１４１−１４２；ｂ）Ｍ．Ｌａｕｔｅｎｓ，Ｗ．Ｋｌｕｔｅ，Ｗ．Ｔａｍ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９６，９６，４９−９２；ｃ）Ｋ．Ｃ．Ｎｉｃｏｌａｏｕ，Ｓ．Ａ．Ｓｎｙｄｅｒ，Ｔ．Ｍｏｎｔａｇｎｏｎ，Ｇ．Ｖａｓｓｉｌｉｋｏｇｉａｎｎａｋｉｓ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．２００２，１１４，１７４２−１７７３；Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００２，４１，１６６８−１６９８；ｄ）Ｅ．Ｊ．Ｃｏｒｅｙ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．２００２，１１４，１７２４−１７４１；Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００２，４１，１６５０−１６６７．［３５］ａ）Ｈ．Ｄｕｒｍａｚ，Ａ．Ｄａｇ，Ｏ．Ａｌｔｉｎｔａｓ，Ｔ．Ｅｒｄｏｇａｎ，Ｇ．Ｈｉｚａｌ，Ｕ．Ｔｕｎｃａ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００７，４０，１９１−１９８；ｂ）Ｈ．Ｄｕｒｍａｚ，Ａ．Ｄａｇ，Ａ．Ｈｉｚａｌ，Ｇ．Ｈｉｚａｌ，Ｕ．Ｔｕｎｃａ，Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｔ Ａ ２００８，４６，７０９１−７１００；ｃ）Ａ．Ｄａｇ，Ｈ．Ｄｕｒｍａｚ，Ｅ．Ｄｅｍｉｒ，Ｇ．Ｈｉｚａｌ，Ｕ．Ｔｕｎｃａ，Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｔ Ａ ２００８，４６，６９６９−６９７７；ｄ）Ｂ．Ｇａｃａｌ，Ｈ．Ａｋａｔ，Ｄ．Ｋ．Ｂａｌｔａ，Ｎ．Ａｒｓｕ，Ｙ．Ｙａｇｃｉ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００８，４１，２４０１−２４０５；ｅ）Ａ．Ｄａｇ，Ｈ．Ｄｕｒｍａｚ，Ｕ．Ｔｕｎｃａ，Ｇ．Ｈｉｚａｌ，Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｔ Ａ ２００９，４７，１７８−１８７．［３６］Ｍ．Ｌ．Ｂｌａｃｋｍａｎ，Ｍ．Ｒｏｙｚｅｎ，Ｊ．Ｍ．Ｆｏｘ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８，１３０，１３５１８−１３５１９．［３７］Ｉｔ ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ ｎｏｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｒａｎｓ−ｃｙｃｌｏｏｃｔｅｎｅ ｉｓ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｄｉｅｎｏｐｈｉｌｅ ｔｏｗａｒｄ ｔｅｔｒａｚｉｎｅｓ ａｎｄ ｓｅｖｅｎ ｏｒｄｅｒｓ ｏｆ ｍａｇｎｉｔｕｄｅ ｍｏｒｅ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｔｈａｎ ｃｉｓ−ｃｙｃｌｏｏｃｔｅｎｅ．［３８］Ｎ．Ｋ．Ｄｅｖａｒａｊ，Ｒ．Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ，Ｓ．Ａ．Ｈｉｌｄｅｒｂｒａｎｄ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２００８，１９，２２９７−２２９９．［３９］Ｗ．Ｓｏｎｇ，Ｙ．Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｑｕ，Ｑ．Ｌｉｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８，１３０，９６５４−９６５５．［４０］Ｗ．Ｓｏｎｇ，Ｙ．Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｑｕ，Ｍ．Ｍ．Ｍａｄｄｅｎ，Ｑ．Ｌｉｎ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．２００８，１２０，２８７４−２８７７；Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００８，４７，２８３２−２８３５．［４１］Ａ．Ｄａｇ，Ｈ．Ｄｕｒｍａｚ，Ｇ．Ｈｉｚａｌ，Ｕ．Ｔｕｎｃａ，Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｔ Ａ ２００８，４６，３０２−３１３．［４２］ａ）Ａ．Ｊ．Ｉｎｇｌｉｓ，Ｓ．Ｓｉｎｎｗｅｌｌ，Ｔ．Ｐ．Ｄａｖｉｓ，Ｃ．Ｂａｒｎｅｒ−Ｋｏｗｏｌｌｉｋ，Ｍ．Ｈ．Ｓｔｅｎｚｅｌ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００８，４１，４１２０−４１２６；ｂ）Ｓ．Ｓｉｎｎｗｅｌｌ，Ａ．Ｊ．Ｉｎｇｌｉｓ，Ｔ．Ｐ．Ｄａｖｉｓ，Ｍ．Ｈ．Ｓｔｅｎｚｅｌ，Ｃ．Ｂａｒｎｅｒ−Ｋｏｗｏｌｌｉｋ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００８，２０５２−２０５４．［４３］Ａ．Ｊ．Ｉｎｇｌｉｓ，Ｓ．Ｓｉｎｗｅｌｌ，Ｍ．Ｈ．Ｓｔｅｎｚｅｌ，Ｃ．Ｂａｒｎｅｒ−Ｋｏｗｏｌｌｉｋ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．２００９，１２１，２４４７−２４５０；Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００９，４８，２４１１−２４１４に記載されるクリックケミストリー反応相手、基、及びハンドルを含むが、これらに限定されない。上記に引用される全ての文献は、本明細書に提供される本発明の概念及び方法に係るタンパク質における設置に適したクリックケミストリーハンドルの開示のために、引用により本明細書に取り込まれる。 例えば、一部の実施態様では、クリックケミストリーハンドルとしてＣ末端のひずみのあるアルキン基、例えば、Ｃ末端シクロオクチン基を含む第１のタンパク質が提供され、クリックケミストリーハンドルとしてＣ末端アジド基を含む第２のタンパク質が提供される。２つのクリックケミストリーハンドルは、共有結合を介してコンジュゲーションされた第１及び第２のタンパク質をもたらすひずみ促進環状付加を行い得るため、高いに反応性である。この例では、タンパク質の２つのＣ末端は、互いにコンジュゲーションされ、それは、Ｃ−Ｃ又は炭素間（Ｃ ｔｏ Ｃ）コンジュゲーションともよばれる。 一部の実施態様では、−ＳＨ、−ＯＨ、−ＮＨＲｂ５、−ＮＨ−ＮＨＲｂ５、又は−Ｎ＝ＮＨから選択される求核性のクリックケミストリーハンドル（Ｎｕ）を含む第１の分子、例えば、第１のタンパク質が、求電子性の相手クリックケミストリーハンドル（Ｅ）を含む第２の分子、例えば、第２のタンパク質にコンジュゲーションされて、式：（式中、Ｚｂ９は、−Ｓ−、−Ｏ−、−Ｎ（Ｒｂ５）−、−ＮＨ−Ｎ（Ｒｂ５）−、又は−Ｎ＝Ｎ−である）のコンジュゲーションされた基とともにキメラタンパク質が形成される。一部の実施態様では、求核性のクリックケミストリーハンドルＮｕは−ＳＨであり、Ｚｂ９は−Ｓ−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＯＨであり、Ｚｂ９は−Ｏ−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＮＨＲｂ５であり、Ｚｂ９は−Ｎ（Ｒｂ５）−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＮＨ−ＮＨＲｂ５であり、Ｚｂ９は−ＮＨ−Ｎ（Ｒｂ５）−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−Ｎ＝ＮＨであり、Ｚｂ９は−Ｎ＝Ｎ−である。一部の実施態様では、Ｒｂ５は水素である。 一部の実施態様では、Ｎｕは、−ＳＨ、−ＯＨ、−ＮＨＲｂ５、−ＮＨ−ＮＨＲｂ５、又は−Ｎ＝ＮＨであり、Ｅは、であり、２つの分子、例えば、２つのタンパク質はコンジュゲーションされて、キメラ分子、例えば、キメラタンパク質が形成され、ここで、Ｎｕ及びＥは、結合されて、式：（式中、Ｚｂ９は、−Ｓ−、−Ｏ−、−Ｎ（Ｒｂ５）−、−ＮＨ−Ｎ（Ｒｂ５）−、又は−Ｎ＝Ｎ−である）のコンジュゲーションされた基が形成される。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＳＨであり、Ｚｂ９は−Ｓ−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＯＨであり、Ｚｂ９は−Ｏ−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＮＨＲｂ５であり、Ｚｂ９は−Ｎ（Ｒｂ５）−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＮＨ−ＮＨＲｂ５であり、Ｚｂ９は−ＮＨ−Ｎ（Ｒｂ５）−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−Ｎ＝ＮＨであり、Ｚｂ９は−Ｎ＝Ｎ−である。一部の実施態様では、Ｒｂ５は水素である。 一部の実施態様では、Ｎｕは、−ＳＨ、−ＯＨ、−ＮＨＲｂ５、−ＮＨ−ＮＨＲｂ５、又は−Ｎ＝ＮＨであり、Ｅは、であり、２つの分子、例えば、２つのタンパク質はコンジュゲーションされて、キメラ分子、例えば、キメラタンパク質が形成され、ここで、Ｎｕ及びＥは、結合されて、式：（式中、Ｚｂ９は、−Ｓ−、−Ｏ−、−Ｎ（Ｒｂ５）−、−ＮＨ−Ｎ（Ｒｂ５）−、又は−Ｎ＝Ｎ−である）のコンジュゲーションされた基が形成される。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＳＨであり、Ｚｂ９は−Ｓ−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＯＨであり、Ｚｂ９は−Ｏ−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＮＨＲｂ５であり、Ｚｂ９は−Ｎ（Ｒｂ５）−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＮＨ−ＮＨＲｂ５であり、Ｚｂ９は−ＮＨ−Ｎ（Ｒｂ５）−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−Ｎ＝ＮＨであり、Ｚｂ９は−Ｎ＝Ｎ−である。一部の実施態様では、Ｒｂ５は水素である。一部の実施態様では、Ｒｂ６は、水素、任意的に置換された脂肪族、又は任意的に置換されたヘテロ脂肪族である。一部の実施態様では、Ｒｂ６は、水素又はＣ１−６アルキルである。一部の実施態様では、Ｒｂ６は、水素又は−ＣＨ３である。一部の実施態様では、Ｒｂ８は水素である。一部の実施態様では、Ｒｂ８はアミノ保護基である。 一部の実施態様では、Ｎｕは、−ＳＨ、−ＯＨ、−ＮＨＲｂ５、−ＮＨ−ＮＨＲｂ５、又は−Ｎ＝ＮＨであり、Ｅは、であり、２つの分子、例えば、２つのタンパク質はコンジュゲーションされて、キメラ分子、例えば、キメラタンパク質が形成され、ここで、Ｎｕ及びＥは、結合されて、式：（式中、Ｚｂ９は、−Ｓ−、−Ｏ−、−Ｎ（Ｒｂ５）−、−ＮＨ−Ｎ（Ｒｂ５）−、又は−Ｎ＝Ｎ−である）のコンジュゲーションされた基が形成される。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＳＨであり、Ｚｂ９は−Ｓ−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＯＨであり、Ｚｂ９は−Ｏ−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＮＨＲｂ５であり、Ｚｂ９は−Ｎ（Ｒｂ５）−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＮＨ−ＮＨＲｂ５であり、Ｚｂ９は−ＮＨ−Ｎ（Ｒｂ５）−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−Ｎ＝ＮＨであり、Ｚｂ９は−Ｎ＝Ｎ−である。一部の実施態様では、Ｒｂ５は水素である。一部の実施態様では、Ｒｂ６は、水素、任意的に置換された脂肪族、又は任意的に置換されたヘテロ脂肪族である。一部の実施態様では、Ｒｂ６は、水素又はＣ１−６アルキルである。一部の実施態様では、Ｒｂ６は、水素又は−ＣＨ３である。一部の実施態様では、Ｒｂ１１は水素である。一部の実施態様では、Ｒｂ１１は酸素保護基である。 一部の実施態様では、Ｎｕは、−ＳＨ、−ＯＨ、−ＮＨＲｂ５、−ＮＨ−ＮＨＲｂ５、又は−Ｎ＝ＮＨであり、Ｅは、−ＣＯ２Ｒｂ６、−ＣＯＸｂ７であり、２つの分子、例えば、２つのタンパク質はコンジュゲーションされて、キメラ分子、例えば、キメラタンパク質が形成され、ここで、Ｎｕ及びＥは、結合されて、式：（式中、Ｚｂ９は、−Ｓ−、−Ｏ−、−Ｎ（Ｒｂ５）−、−ＮＨ−Ｎ（Ｒｂ５）−、又は−Ｎ＝Ｎ−である）のコンジュゲーションされた基が形成される。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＳＨであり、Ｚｂ９は−Ｓ−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＯＨであり、Ｚｂ９は−Ｏ−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＮＨＲｂ５であり、Ｚｂ９は−Ｎ（Ｒｂ５）−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＮＨ−ＮＨＲｂ５であり、Ｚｂ９は−ＮＨ−Ｎ（Ｒｂ５）−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−Ｎ＝ＮＨであり、Ｚｂ９は−Ｎ＝Ｎ−である。一部の実施態様では、Ｒｂ５は水素である。 一部の実施態様では、Ｎｕは、−ＳＨ、−ＯＨ、−ＮＨＲｂ５、−ＮＨ−ＮＨＲｂ５、又は−Ｎ＝ＮＨであり、Ｅは、であり、２つの分子、例えば、２つのタンパク質はコンジュゲーションされて、キメラ分子、例えば、キメラタンパク質が形成され、ここで、Ｎｕ及びＥは、結合されて、式：（式中、Ｚｂ９は、−Ｓ−、−Ｏ−、−Ｎ（Ｒｂ５）−、−ＮＨ−Ｎ（Ｒｂ５）−、又は−Ｎ＝Ｎ−である）のコンジュゲーションされた基が形成される。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＳＨであり、Ｚｂ９は−Ｓ−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＯＨであり、Ｚｂ９は−Ｏ−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＮＨＲｂ５であり、Ｚｂ９は−Ｎ（Ｒｂ５）−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＮＨ−ＮＨＲｂ５であり、Ｚｂ９は−ＮＨ−Ｎ（Ｒｂ５）−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−Ｎ＝ＮＨであり、Ｚｂ９は−Ｎ＝Ｎ−である。一部の実施態様では、Ｒｂ５は水素である。一部の実施態様では、Ｒｂ６は、水素、任意的に置換された脂肪族、又は任意的に置換されたヘテロ脂肪族である。一部の実施態様では、Ｒｂ６は、水素又はＣ１−６アルキルである。一部の実施態様では、Ｒｂ６は、水素又は−ＣＨ３である。 一部の実施態様では、Ｎｕは、−ＳＨ、−ＯＨ、−ＮＨＲｂ５、−ＮＨ−ＮＨＲｂ５、又は−Ｎ＝ＮＨであり、Ｅは、であり、２つの分子、例えば、２つのタンパク質はコンジュゲーションされて、キメラ分子、例えば、キメラタンパク質が形成され、ここで、Ｎｕ及びＥは、結合されて、式：（式中、Ｚｂ９は、−Ｓ−、−Ｏ−、−Ｎ（Ｒｂ５）−、−ＮＨ−Ｎ（Ｒｂ５）−、又は−Ｎ＝Ｎ−である）のコンジュゲーションされた基が形成される。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＳＨであり、Ｚｂ９は−Ｓ−である（チオール−イン反応）。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＯＨであり、Ｚｂ９は−Ｏ−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＮＨＲｂ５であり、Ｚｂ９は−Ｎ（Ｒｂ５）−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＮＨ−ＮＨＲｂ５であり、Ｚｂ９は−ＮＨ−Ｎ（Ｒｂ５）−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−Ｎ＝ＮＨであり、Ｚｂ９は−Ｎ＝Ｎ−である。一部の実施態様では、Ｒｂ５は水素である。一部の実施態様では、Ｒｂ６は、水素、任意的に置換された脂肪族、又は任意的に置換されたヘテロ脂肪族である。一部の実施態様では、Ｒｂ６は、水素又はＣ１−６アルキルである。一部の実施態様では、Ｒｂ６は、水素又は−ＣＨ３である。 一部の実施態様では、Ｎｕは、−ＳＨ、−ＯＨ、−ＮＨＲｂ５、−ＮＨ−ＮＨＲｂ５、又は−Ｎ＝ＮＨであり、Ｅは、であり、２つの分子、例えば、２つのタンパク質はコンジュゲーションされて、キメラ分子、例えば、キメラタンパク質が形成され、ここで、Ｎｕ及びＥは、結合されて、式：（式中、Ｚｂ９は、−Ｓ−、−Ｏ−、−Ｎ（Ｒｂ５）−、−ＮＨ−Ｎ（Ｒｂ５）−、又は−Ｎ＝Ｎ−である）のコンジュゲーションされた基が形成される。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＳＨであり、Ｚｂ９は−Ｓ−である（チオール−イン反応）。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＯＨであり、Ｚｂ９は−Ｏ−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＮＨＲｂ５であり、Ｚｂ９は−Ｎ（Ｒｂ５）−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＮＨ−ＮＨＲｂ５であり、Ｚｂ９は−ＮＨ−Ｎ（Ｒｂ５）−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−Ｎ＝ＮＨであり、Ｚｂ９は−Ｎ＝Ｎ−である。 一部の実施態様では、Ｎｕは、−ＳＨ、−ＯＨ、−ＮＨＲｂ５、−ＮＨ−ＮＨＲｂ５、又は−Ｎ＝ＮＨであり、Ｅは、であり、２つの分子、例えば、２つのタンパク質はコンジュゲーションされて、キメラ分子、例えば、キメラタンパク質が形成され、ここで、Ｎｕ及びＥは、結合されて、式：（式中、Ｚｂ９は、−Ｓ−、−Ｏ−、−Ｎ（Ｒｂ５）−、−ＮＨ−Ｎ（Ｒｂ５）−、又は−Ｎ＝Ｎ−である）のコンジュゲーションされた基が形成される。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＳＨであり、Ｚｂ９は−Ｓ−である（チオール−イン反応）。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＯＨであり、Ｚｂ９は−Ｏ−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＮＨＲｂ５であり、Ｚｂ９は−Ｎ（Ｒｂ５）−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＮＨ−ＮＨＲｂ５であり、Ｚｂ９は−ＮＨ−Ｎ（Ｒｂ５）−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−Ｎ＝ＮＨであり、Ｚｂ９は−Ｎ＝Ｎ−である。 一部の実施態様では、Ｎｕは、−ＳＨ、−ＯＨ、−ＮＨＲｂ５、−ＮＨ−ＮＨＲｂ５、又は−Ｎ＝ＮＨであり、Ｅは、であり、２つの分子、例えば、２つのタンパク質はコンジュゲーションされて、キメラ分子、例えば、キメラタンパク質が形成され、ここで、Ｎｕ及びＥは、結合されて、式：（式中、Ｚｂ９は、−Ｓ−、−Ｏ−、−Ｎ（Ｒｂ５）−、−ＮＨ−Ｎ（Ｒｂ５）−、又は−Ｎ＝Ｎ−である）のコンジュゲーションされた基が形成される。