生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公表特許公報(A)_ＤＮＡミスマッチ修復機能を判別する方法 |
| 出願番号： | 2014517733 |
| 年次： | 2014 |
| IPC分類： | C12Q 1/68,C12N 15/09 |
特許情報キャッシュ
ナイストロム、ミンナ カンシカス、ミンッツ ペルトメキ、ペイビ JP 2014520515 公表特許公報(A) 20140825 2014517733 20120629 ＤＮＡミスマッチ修復機能を判別する方法 ヘルシンキ・イリオピスト 514002846 Ｈｅｌｓｉｎｇｉｎ ｙｌｉｏｐｉｓｔｏ 蔵田 昌俊 100108855 福原 淑弘 100109830 野河 信久 100103034 峰 隆司 100075672 砂川 克 100140176 ナイストロム、ミンナ カンシカス、ミンッツ ペルトメキ、ペイビ FI 20115709 20110701 US 61/503,735 20110701 C12Q 1/68 20060101AFI20140730BHJP C12N 15/09 20060101ALN20140730BHJP JPC12Q1/68 AC12N15/00 A AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KM,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC,VN,ZA EP2012062708 20120629 WO2013004618 20130110 32 20140219 4B024 4B063 4B024AA11 4B024BA80 4B024CA01 4B024CA09 4B024HA12 4B063QA05 4B063QA19 4B063QQ02 4B063QQ08 4B063QQ43 4B063QR08 4B063QR32 4B063QR42 4B063QS25 4B063QS34 4B063QX02発明の分野 本発明は、癌の診断法に関し、ヒト対象がＤＮＡミスマッチ修復機能障害を有しているかどうかを判別するため、ならびに、それにより、遺伝性癌、特に、結腸直腸癌を発症するリスクが高まる、機能欠損を有するミスマッチ修復遺伝子を特定するためのＤＮＡミスマッチ修復アッセイに基づく方法を提供する。本方法は、リンチ症候群の診断の新規の方法も提供する。本方法は、正常な組織、たとえば、線維芽細胞由来のサンプルに対して実施される。発明の背景 結腸直腸癌（ＣＲＣ）は、米国およびヨーロッパにおいて癌に関連した死亡の２番目に一般的な原因である。Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ、１０（５）：６５１〜６６５、２０１０におけるＰｉｎｏ，Ｍ．Ｓ．およびＣｈｕｎｇ，Ｄ．Ｄ．による最近のレビュー論文によると、ＣＲＣは、米国において推定年間５２，０００名および欧州において年間１４６，０００名の死亡の原因となっている。新たに診断されるＣＲＣの症例のおよそ２〜５％は、リンチ症候群に起因する可能性がある。 遺伝性非ポリポーシス大腸癌症候群（ＨＮＰＣＣ）と呼ばれることも多いリンチ症候群（ＬＳ）は、早期発症型の結腸直腸および子宮内膜癌、ならびに胃腸管（たとえば、胃、小腸、胆管）、泌尿器系（urinary collecting system）（腎盂、尿管）および女性生殖器系（卵巣）における他の場所の腫瘍を含む特定の結腸外の癌のリスクの増加により明らかになる。 選択されたＬＳ家族の研究は、診断時の平均年齢が４０代半ばで７０〜８０％の結腸癌の生涯リスクを推定した。ＬＳにおいて２番目に一般的な癌は、子宮内膜癌であり、ＬＳの女性は、子宮内膜および卵巣癌の発症の累積的な生涯リスクを有し、診断時の平均年齢が散発例よりもおよそ１０年早い。ＬＳ患者の胃癌の生涯リスクは、母集団間で変化し、胃癌の高い固有のリスクがある地域、たとえば、中国および韓国において特に発病率が高く、およそ３０％の生涯リスクである。