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＳＨであり、Ｚｂ９は−Ｓ−である（チオール−イン反応）。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＯＨであり、Ｚｂ９は−Ｏ−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＮＨＲｂ５であり、Ｚｂ９は−Ｎ（Ｒｂ５）−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＮＨ−ＮＨＲｂ５であり、Ｚｂ９は−ＮＨ−Ｎ（Ｒｂ５）−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−Ｎ＝ＮＨであり、Ｚｂ９は−Ｎ＝Ｎ−である。 一部の実施態様では、Ｎｕは、−ＳＨ、−ＯＨ、−ＮＨＲｂ５、−ＮＨ−ＮＨＲｂ５、又は−Ｎ＝ＮＨであり、Ｅは、であり、２つの分子、例えば、２つのタンパク質はコンジュゲーションされて、キメラ分子、例えば、キメラタンパク質が形成され、ここで、Ｎｕ及びＥは、結合されて、式：（式中、Ｚｂ９は、−Ｓ−、−Ｏ−、−Ｎ（Ｒｂ５）−、−ＮＨ−Ｎ（Ｒｂ５）−、又は−Ｎ＝Ｎ−である）のコンジュゲーションされた基が形成される。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＳＨであり、Ｚｂ９は−Ｓ−である（チオール−イン反応）。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＯＨであり、Ｚｂ９は−Ｏ−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＮＨＲｂ５であり、Ｚｂ９は−Ｎ（Ｒｂ５）−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−ＮＨ−ＮＨＲｂ５であり、Ｚｂ９は−ＮＨ−Ｎ（Ｒｂ５）−である。一部の実施態様では、Ｎｕは−Ｎ＝ＮＨであり、Ｚｂ９は−Ｎ＝Ｎ−である。 一部の実施態様では、Ｎｕは−Ｎ＝ＮＨであり、Ｅは−ＣＨＯであり、２つの分子はコンジュゲーションされて、式（ＩＩＩ）のホモ２量体又はヘテロ２量体ポリペプチドが形成され、ここで、Ｎｕ及びＥは、結合されて、式：のコンジュゲーションされた基が形成される。 一部の実施態様では、Ｎｕは−ＮＨＲｂ５であり、Ｒｂ５は水素であり、Ｅは−ＣＨＯであり、２つの分子、例えば、２つのタンパク質はコンジュゲーションされて、キメラ分子、例えば、キメラタンパク質が形成され、ここで、Ｎｕ及びＥは、結合されて、式：のコンジュゲーションされた基が形成される。 一部の実施態様では、Ｎｕは−ＮＨ−Ｎ（Ｒｂ５）−であり、Ｒｂ５は水素であり、Ｅは−ＣＨＯであり、２つの分子、例えば、２つのタンパク質はコンジュゲーションされて、キメラ分子、例えば、キメラタンパク質が形成され、ここで、Ｎｕ及びＥは、結合されて、式：のコンジュゲーションされた基が形成される。 一部の実施態様では、Ｎｕは、であり、Ｅは、であり、２つの分子、例えば、２つのタンパク質は、ディールス・アルダー反応を介してコンジュゲーションされて、キメラ分子、例えば、キメラタンパク質が形成され、ここで、Ｎｕ及びＥは、結合されて、式：のコンジュゲーションされた基が形成される。一部の実施態様では、Ｒｂ１０は水素である。一部の実施態様では、Ｒｂ６は、水素又は任意的に置換された脂肪族、例えば、アシルである。 一部の実施態様では、Ｎｕは−Ｎ３であり、Ｅは、であり、２つの分子、例えば、２つのタンパク質は、ヒュスゲン１，３−双極性環状付加反応を介してコンジュゲーションされて、キメラ分子、例えば、キメラタンパク質が形成され、ここで、Ｎｕ及びＥは、結合されて、式：又はのコンジュゲーションされた基が形成される。一部の実施態様では、Ｒｂ６は、水素、任意的に置換された脂肪族、又は任意的に置換されたヘテロ脂肪族である。一部の実施態様では、Ｒｂ６は、水素又はＣ１−６アルキルである。一部の実施態様では、Ｒｂ６は、水素又は−ＣＨ３である。一部の実施態様では、Ｒｂ６は水素である。 一部の実施態様では、クリックケミストリーハンドルＮｕ（ここで、各Ｎｕは、独立に、−ＳＨ、−ＯＨ、−ＮＨＲｂ５、−ＮＨ−ＮＨＲｂ５、又は−Ｎ＝ＮＨである）をそれぞれ含む２つのタンパク質は、２つのポリペプチドを、式（式中、Ｘｂ７は脱離基であり、Ｗ３は、任意的に置換されたアルキレン；任意的に置換されたアルケニレン；任意的に置換されたアルキニレン；任意的に置換されたヘテロアルキレン；任意的に置換されたヘテロアルケニレン；任意的に置換されたヘテロアルキニレン；任意的に置換されたアリーレン；又は任意的に置換されたヘテロアリーレンからなる群から選択される）のビス求電子剤と反応させて、式：（式中、Ｚｂ９は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒｂ５）−、−ＮＨ−Ｎ（Ｒｂ５）−、又は−Ｎ＝Ｎ−である）のコンジュゲーションされた基を得ることによって、コンジュゲーションされる。一部の実施態様では、各Ｎｕは−ＳＨであり、各Ｚｂ９は−Ｓ−である。一部の実施態様では、各Ｎｕは−ＯＨであり、各Ｚｂ９は−Ｏ−である。一部の実施態様では、各Ｎｕは−ＮＨＲｂ５であり、各Ｚｂ９は−Ｎ（Ｒｂ５）−である。一部の実施態様では、各Ｎｕは−ＮＨ−ＮＨＲｂ５であり、各Ｚｂ９は−ＮＨ−Ｎ（Ｒｂ５）−である。一部の実施態様では、各Ｎｕは−Ｎ＝ＮＨであり、各Ｚｂ９は−Ｎ＝Ｎ−である。一部の実施態様では、Ｗ３は、任意的に置換されたアルキレンである。一部の実施態様では、Ｗ３は、任意的に置換されたアリーレンである。一部の実施態様では、Ｗ３は、任意的に置換されたヘテロアリーレンである。２個のＮｕ基と２個のＸｂ７基とのさまざまな組合せが考えられる。一部の実施態様では、２個のＮｕ基、ひいては２個のＺｂ９基は同じである。一部の実施態様では、２個のＮｕ基、ひいては２個のＺｂ９基は異なる。一部の実施態様では、２個のＸｂ７基は同じである。一部の実施態様では、２個のＸｂ７基は異なる。 Ｗ３が、任意的に置換されたアルキレンである一部の実施態様では、ビス求電子剤は、式：のものである。 例えば、ビス求電子剤が、式：のものである場合、得られるコンジュゲーションされた基は、式：のものである。 Ｗ３が、任意的に置換されたヘテロアリーレンである一部の実施態様では、ビス求電子剤は、式：のものである。 例えば、ビス求電子剤が、式：のものである場合、得られるコンジュゲーションされた基は、式のものである。 一部の実施態様では、クリックケミストリーハンドルＥ（ここで、各Ｅは、独立に、脱離基、−ＣＨＯ、−ＣＯ２Ｒｂ６、−ＣＯＸｂ７、から選択される）をそれぞれ含む２つのタンパク質は；２つのポリペプチドを、ビス求核剤Ｎｕ−−Ｗ４−−Ｎｕ（ここで、各Ｎｕは、−ＳＨ、−ＯＨ、−ＮＨＲｂ５、−ＮＨ−ＮＨＲｂ５、−Ｎ＝ＮＨ、−Ｎ＝Ｃ、−Ｎ３、又はであり、Ｗ４は、独立に、任意的に置換されたアルキレン；任意的に置換されたアルケニレン；任意的に置換されたアルキニレン；任意的に置換されたヘテロアルキレン；任意的に置換されたヘテロアルケニレン；任意的に置換されたヘテロアルキニレン；任意的に置換されたアリーレン；任意的に置換されたヘテロアリーレン；又はそれらの組合せを表す）と反応させて；コンジュゲーションされたポリペプチドを得ることによって、コンジュゲーションされる。Ｗ４にコンジュゲーションされた２個のＥ基は、独立に、上述され、以下にも挙げられるコンジュゲーションされた基のいずれかに対応する：２個のＥ基のさまざまな組合せが考えられる。一部の実施態様では、２個のＥ基は同じである。一部の実施態様では、２個のＥ基は異なる。一部の実施態様では、２個のＮｕ基、ひいては２個のＺｂ９基は異なる。一部の実施態様では、２個のＸｂ７基は同じである。一部の実施態様では、２個のＸｂ７基は異なる。キメラタンパク質及びその使用 本発明のいくつかの実施態様は、キメラタンパク質、例えばソルターゼ認識モチーフを含み、クリックケミストリーを介して第２分子にコンジュゲーションしたタンパク質を提供する。いくつかの実施態様では、キメラタンパク質は、抗体又は抗体断片、例えばナノボディを含む。いくつかの実施態様では、抗体又は抗体断片は、治療用抗体又は抗体断片、例えば治療標的抗原に結合する抗体又は抗体断片である。本発明はこの点において限定的でないため、いくつかの実施態様は、当業者に公知のあらゆる治療用抗体を包含している。さらに、治療用抗原、例えば治療用抗原の同一又は異なるエピトープに結合する公知の治療用抗体としての任意の抗体又は抗体断片は、例えば本明細書で説明されるキメラ抗体の生成のために、本発明のいくつかの実施態様で使用してよい。いくつかの実施態様は、本明細書で説明する方法により、このような治療用抗体の誘導体化の結果として生成されるキメラ抗体、又は治療用抗原に結合する抗体を提供する。 いくつかの実施態様では、キメラタンパク質は、細胞集団、組織、生物又は被検体内の特定の抗原、細胞型又は部位を標的にする。例えば、いくつかの実施態様では、キメラ二重特異性抗体が提供されており、これは標的部位（例えば、器官、細胞又は細胞型（例えば腫瘍細胞等の疾患状態の細胞）、組織又は疾患部位）に抗体を向ける第１抗原結合ドメインと、例えば治療的機能等の機能を提供する第２抗原結合ドメインとを含む。このような治療的機能は、毒素により、又は標的部位に対して特異的な細胞若しくは細胞型を引きつける分子により提供できる。いくつかの実施態様では、キメラタンパク質が提供され、これは、例えばある被検体における特異的な細胞、細胞型、組織又は部位を標的にする抗体を含み、この抗体はクリックケミストリーを介して、治療薬、例えば小型分子又は治療用ポリペプチドにコンジュゲーションされる。いくつかの実施態様では、本明細書で提供される治療用タンパク質は、標的抗原としての腫瘍抗原に結合する。いくつかの実施態様では、本明細書で提供される治療用タンパク質は、公知の、あるいは可能性のある病原体（例えばウイルス、細菌、真菌又は寄生生物）の抗原に結合する。 本明細書で提供されるキメラポリペプチド及びタンパク質は、クリックケミストリーハンドルを含むか、又はそれに結合可能ないずれの治療薬も含んでよいことを当業者に理解されたい。 いくつかの実施態様では、本明細書で説明される方法及び試薬は、固体若しくは半固体の支持体又は表面、例えば粒子（場合により磁性）、微粒子、ナノ粒子、ビーズ、スライド、フィルター又はウェル（例えばマルチウェル／マイクロタイタープレート）に標的タンパク質を付着させるために使用する。 いくつかの実施態様では、本明細書で説明される方法及び試薬並びに修飾タンパク質、例えば本明細書で説明されるキメラタンパク質又はキメラ抗体を、研究、検出、スクリーニング、診断アッセイ又は治療用途のために、インビトロ、インビボで使用する。代表的な非限定的治療用途には、感染症治療、癌治療及び代謝性疾患治療が挙げられる。本発明はこの点において限定的でないため、他の治療用途は当業者にとって明らかであろう。選択された標的タンパク質 いずれの場合においても本発明を限定することなく、本項では特定の標的タンパク質について述べる。一般的に、本明細書で提供される方法により、いずれのタンパク質又はポリペプチドを、クリックケミストリーハンドルを運ぶように修飾する、及び／又はクリックケミストリーを介して別の分子にコンジュゲーションすることができる。いくつかの実施態様では、標的タンパク質は、自然発生タンパク質又はポリペプチドと、少なくとも８０％又は少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、８６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又は１００％一致するポリペプチドを含むか、又はそれのみから構成される。いくつかの実施態様では、標的タンパク質は、わずか１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸が自然発生配列と異なっている。いくつかの実施態様では、自然発生タンパク質は、例えばヒト起源の哺乳動物タンパク質である。いくつかの実施態様では、タンパク質は、抗体、抗体断片又は抗原結合ドメインを含むタンパク質である。いくつかの実施態様では、自然発生タンパク質は、サイトカイン、例えばＩ型サイトカインである。特定の関心対象であるいくつかの実施態様では、標的タンパク質は、４ヘリックス束タンパク質、例えば４ヘリックス束サイトカインである。代表的な４ヘリックス束サイトカインとしては、例えば特定のインターフェロン（例えばＩ型インターフェロン、例えばＩＦＮ‐α）、インターロイキン（例えばＩＬ‐２、ＩＬ‐３、ＩＬ‐４、ＩＬ‐５、ＩＬ‐６、ＩＬ‐７、ＩＬ‐１２）及びコロニー刺激因子（例えばＧ‐ＣＳＦ、ＧＭ‐ＣＳＦ、Ｍ‐ＣＳＦ）が挙げられる。ＩＦＮは、例えばインターフェロンアルファ２ａ又はインターフェロンアルファ２ｂであってよい。特定のこれらサイトカインの詳細な説明は、例えばMott HR and Campbell ID. “Four-helix bundle growth factors and their receptors: protein-protein interactions.” Curr Opin Struct Biol. 1995 Feb;5(1):114-21と；Chaiken IM, Williams WV. “Identifying structure-function relationships in four-helix bundle cytokines: towards de novo mimetics design.” Trends Biotechnol. 1996 Oct;14(10):369-75及び；Klaus W, et al., “The three-dimensional high resolution structure of human interferon alpha-2a determined by heteronuclear NMR spectroscopy in solution”. J Mol Biol., 274(4):661-75, 1997を参照されたい。 いくつかの実施態様では、サイトカインは、前述のサイトカインの１種以上に類似した構造を有する。例えば、サイトカインは、白血病抑制因子（ＬＩＦ）又はオンコスタチンＭ等のＩＬ‐６クラスサイトカインであってよい。いくつかの実施態様では、サイトカインは、本来、ＧＰ１３０シグナル伝達サブユニットを含む受容体に結合するものである。他の関心対象の４ヘリックス束タンパク質としては、成長ホルモン（ＧＨ）、プロラクチン（ＰＲＬ）及び胎盤性ラクトゲンが挙げられる。いくつかの実施態様では、標的タンパク質は、赤血球産生刺激剤、例えば４ヘリックス束サイトカインでもあるエリスロポエチン（ＥＰＯ）である。いくつかの実施態様では、赤血球産生刺激剤は、ＥＰＯ変異体、例えば新赤血球産生刺激タンパク質（ＮＥＳＰ）とも呼ばれるダーベポエチンアルファであり、これはＮ結合炭水化物鎖を５つ含むように操作されている（これは組み換えＨｕＥＰＯより２つ多い）。いくつかの実施態様では、タンパク質は、５つのヘリックスを含む。例えば、タンパク質は、インターフェロンベータ、例えばインターフェロンベータ１ａ又はインターフェロンベータ１ｂであってよく、これは（認識されているように）４ヘリックス束サイトカインとして分類されることが多い。いくつかの実施態様では、標的タンパク質は、ＩＬ‐９、ＩＬ‐１０、ＩＬ‐１１、ＩＬ‐１３又はＩＬ‐１５である。特定のサイトカインについては、例えばHunter, CA, Nature Reviews Immunology 5, 521-531, 2005を参照されたい。また、Paul, WE (ed.), Fundamental Immunology, Lippincott Williams & Wilkins; 6th ed., 2008も参照されたい。参照により全てが本明細書に組み込まれている、本明細書で引用された引用文献に記載のタンパク質は、すべて標的タンパク質として使用できる。 いくつかの実施態様では、標的タンパク質は、米国食品医薬品局（又は欧州医薬品審査庁等の同等の監督機関）に認可されたヒトの疾患又は障害の治療に使用するためのタンパク質である。このようなタンパク質は、ＰＥＧ化型が臨床検査にて試験され、及び／又は市販認可されているタンパク質であるか、そうでなくてよい。 いくつかの実施態様では、標的タンパク質は、神経栄養因子、すなわち神経系細胞（神経前駆細胞、ニューロン、グリア細胞、例えば星状膠細胞、乏突起膠細胞、ミクログリア等の本明細書で使用されている用語）の生存期間、発達及び／又は機能を促進する因子である。例えば、いくつかの実施態様では、標的タンパク質は、神経突起伸長を促進する因子である。いくつかの実施態様では、タンパク質は、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ；４ヘリックス束タンパク質）又はアクソカイン（Ａｘｏｋｉｎｅ）等のその類似体であり、そしてＣ末端で１５アミノ酸がトランケートされて２つのアミノ酸が置換されたヒト毛様体神経栄養因子の修飾型であり、これはインビトロ及びインビボのアッセイにおいてＣＮＴＦより３〜５倍強力であり安定特性が向上されている。 いくつかの実施態様では、標的タンパク質は、ホモ２量体又はヘテロ２量体（又は、４量体等の、２個を越えるサブユニットを含むホモ若しくはヘテロオリゴマー）を形成するものである。特定の実施態様では、ホモ２量体、ヘテロ２量体又はオリゴマー構造は、第１サブユニットの末端が第２サブユニットの末端に極めて接近しているような構造である。例えば、第１サブユニットのＮ末端は、第２サブユニットのＣ末端に極めて接近している。特定の実施態様では、ホモ２量体、ヘテロ２量体又はオリゴマー構造は、第１サブユニットの末端及び第２サブユニットの末端が受容体との相互作用に関与しないような構造をしており、これにより、生物活性に重大な影響を及ぼすことなく、非遺伝的にコードされたペプチド要素を介して末端を結合できる。いくつかの実施態様では、ホモ２量体、ヘテロ２量体又はオリゴマーの２つのサブユニットの末端は、本明細書で説明される方法を用いてクリックケミストリーによりコンジュゲーションされ、それにより、少なくとも２つのサブユニットが共有結合している２量体（又はオリゴマー）が生成される。例えば、神経栄養性神経成長因子（ＮＧＦ）；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；ニューロトロフィン３（ＮＴ３）；及びニューロトロフィン４（ＮＴ４）は、約５０％の配列同一性を有して２量体形態で存在する２量体分子である。例えばRobinson RC, et al., “Structure of the brain-derived neurotrophic factor/neurotrophin 3 heterodimer.”, Biochemistry. 34(13):4139-46, 1995と、Robinson RC, et al., “The structures of the neurotrophin 4 homodimer and the brain-derived neurotrophic factor/neurotrophin 4 heterodimer reveal a common Trk-binding site.” Protein Sci. 8(12):2589-97, 1999、及びその文献にある引用文献を参照されたい。いくつかの実施態様では、２量体タンパク質は、サイトカイン、例えばインターロイキンである。 いくつかの実施態様では、標的タンパク質は、酵素、例えば代謝又は他の生理学的過程に重要な酵素である。当技術分野で公知の通り、酵素又は他のタンパク質が欠乏すると様々な疾患が誘引される可能性がある。このような疾患には、炭水化物代謝、アミノ酸代謝、有機酸代謝、ポルフィリン代謝及びプリン又はピリミジン代謝等の代謝不全に関連する疾患や、リソソーム蓄積症、血液凝固等が挙げられる。例としては、ファブリー病、ゴーシェ病、ポンペ病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、アスパラギナーゼ欠損症、ポルフィリン症、血友病及び遺伝性血管浮腫が挙げられる。いくつかの実施態様では、タンパク質は、凝固又は凝血因子（例えば因子ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ又はＩＸ）である。他の実施態様では、タンパク質は、炭水化物代謝、アミノ酸代謝、有機酸代謝、ポルフィリン代謝、プリン又はピリミジン代謝及び／又はリソソーム蓄積に役割を担う酵素であり、ここでは、酵素の外因性投与は少なくとも部分的に疾患を緩和する。 いくつかの実施態様では、標的タンパク質は、受容体又は受容体断片（例えば細胞外ドメイン）を含む。いくつかの実施態様では、受容体はＴＮＦα受容体である。特定の実施態様では、標的タンパク質は尿酸酸化酵素を含む。 本明細書で説明されるタンパク質の配列は、当業者に理解されるものとする。制限ではないが、特定の標的タンパク質の配列は、例えば、米国特許出願第10/773,530号;同第11/531,531号; 同第11/707,014号; 同第11/429,276号; 同第11/365,008号の各明細書に示されている。いくつかの実施態様では、標的タンパク質は表３に収載されている。本発明は、本明細書で説明される任意のタンパク質及び当業者に公知の任意のタンパク質に独創的な方法を適用することを含む。 いくつかの実施態様では、本発明は、任意の標的タンパク質の修飾型を提供し、修飾型は（ｉ）Ｎ末端のグリシン等の１つ以上の求核性残基（例えば１〜１０残基）、任意で切断認識配列、例えば求核性残基（単数又は複数）を遮蔽するプロテアーゼ切断認識配列を含むか；又は（ｉｉ）Ｃ末端上若しくは近傍にあるソルターゼ認識モチーフを含む。いくつかの実施態様では、標的タンパク質は、（ｉ）及び（ｉｉ）の両方を含む。このような修飾タンパク質を、本明細書で説明されるタンパク質コンジュゲーションの方法に用いてよい。 特定のタンパク質、例えば分泌された真核生物（例えば哺乳動物）のタンパク質が細胞内処理（例えば分泌前の分泌シグナルの切断、及び／又は生物活性に必要でない他の部分（単数又は複数）の除去）されて成熟形態を生成することが高い頻度であることは当業者に理解されるものとする。このように成熟した標的タンパク質の生物学的活性型は、本発明の特定の実施態様に使用される。 多数の前述のタンパク質及び異なる哺乳動物種由来の配列に関し、大量の構造／機能情報が利用可能であり、これは大幅な生物活性（例えば、自然発生タンパク質活性の少なくとも２５％、７５％、９０％以上）を保持する自然発生配列の変形型を設計するために使用できることを理解されたい。例えば、多様なタンパク質の結晶構造又はＮＭＲ構造は、任意で対応する受容体と組み合わせて使用可能である。また、天然構造では、自然発生Ｎ及びＣ末端が互いに極めて接近していなければ、末端が近接するように、例えば柔軟なペプチドスペーサーによりＮ末端及び／又はＣ末端において自然発生配列を伸長できることを理解されたい。 様々な実施態様では、抗体は関心対象の抗原に結合する。関心対象の抗原は、例えばポリペプチド、多糖、炭水化物、脂質、核酸又はこれらの組合せであるか、又はこれらを含み得る。様々な実施態様では、抗原は天然発生体又は合成体であり得る。いくつかの実施態様では、病原体、感染細胞又は新生細胞（例えば癌細胞）に遺伝子的にコードされるポリペプチド又はペプチドによって、抗原が自然に生成される及び／又は抗原がそれらを含んでいる。いくつかの実施態様では、抗原は、自己抗原（「自家抗原」）又は自己免疫反応を開始する若しくは促進する能力を有する作因である。いくつかの実施態様では、抗原は、いくつかの実施態様では病原因子である、ウイルス、細菌、真菌若しくは寄生生物に生成されるか、又はこれらに遺伝的にコードされる。少なくとも１種の哺乳類種又は鳥類種、例えばヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ウマ、ヤギ及び／又はブタ種において、いくつかの実施態様では、作因（例えばウイルス、細菌、真菌、寄生生物）が疾患を感染させ、いくつかの実施態様では、作因が疾患を発症させる。いくつかの実施態様では、病原体は、その寿命の少なくとも一部の期間、細胞内部に存在する。いくつかの実施態様では、病原体は細胞外部に存在する。様々な実施態様では、例えば抗原を使用する目的で、例えばそれに対する抗体を同定、生成、試験又は使用するために、特定の産生源由来の抗原をこのような産生源から同定し、又は適切な手段を使用して（例えば組み換え、合成等により）生成できることを理解されたい。抗原は例えば、別の分子又はエンティティ（例えばアジュバント）へのコンジュゲーション、化学的又は物理的変性等により修飾される。いくつかの実施態様では、抗原は、エンベロープタンパク質、カプシドタンパク質、分泌タンパク質、構造タンパク質、細胞壁タンパク質若しくは多糖、カプセルタンパク質若しくは多糖、又は酵素である。いくつかの実施態様では、抗原は毒素、例えば細菌性毒素である。 代表的なウイルスとしては、例えば、レトロウイルス科（例えばＨＩＶ‐Ｉといったヒト免疫不全ウイルス等のレンチウイルス）；カリシウイルス科（例えば胃腸炎の原因である株）；トガウイルス科（例えば馬脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（例えばデング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス）；コロナウイルス科（例えばコロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えばエボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えばパラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器多核体ウイルス）；オルトミクソウイルス科（例えばインフルエンザウイルス）；ブニヤウイルス科（例えばハンタンウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルス及びナイロビヒツジ病ウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えばレオウイルス、オルビウイルス及びロタウイルス）；ビルナウイルス科；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科；ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型及び２型、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＥＢＶ、ＫＳＶ）；ポックスウイルス科（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；及びピコルナウイルス科（例えばポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）が挙げられる。 代表的な細菌類としては、例えば、ヘリコバクター・ピロリ、ボレリア・ブルグドルフェリ、レジュネラ・ニューモフィラ、マイコバクテリア（例えばＭ．ツベルクローシス、Ｍ．アビウム、Ｍ. イントラセルラーレ、Ｍ．カンサシ、Ｍ．ゴルドナエ）、黄色ブドウ球菌、淋菌、髄膜炎菌、リステリア・モノサイトゲネス、化膿レンサ球菌（Ａ群レンサ球菌）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｂ群レンサ球菌）、レンサ球菌（ビリダンス群）、大便レンサ球菌、ストレプトコッカス・ボビス、レンサ球菌（嫌気性菌種）、肺炎レンサ球菌、カンピロバクター種、エンテロコッカス種、クラミジア種、インフルエンザ桿菌、炭疽菌、コリネバクテリウム・ジフテリエ、ブタ丹毒菌、ウェルシュ菌、破傷風菌、エンテロバクター・エロゲネス、肺炎桿菌、パスツレラ・マルトシダ、バクテロイデス種、フソバクテリウム・ヌクレアタム、ストレプトバシラス・モニリフォルミス、トレポネーマ・パリダム、トレポネーマ・ペルテニュ、レプトスピラ、ウシ放線菌及び野兎病菌が挙げられる。 代表的な真菌類としては、例えば、黄色こうじ菌、アスペルギルス・フミガータス及び黒色こうじ菌等のアスペルギルス属；ブラストミセス・デルマチチジス等のブラストミセス属；カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・ギリエルモンジィ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・パラシローシス及びカンジダ・トロピカリス等のカンジダ属；コクシジオイデス・イミチス等のコクシジオイデス属；クリプトコッカス・ネオフォルマンス等のクリプトコッカス属；エピデルモフィトン属；フサリウム属；ヒストプラズマ・カプスラーツム等のヒストプラズマ属；癜風菌等のマラセジア属；ミクロスポルム属；ムコール属；南アメリカ分芽菌等のパラコクシジオイデス属；ペニシリウム・マルネッフェイ等のペニシリウム属；ピキア・アノマラ及びピキア・ギリエルモンジィ等のピチア属；ニューモシスチス・カリニ等のニューモシスチス属；シュードアレシェリア・ボイジイ等のシュードアレシェリア属；リゾプス・オリーゼ等のリゾプス属；ロドトルラ・ルブラ等のロドトルラ属；スケドスポリウム・アピオスペルムム等のスケドスポリウム属；スエヒロタケ等のスエヒロタケ属；スポロトリックス・シェンキィ等のスポロトリクス属；毛瘡白癬菌、紅色白癬菌、トリコフィトン・ベルコースム及び紫色白癬菌等の白癬菌属；トリコスポロン・アサヒ、トリコスポロン・クタネウム、トリコスポロン・インキン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｉｎｋｉｎ）及びトリコスポロン・ムコイデス等のトリコスポロン属が挙げられる。 代表的な寄生生物としては、例えば、プラスモジウム種（例えば熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、Ｐ．ヨエリ、Ｐ．ベルゲイ）、エントアメーバ種（例えば赤痢アメーバ）、ジアルジア種（例えば腸鞭毛虫、Ｇ．デュオデナリス（Ｇ．ｄｕｏｄｅｎａｌｉｓ）ランブル鞭毛虫、ネズミジアルジア、Ｇ．アジリス、Ｇ．アルダエ（ａｒｄａｅ）及びＧ．シッタシ）、トキソプラズマ種（例えばトキソプラズマ原虫）、クリプトスポリジウム種（例えば小型クリプトスポリジウム（Ｃ．ｐａｒｖｕｍ）、ネズミクリプトスポリジウム（Ｃ．ｍｕｒｉｓ）、ネコクリプトスポリジウム（Ｃ．ｆｅｌｉｓ）、モルモットクリプトスポリジウム（Ｃ．ｗｒａｉｒｉ）、ニワトリクリプトスポリジウム（Ｃ．ｂａｉｌｅｙｉ）、シチメンチョウクリプトスポリジウム（Ｃ．ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）、ヘビクリプトスポリジウム（Ｃ．ｓｅｒｐｅｎｔｉｓ）及び魚類クリプトスポリジウム（Ｃ．ｎａｓｏｒｕｍ））、シクロスポラ種（例えばＣ．カイエタネンシス）、ネグレリア種（例えばネグレリア・フォーレリ）、アカントアメーバ種、リーシュマニア種（例えば大型リーシュマニア、熱帯リーシュマニア、エチオピアリーシュマニア、メキシコリーシュマニア、ブラジルリーシュマニア、ドノバンリーシュマニア、小児リーシュマニア、シャーガスリーシュマニア）、シストソーマ種（例えばマンソン住血吸虫）並びにトリパノソーマ種（例えばＴ．アンビストマ、Ｔ．アビウム、Ｔ．ブルセイ、Ｔ．クルーズ、Ｔ．コンゴ、Ｔ．エクイヌム、Ｔ．ルイス、Ｔ．タイレリ及びＴ．ビバックス）が挙げられる。 いくつかの実施態様では、抗原は腫瘍抗原（ＴＡ）である。一般的に、腫瘍抗原は、腫瘍細胞に生成されるいずれの抗原性物質（例えば腫瘍原性細胞、又はいくつかの実施態様では癌間質細胞、例えば癌関連線維芽細胞等の腫瘍関連細胞）であってよい。多くの実施態様では、腫瘍抗原は、非腫瘍細胞によるものとは異なり、腫瘍細胞により発現する分子（又はその一部）である。腫瘍抗原には、例えば、通常はごく少量で生成されて腫瘍細胞では大量に発現するタンパク質、通常は発達の特定の段階でのみ生成されるタンパク質、構造（例えば配列若しくは翻訳後修飾（単数又は複数））が腫瘍細胞の変異により改変されるタンパク質、又は免疫系とは隔絶された（正常状態下）正常タンパク質が挙げられる。腫瘍抗原は、例えば腫瘍細胞を同定又は検出する際（例えば診断する目的、及び／又は例えば再発を試験するために腫瘍で治療を受けた被検体をモニタリングする目的のため）、及び／又は多様な薬剤（例えば治療薬）を腫瘍細胞に向ける目的において有用であると考えられる。例えば、いくつかの実施態様では、キメラ抗体が提供されており、これは腫瘍抗原に結合する抗体断片の抗体を含み、クリックケミストリーを介して治療薬、例えば細胞毒性薬にコンジュゲーションされている。いくつかの実施態様では、ＴＡは、突然変異遺伝子、例えば癌遺伝子若しくは突然変異腫瘍抑制遺伝子、過剰発現若しくは異常発現細胞タンパク質、発癌ウイルス（例えばＨＢＶ；ＨＣＶ；ＥＢＳやＫＳＶ等のヘルペスウイルスファミリーメンバー；パピローマウイルス等）にコードされた抗原、又は癌胎児性抗原の発現産物である。癌胎児性抗原は、通常は胚発生の初期段階で生成され、免疫系が完全に発生する時までに大部分が消失又は完全に消失する。例としてはアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ、例えば生殖細胞腫瘍及び肝細胞癌に見られる）及び癌胎児抗原（ＣＥＡ、例えば腸癌、場合により肺癌又は乳癌に見られる）が挙げられる。チロシナーゼは、通常はごく少量で生成されるが、その生成が特定の腫瘍細胞（例えばメラノーマ細胞）で大量に増加するタンパク質の例である。他の代表的なＴＡとしては、例えば、ＣＡ‐１２５（例えば卵巣癌に見られる）；ＭＵＣ‐１（例えば乳癌に見られる）；上皮性腫瘍抗原（例えば乳癌に見られる）；メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ；例えば悪性メラノーマに見られる）；前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ、前立腺癌に見られる）が挙げられる。いくつかの実施態様では、ＴＡは、少なくとも部分的に腫瘍細胞の細胞表面で露出している。いくつかの実施態様では、腫瘍抗原は、異常に修飾されたポリペプチド又は脂質、例えば異常に修飾された細胞表面糖脂質又は糖タンパク質を含む。ＴＡは、特定のタイプの腫瘍のサブセット及び／又は腫瘍内細胞のサブセットにより発現し得ることを理解されたい。 本明細書で提供される方法によるキメラ抗体又はタンパク質の生成に有用である代表的な治療用抗体としては、限定するものではないが、下記の抗体が挙げられる（抗体の標的は、代表的な非限定的治療の適応症と共に括弧内に収載している）： アブシキシマブ（糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ；心血管疾患）、アダリムマブ（ＴＮＦ‐α、多様な自己免疫疾患、例えば関節リウマチ）、アレムツズマブ（ＣＤ５２；慢性リンパ性白血病）、バシリキシマブ（ＩＬ‐２Ｒα受容体（ＣＤ２５）；移植片拒絶）、ベバシズマブ（血管内皮増殖因子Ａ；様々な癌、例えば結腸直腸癌、非小細胞肺癌、神経膠芽腫、腎癌、滲出型加齢関連黄斑変性）、カツマキソマブ、セツキシマブ（ＥＧＦ受容体、様々な癌、例えば結腸直腸癌、頭頸部癌）、セルトリズマブ（例えばセルトリズマブペゴール）（ＴＮＦアルファ；クローン病、関節リウマチ）、ダクリズマブ（ＩＬ‐２Ｒα受容体（ＣＤ２５）；移植片拒絶）、エクリズマブ（補体タンパク質Ｃ５；発作性夜間血色素尿症）、エファリズマブ（ＣＤ１１ａ；乾癬）、ゲムツズマブ（ＣＤ３３；急性骨髄性白血病（例えばカリチアマイシンと併用する））、イブリツモマブチウキセタン（ＣＤ２０；非ホジキンリンパ腫（例えばイットリウム９０又はインジウム１１１と併用する））、インフリキシマブ（ＴＮＦアルファ；様々な自己免疫疾患、例えば関節リウマチ）、ムロモナブ‐ＣＤ３（Ｔ細胞ＣＤ３受容体；移植片拒絶）、ナタリズマブ（アルファ‐４（α４）インテグリン；多発性硬化症、クローン病）、オマリズマブ（ＩｇＥ；アレルギー関連喘息）、パリビズマブ（ＲＳＶＦタンパク質のエピトープ；呼吸器多核体ウイルス感染）、パニツムマブ（ＥＧＦ受容体；癌、例えば結腸直腸癌）、ラニビズマブ（血管内皮増殖因子Ａ；滲出型加齢関連黄斑変性）、リツキシマブ（ＣＤ２０；非ホジキンリンパ腫）、トシツモマブ（ＣＤ２０；非ホジキンリンパ腫）、トラスツズマブ（ＥｒｂＢ２；乳癌）及びこれらの任意の抗原結合断片。 いくつかの実施態様では、同じ疾患の治療に有用な治療用モノクローナル抗体と第２処置薬剤とを、本明細書で説明する独創的アプローチを用いてコンジュゲーションする。いくつかの実施態様では、第２処置薬剤はポリペプチド、ペプチド、小分子又は第２抗体を含む。 いくつかの実施態様では、モノクローナル抗体とサイトカイン、例えばインターフェロン、例えばインターフェロンアルファとを本明細書で説明する独創的アプローチを用いてコンジュゲーションする。場合により、モノクローナル抗体及びサイトカインは両方とも同じ疾患の治療に有用である。 いくつかの実施態様では、本明細書で説明する独創的アプローチ用いて、多サブユニットタンパク質の２つ（以上）のサブユニット（例えば分離したポリペプチド鎖）をコンジュゲートする。いくつかの実施態様では、多サブユニットタンパク質は、受容体（例えば細胞表面受容体）である。いくつかの実施態様では、多サブユニットタンパク質は酵素である。いくつかの実施態様では、多サブユニットタンパク質はサイトカインである。いくつかの実施態様では、多サブユニットタンパク質はチャネル又は輸送体である。いくつかの実施態様では、このような結合により、多サブユニットタンパク質の適切な折り畳みが容易になる（例えば折り畳みが促進されるか、又は正しく折り畳まれた機能性タンパク質の割合が増加する）。 いくつかの実施態様では、標的タンパク質又はポリペプチドは、タンパク質形質導入ドメインを含む。独創的アプローチを用いて、タンパク質形質導入ドメインを関心対象のポリペプチドに結合させてよい。 いくつかの実施態様では、本明細書で説明する独創的アプローチを用いて、ワクチン、例えば１価又は多価ワクチンを生成する。例えば、独創的アプローチを用いて２種以上の抗原（例えば１種以上の上述したような病原因子又は腫瘍抗原）を結合してよい。いくつかの実施態様では、得られた薬剤は、例えば、任意で好適な担体（単数又は複数）又は賦形剤（単数又は複数）を含む、適当な組成物に含ませて被検体に投与してよい。いくつかの実施態様では、得られた薬剤をエクスビボで使用して、例えば、免疫系細胞、例えばドナーから事前に得たＴ細胞、抗原提示細胞（例えば樹状細胞）を刺激するか、又はその細胞に取り込ませる。いくつかの実施態様では、細胞を後に投与する被検体がドナーである。いくつかの実施態様では、ワクチンは、病原体又は腫瘍に対して哺乳動物又は鳥類被検体を免疫化するために、例えば病原体（若しくは病原体に感染した細胞）又は腫瘍に対する免疫応答を、誘発するか、又は促進するために使用するワクチンである。 いくつかの実施態様では、本明細書で説明する独創的アプローチを用いて抗原及びサイトカインをコンジュゲーションし、ここで、サイトカインは場合により、例えばＴ細胞（例えば細胞毒性細胞、ヘルパー細胞、制御細胞又はナチュラルキラー細胞に属すＴ細胞）、Ｂ細胞、マクロファージ等の、免疫系細胞の刺激、増殖、分化、及び／又は少なくとも活性を調節する。 いくつかの態様では、本発明は本明細書で説明する方法による生成した薬剤、及びこのような薬剤から成る組成物を含むことを理解されたい。いくつかの態様では、本発明は例えば、本明細書で説明する１つ以上の目的又は他の目的のためにこのような薬剤を使用する方法を含むことを理解されたい。医薬組成物 いくつかの実施態様では、本発明は、本明細書で説明する修飾タンパク質、例えばクリックケミストリーハンドルを担持するように修飾されたタンパク質、又はクリックケミストリーを介して第２分子、例えば別のタンパク質にコンジュゲーションしたキメラタンパク質のいずれかを含む医薬組成物を提供する。