これらの地域では、胃癌に対するリスクが子宮内膜癌に対するリスクを上回る。 リンチ症候群は、ＤＮＡミスマッチ修復（ＭＭＲ）機構にとって重要な遺伝子における変異の常染色体優性遺伝と極めて関連づけられ、４つのＤＮＡミスマッチ修復（ＭＭＲ）遺伝子、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６およびＰＭＳ２のうちの１つにおける生殖細胞系列変異に起因する。さらに、散発性の結腸腫瘍の２５％ならびに子宮内膜、卵巣および一部のその他の器官および組織のいくつかの腫瘍は、ＭＭＲに欠損がある。ＭＭＲタンパク質は、通常、マイクロサテライトとして知られる短い反復配列の複製過程においてＤＮＡポリメラーゼのスリッページによって引き起こされた不適正なヌクレオチドおよび挿入／欠失ループを認識し、修復する。 ゲノムの完全性（genomic integrity）を維持するためにヘテロダイマーとして働くヒトのミスマッチ修復（ＭＭＲ）機構に関与する５つのタンパク質は、ＭｕｔＬα（ＭＬＨ１＋ＰＭＳ２）、ＭｕｔＳα（ＭＳＨ２＋ＭＳＨ６）およびＭｕｔＳβ（ＭＳＨ２＋ＭＳＨ３）である。ＭＭＲタンパク質は、ＤＮＡの複製および組換えの過程で新たに合成された鎖上に生じる塩基／塩基ミスマッチおよび小さな挿入／欠失ループ（ＩＤＬ）を修正する。 最も頻繁に変異がもたらされる遺伝子は、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６およびＰＭＳ２を含み、その生殖細胞系列変異（germline variation）は、ＬＯＶＤデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｓｉｇｈｔ−ｇｒｏｕｐ．ｏｒｇ／；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｏｖｄ．ｎｌ／）において報告されている。ＭＭＲ遺伝子に影響を及ぼす大半の変異は切断であるが、かなりの割合の変異が１つのアミノ酸置換またはインフレームの欠失をもたらし、無害な遺伝子多型と区別することが難しい。そのような変化は、ポリペプチドの機能に対する変異の影響が特徴づけられていないため意義不明の変異（ＶＵＳ）と呼ばれることが多い。 ＭＭＲ欠損腫瘍は、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）と強く関連づけられている。しかしながら、ＭＳＩの程度およびタイプは、変異がもたらされたＭＭＲ遺伝子により異なる（Ｋａｎｔｅｌｉｎｅｎら、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、１〜６、２０１０）。 ＬＳでは、個人には変異対立遺伝子による遺伝性の易罹患性が既にあり、ＭＭＲ機能を失い腫瘍形成が始まるためには体細胞に第２の打撃が必要なだけであるという事実に基づき、ＬＳにおける癌発症の平均年齢は、散発性の結腸直腸癌のそれよりも著しく低い。したがって、ＬＳ腫瘍は、原因となるＭＭＲタンパク質の欠如または量の低下ならびにＭＳＩを引き起こすＤＮＡ修復障害によって特徴づけられる。 集中的な癌の監視を必要とすることになるハイリスクの患者を特定するために、ＬＳの適時の識別が極めて重要である。大腸内視鏡検査スクリーニングおよび前駆病変、腺腫の除去は、ＭＭＲ遺伝子変異保因者の癌罹患率および死亡率を著しく減少させる（Ｊａｒｖｉｎｅｎら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１８：８２９〜８３４、２０００）。費用対効果の分析は、ＭＭＲ遺伝子変異保因者の結腸直腸癌の監視は有効であり、監視なしの結果よりも大幅に費用が少ないことを示している。結腸直腸癌と新規診断をされた全個人には、年齢または家族歴にかかわらず、リンチ症候群についての遺伝子検査が提供されるべきであると合衆国の疾病管理予防センター（ＣＤＣ）は勧告している。ＣＤＣの報告は、現在、いかなる特定のスクリーニング手順も代替手順と比較して推奨するための十分な証拠はないとさらに言明している。 