いくつかの態様では、タンパク質は、クリックケミストリーを介してポリマー、例えばＰＥＧにコンジュゲーションされる。 医薬組成物は、様々な薬学的に許容可能な担体を含む場合がある。薬学的に許容可能な担体は、当技術分野で周知であり、例えば、水、５％デキストロース、若しくは生理学的緩衝食塩水等の水溶液、又は他の溶媒、又はグリコール、グリセロール等のビヒクル、オリーブオイル等の油、又はヒト若しくは非ヒト被検体への投与に適した注射用有機エステルが挙げられる。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st edition; Lippincott Williams & Wilkins, 2005を参照されたい。いくつかの実施態様では、薬学的に許容可能な担体又は組成物は無菌である。医薬組成物は、活性剤以外に、例えばバルク剤、充填剤、可溶化剤、安定化剤、浸透圧剤、摂取促進剤等として作用する薬学的に許容可能な化合物を含んでよい。薬学的に許容可能な化合物としては、例えばグルコース、スクロース、ラクトース等の炭水化物；デキストラン；マンニトール等のポリオール；アスコルビン酸若しくはグルタチオン等の抗酸化剤；保存料；キレート剤；バッファー；又は他の安定化剤若しくは賦形剤が挙げられる。薬学的に許容可能な担体（単数又は複数）及び／又は薬学的に許容可能な化合物（単数又は複数）は、例えば、活性薬剤の性質、例えば組成物の溶解性、適合性（通常の使用状況下で医薬組成物の薬理学的効果を実質的に低下させるような様式で相互作用する組成物中に複数の物質が共存可能であることを意味する）及び／又は投与経路に応じて選択できる。医薬組成物は、液体、ゲル、ローション、タブレット、カプセル、軟膏、クリーム、経皮パッチ等の形態としてよい。医薬組成物は、例えば非経口投与等の様々な経路により被検体に投与することが可能である。代表的な投与経路としては、静脈内投与；呼吸投与（例えば吸引）、筋肉内投与、鼻孔投与、腹腔内投与、経口投与、皮下投与及び局所投与が挙げられる。経口投与には、タブレット、錠剤、糖衣剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等としての薬学的に許容可能な担体と共に化合物を処方してよい。いくつかの実施態様では、化合物は標的組織に直接投与してよい。直接投与は例えば、注射、又は組織内への徐放性植込み剤の移植により達成できる。当然ながら、徐放性植込み剤は好適な部位であれば何処でも移植可能である。いくつかの実施態様では、徐放性植込み剤は癌再発リスクを持つ被検体の予防的処置に特に適していると考えられる。いくつかの実施態様では、徐放性植込み剤は、少なくとも３０日間、例えば少なくとも６０日間、例えば最大で３〜６カ月間以上、治療レベルの活性薬剤を送達する。当業者は患者の体重、全身健康状態、治療対象である特有の状態等の要素を考慮して、効果的な用量及び投与の用法を選択できる。代表的な用量は、インビトロでの試験によって選択し、当技術分野で標準であるように、動物モデル及び／又はヒト臨床試験で検査してもよい。 本発明の態様による修飾タンパク質を含む医薬組成物は、効果的量で送達してよく、この量は、例えばある疾患又は状態の１つ以上の症状又は兆候を軽減する関心対象の生物学的応答を達成するために十分な量を意味する。正確な必要量は、被検体の種類、年齢、体重、性別及び全身状態、疾患又は障害の重症度、特定の化合物及びその活性、その投与法、併用療法等の因子により被検体間で異なり得る。いくつかの実施態様では、化合物、例えばタンパク質は、投与のしやすさ及び用量の均一性を促進するために用量単位で処方し、本明細書で使用するこの用語は、患者を治療するために適切な、物理的に別個である薬剤の単位を意味する。しかし合計日用量は、妥当な臨床的判断の範囲内で主治医により決定されることは理解されるものとする。いくつかの実施態様では、例えばＰＥＧをコンジュゲーションしたタンパク質を投与する際、非ＰＥＧ化型の好適な用量についての入手可能な情報は、任意でインビトロ活性データと合わせられ、前臨床試験及び／又は臨床用途に適した用量を選択する際のガイドラインとして使用できる。 多様な異なる疾患及び障害を治療するために、医薬組成物を使用できる。いくつかの実施態様では、医薬組成物を使用し、例えば当該非修飾タンパク質が有用ないずれの疾患又は状態を治療する。したがって本発明は、独創的なタンパク質を、それを必要とする被検体に投与する工程を含む治療法を提供する。被検体は典型的には、哺乳動物被検体、例えばヒトである。いくつかの実施態様では、被検体はヒトに影響を及ぼす疾患又は障害のモデルとして有用な非ヒト動物である。動物モデルは、例えば有効性の評価及び／又は好適な用量の決定のための前臨床試験等に使用できる。 いくつかの実施態様では、独創的タンパク質を、例えば疾患又は障害の兆候又は症状を示さない被検体（なお、障害を発症するリスクを有するか、又は疾患若しくは障害を発症すると予測される被検体）に予防的に投与する。いくつかの実施態様では、疾患又は障害の１つ以上の兆候又は症状を発症した被検体、例えば疾患又は障害を有すると診断された被検体に独創的タンパク質を投与する。場合により、当該方法は、当該タンパク質が適切な治療となる疾患又は障害に被検体が罹患していることを診断する工程を含む。例えばインターフェロンには、自己免疫疾患（例えば多発性硬化症）及び感染症（例えば、フラビウイルスファミリー、例えばＨＢＶ、ＨＣＶに属すウイルスによる感染等のウイルス感染；細菌感染、真菌感染、寄生生物）の治療における多様な用途がある。代表的なウイルスとしては、例えばＣ型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルス、ウシウイルス性下痢症ウイルス等のフラビウイルス科ファミリーのウイルス；例えばＢ型肝炎ウイルス等のヘパドナウイルス科ファミリーのウイルス；例えば脳心筋炎ウイルス、ヒトライノウイルス及びＡ型肝炎ウイルス等のピコルナウイルス科ファミリーのウイルス；例えばヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ヒトＴ‐リンパ球好性ウイルス及びラウス肉腫ウイルス等のレトロウイルス科ファミリーのウイルス；例えばＳＡＲＳコロナウイルス等のコロナウイルス科ファミリーのウイルス；例えば狂犬病ウイルス及び水疱性口内炎ウイルス等のラブドウイルス科ファミリーのウイルス、例えば呼吸器多核体ウイルス及びパラインフルエンザウイルス等のパラミクソウイルス科ファミリーのウイルス、例えばヒトパピローマウイルス等のパピローマウイルス科ファミリーのウイルス、並びに例えば単純ヘルペスウイルス等のヘルペスウイルス科ファミリーのウイルスが挙げられるが、これらに限定されるものではない。 多種の癌の治療としてインターフェロン療法（化学療法及び放射線照射と併用することが多い）が利用されており、この用語は固形腫瘍（癌腫、肉腫）及び白血病を包含するものとして本明細書で使用されている。いくつかの実施態様では、腫瘍は腺癌である。いくつかの実施態様では、腫瘍は肉腫である。いくつかの実施態様では、腫瘍は胸部、リンパ節、前立腺、腎臓、膀胱、肺、肝臓、消化管、結腸、精巣、胃、膵臓、甲状腺、皮膚、卵巣、子宮、頸部、皮膚、神経、骨及び神経系（例えば脳）から選択される器官又は器官系に影響を及ぼす。いくつかの実施態様では、インターフェロンを、血液悪性腫瘍、例えば白血病又はリンパ腫、例えばヘアリー細胞白血病、慢性骨髄性白血病、結節性リンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫を治療するために使用する。いくつかの実施態様では、ＩＦＮ、例えばＩＦＮ‐α２ｂを用いてメラノーマを治療する。 ＥＰＯ等の赤血球産生刺激剤は、多様な原因から起こる貧血を治療するために使用する。例えば、貧血は、慢性疾患の貧血、薬物療法（例えば癌化学療法）、放射線照射、腎疾患（例えば糖尿病）、感染疾患又は失血に関連する貧血であり得る。Ｇ‐ＣＳＦ、ＧＭ‐ＣＳＦ及び／又はＭ‐ＣＳＦ等のコロニー刺激因子は、例えば薬物療法（例えば癌化学療法）、放射線照射、感染疾患又は失血により起こり得る白血球減少症、例えば好中球減少症及び／又はリンパ球減少症を治療するために使用できる。 神経栄養因子タンパク質は、例えば神経変性疾患（例えば筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病）、中枢又は末梢神経系損傷を治療するために使用できる。 成長ホルモンは、例えば小児成長障害及び成人成長ホルモン欠乏症を治療するために使用できる。 インターロイキンは、多様な目的の免疫応答を調節するため、例えば感染因子又は癌に対する免疫応答を刺激するために使用される。いくつかの実施態様では、インターロイキンは免疫系細胞を刺激し、並びに／又は、自然免疫応答及び／若しくは適応免疫応答の強度及び／若しくは持続期間を促進する。当技術分野で公知のように、特定のインターロイキンは、先天的及び／又は後天的な免疫応答の強度及び／又は持続期間が限定されやすくなる。このようなインターロイキンの投与は、異常な又は過剰な活性免疫応答が有害になり得る自己免疫疾患、敗血症又は他の状態を治療する際に利用できる。 自己免疫疾患としては、Ｉ型糖尿病（例えば若年発症型糖尿病）、多発性硬化症、強皮症、強直性脊椎炎、サルコイド、尋常性天疱瘡、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、若年性関節炎、ベーチェット症候群、ライター病、ベルジェ病、皮膚筋炎、ウェゲナー肉芽腫症、自己免疫性心筋炎、抗糸球体基底膜抗体病（グッドパスチャー症候群等）、拡張型心筋症、甲状腺炎（例えば橋本甲状腺炎、グレーブス病）、及びギランバレー症候群が挙げられる。 グラム陽性又はグラム陰性細菌、マイコバクテリア、カンジダ又はアスペルギルス等の真菌、蠕虫等に起因する疾患は特定の実施態様における関心対象である。代表的な細菌及び真菌としては以下の群内に該当するものが挙げられる：放線菌目（例えばコリネバクテリウム、マイコバクテリウム、ノカルジア）、アスペルギルス、バチルス科（例えば炭疽菌、クロストリジウム）、バクテロイデス科、ブラストミセス、ボルデテラ、ボレリア、ブルセラ、カンジダ、カンピロバクター、コクシジオイデス、クリプトコッカス、皮膚真菌、腸内細菌科（クレブシエラ、サルモネラ、セラチア、エルシニア）、エリシペロスリクス、ヘリコバクター、レジオネラ、レプトスピラ、リステリア、マイコプラズマ目、ナイセリア科（例えばアシネトバクター、髄膜炎菌）、パスツレラ科（例えばアクチノバチルス、ヘモフィルス、パスツレラ）、シュードモナス、リケッチア科、クラミジア科、トレポネーマ及びブドウ球菌。 いくつかの実施態様では、修飾した、例えばＰＥＧ化したタンパク質は、非修飾形態と比較して有効性が増加し、及び／又は同等の有効性を達成しつつ用量が少なくなるか、若しくは投与回数が減り（投与間隔が広がる）、及び／又は毒性が低減され（副作用が低減され、耐容性及び安全性が増加する）、及び／又は利便性と適性が高い投与経路での投与が可能になる。 なお、本発明は、上述の代表的なクリックケミストリーハンドルと追加的なクリックケミストリーハンドル、反応性クリックケミストリーハンドルペアに限定されるものではなく、このようなクリックケミストリーハンドルペアの反応条件は当業者にとって明らかである。 以下の実施例は本明細書で提供する方法、試薬及び組成物の代表的な実施化を説明することを意図したものであり、本発明の範囲を限定するものではない。実施例１： クリックケミストリーをソルターゼ触媒アシル転移と組み合わせることにより創生されたＮ対Ｎ及びＣ対Ｃタンパク質融合物の生成 タンパク質融合物は有用な生化学ツールである。遺伝子コンストラクトを用いて、ＧＦＰに融合させた種々のタンパク質が発現されている。しかしながらタンパク質融合技術の主要な欠点の１つは、あるタンパク質のＣ末端が別のタンパク質のＮ末端に融合されているＣＮ連結タンパク質融合物のみを得ることができる点である。このことにより、そのようなタンパク質融合物の範囲は占有されていない、又は融合されていないＮ又はＣ末端を必要としないものに限定される。例えば、抗体のＮ末端は抗原認識のために必要であり、従って、二重特異性抗体はタンパク質融合技術を含む従来の組み換え技術を用いて生成することはできない。ユビキチンのような別のタンパク質は正常な活性のために未修飾のＣ末端を必要とする。 本発明の一部の局面はソルターゼ反応とクリックケミストリーとの組み合わせを用いたＮ対Ｎ及びＣ対Ｃタンパク質融合物の調製のための方法及び試薬を提供する。ソルターゼ触媒アシル転移は適切に修飾されたタンパク質のＣ末端における置換基の全ての態様の容易な設置を可能にする。良好なアシル転移反応のための唯一の必要条件は標的タンパク質における適切に露出されたＬＰＸＴＧ（配列番号２）モチーフの存在である。ソルターゼ触媒反応において使用できる親核物質の設計も同様に単直であり：グリシン残基、更にはアルキルアミンのショートランのみで反応進行に十分である。クリックケミストリーハンドルのソルターゼ媒介設置とその後のクリックケミストリー反応を介したＣ−Ｃ及びＮ−Ｎコンジュゲーションされたタンパク質の形成に関する代表的なスキームに関しては、図１を参照する。クリックハンドルであるアジド及びシクロオクチンはそれぞれＮ３及び８角形で示す。 ソルターゼ反応を介したタンパク質上へのクリックケミストリーハンドルの設置の重要な利点はソルターゼ反応に必要な親核物質の合成及び生理学的条件下の非変性タンパク質に対する反応の実施が容易な点である（図２Ａ）。ソルターゼ反応で以前に使用されていた親核物質は以下の修飾、即ちビオチン、蛍光団、脂肪酸、核酸、脂質、放射性同位体、炭水化物、また更には適切に露出したグリシン残基Ｎ末端ストレッチ（例えば１〜１０Ｇ残基）を有するタンパク質の何れかを包含していた。 本発明の一部の局面はクリック反応のためのハンドルを提供する親核物質の合成を介した広範なタンパク質修飾を可能にする。このことにより自身のＣ末端で融合されたタンパク質の創生が可能になる。この目的のために使用できる何れかの型のバイオ直交型クリック反応及び適用できる一部の例は、銅触媒クリック反応、（無痕跡型）シュタウディンガーライゲーション、ひずみ促進型クリック反応、チオ・エン反応、（逆電子要請）ディールス・アルダー反応、オキシムライゲーション及び非変性化学ライゲーションであるが、これらに限定されない（表Ｉ及び図２Ｂ参照）。一部の実施態様においては、これらの官能性は天然アミノ酸の側鎖上に、或いは非天然アミノ酸の取り込みにより導入される。 本発明の一部の局面は二重特異性のキメラ抗体の形成のための方法及び試薬を提供する。一部の実施態様において、２つの抗体はそれらのＣ末端においてクリックケミストリーを介してコンジュゲーションされることによりキメラ抗体を形成する。Ｃ−Ｃ末端コンジュゲーションにより、コンジュゲーションされた抗体の抗原結合Ｎ末端は、それらの抗原結合特性を保持できるようになる。そのようにコンジュゲーションされた２つの抗体が異なる抗原に結合すれば、その結果生じるキメラ抗体は二重特異性となる。 本発明の一部の局面は本発明の一部の実施態様に従った二重特異性抗体の調製のための方策を提供する。一部の実施態様において、ソルターゼ認識配列、例えばＣ末端ＬＰＸＴＧＧ（配列番号３）配列を含有する抗体が提供される。一部の実施態様において、抗体は更にＣ末端タグ、例えばヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグを含む。このような抗体は組み換え方法を介して、そして当該分野で良く知られている試薬を用いて得ることができる。 一部の実施態様において、ソルターゼ反応のための親核物質、例えばクリックケミストリーハンドルを含むＧＧＧ−ペプチドは標準的な固相ペプチド合成を用いて合成される。 一部の実施態様において、Ｃ末端ソルターゼ認識モチーフを含む第１の抗体は第１のクリックケミストリーハンドル（例えばハンドルＡ、図２Ｂ参照）を含む親核物質の存在下、ソルターゼ触媒反応により修飾される。ソルターゼ認識モチーフを含む第２の抗体、例えば第１の抗体とは異なる抗原に結合する抗体は、第２のクリックケミストリーハンドル（例えばハンドルＢ、図２Ｂ参照）を含む親核物質の存在下、ソルターゼ触媒反応により修飾される。２つのクリックケミストリーハンドル（例えばハンドルＡ及びＢ）は典型的には、それらがクリックケミストリー反応において反応することにより共有結合を形成できることを意味するクリック「パートナー」である。一部の代表的なクリック反応及びパートナークリックハンドルは表１及び図２Ｂに記載するとおりである。ソルターゼ反応の結果として、Ｃ末端クリックケミストリーハンドルが設置されている抗体が得られる（図２Ｃ）。 一部の実施態様において、ソルターゼ修飾抗体は例えばＨｉｓタグ精製、サイズ排除クロマトグラフィー及び／又はイオン交換クロマトグラフィーを用いて単離又は精製される。一部の実施態様において、第１及び第２のソルターゼ修飾抗体はそれぞれのクリック反応が起こるために適した生理学的条件下で混合される。例えばクリック反応が生理学的条件下で起こるために銅のような触媒が必要であれば、反応が起こるために適する条件は、クリック反応を触媒するために有効な量の銅触媒の準備を包含する。 一部の実施態様において、クリック反応は例えば反応の終了を判定するためにＬＣ／ＭＳ及びゲルクロマトグラフィーを用いて追跡される。一部の実施態様において、反応が終了したらＣ対Ｃ融合タンパク質は例えば上記した方法により単離又は精製される（図２Ｄ）。実施例２：ソルターゼ反応を介した非クリック官能性の設置 ソルターゼ反応のために親核物質中に取り込むことのできる官能性はクリックケミストリーハンドルに限定されない。ソルターゼ親核物質はソルターゼ反応で以前に使用されていた官能性の何れかを装備していてよい（図３Ａ）。例えば、一部の実施態様においては、修飾タンパク質、例えばソルターゼ修飾抗体の可視化、精製及び４量体化を可能にするビオチンが、ストレプトアビジンを用いて取り込まれる。一部の実施態様において、タンパク質２量体の可視化を可能とする蛍光団、例えば蛍光タンパク質又は蛍光部分が取り込まれる。これは特に二重特異性抗体の場合にＦＡＣＳ及び顕微鏡実験においてそれらを使用可能とする有用な特徴である。更に、適合性のあるクリックハンドルの組み合わせを、更に複雑な構造、例えばタンパク質３量体及びＰＥＧ化タンパク質２量体の合成のために使用してよい（図３Ｂ）。 固相合成により可能となる柔軟性を考慮すれば、更に別の官能性を縫合部に包含させることによりそのようなキメラタンパク質に付与される特性の範囲を更に拡大することができる。例えば、合成重合体、例えばＰＥＧ部分のソルターゼ媒介設置はペプチド及びタンパク質の半減期を延長することができ、例えばそのような修飾はサイトカインの循環系中半減期を延長する。検出可能な標識、例えば、蛍光団、蛍光タンパク質、染料、バイオルミネセント酵素及びプローブ、又は放射性同位体の取り込みは、全ての一般的に使用されている画像化様式の利用機会を与える。実施例３：二重特異性キメラ抗体の形成 クリックケミストリーハンドルのソルターゼ媒介設置の代表的な方策を適用することにより、ラクダ抗体に典型的なＶＨＨドメインの使用に基づいて二重特異性抗体フラグメントを形成した。他の哺乳類の種とは異なり、ラクダは別のクラスの抗体を保有しており、その結合部位はＶＨドメインのみから構築されている。これらのドメインをいわゆるナノボディとして細菌中で発現できる。これらは小型であり、そして操作が容易であるため、治療薬の構築のための魅力的な標的となっている。特に単一の試薬の中に２つの異なる認識特異性を組み合わせることが可能である点は、いわゆる二重特異性抗体の構築を有望とする。 ＶＨＨフラグメントをナノボディとしてＥ・コリ中で発現させた。ＶＨＨフラグメントはＧＦＰに対してビクーナ中で作成した抗体及び２−マイクログロブリンに対してラマ中で作成した抗体に基づくものとした。両方のナノボディにはＬＰＸＴＧ（配列番号：２）モチーフを装備することによりそれらがソルタギング反応に対応できるようにした。親核物質の設計においては、一方のナノボディ上へひずみのあるシクロオクチン、そして他方のナノボディ上へはアジドを設置することにより、銅非存在下にクリック反応が進行できるようにした。 クリック反応のための最適条件は、適切に修飾されたユビキチン（Ｕｂ、図４、スキーム）、ユビキチンビニルメチルエステル（ＵｂＶＭＥ）、ユビキチン特異的プロテアーゼを共有結合修飾する親電子Ｕｂ誘導体に対して実施したＮ末端標識反応を用いることにより樹立した。この反応のために、ＵｂＶＭＥの（Ｇｌｙ）３伸長型を選択した。クリック反応の実施によりＵｂＶＭＥ２量体が得られ、その官能性はユビキチンＣ末端ヒドロラーゼＵＣＨＬ３の修飾により評価した（図４、ゲル画像）。使用する化学的特徴の重要な局面はこの反応における基質であるタンパク質に対して損傷を与える可能性のある過酷な条件の回避である。全ての変換は中性ｐＨの水性環境中で実施される。 Ｎ及びＣ末端ソルタギング反応は同等の効率（図５）で進行することが観察され、そしてそのため、ここで使用するスキームはＣ対ＣのみならずＮ対Ｎ融合も可能にし、その双方とも従来の組み換え技術では達成不可能であった。ソルターゼ反応の反応体（例えば投入ナノボディ）並びに反応で使用されるソルターゼにタグ、例えばＨｉｓ６タグは装備されている一部の実施態様においては、適切な結合剤、例えばＮｉＮＴＡアガロース上への吸着がこれらの反応体を効果的に枯渇させ、これにより所望の「ソルタギングされた」産物の１段階精製が可能となる。 アジド修飾Ｕｂ及びシクロオクチン修飾Ｕｂの２量体化反応の速度論的特徴を調べた（図６）。Ｎ３−Ｕｂとシクロオクチン−Ｕｂの何れかのみを含む試料中では２量体化は観察されなかった。しかしながら共にインキュベーションした場合、３０分のインキュベーションの後には２量体化が検知可能となり、そして１時間のインキュベーション時間で飽和状態に達した。反応はＮ３−及びシクオオオクチン−Ｕｂの種々の混合比において効率的であった。 ２つのナノボディをＵｂに関して決定された最適反応条件下においてそれぞれクリックケミストリーハンドル、アジド及びシクロオクチンのソルターゼ媒介設置に付した（反応条件については実施例４参照、図７）。これにより得られる各々適切なクリックハンドルを含むナノボディをサイズ排除クロマトグラフィーで精製することにより未取込のソルターゼ反応親核物質が存在する場合はそれらを除去した（図８）。精製されたナノボディはユビキチン２量体化と同様のクリックケミストリー反応を介してコンジュゲーションすることができる。コンジュゲーションされた産物はＳ７５カラム上のサイズ排除クロマトグラフィーにより精製することができ、所望の産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＭＳ／ＭＳで特性化することによりＣ対Ｃナノボディ融合産物のアイデンティティを確認できる。 粗製の反応混合物を調製し、共にＥ・コリ中で発現された標的抗原であるベータ−２−マイクログロブリン及びｅＧＦＰの飽和量と共にインキュベーションすることができる。サイズ排除クロマトグラフィーとその後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び個々の画分の銀染色により、それらの予測されるストークス半径における未結合抗体の同定並びに各々その同属体抗原と複合体化した別個のナノボディの同定が可能となる。Ｎ対Ｎ及びＣ対Ｃタンパク質コンジュゲーションの例によれば、標準的な遺伝子的方法では到達できないキメラタンパク質も本明細書に記載した方法及び試薬を用いれば良好な収率で得られる場合があることがわかる。 図９は抗ＧＦＰナノボディのソルタギングを示す。図１０はインターフェロンアルファ（ＩＮＦＡ）及び抗ＧＦＰ（抗ｅＧＦＰ）ナノボディのソルタギングを示す。３７：Ｃ末端アジド；５７：Ｃ末端シクロオクチン；４０：Ｎ末端シクロオクチン；４１：Ｎ末端アジド。図１１はＩＮＦＡ及び抗ＧＦＰのソルタギングを示す。実施例４：材料及び方法ソルターゼ反応ペプチドの固相ペプチド合成 Ｒｉｎｋアミド樹脂をＮＭＰ中に溶媒和させ、ＮＭＰ中２０％ピペリジンで樹脂を処理することによりＦｍｏｃ基を除去した後、樹脂にローディングし、連続工程を用いて伸長した。（Ｉ）樹脂をＮＭＰ（３ｘ）、ＣＨ２Ｃｌ２（３ｘ）及びＮＭＰで洗浄した。（ＩＩ）Ｆｍｏｃ−保護アミノ酸（市販品又は自家製）をＨＯＢｔ（３当量）、ＰｙＢＯＰ（３当量）及びＤｉＰＥＡ（６当量）の存在下に濃縮した。（ＩＩＩ）樹脂を工程（Ｉ）と同条件を用いて再度洗浄した。（ＩＶ）カイザー試験を用いてカップリングをモニタリングし、そして終了後（Ｖ）ＮＭＰ中２０％ピペリジンを用いてＦｍｏｃ−保護基を除去した。 最後に、３時間９５％ＴＦＡ、２．５％ＴＩＳ、２．５％Ｈ２Ｏの存在下に樹脂を攪拌することにより樹脂からペプチドを切断した。氷冷Ｅｔ２Ｏを切断溶液に添加し、形成した沈殿は、４℃で３０分間溶液を遠心分離することによりペレット化した。粗製のペプチドは逆相ＨＰＬＣ精製により精製した（使用バッファー：Ａ：Ｈ２Ｏ、Ｂ：ＡＣＮ、Ｃ：Ｈ２Ｏ中１０％ＴＦＡ）。Ｃ末端ペプチドＨ２Ｎ−ＧＧＧＫ（アジドヘキサン酸）−ＣＯＮＨ２ Ｒｉｎｋアミド樹脂（１００ｍｇ、５０μｍｏｌ）をＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨと共にローディングし、一般的方法に記載される通り、Ｆｍｏｃ−ＧＧＧ−ＯＨと共に伸長した。ＣＨ２Ｃｌ２で樹脂を洗浄した後、３０分間（又は黄色が完全に消失するまで）ＣＨ２Ｃｌ２中１％ＴＦＡ、１％ＴＩＳで２回樹脂を処理することによりＭｔｔ保護基を除去した。樹脂をＣＨ２Ｃｌ２（５ｘ）、ＮＭＰ（５ｘ）及び５等量のＤｉＰＥＡを含有するＮＭＰで洗浄した。アジドヘキサン酸（３１ｍｇ、２００μｍｏｌ）をＰｙＢＯＰ（１０４ｍｇ、２００μｍｏｌ）及びＤｉＰＥＡ（７０μＬ、４００μｍｏｌ）を用いて縮合した。２時間振とうした後、カイザー試験によると完全な変換が明らかになった。Ｎ末端Ｆｍｏｃ基を除去し、一般的方法に記載される通りペプチドを樹脂から切断した。逆相ＨＰＬＣ精製（１２分にわたり１５〜２４％Ｂ（３ＣＶ）、Ｒｔ＝８分）により標題化合物（１５．４ｍｇ、３３μｍｏｌ、６７％）をオフホワイトの固体として得た。Ｈ２Ｎ−ＧＧＧＣ（ＤＢＣＯ）−ＣＯＮＨ２ Ｒｉｎｋアミド樹脂（１６７ｍｇ、１００μｍｏｌ）をＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨと共にローディングし、Ｆｍｏｃ−ＧＧＧ−ＯＨと共に伸長し、そして一般的方法に記載の通り樹脂から切断することにより、粗製のＨ２Ｎ−ＧＧＧＣ−ＣＯＮＨ２（配列番号１２９）を定量的収率で得た。このペプチド（３８ｍｇ、８３μｍｏｌ）をＰＢＳ（０．２５ｍＬ）中に溶解し、そしてこれにＤＭＦ（０．２５ｍＬ）中ＤＢＣＯ−マレイミド（１７ｍｇ、４０μｍｏｌ）を添加した。反応物を一晩攪拌し、ＴＦＡで酸性化し、ＲＰ−ＨＰＬＣ（２０分にわたり２０〜３５％Ｂ（５ＣＶ））で精製することによりにより標題化合物（１５．３ｍｇ、２２μｍｏｌ、２７％）を白色固体として得た。Ｎ末端ペプチドアジドヘキサン酸−ＬＰＥＴＧＧ−ＣＯＮＨ２ Ｒｉｎｋアミド樹脂（６０μｍｏｌ）をＦｍｏｃ−Ｇｌｙｃ−ＯＨと共にローディングし、適切に保護されたアミノ酸と共に伸長し、そして一般的方法に記載の通り樹脂から切断した。最終カップリングのためにアジドヘキサン酸を使用した。ＲＰ−ＨＰＬＣ（１２分にわたり２６〜３５％Ｂ（３ＣＶ））により標題化合物（９．５ｍｇ、１３μｍｏｌ、１３％）を白色固体として得た。ＤＢＣＯ−ＬＰＥＴＧＧ−ＣＯＮＨ２ リンクアミド樹脂をＦｍｏｃ−Ｇｌｙｃ−ＯＨと共にローディングし、適切に保護されたアミノ酸と共に伸長し、そして一般的方法に記載の通り樹脂から切断した。Ｅｔ２Ｏから沈殿させることにより粗製のＨ２Ｎ−ＬＰＥＴＧＧ−ＣＯＮＨ２（配列番号１３２）（１７．９ｍｇ、３１．３μｍｏｌ）を得て、これをＤＭＦ（０．５ｍＬ）中に溶解した。ＤＢＣＯ−ＯＳｕ（１４ｍｇ、２０μｍｏｌ）を添加し、反応物を一晩攪拌した。溶液を希釈した後、ＲＰ−ＨＰＬＣ（１２分にわたり２５〜３４％Ｂ（３ＣＶ））により精製し、標題化合物をオフホワイトの固体として得た。ユビキチンのソルタギング ソルターゼ（７．２μＬ、７００μＭ）及びプローブ（１０μＬ、５ｍＭ）を１００μＬのソルターゼバッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＣａＣｌ２）中のユビキチン（５８μＭ）に添加した。得られた混合物を２時間３７℃でインキュベーションした。次に溶液を酸性化し、逆相ＨＰＬＣで精製した。得られた精製タンパク質を真空下に濃縮し、Ｈ２Ｏに再溶解し、ゲル電気泳動で定量した。ナノボディのソルタギング ソルターゼ（７．２μＬ、７００μＭ）及びプローブ（１０μＬ、５ｍＭ）を１００μＬのソルターゼバッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＣａＣｌ２）中のナノボディ（１５μＭ）に添加した。得られた混合物を３７℃で一晩インキュベーションした。次に溶液をＥｔ３ＮＨＯＡｃ（ｐＨ５）で希釈し、サイズ排除クロマトグラフィーで精製した。得られた精製タンパク質を真空下に濃縮し、Ｈ２Ｏに再溶解し、ゲル電気泳動で定量した。ユビキチンの２量体化 アジド修飾ユビキチン及びＤＢＣＯ修飾ユビキチンを１：１の比で混合し、３７℃で０．５〜７時間インキュベーションした。２量体化産物への変換はゲル電気泳動を用いて分析した。活性の検定 アジド修飾ＵｂＶＭＥ及びＤＢＣＯ修飾ＵｂＶＭＥを１：１の比で混合し、３７℃で一晩インキュベーションした。２量体化の後、試料をＴｒｉｓバッファー（７μＬ）で希釈し、ＵＣＨＬ３（２μＬ、ＵｂＶＭＥに対して５倍過剰）を添加した。得られた混合物を２時間インキュベーションし、試料バッファー（４ｘ）で変性し、１５％ゲル上にローディングした。タンパク質をＰＶＤＦ膜に転移させた。膜をＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（０．１％）中４％ミルクでブロッキングした。ウサギポリクローナル抗ユビキチン（１：１００）を添加し、膜を室温で３０分間攪拌した。膜をＰＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した後、二次抗体（ＨＲＰヤギ抗ウサギ、１：２５０００）を添加した。室温で３０分間振とうした後、膜をＰＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎ（ｘ４）で洗浄し、タンパク質を、ＥＣＬｐｌｕｓを用いて可視化した。実施例５：非天然Ｎ−Ｎ及びＣ−Ｃタンパク質融合物の調製 本明細書に記載した方策を用いることにより融合パートナーの生物活性を完全に保持しつつ連結タンパク質に対して化学的損傷をもたらすことなくＮ対Ｎ及びＣ対Ｃタンパク質融合物を生成した。ソルターゼＡを用いて必要な修飾を目的タンパク質のＮ又はＣ末端上に設置することにより、ひずみ促進銅非含有ヒュスゲン環化付加を実施した。ここではタンパク質−タンパク質融合物に適用すれば、記載した方法を用いて如何なるタンパク質も目的の如何なる物質ともコンジュゲーションすることができる。材料及び方法 一般的実験。全ての化学薬品は商業的供給源のものであり、入手した状態で使用した。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）はＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍより購入した。リンクアミド樹脂はＡｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈより購入した。シクロオクチン試薬はＣｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｏｏｌｓより購入した。生物学的操作において、又は反応溶媒として使用した水はＭｉｌｌｉＱ精製システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて精製した。ＤｒｉＳｏｌｖ（登録商標）無水ＣＨ２Ｃｌ２、ＤｒｉＳｏｌｖ（登録商標）無水ＭｅＯＨ、ＤｒｉＳｏｌｖ（登録商標）無水ＤＭＦはＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。再蒸留した無水Ｎ、Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（ＤｉＰＥＡ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈより入手した。 質量スペクトル分析。ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ分析はＭｉｃｒｏｍａｓｓＬＣＴ質量分析器（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ（登録商標）ＭＳ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）及びＨＴＣ ＰＡＬオートサンプラー（Ｍｉｃｈｒｏｍ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ、ＵＳＡ）及びＷａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ５μｍＣ８カラム（２．１ｘ５０ｍｍ、ＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ（０．１％ギ酸）勾配移動相、１５０μＬ／分）を装備したＰａｒａｄｉｇｍ ＭＧ４ＨＰＬＣシステムを用いて実施した。 ＨＰＬＣ／ＦＰＬＣ。以下に示す通り、Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ Ｐａｋ１５μｍ、１００ÅＣ１８カラム（７．８ｘ３００ｍｍ、ＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ勾配移動相、３ｍＬ／分）を装備したＡｇｉｌｅｎｔ １１００ Ｓｅｒｉｅｓ ＨＰＬＣシステムを用いてＨＰＬＣ精製を行った。サイズ排除及びカチオン交換クロマトグラフィーはＨｉＬｏａｄ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）又はＭｏｎｏＳ５／５０ＧＬカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）をそれぞれ装備したＰｈａｒｍａｃｉａ ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒシステム上で実施した。 ＵＶ−ｖｉｓｓスペクトル分析。ＵＶ−ｖｉｓスペクトル分析はＮａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ−１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）上にて実施した。 Ｉｎ−ｇｅｌ蛍光。蛍光ゲル画像はＴｙｐｈｏｏｎ９２００Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｍｏｄｅ Ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて獲得した。 プローブの固相ペプチド合成に関する一般的操作法。Ｒｉｎｋアミド樹脂をＮＭＰ中に溶媒和させ、ＮＭＰ中２０％ピペリジンで樹脂を処理することによりＦｍｏｃ基を除去した後、樹脂をローディングし、連続工程を用いて伸長した。 （Ｉ）樹脂をＮＭＰ（３ｘ）、ＣＨ２Ｃｌ２（３ｘ）及びＮＭＰで洗浄した。（ＩＩ）Ｆｍｏｃ−保護アミノ酸をＨＯＢｔ（３当量）、ＰｙＢＯＰ（３当量）及びＤｉＰＥＡ（６当量）の存在下に縮合した。（ＩＩＩ）樹脂を工程（Ｉ）と同条件を用いて再度洗浄した。（ＩＶ）カイザー試験を用いてカップリングをモニタリングし、そして終了後（Ｖ）ＮＭＰ中２０％ピペリジンを用いてＦｍｏｃ−保護基を除去した。最終工程において、３時間９５％ＴＦＡ、２．５％ＴＩＳ、２．５％Ｈ２Ｏの存在下に樹脂を攪拌することにより樹脂からペプチドを切断した。氷冷Ｅｔ２Ｏを切断溶液に添加し、形成した沈殿は、４℃で３０分間溶液を遠心分離することにより収集した。粗製のペレットは逆相ＨＰＬＣ精製により精製した（使用バッファー：Ａ：Ｈ２Ｏ、Ｂ：ＡＣＮ、Ｃ：Ｈ２Ｏ中１０％ＴＦＡ）。Ｎ末端プローブ アジドヘキサン酸−ＬＰＥＴＧＧ−ＣＯＮＨ２（１）。Ｒｉｎｋアミド樹脂（６０μｍｏｌ）をＦｍｏｃ−Ｇｌｙｃ−ＯＨと共にローディングし、適切に保護されたアミノ酸と共に伸長し、一般的方法に記載の通り樹脂から切断した。最終カップリングのためにアジドヘキサン酸を使用した。ＲＰ−ＨＰＬＣ（１２分にわたり２６〜３５％Ｂ（３ＣＶ））により標題化合物（９．５ｍｇ、１３μｍｏｌ、１３％）を白色固体として得た。ＬＣ／ＭＳ：Ｒｔ６．３４分；直線勾配１０分にわたり５→４５％Ｂ；ＥＳＩ／ＭＳ： ｍ／ｚ ＝ ７１１．１ ［Ｍ＋Ｈ］＋． １Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ４．６５ （ｄｄ， Ｊ ＝ １０．０， ４．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４２ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．４， ６．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３５ （ｄｄ， Ｊ ＝ ９．２， ５．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３０−４．２４ （ｍ， ２Ｈ）， ４．００ （ｓ， ２Ｈ）， ３．９６ （ｓ， ２Ｈ）， ３．９１−３．８４ （ｍ， ４Ｈ）， ３．７０−３．６４ （ｍ， １Ｈ）， ２．４８ （ｔ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２６ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６）， ２．２４−１．９６ （ｍ， ６Ｈ）， １．７８−１．７０ （ｍ， １Ｈ）， １．６９−１．５６ （ｍ， ７Ｈ）， １．４４−１．３８ （ｍ， ３Ｈ）， １．２１ （ｄ， Ｊ ６．４ Ｈｚ， ３Ｈ）， ０．９７ （ｔ， ６．４ Ｈｚ， ６Ｈ）。 ＤＩＢＡＣ−ＬＰＥＴＧＧ−ＣＯＮＨ２（２）。リンクアミド樹脂をＦｍｏｃ−Ｇｌｙｃ−ＯＨと共にローディングし、適切に保護されたアミノ酸と共に伸長し、そして一般的方法に記載の通り樹脂から切断した。Ｅｔ２Ｏから沈殿させることにより粗製のＨ２Ｎ−ＬＰＥＴＧＧ−ＣＯＮＨ２（配列番号１３２）（１７．９ｍｇ、３１．３μｍｏｌ）を得て、これをＤＭＦ（０．５ｍＬ）中に溶解した。ＤＩＢＡＣ−ＯＳｕ（１４ｍｇ、２０μｍｏｌ）を添加し、反応物を一晩攪拌した。溶液を希釈した後、ＲＰ−ＨＰＬＣ（１２分にわたり２５〜３４％Ｂ（３ＣＶ））により精製し、標題化合物（１３．１ｍｇ、１２．３μｍｏｌ、３９％）をオフホワイトの固体として得た。ＬＣ／ＭＳ：Ｒｔ９．４２分；直線勾配１０分にわたり５→４５％Ｂ；ＥＳＩ／ＭＳ： ｍ／ｚ ＝１０６６．１４ ［Ｍ＋Ｈ］＋． １Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ７．６５ （ｄｄ， Ｊ ＝１３．２， ７．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４６−７．２８ （ｍ， ７Ｈ）， ５．０５ （ｄ， Ｊ ＝ １４．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．７２−４．６５ （ｍ， １Ｈ）， ４．６０−４．５０ （ｍ， １Ｈ）， ４．４８−４．３８ （ｍ， ２Ｈ）， ４．３６ （ｄ， Ｊ ＝ ４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．２６−４．２３ （ｍ， １Ｈ）， ４．０４−３．８７ （ｍ， ５Ｈ）， ３．７３−３．６２ （ｍ， ２Ｈ）， ３．５２−３．３８ （ｍ， １Ｈ）， ３．１０−２．９２ （ｍ， １Ｈ）， ２．８２−２．６７ （ｍ， １Ｈ）， ２．５６−２．３９ （ｍ， ５Ｈ）， ２．３４−２．０９ （ｍ， ６Ｈ）， ２．０７−１．９８ （ｍ， ４Ｈ）， １．９４−１．８５ （ｍ， ２Ｈ）， １．７２−１．５２ （ｍ， ６Ｈ）， １．５０−１．４０ （ｍ， １Ｈ）， １．２０ （ｄ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ， ３Ｈ）， ０．９８−０．９０ （ｍ， ６Ｈ）。Ｃ末端プローブ Ｈ２Ｎ−ＧＧＧＫ（Ｎ３）Ｋ（ＴＡＭＲＡ）−ＣＯＮＨ２（３）。Ｒｉｎｋアミド樹脂（６０μｍｏｌ）をＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨと共にローディングし、一般的方法に記載の通りＦｍｏｃ−アジドリジン−ＯＨ及びＦｍｏｃ−ＧＧＧ−ＯＨと共に伸長した。ＣＨ２Ｃｌ２で樹脂を洗浄した後、３０分間（又は黄色が完全に消失するまで）ＣＨ２Ｃｌ２中１％ＴＦＡ、１％ＴＩＳで２回樹脂を処理することによりＭｔｔ保護基を除去した。樹脂をＣＨ２Ｃｌ２（５ｘ）、ＮＭＰ（５ｘ）及びＤｉＰＥＡを含有するＮＭＰ（４３．５μＬ、２５０μｍｏｌ、５等量）で洗浄した。５（６）−カルボキシテトラメチルローダミン（７７ｍｇ、１８０μｍｏｌ、３当量）をＰｙＢＯＰ（９４ｍｇ、１８０μｍｏｌ、３当量）及びＤｉＰＥＡ（６５μＬ、３７０μｍｏｌ、６当量）を用いて縮合した。１６時間振とうした後、カイザー試験によると完全な変換が明らかになった。Ｎ末端Ｆｍｏｃ基を除去し、一般的方法に記載される通りペプチドを樹脂から切断した。逆相ＨＰＬＣ精製（１２分にわたり２５〜３４％Ｂ（３ＣＶ））により標題化合物（４１．４ｍｇ、５０．５μｍｏｌ、８１％）を紫色固体として得た。ＬＣ／ＭＳ：Ｒｔ５．５０及び６．１０分；直線勾配１０分にわたり５→４５％Ｂ；ＥＳＩ／ＭＳ： ｍ／ｚ ＝ ８８３．３ ［Ｍ＋Ｈ］＋． １Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ８．７８ （ｄ， Ｊ ＝ １．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．２８ （ｄｄ， Ｊ ＝ ７．６， １．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．５３ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ）， ７．１４ （ｄ， Ｊ ＝ ９．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．０６ （ｄｄ， Ｊ ＝ ９．６， ２．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．９８ （ｄ， Ｊ ＝ ２．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．３４ （ｄｄ， Ｊ ＝ ９．２， ５．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．９８ （ｄ， １４．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９６ （ｓ， ２Ｈ）， ３．８２ （ｄ， １８．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．８０ （ｓ， ２Ｈ）， ３．５４−３．４６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．３２−３．２８ （ｍ， １４Ｈ）， １．９４−１．４５ （ｍ， １２Ｈ）。 Ｈ２Ｎ−ＧＧＧＣ（ＤＩＢＡＣ）−ＣＯＮＨ２（４）。Ｒｉｎｋアミド樹脂（１６７ｍｇ、１００μｍｏｌ）をＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨと共にローディングし、Ｆｍｏｃ−ＧＧＧ−ＯＨと共に伸長し、一般的方法に記載の通り樹脂から切断することにより、粗製のテトラペプチドＨ２Ｎ−ＧＧＧＣ−ＣＯＮＨ２（配列番号１２９）を定量的収率で得た。このペプチド（３８ｍｇ、８３μｍｏｌ、２当量）をＰＢＳ（０．２５ｍＬ）中に溶解し、そしてこれにＤＭＦ（０．２５ｍＬ）中のＤＩＢＡＣ−マレイミド（１７ｍｇ、４０μｍｏｌ、１当量）を添加した。反応物を一晩攪拌し、ＴＦＡで酸性化し、ＲＰ−ＨＰＬＣ（２０〜３５％Ｂｉｎ２０ｍｉｎ（５ＣＶ））で精製することにより標題化合物（１５．３ｍｇ、２２μｍｏｌ、２７％）を白色固体として得た。ＬＣ／ＭＳ：Ｒｔ６．９０分；直線勾配１０分にわたり５→４５％Ｂ；ＥＳＩ／ＭＳ： ｍ／ｚ ＝ ７１９．３ ［Ｍ＋Ｈ］＋． １Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， Ｍ） δ ｐｐｍ ７．６６ （ｄ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．５５−７．５１ （ｍ， １Ｈ）， ７．４８−７．４５ （ｍ， ３Ｈ）， ７．３８ （ｄｔ， Ｊ ＝７．６， １．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３７−７．３３ （ｍ， １Ｈ）， ７．２８ （ｄ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．１４ （ｄ， Ｊ ＝１４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．６９−４．６４ （ｍ， １Ｈ）， ４．０１−３．８５ （ｍ， ６Ｈ）， ３．７７ （ｄ， Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ， １Ｈ） ３．７３ （ｓ， １Ｈ）， ３．７０ （ｓ， １Ｈ）， ３．６７−３．６３ （ｍ， ２Ｈ）， ３．３９ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １４．０， ５．２， ２．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．２７−３．０５ （ｍ， ５Ｈ）， ２．９７ （ｄｄｄ， Ｊ ＝１４， ８．４， ５．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．４８−２．４１ （ｍ， ３Ｈ）， ２．３３−２．８７ （ｍ， ２Ｈ） ２．０８−１．９９ （ｍ， １Ｈ）。 Ｈ２Ｎ−ＧＧＧＫ（アジドヘキサン酸）−ＣＯＮＨ２（５）。Ｒｉｎｋアミド樹脂（１００ｍｇ、５０μｍｏｌ）をＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨと共にローディングし、一般的方法に記載されるとおり、Ｆｍｏｃ−ＧＧＧ−ＯＨと共に伸長した。ＣＨ２Ｃｌ２で樹脂を洗浄した後、３０分間（又は黄色が完全に消失するまで）ＣＨ２Ｃｌ２中１％ＴＦＡ、１％ＴＩＳで２回樹脂を処理することによりＭｔｔ保護基を除去した。樹脂をＣＨ２Ｃｌ２（５ｘ）、ＮＭＰ（５ｘ）及びＤｉＰＥＡを含有するＮＭＰ（４３．５μＬ、２５０μｍｏｌ、５等量）で洗浄した。アジドヘキサン酸（３１ｍｇ、２００μｍｏｌ、４当量）をＰｙＢＯＰ（１０４ｍｇ、２００μｍｏｌ、４当量）及びＤｉＰＥＡ（７０μＬ、４００μｍｏｌ、８当量）を用いて縮合した。２時間振とうした後、カイザー試験によると完全な変換が明らかになった。Ｎ末端Ｆｍｏｃ基を除去し、一般的方法に記載される通りペプチドを樹脂から切断した。逆相ＨＰＬＣ精製（１２分にわたり１５〜２４％Ｂ（３ＣＶ））により標題化合物（１５．４ｍｇ、３３μｍｏｌ、６７％）をオフホワイトの固体として得た。ＬＣ／ＭＳ：Ｒｔ２．７７分；直線勾配１０分にわたり５→４５％Ｂ；ＥＳＩ／ＭＳ： ｍ／ｚ ＝ ４５６．３ ［Ｍ＋Ｈ］＋． １Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ４．３５ （ｄｄ， Ｊ ＝ ９．２， ４．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９８ （ｄ， Ｊ ＝ １６．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９７ （ｓ， ２Ｈ）， ３．８６ （ｄ， Ｊ ＝ １６．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．７８ （ｓ， ２Ｈ）， ３．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．１７ （ｄｔ， Ｊ ＝６．８， ２．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２０ （ｔ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．８６−１．８１ （ｍ， １Ｈ）， １．７３ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １８．４， ９．４， ５．０ Ｈｚ， １Ｈ）， １．６７−１．５７ （ｍ， ４Ｈ）， １．５５−１．４７ （ｍ， ２Ｈ）， １．４３−１．３８ （ｍ， ４Ｈ）。 タンパク質のクローニング及び発現。Ｎ末端Ｈｉｓタグとその後のトロンビン切断部位（ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＧＧＳＨ、配列番号１３０）にＮ末端融合したユビキチンをｐＥＴ２８ベクター中にクローニングした。ベクターをＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ内に形質転換した。スターター培養物をＬＢ中に生育させた。発現培養を０．２のＯＤ６００において開始した。培養物が０．６〜０．８のＯＤ６００に到達した時点で、細菌を１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、３７℃で６時間培養した。細菌を１５分間６０００Ｇで遠心分離することにより収集し、ペレットを溶解バッファー（２０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０、１５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、５０μｇ／ｍＬＤＮＡｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）及び１錠／２５ｍＬの完全プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ））に再懸濁し、そして超音波処理した。溶解物を遠心分離により澄明化した。可溶性タンパク質をＮｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。トロンビン配列を、トロンビンＣｌｅａｎＣｌｅａｖｅキット（ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて除去した。 Ｎ末端でトロンビン切断部位とその後のＧＧＧ（ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＧＧ、配列番号１３１）と融合し、Ｃ末端でインテリンに融合したユビキチン（１−７５）をｐＴＹＢ２内にクローニングした。ベクターをＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ内に形質転換した。構築されたユビキチン−インテリンを発現させ、精製し、ＨＡタグ付ＵｂＶＭＥに関して前記したとおりＵｂＶＭＥに変換した。トロンビンＣｌｅａｎＣｌｅａｖｅキットを用いてＮ末端グリシン残基を露出させた。 Ｃ末端ＬＰＥＴＧＧ（配列番号１）を含有する抗ＧＦＰの合成型をｐＥＴ２８Ａ＋ベクター内にサブクローニングした。ベクターをＥ・コリＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ内に形質転換した。スターター培養物（２５０ｍＬ、ＬＢ培地）を３７℃で飽和するまで一晩生育させた。ＯＤ６００＝０．２（２Ｌ、コウボ／トリペプトン（２ＹＴ）培地）で開始した発現培養をＯＤ６００＝０．６となるまで３７℃で生育させた。細菌をＩＰＴＧ（１ｍＭ）で誘導し、２５℃で１６時間生育させた。１５分間６０００Ｇで遠心分離することにより細菌を収集し、それらを溶解バッファー（２０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０、１５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、５０μｇ／ｍＬＤＮＡｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）及び１錠／２５ｍＬの完全プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ））中で超音波処理することにより溶解した。溶解物を遠心分離により澄明化した。可溶性タンパク質はＮｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）とその後のＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ７５上のサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。 Ｃ末端ＬＰＥＴＧＧＨＨＨＨＨＨ（配列番号４５）を含有するＶＨＨ７を、ｐｅｌＢリーダー配列にＮ末端で先導されたｐＨＥＮベクター内にクローニングした。ベクターをＥ・コリＷＫ６内に形質転換した。開始培養物（２５０ｍＬ）を３７℃で飽和するまで２ＹＴ中で一晩生育させた。発現培養を０．２のＯＤ６００において開始した。培養物がＯＤ６００＝０．７に到達した時点で、タンパク質の発現を１ｍＭＩＰＴＧ添加により誘導した。細菌を３７℃で一晩培養した。４℃で１時間１容量の１ｘＴＥＳバッファー（Ｔｒｉｓ０．２Ｍ、ＥＤＴＡ０．６５ｍＭ、Ｓｕｃｒｏｓｅ０．５Ｍ）中で細菌ペレットをインキュベーションすることによりペリプラズム画分を単離し、その後、２容量の０．２５ｘＴＥＳバッファーを添加した。得られた懸濁液を４℃で一晩攪拌した。溶液を遠心分離により澄明化し、アミコンウルトラ３Ｋスピン濃縮器を用いて濃縮し、タンパク質をＮｉ−ＮＴＡに付した。サイズ排除クロマトグラフィーによりタンパク質を更に精製した。 リーダー配列を有さず、Ｃ末端において配列ＧＧＬＰＥＴＧＧＨＨＨＨＨＨ（配列番号４６）に融合されたヒトインターロイキン−２をｐＥＴ２８ａ＋ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にクローニングした。ベクターをＥ・コリＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ内に形質転換し、スターター培養物を３７℃で一晩生育させた。スターター培養物を発現培養物（３Ｌ、２ＹＴ）に添加し、ＯＤ６００が０．６に到達するまで生育させた。発現を誘導するために１ｍＭＩＰＴＧ（終濃度）を添加し、細菌を４時間３７℃で生育させた。細菌を４℃で１５分間６０００Ｇで遠心分離することにより収集した。細菌を溶解バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、５０μｇ／ｍＬＤＮＡｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）及び１錠／２５ｍＬの完全プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ））中で超音波処理によって溶解した。封入体を遠心分離（４℃で１５分間１２０００ｘｇ）により収集した。５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、６Ｍグアニジニウム中に溶解する前に、封入物をまずペレット溶解バッファー（１ｘ）、ｎ−ブタノール（１ｘ）、及び５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ＭグアニジニウムＨＣｌ（２ｘ）再懸濁とその後の遠心分離により洗浄した。 未折畳のタンパク質（６ｍｇ／ｍＬ、０．７ｍＬ）をＴＣＥＰ（１ｍＭ）で前処理し、その後、２５℃の再折畳バッファー（２００ｍＬ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセロール、５ｍＭグルタチオン、０．５ｍＭ酸化グルタチオン）に添加した（０．１ｍＬ／ｈ）。反応物を２日間攪拌し、Ｎｉ−ＮＴＡカラム上で濃縮し、その後サイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。 Ｓ・アウレウスのソルターゼＡ及びヒトＩＦＮα２ａを文献に従って発現させ、精製した（Ｐｏｐｐ， Ｍ． Ｗ．； Ｄｏｕｇａｎ， Ｓ． Ｋ．； Ｃｈｕａｎｇ， Ｔ．−Ｙ．； Ｓｐｏｏｎｅｒ， Ｅ．； Ｐｌｏｅｇｈ， Ｈ． Ｌ． Ｐ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕｓａ ２０１１， １０８， ３１６９−３１７４； ａｎｄ Ｐｏｐｐ， Ｍ． Ｗ．； Ａｎｔｏｓ， Ｊ． Ｍ．； Ｐｌｏｅｇｈ， Ｈ． Ｌ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ； Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ． Ｅ．； Ｄｕｎｎ， Ｂ． Ｍ．； Ｓｐｅｉｃｈｅｒ， Ｄ． Ｗ．； Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ， Ｐ． Ｔ．， Ｅｄｓ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．： Ｈｏｂｏｋｅｎ， ＮＪ， ＵＳＡ， ２００１； これらは参照により全体が本明細書に組み込まれる）。 Ｎ３−ＬＰＥＴＧＧ（１）及びＤＩＢＡＣ−ＬＰＥＴＧＧ（２）によるユビキチンの修飾。ユビキチンをＵｂＶＭＥに関して記載したとおり１及び２で修飾した。Ｎ３−Ｕｂ：Ｒｔ７．１７分；直線勾配１０分にわたり５→４５％Ｂ；ＥＳＩ／ＭＳ：ｍ／ｚ＝９５４２（Ｍ＋Ｈ）＋。ＤＩＢＡＣ−Ｕｂ：Ｒｔ７．３７分；直線勾配１０分にわたり５→４５％Ｂ；ＥＳＩ／ＭＳ：ｍ／ｚ＝９８９８（Ｍ＋Ｈ）＋。 ユビキチンの２量体化。アジド修飾ユビキチン（５μＬ、４μｇ／μＬ）及びＤＩＢＡＣ修飾ユビキチン（８μＬ、２．５μｇ／μＬ）を混合（終濃度はタンパク質１７０μＭ）し、３７℃で０．５〜７時間インキュベーションした。２量体化産物への変換はゲル電気泳動を用いて分析した。 Ｎ末端ソルタギング．Ｓ・アウレウスのソルターゼＡ（１５０μＭ終濃度、５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ中４．５×保存液）及びプローブ１又は２（０．５ｍＭ終濃度、１０×保存液）をソルターゼバッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＣａＣｌ２）中のＵｂＶＭＥ（５８μＭ終濃度）に添加した。得られた混合物を３時間３７℃でインキュベーションした。次に、溶液をＨ２Ｏ中１％ＴＦＡで酸性化し、逆相ＨＰＬＣ（２０分にわたり３０→４５％Ｂ、３ｍＬ／分）により精製した。得られた精製タンパク質を飽和水性ＮａＨＣＯ３で中和し、真空下に濃縮し、Ｈ２Ｏに再溶解し、ゲル電気泳動で定量した。タンパク質をＬＣ／ＭＳで分析した。Ｎ３−ＵｂＶＭＥ：Ｒｔ７．７０分；直線勾配２０分にわたり５→４５％Ｂ；ＥＳＩ／ＭＳ：ｍ／ｚ＝９７１４（Ｍ＋Ｈ）＋。ＤＩＢＡＣ−ＵｂＶＭＥ：Ｒｔ７．５４分；直線勾配２０分にわたり５→４５％Ｂ；ＥＳＩ／ＭＳ：ｍ／ｚ＝９３６０（Ｍ＋Ｈ）＋。 Ｃ末端ソルタギング．Ｓ・アウレウスのソルターゼＡ（１５０μＭ終濃度、５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ中４．５×保存液）及びプローブ（０．５ｍＭ終濃度、１０×保存液）をソルターゼバッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＣａＣｌ２）中のＶＨＨ（１５μＭ終濃度）に添加した。得られた混合物を一晩２５℃でインキュベーションした。タンパク質をＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ７５上のサイズ排除により精製した。得られた精製タンパク質を遠心フィルターユニット中で濃縮し、ゲル電気泳動及びＬＣ／ＭＳで分析した。抗ＧＦＰ−３：Ｒｔ６．０２分；直線勾配２０分にわたり５→４５％Ｂ；ＥＳＩ／ＭＳ：ｍ／ｚ＝１４３３０（Ｍ＋Ｈ）＋。抗ＧＦＰ−４：Ｒｔ７．９０分；直線勾配２０分にわたり５→４５％Ｂ；ＥＳＩ／ＭＳ：ｍ／ｚ＝１４１７０（Ｍ＋Ｈ）＋。ＶＨＨ７−３：Ｒｔ７．２０分；直線勾配２０分にわたり５→４５％Ｂ；ＥＳＩ／ＭＳ：ｍ／ｚ＝１５５４９（Ｍ＋Ｈ）＋。ＶＨＨ７−５：Ｒｔ７．００分；直線勾配２０分にわたり５→４５％Ｂ；ＥＳＩ／ＭＳ：ｍ／ｚ＝１５１３９（Ｍ＋Ｈ）＋。 ２量体ＵｂＶＭＥコンストラクトの合成。アジド修飾ＵｂＶＭＥ（４２．５μＬ、８０μＭ）及びシクロオクチン修飾ＵｂＶＭＥ（４２．５μＬ、７０μＭ）の混合物を一晩インキュベーションし、その後、逆相ＨＰＬＣ（２０分にわたり３０→４５％Ｂ、３ｍＬ／分）で精製した。精製後、溶液を飽和水性ＮａＨＣＯ３で中和し、真空下に濃縮した。反応性ビニルメチルエステル１つのみを含有する２量体ユビキチンコンストラクトは、アジド修飾ユビキチン（４２．５μＬ、８０μＭ）をシクロオクチン修飾ＵｂＶＭＥ（４２．５μＬ、７０μＭ）と共に、又はアジド修飾ＵｂＶＭｅ（４２．５μＬ、８０μＭ）をシクロオクチン修飾ユビキチン（４２．５μＬ、７０μＭ）と共にインキュベーションすることにより得られた。２量体化の後、タンパク質を前述の通り精製して操作した。 ２量体ＵｂＶＭＥコンストラクトによるＵＣＨＬ３の標識。精製された２量体コンストラクト（０．５μｇ、２４．５ｐｍｏｌ）をＵＣＨＬ３（９４ｐｍｏｌ）の存在下又は非存在下に２０μＬＴｒｉｓバッファー（２０ｍＭ、ｐＨ８、１００ｍＭＮａＣｌ、０．１ｍＭＴＣＥＰ）中に希釈した。得られた混合物を２時間インキュベーションし、ラエムリ試料バッファー（４×）で変性し、ＴＲＩＳ−トリシンゲル上にローディングした。タンパク質はクーマジーブリリアントブルー染色により直接分析するか、又は、ＰＶＤＦ膜に転移させた。膜をＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（０．１％ｖ／ｖ）中４％ＢＳＡでブロッキングした。ペンタＨｉｓＨＲＰ（１：１２５００）を添加し、膜を室温で３０分間攪拌した。膜をＰＢＳ中０．１％ｖ／ｖＴｗｅｅｎで４回洗浄し、その後、タンパク質を、ＥＣＬｐｌｕｓを用いて可視化した。 ナノボディの２量体化。ホモ２量体抗ＧＦＯナノボディ抗ＧＦＰ−３（１００μＬ、８０μＭ）及び抗ＧＦＰ−４（１００μＬ、８５μＭ）室温で一晩インキュベーションすることにより調製した。ヘテロ２量体ＶＨＨ７−３−抗ＧＦＰ−４及びＶＨＨ７−５−抗ＧＦＰ−４は２５℃で一晩ＶＨＨ７−３（２０μＭ溶液２００μＬ）又はＶＨＨ７−５（６０μＭ溶液２００μＬ）を抗ＧＦＰ−４（１００μＬの１２０μＭ溶液）と反応させることにより得た。２量体ナノボディはＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ７５上のサイズ排除により精製した。画分を収集し、遠心フィルターユニット中で濃縮した。精製した２量体を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析した。（抗ＧＦＰ）２：Ｒｔ１０．０７分；直線勾配２０分にわたり５→４５％Ｂ；ＥＳＩ／ＭＳ：ｍ／ｚ＝２８５２６（Ｍ＋Ｈ２Ｏ＋Ｈ）＋。ＶＨＨ７−３−抗ＧＦＰ−４：Ｒｔ１０．９１分；直線勾配２０分にわたり５→４５％Ｂ；ＥＳＩ／ＭＳ：ｍ／ｚ＝２９７５５（Ｍ＋Ｈ２Ｏ＋Ｈ）＋。ＶＨＨ７−５−抗ＧＦＰ−４：Ｒｔ１０．８７分；直線勾配２０分にわたり５→４５％Ｂ；ＥＳＩ／ＭＳ：ｍ／ｚ＝２９３２９（Ｍ＋Ｈ２Ｏ＋Ｈ）＋。 ホモ２量体ナノボディの官能性試験。ホモ２量体抗ＧＦＰナノボディ（２０μＬ、２５μＭ）をＧＦＰ（８０μＭ溶液２．５μＬ、１０μＬ及び３０μＬ）と共にインキュベーションした。形成したナノボディ−ＧＦＰ複合体をＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ２００上のサイズ排除に付した。 ヘテロ２量体ナノボディの官能性試験。リンパ節細胞をＣ５７ＢＬ／６（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓ）又はＭＨＣＩＩ−欠損マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓ）から採取し、洗浄し、４℃においてＶＨＨ７−抗ＧＦＰ、ＧＦＰ及びＶＨＨ７−抗ＧＦＰ＋ＧＦＰと共に１０分間インキュベーションした。細胞を遠心分離により収集し、ＰＢＳで洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。 インビボ送達試験。送達試験のために、ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓ）に二重特異性抗体又はＧＦＰ（マウスあたり５０μｇ）の何れかを尾静脈内に注射した。二重特異性抗体を投与したマウスには、直接腹腔内投与によりＧＦＰ（５０μｇ）を、又は静脈内投与によりＧＦＰ（５０μＬ）を１時間後に投与した。５．５時間後、採血し、マウスを屠殺し、リンパ節、胸腺及び脾臓から細胞を単離した。細胞をＰＢＳで洗浄し、４℃で１０分間、抗ＣＤ１９−ＡＰＣ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及び７−ＡＡＤ（Ｖｉａｐｒｏｂｅ、ＢＤ）と共にインキュベーションした。細胞をＰＢＳで洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。結果 Ｎ対Ｎタンパク質２量体を構築するために、ＬＰＸＴＧＧ（配列番号３）ペプチド１及び２を合成し、アジドヘキサン酸又はジベンゾアザシクロオクチン（ＤＩＢＡＣ）をＮ末端に装備した。（２５）（図１２Ａ）。Ｓ・アウレウス由来のソルターゼＡを用いて、これらのペプチドを、導入親核物質として機能するために適度に露出したＧｌｙ残基のショートランによりに基質Ｇ３−ユビキチン（Ｇ３Ｕｂ）のＮ末端にライゲーションした。ペプチド１及び２はＧ３−ユビキチン上に効率的にアシル転移された（図１３）。修飾タンパク質の保有により２量体化の必要条件が樹立された。アジド修飾ユビキチン（８０μＭ）を混合し、シクロオクチンを装備したユビキチンの化学量論的な量と共に３７℃でインキュベーションした。３０分後、クーマジーブリリアントブルー染色により、そして抗ユビキチンイムノブロットにおいて明らかにされたとおり、ユビキチン２量体に相当する約１８ＫＤａのポリペプチドが観察された（図１３）。インキュベーション時間を７時間まで延長することにより、ＩｍａｇｅＪを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる定量によれば約７０％の２量体ユビキチンへの変換が起こった。より低濃度（１５μＭ）においては、より緩徐な速度ではあるものの反応はなお進行していた（１６時間語に約７０％変換）。 連結されたタンパク質がそれらの生物活性を保持しているかどうかを評価するために、ユビキチンビニルメチルエステル（ＵｂＶＭＥ）の２価の型（Ｎ対Ｎ融合物）を構築した。ＵｂＶＭＥは多数のユビキチン特異的プロテアーゼ（ＵＳＰ）を共有結合修飾する活性な部位指向性のプローブである（２６）。これらの付加物の形成はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析時の運動性のシフトにより容易に可視化される。ＵｂＶＭＥの２価型によるＵＳＰの修飾は、形成される付加物の分子量の相応の増大を伴って２つのＵｂＶＭＥ単位及び２つのＵＳＰコピーを含有する複合体をもたらすはずである。即ち、２量体ＵｂＶＭＥコンストラクトの合成は２つのバイオ直交型反応、即ちビニルメチルエステル部分を担持しているユビキチンのＣ末端修飾型を得るためのインテリン系非変性ライゲーション（２６）及びＮ末端ソルタギング反応（２７）を組み合わせた作用を利用している。記載したとおり調製したＧ３−ＵｂＶＭＥから出発して、アジド−及びひずみのあるシクロオクチン修飾型を得た。等モル量のアジド−及びシクロオクチン修飾ＵｂＶＭＥを反応させ、その後逆相ＨＰＬＣにより精製して未反応のＵｂＶＭＥ単量体があればそれを除去することにより、２価の付加物を得た。この２価の付加物の反応性を、ＵｂＶＭＥとの複合体としての結晶構造が既知であるユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼアイソザイムＬ３（ＵＣＨＬ３）の使用により評価した（２８）。対照としてＣ末端の一方に反応性ビニルメチルエステルを、もう一方に非反応性カルボン酸を装備している２量体コンストラクトを生成した。従って、得られたＵｂＶＭＥ−ユビキチンは単一のＵＣＨＬ３分子を結合することができる。２価のＵｂＶＭＥを過剰量のＮ末端Ｈｉｓタグ付きＵＣＨＬ３（ビニルメチルエステル当たり２等量）（図１４Ｂ）と共にインキュベーションすることにより、２つのＵＣＨＬ３分子（約６７ｋＤａ）に結合した２価の付加物が得られた。ＵＣＨＬ３を対照であるＵｂＶＭＥ−ユビキチンコンストラクト又はＵｂＶＭＥと共にインキュベーションしたところ、予測された分子量シフト、即ち、ＵｂＶＭＥ−ユビキチン２量体で修飾されたＵＣＨＬ３（約４７ｋＤａ）及びＵｂＶＭＥ単量体で修飾されたＵＣＨＬ３（約３７ｋＤａ、図１３参照）がそれぞれ観察された。Ｈｉｓ６（図１４Ｃ）に関するイムノブロットにより新しく形成された付加物が実際に、ＵＣＨＬ３投入材料中に取り込まれたＨｉｓ６タグを含有していることが確認された。即ち、クリック反応により生成した２価の付加物中の両方のＵｂＶＭＥ単位は、意図する標的を共有結合修飾するそれらの能力からわかるとおり完全な活性を保持している。 第２の例を検討した。ラクダ類は重鎖のみよりなる特異な抗体を生産する（２９）。それらの可変領域はＶＨＨとしても知られているシングルドメインコンストラクトとして組み換え発現した場合に完全な抗原結合能力を保持している（３０）。２価のシングルドメインＶＨＨタンパク質は、複合ソルタギングクリック法を用いてそれらのＣ末端を介してそれらをコンジュゲーションすることにより合成した。アジド３又はシクロオクチン４を含有するトリグリシンペプチドを合成し（図１５Ａ）、そして緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に特異的なラクダＶＨＨの合成型を組み換えにより生産した（３１）。このＶＨＨを修飾してソルターゼ基質モチーフとそれに続く（Ｈｉｓ）６タグを含有させることにより精製を容易にした。２５℃で一晩インキュベーション後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＬＣ／ＭＳによるとクリックハンドルで標識された抗ＧＦＰ ＶＨＨへの良好な変換が達成された。サイズ排除クロマトグラフィーにより過剰なトリグリシン親核物質を除去することによりその後の２量体化反応への干渉を回避した（図１６）。これらの修飾されたＶＨＨを使用して、相当するＣ対Ｃ融合ホモ２量体を形成し（図１５Ｂ）、これをサイズ排除クロマトグラフィーにより均質になるまで精製した（図１６）。 ＶＨＨ単量体及び２量体を標的抗原ＧＦＰと共にインキュベーションすることにより複合体の形成を評価した。修飾されたＶＨＨはＧＦＰと共にインキュベーションしたところ、サイズ排除クロマトグラフィー実験において、予測されたストークス半径増大を示した（図１７）。次にＣ対ＣのＶＨＨ２量体を漸増濃度のＧＦＰと共にインキュベーションし、２量体とＧＦＰの間に形成された複合体をサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した（図１５Ｃ）。形成されたＶＨＨ２量体は低濃度の添加ＧＦＰにおいて単一のＧＦＰで占有される２量体から容易に分割され、後者はより高いＧＦＰ濃度において２つのＧＦＰ部分により占有される２量体から容易に分割された（図１８）。 このデータはこの例では単一のＶＨＨドメインである抗体フラグメントのＣ対Ｃ融合が本発明の局面によるクリックケミストリーと組み合わせてソルターゼを使用して容易に達成できることを示している。良好な変換（約９０％）のみならず、得られた産物はそれらの完全な機能を保持している。ソルターゼ反応で使用した親核物質の大部分が水溶性であり、そして過酷及び／又は非選択的反応条件を要する全ての必要な官能基が親核物質の合成の間に導入されるため、この方法は生物活性に影響する可能性のある望ましくない副反応（例えば使用可能なアミノ基のアシル化（１８）、タンパク質の変性）を最小限にする。 上記実験を拡張し、自身のＣ末端を介して抗ＧＦＰ ＶＶＨに連結したアルパカ由来ＶＨＨであるマウスクラスＩＩ ＭＨＣ産物に対して特異的なＶＨＨ（ＶＨＨ７）を形成し、ヘテロ二重特異性産物を創生した。２つの付加物、即ち１つは接合部においてテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）蛍光団を含有するもの（ペプチド３使用）及び非蛍光コンジュゲート（ペプチド５使用）を調製した。２つの付加物を精製することにより蛍光及び非蛍光の二重特異性ＶＨＨ調製品（図１９）を得て、中に含むＢ細胞がクラスＩＩＭＨＣ産物に対して均一に陽性であるマウスリンパ節細胞に添加した。細胞を二重特異性蛍光ＶＨＨに曝露したところ、ＴＡＭＲＡチャンネル中のＢ細胞の特異的染色が観察された（図２０Ａ）。非蛍光二重特異性抗体では染色は観察されなかった（図２０）。次に、二重特異性ＶＨＨに曝露した細胞にＧＦＰを添加した。これにより両方の二重特異性物質についてＧＦＰチャンネルの染色が起こった。この結果は本例でもまた融合パートナーの各々がその活性及び特異性を保持していることを示している。ＭＨＣクラスＩＩノックアウトマウスのリンパ節細胞は二重特異性ＶＨＨによる染色が起こらず、特異性が明らかになった。 このような二重特異性抗体誘導体の深部組織リザーバーの創生のための使用を明らかにするために（３２）、抗ＧＦＰ−ＶＨＨ７二重特異性コンストラクトを、この試薬を用いてまず該当細胞集団（Ｂ細胞）を標的にすることを目的に、静脈内注射した。組み換えＧＦＰ（５０μｇ）の単回ボーラス投与を腹腔内に直接行うか、１時間後に静脈内に行い、５．５時間後に動物を屠殺した。脾細胞を採取し、フローサイトメトリーで分析した（図２０Ｂ）。大部分のＣＤ１９＋細胞（Ｂ細胞）はＧＦＰ＋であり、インビボでのＧＦＰの捕獲が成功したことを示していた。二重特異性コンストラクトを投与していない対照動物へのＧＦＰの投与ではＣＤ１９＋又はＣＤ１９−細胞上のＧＦＰ染色は観察されなかった。即ち、本実験は、二重特異性コンストラクトをまず目的細胞集団を標的として使用し、次にこれを残りの遊離第２結合部位に対するリガンドで目標とすることができることを示している。この型の二重特異性試薬の構築により、例えば全身インターロイキン−２（ＩＬ２）投与の場合に観察されるような急性毒性を回避できるような態様においてターゲティングされた生物薬剤送達が可能になる。 本明細書に提示した方法及び試薬を用いれば、ソルターゼ反応において、そして全ての可能な形状において、基質であることがわかっている如何なる物質も連結することが、ここに可能となる。例えばＣ末端コンジュゲーションされたヒトＩＬ２及びインターフェロン−αを、本手順を用いて抗ＧＦＯ及びＶＨＨ−７に良好にコンジュゲーションすることができ、これらのツールの全般的適用性が示された。考察 タンパク質をそのＮ又はＣ末端を介して融合する能力は、標準的な遺伝子的手段によっては到達できない分子の生産のための直接的機会をもたらす。この態様において連結されたタンパク質はＮ対Ｎ及びＣ対Ｃの融合に関して官能性を保持する。説明的な例として、両方の融合パートナーの結合能力を完全に保持しながらＣ末端融合した二重特異性ラクダ由来ＶＨＨコンストラクトを創生する能力が明らかにされている。可能な適用は他の融合にも拡張される。両方のＣ又は両方のＮ末端が適切な機能のために利用可能のまま残存することを所望の組み合わせが必要とするような状況に対しては、標準的な遺伝子的手順では不十分である。固相ペプチド合成に適する在庫試薬でもこの種の融合を可能にするペプチドの容易な到達が可能となる段階にまで、クリックケミストリーは発展している。今回はタンパク質−タンパク質融合物に関して明らかにしたが、２つのタンパク質を連結するために使用するクリックハンドルを更に修飾することにより、更に別の官能性、例えば蛍光団、又は薬理学的に活性な小分子の設置も可能になる。目的のタンパク質の修飾が簡単であること、異なる原料の組み換えソルターゼを容易に到達できること、及び標準的ペプチド合成法の使用を介して親核物質設計において柔軟性が得られることは、ソルターゼ媒介アシル転移の汎用性に寄与する。 他の手段では容易に到達できないタンパク質融合は、本明細書に記載した技術を用いれば容易に届く範囲内にある。注目すべきは、Ｈｕｄａｋ等は同様の目的を達成するためのひずみ促進型クリックケミストリーと組み合わせたアルデヒドタグの使用を記載しており、ヒト成長ホルモン及びマルトース結合タンパク質に融合したｈＩｇＧを生産している（３３）。この手順は本発明者等のソルタキングの方策と直交しており、Ｈｕｄａｋ等により開発されたアルデヒドタグクリックケミストリーのような方法を本発明者等により開発された化学酵素的方法と組み合わせることにより、より困難なタンパク質−タンパク質融合物に到達できる可能性があることを直接的に示唆している。引用文献1. Lippincott-Schwartz J, Patterson GH (2003) Development and Use of Fluorescent Protein Markers in Living Cells. Science 300:87-91.2. Seifert R, Wenzel-Seifert K, Kobilka BK (1999) GPCR-G fusion proteins: molecular analysis of receptor-G-protein coupling. Trends Pharmacol Sci 20:383-389.3. Han Y, Moreira IS, Urizar E, Weinstein H, Javitch JA (2009) Allosteric communication between protomers of dopamine class A GPCR dimers modulates activation. Nat Meth 5:688-695.4. Leong SR et al. (1997) IL-8 single-chain homodimers and heterodimers: interactions with chemokine receptors CXCR1, CXCR2, and DARC. Protein Sci 6:609-617.5. Nasser MW et al. (2009) Differential activation and regulation of CXCR1 and CXCR2 by CXCL8 monomer and dimer. J Immunol 183:3425-3432.6. Drury LJ et al. (2011) Monomeric and dimeric CXCL12 inhibit metastasis through distinct CXCR4 interactions and signaling pathways. P Natl Acad Sci Usa 108:17655-17660.7. Boado RJ et al. 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Angew Chem Int Ed 51:4161-4165. 発明の概要、詳細な説明及び実施例に列挙した全ての参考文献の全体の内容は各々の参考文献が個々に参照により本明細書に組み込まれるように、参照により本明細書に組み込まれる。組み込まれた参考文献と本明細書との間に矛盾がある場合は、本明細書を優先する。 上記した明細書は当業者が本発明を実施するために十分であると考える。実施例は本発明の１つの局面の単一の説明であることを意図しているため、本発明は記載した例により範囲を限定されるものでは無く、そして他の機能的に等価な実施態様は本発明の範囲に包含される。本明細書において示し、そして記載したものに加えて本発明の種々の変更例が上記説明から当業者には明らかであり、それらは添付の請求項の範囲に包含される。本発明の利点及び目的は本発明の各々の実施態様により必ずしも包含されない。等価物及び範囲 当業者であれば本明細書に記載した特定の実施態様の多くの等価物を定型的な実験の範囲内で認識し、或いは確認することができる。本発明の範囲は上記記載により限定されることを意図しておらず、むしろ、添付の請求項に示されるとおりである。 請求項において、特段反する記載があったり、又は別様に内容から明らかでない限り、単数表記は１つか１つより多いことを意味する。群の構成員１つ以上の間に「又は」又は「及び／又は」を含む請求項又は説明は、特段反する記載があったり、又は別様に内容から明らかでない限り、１つ、１つ以上、又は全ての群の構成員が所定の生成物、式、又はプロセスに含まれ、存在し、使用され、又は別様に関連する場合に満たされると考える。本発明は群構成員の厳密に１つが所定の生成物又はプロセスにおいて存在するか、使用されるか、別様に関連する実施態様を包含する。本発明は又、群構成員の１つより多く、又は全てが所定の生成物又はプロセスにおいて存在するか、使用されるか、別様に関連する実施態様を包含する。 更に、１つ以上の請求項又は記載の該当する部分にある１つ以上の限定、要素、節、説明用語等が別の請求項内にも導入される、全ての変形、組み合わせ、及び順列を包含すると理解しなければならない。例えば他の請求項に従属している何れかの請求項は同じ基本請求項に従属する何れかの他の請求項に存在する１つ以上の限定を包含するよう変更することができる。更に、請求項が組成物を指す場合、別様に明示されない限り、又は矛盾や非整合が生じることが通常の当業者に明らかでない限り、本明細書に開示されている目的の何れかのために組成物を使用する方法が包含され、そして本明細書に開示した製造方法の何れか又は当該分野で知られている他の方法に従って組成物を製造する方法が包含される。 例えばマーカッシュグループ様式におけるリストとして要素が提示されている場合、要素の各サブグループもまた開示され、そして何れの要素もグループから除外できると理解しなければならない。「含む」とは開放的表現を意図しており、追加的な要素又は工程の包含を可能とすることに留意すべきである。一般的に本発明又は本発明の局面が特定の要素、特徴、工程等を含むと表記されている場合、特定の本発明の実施態様又は本発明の局面はそのような要素、特徴、工程等よりなるか、又は本質的になる。単純化のためにこれらの実施態様は本明細書中の文章において特に明示していない。即ち、１つ以上の要素、特徴、工程等を含む本発明の各実施態様につき、本発明はこれらの要素、特徴、工程等よりなるか、又は本質的になる実施態様も提供する。 範囲を示す場合、終端は包含される。更に、特段の記載が無い限り、又は別様に内容及び／又は当業者の理解から明らかでない限り、範囲が示される場合、範囲内、並びに、一部の実施態様においては、別様に内容から明らかに推測されない限り、範囲の下限の単位の１０分の１までの全ての特定の数値が与えられることを理解すべきである。また特段の記載が無い限り、又は別様に内容及び／又は当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表示された数値はその範囲内の何れかの下位範囲を仮定することができ、その場合、下位範囲の終端はその範囲の下限の単位の１０分の１と同程度の精度まで表示されると理解しなければならない。 更に、本発明の何れかの特定の実施態様は１つ以上の請求項の何れかから明示的に除外されてよいと理解すべきである。範囲が示される場合、範囲内の何れかの数値又は数値のグループは１つ以上の請求項の何れかから明示的に除外されてよい。本発明の組成物及び／又は方法の何れかの実施態様、要素、特徴、適用又は局面は１つ以上の請求項の何れかから除外できる。簡潔にするため、１つ以上の要素、特徴、目的又は局面が除外される実施態様の全てを本明細書において明示的には示さない。 クリックケミストリーハンドルを標的タンパク質のＣ末端に設置する方法であって、（ａ）Ｃ末端ソルターゼ認識モチーフを前記標的タンパク質に提供するステップと、（ｂ）ソルターゼ酵素存在下で、該ソルターゼが、前記タンパク質と、前記クリックケミストリーハンドルを含むペプチドとをアミド基転移させて、前記標的タンパク質を前記クリックケミストリーハンドルにコンジュゲーションさせるのに適する条件下で、１−１０個のＮ末端グリシン残基かＮ末端アルキルアミン基かと、前記クリックケミストリーハンドルとを含むペプチド又は試薬に前記標的タンパク質を接触させるステップとを含む、方法。 前記標的タンパク質は、該タンパク質のＣ末端で前記ソルターゼ認識モチーフに融合される、請求項１に記載の方法。 標的タンパク質のＮ末端にクリックケミストリーハンドルを設置する方法であって、（ａ）１−１０個のＮ末端グリシン残基か、Ｎ末端アルキルアミン基かを前記標的タンパク質に供与するステップと、（ｂ）ソルターゼ酵素の存在下で、該ソルターゼが、前記タンパク質と、ソルターゼ認識モチーフを含むペプチドとをアミド基転移させて、前記標的タンパク質を前記クリックケミストリーハンドルにコンジュゲーションさせるのに適する条件下で、前記ペプチドと、前記クリックケミストリーハンドルとに前記標的タンパク質を接触させるステップとを含む、方法。 前記標的タンパク質は、該タンパク質のＮ末端で、前記１−１０個のグリシン残基か、Ｎ末端アルキルアミン基かと融合される、請求項３に記載の方法。 前記ソルターゼ認識モチーフは、ソルターゼＡ認識モチーフである、請求項１−４のいずれかに記載の方法。 前記ソルターゼ認識モチーフはＬＰＸＴ配列を含む、請求項１−５のいずれかに記載の方法。 前記１−１０個のグリシン残基は３個のＮ末端グリシン残基である、請求項１−６のいずれかに記載の方法。 前記ペプチドは、前記１−１０個のグリシン残基かＮ末端アルキルアミン基かと、前記クリックケミストリー基との間か、前記クリックケミストリー基と、前記ソルターゼ認識配列との間かにリンカーを含む、請求項１−７のいずれかに記載の方法。 前記リンカーは１−１００個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の方法。 前記クリックケミストリーハンドルは、末端アルキン、アジド、ひずみのあるアルキン、ジエン、親ジエン体、アルコキシアミン、カルボニル、ホスフィン、ヒドラジド、チオール、テトラジン及びアルケンから選択される、請求項１−９のいずれかに記載の方法。 前記クリックケミストリーハンドルはシクロオクチン及びアジドからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。 前記ソルターゼ認識配列はＬＰＥＴＧ（配列番号４）である、請求項１−１１のいずれかの方法。 ２つのタンパク質を翻訳後にコンジュゲーションさせてキメラタンパク質を形成する方法であって、 第１のクリックケミストリーハンドルが第２のクリックケミストリーハンドルと反応して、共有結合を介して連結される前記タンパク質２つを含むキメラタンパク質を形成するのに適する条件下で、第１のクリックケミストリーハンドルにコンジュゲーションされた第１のタンパク質を、第２のクリックケミストリーハンドルにコンジュゲーションされた第２のタンパク質に接触させることを含む、方法。 第１のクリックケミストリーハンドルは第１のタンパク質のＮ末端にコンジュゲーションされ、第２のクリックケミストリーハンドルは第２のタンパク質のＮ末端にコンジュゲーションされ、前記キメラタンパク質は、第１及び第２のタンパク質のＮ末端とＮ末端とがコンジュゲーションされる、請求項１３に記載の方法。 第１のクリックケミストリーハンドルは第１のタンパク質のＣ末端にコンジュゲーションされ、第２のクリックケミストリーハンドルは、第２のタンパク質のＣ末端にコンジュゲーションされ、前記キメラタンパク質は、第１及び第２のタンパク質のＣ末端とＣ末端とがコンジュゲーションされる、請求項１３に記載の方法。 第１のタンパク質のクリックケミストリーハンドルは、末端アルキン、ひずみのあるアルキン、ジエン、アルコキシアミン、ホスフィン、ヒドラジン、テトラジン及びチオールからなる群から選択される、請求項１３−１５のいずれかに記載の方法。 第２のタンパク質のクリックケミストリーハンドルは、アジド、親ジエン体、カルボニル及びアルケンからなる群から選択される、請求項１３−１６のいずれかに記載の方法。 （ｉ）第１のタンパク質のクリックケミストリーハンドルは末端アルキンで、第２のタンパク質のクリックケミストリーハンドルはアジドであるか、 （ｉｉ）第１のタンパク質のクリックケミストリーハンドルはひずみのあるアルキンで、第２のタンパク質のクリックケミストリーハンドルはアジドであるか、 （ｉｉｉ）第１のタンパク質のクリックケミストリーハンドルはジエンで、第２のタンパク質のクリックケミストリーハンドルは親ジエン体であるか、 （ｉｖ）第１のタンパク質のクリックケミストリーハンドルはアルコキシアミンで、第２のタンパク質のクリックケミストリーハンドルはカルボニルであるか、 （ｖ）第１のタンパク質のクリックケミストリーハンドルはホスフィンで、第２のタンパク質のクリックケミストリーハンドルはアジドであるか、 （ｖｉ）第１のタンパク質のクリックケミストリーハンドルはヒドラジンで、第２のタンパク質のクリックケミストリーハンドルはカルボニルであるか、 （ｖｉｉ）第１のタンパク質のクリックケミストリーハンドルはチオールで、第２のタンパク質のクリックケミストリーハンドルはアルケンであるか、 （ｖｉｉｉ）第１のタンパク質のクリックケミストリーハンドルはシクロオクチンで、第２のタンパク質のクリックケミストリーハンドルはアジドである、請求項１３−１７のいずれかに記載の方法。 ソルターゼ認識配列を含む、第１の抗体又は抗原結合断片と、 ソルターゼ認識配列を含む、第２の抗体又は抗原結合断片とを含み、第１及び第２の抗体又は抗原結合断片は、クリックケミストリーを介して一体にコンジュゲーションされる、二重特異性のキメラ抗体。 第１及び第２の抗体又は抗原結合断片は、Ｃ末端どうし（Ｃ−Ｃ）か、Ｎ末端どうし（Ｎ−Ｎ）かで共有結合を介して一体にコンジュゲーションされる、請求項１９に記載のキメラ抗体。 第１及び／又は第２の抗体は、単一ドメイン抗体又はその抗原結合断片を含む、請求項１９又は２０に記載のキメラ抗体。 第１及び／又は第２の抗体は、ラクダ抗体又はその抗原結合断片を含む、請求項１９−２１のいずれかに記載のキメラ抗体。 第１及び／又は第２の抗体は、ＶＨＨドメイン又はその抗原結合断片を含む、請求項１９−２２のいずれかに記載のキメラ抗体。 第１及び／又は第２の抗体は、ｓｃＦｖ又はその抗原結合断片を含む、請求項１９−２３のいずれかに記載のキメラ抗体。 第１及び／又は第２の抗体は、ナノボディ又はその抗原結合断片を含む、請求項１９−２４のいずれかに記載のキメラ抗体。 第１及び第２の抗体又はその抗原結合断片は、異なる抗原を結合する、請求項１９−２５のいずれかに記載のキメラ抗体。 第１及び第２の抗体又はその抗原結合断片は、同一の抗原を結合する、請求項１９−２５のいずれかに記載のキメラ抗体。 第１及び第２の抗体又はその抗原結合断片は、同一の抗原の異なるエピトープを結合する、請求項２７に記載のキメラ抗体。 ソルターゼ認識モチーフを有する標的タンパク質と、該タンパク質にクリックケミストリーを介してコンジュゲーションされる第２の分子とを含む、タンパク質。 前記ソルターゼ認識モチーフは配列ＬＰＸＴを含む、請求項２９に記載のタンパク質。 前記タンパク質は、前記標的タンパク質上にクリックケミストリーハンドルを翻訳後に設置して、前記標的タンパク質を第２の分子に接触させることにより生成され、第２の分子は第２のクリックケミストリーハンドルを含み、第２のクリックケミストリーハンドルは、前記標的タンパク質のクリックケミストリーハンドルと反応可能して、適当な条件下で共有結合を形成することができる、請求項２９又は３０に記載のタンパク質。 第２の分子は、第２のタンパク質、低分子化合物、核酸又は脂質である、請求項２７−３１のいずれかに記載のタンパク質。 第２のタンパク質はソルターゼ認識モチーフを含む、請求項３２に記載のタンパク質。 前記標的タンパク質及び第２のタンパク質は、Ｎ末端どうし（Ｎ−Ｎ）又はＣ末端どうし（Ｃ−Ｃ）でクリックケミストリーを介して翻訳後にコンジュゲーションされる、請求項３２又は３３に記載のタンパク質。 前記標的タンパク質は抗原結合ドメインを含む、請求項２９−３４のいずれかに記載のタンパク質。 第２の分子は抗原結合ドメインを含む、請求項２９−３５のいずれかに記載のタンパク質。 前記標的タンパク質及び第２の分子は、それぞれ、抗原結合ドメインを含み、前記標的タンパク質の抗原結合ドメインと、第２の分子の抗原結合ドメインとは異なる、請求項３２−３６のいずれかに記載のタンパク質。 前記タンパク質の抗原結合ドメインと、第２の分子の抗原結合ドメインとは、異なる抗原を結合する、請求項３７に記載のタンパク質。 前記タンパク質及び／又は第２の分子の抗原結合ドメインは、抗体、その抗原結合断片、アドネクチン、アフィボディ、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ又はアプタマーを含み、請求項３７又は３８に記載のタンパク質。 前記タンパク質及び／又は第２の分子の抗原結合ドメインは、ラクダ抗体、ＶＨＨドメイン、単一ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、ナノボディ又はこれらの抗原結合断片を含む、請求項３７−３９のいずれかに記載のタンパク質。 第２の分子は合成ポリマーを含む、請求項２９に記載のタンパク質。 前記合成ポリマーはＰＥＧ原子団を含む、請求項４１に記載のタンパク質。 追加の分子は検出可能な標識を含む、請求項２９に記載のタンパク質。 前記検出可能な標識は。蛍光発色団、酵素又は放射性同位元素を含む、請求項４３に記載のタンパク質。 前記検出可能な標識は、蛍光タンパク質、蛍光色素、ルシフェラーゼ及びペロキシダーゼからなる群から選択される、請求項４４に記載のタンパク質。 ソルターゼ認識モチーフと、該ソルターゼ認識モチーフにコンジュゲーションされるクリックケミストリーハンドルとを含む、タンパク質。 前記ソルターゼ認識モチーフは配列ＬＰＸＴを含む、請求項４６に記載のタンパク質。 前記タンパク質は抗原結合ドメインを含む、請求項４６又は４７に記載のタンパク質。 前記タンパク質は、抗体又はその抗原結合断片を含む、請求項４６−４８のいずれかに記載のタンパク質。 前記タンパク質は、ラクダ抗体、その抗原結合断片、ＶＨＨドメイン、単一ドメイン抗体、ナノボディ、ｓｃＦｖ、アフィボディ、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ又はアドネクチンを含む、請求項４９に記載のタンパク質。 前記タンパク質は、前記クリックケミストリー基と、ソルターゼ認識モチーフとの間にリンカーを含む、請求項２９−５０のいずれかに記載のタンパク質。 前記リンカーは１−１００個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む、請求項５１に記載のタンパク質。 前記クリックケミストリーハンドルは前記タンパク質のＣ末端に存在する、請求項４６−５０のいずれかに記載のタンパク質。 前記クリックケミストリーハンドルは前記タンパク質のＮ末端に存在する、請求項４６−５０のいずれかに記載のタンパク質。 前記クリックケミストリーハンドルは、末端アルキン、アジド、ひずみのあるアルキン、ジエン、親ジエン体、アルコキシアミン、カルボニル、ホスフィン、ヒドラジン、チオール及びアルケンからなる群から選択される、請求項４６−５０のいずれかに記載のタンパク質。 （ａ）１−１０個のグリシン残基か、第１のクリックケミストリーハンドルにコンジュゲーションされる末端アルキルアミンかを含む第１のペプチドと、 （ｂ）第２のクリックケミストリーハンドルにコンジュゲーションされるソルターゼ認識モチーフを含む第２のペプチドと、 任意的に、（ｃ）ソルターゼ酵素とを含み、 第１及び第２のペプチドのクリックケミストリーハンドルは適当な条件下で反応できる、キット。 （ａ）第１のクリックケミストリーハンドルにコンジュゲーションされる、１−１０個のグリシン残基か、末端アルキルアミンかを含む第１のペプチドと、 （ｂ）第２のクリックケミストリーハンドルにコンジュゲーションされる、１−１０個のグリシン残基か、末端アルキルアミンかを含む第２のペプチドと、 任意的に、（ｃ）ソルターゼ酵素とを含み、 第１及び第２のペプチドのクリックケミストリーハンドルは適当な条件下で反応できる、キット。 （ａ）第１のクリックケミストリーハンドルにコンジュゲーションされるソルターゼＡ認識モチーフを含む第１のペプチドと、 （ｂ）第２のクリックケミストリーハンドルにコンジュゲーションされるソルターゼ認識モチーフを含む第２のペプチドと、 任意的に（ｃ）ソルターゼ酵素とを含み、 第１及び第２のペプチドのクリックケミストリーハンドルは適当な条件下で反応できる、キット。 第１のクリックケミストリーハンドルは、末端アルキン、ひずみのあるアルキン、ジエン、アルコキシアミン、ホスフィン、ヒドラジド及びチオールからなる群から選択される、請求項５６−５８のいずれかに記載のキット。 第２のクリックケミストリーハンドルは、アジド、親ジエン体、カルボニル及びアルケンからなる群から選択される、請求項５６−５９のいずれかに記載のキット。 （ｉ）第１のタンパク質のクリックケミストリーハンドルは末端アルキンで、第２のタンパク質のクリックケミストリーハンドルはアジドであるか、 （ｉｉ）第１のタンパク質のクリックケミストリーハンドルはひずみのあるアルキンで、第２のタンパク質のクリックケミストリーハンドルはアジドであるか、 （ｉｉｉ）第１のタンパク質のクリックケミストリーハンドルはジエンで、第２のタンパク質のクリックケミストリーハンドルは親ジエン体であるか、 （ｉｖ）第１のタンパク質のクリックケミストリーハンドルはアルコキシアミンで、第２のタンパク質のクリックケミストリーハンドルはカルボニルであるか、 （ｖ）第１のタンパク質のクリックケミストリーハンドルはホスフィンで、第２のタンパク質のクリックケミストリーハンドルはアジドであるか、 （ｖｉ）第１のタンパク質のクリックケミストリーハンドルはヒドラジンで、第２のタンパク質のクリックケミストリーハンドルはカルボニルであるか、 （ｖｉｉ）第１のタンパク質のクリックケミストリーハンドルはチオールで、第２のタンパク質のクリックケミストリーハンドルはアルケンであるか、 （ｖｉｉｉ）第１のタンパク質のクリックケミストリーハンドルはシクロオクチンで、第２のタンパク質のクリックケミストリーハンドルはアジドである、請求項５６−６０のいずれかに記載のキット。 触媒、反応バッファー及び／又はキットの使用説明書をさらに含む、請求項５６−６１のいずれかに記載のキット。 標的タンパク質上にクリックケミストリーハンドルを設置する方法及び試薬と、クリックケミストリーハンドルを含む修飾タンパク質とが提供される。さらに、クリックケミストリーを介してコンジュゲーションされる２つのタンパク質を含む、キメラタンパク質、例えば、二重特異性抗体と、それらの生成方法及び使用方法とが本明細書に開示される。 配列表

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