多種多様の臨床表現型がＬＳ診断法を複雑にしているにもかかわらず、一般的なＣＲＣの負荷とＬＳ家族を区別するためのいくつかの臨床ガイドラインが確立された。現在、ＬＳの臨床診断は、アムステルダム基準または改訂ベセスダガイドラインに大きく依存しており、これは、癌発症年齢、家族内の罹患した個人の数および分離ならびにＭＳＩの程度を考慮するものである（Ｐｉｎｏ＆Ｃｈｕｎｇ、上記）。しかしながら、多くの推定上のＬＳ家族は、これらの基準に合わず、彼らにおける病因の生殖細胞系列ＭＭＲ遺伝子変異を特徴づけることによってのみＬＳ家族として識別されるであろう。 ＭＭＲ遺伝子変異保因者、すなわち、リンチ症候群に冒された対象を特定するための従来の診断ワークフローは、いくつかの段階、たとえば、腫瘍研究、ＤＮＡ分析、変異の病原性についてのインビトロ試験を含み、遺伝子異常の検出から、ＭＭＲ能の低下と関連づけられるかの評価に進む。ＬＳに関連した腫瘍を診断する際の最初の臨床的ステップは、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）およびＭＳＩ分析を含み、ＩＨＣおよびＭＳＩの結果によって決まった変異スクリーニングが続く。変異をスクリーニングするための一手順は、全４つのＭＭＲ遺伝子（ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６およびＰＭＳ２）を分析することである。病因の変異が見つかると、ＬＳが確認でき、またはＭＭＲ遺伝子変異がないと、可能性は低いと見なされるが除外はされない（単独または組み合わせて使用されるかのいずれにしても、１００％の感度かつ特異的な方法はないため）。 本発明者らによる最近の発表（Ｋａｎｓｉｋａｓら、Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ ３２：１０７〜１１５、２０１１）は、インビトロにおけるＭＭＲ能に関する合成変異タンパク質の試験が、病原性試験に関する基礎を形成することを開示している。発表されたインビトロＭＭＲアッセイは、相同的なヒトＭＭＲ系におけるＬＳ変異の表現型の結果について研究している。ＬＳ変異タンパク質の構築は、問題の遺伝子異常が発見され、ＤＮＡ配列レベルで完全に特徴づけられることを必要とする。３ステップの決定木が次のように提案された（Ｃｏｕｃｈら、Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ ２９：１３１４〜１３２６、２００８）： しかしながら、臨床診断の確立のために使用される本試験と関連していくつかの欠点がある： ＭＳＩ試験は、労働集約的であり、専門の分子病理学的サービス（molecular pathologic service）を必要とし、ＭＳＩは、ＬＳの特徴ではあるが、ＬＳに特有のものではない。およそ１０〜２５％の散発性ＣＲＣおよび多くの結腸外の癌もＭＳＩを示す。さらに、ＬＳ関連および散発性ＭＳＩ陽性ＣＲＣは、多くの共通の病理組織学的特徴を有しているが、散発性ＭＳＩ ＣＲＣは、家族歴陽性と関連づけられない点で異なる。 ＩＨＣ試験の固有の潜在的な欠点は、技術がいくぶん主観的であり、組織標本の品質、染色および結果の解釈によって決まることである。興味深いことに、異常な染色パターンは、組織保存および腫瘍の微小環境に起因する場合もある。たとえば、遺伝学的にＭＭＲ能力のある組織においてであっても、組織低酸素または酸化ストレスがＭＭＲタンパク質の機能を弱める場合もあり、限局的な減少または薄い染色につながる。ＭＭＲ遺伝子における二次的な異常がまれな染色パターンにつながる場合もある。 しかしながら、ＬＳを診断する現在の方法に関する最も明らかな制約は、試験が、ＬＳ病歴がわかっているか、もしくは疑わしい家族からの対象または癌に既に冒されている対象に対する遺伝子検査および変異分析に基づくものであることである。この事実が、現在の診断法を保因者であることが疑われる健康な対象の通常のスクリーニングに適さないものにしている。さらに、現在の試験方式は、十分な設備が整った研究所ならびに極めて技量のある検査技師を必要とする非常に困難なものである。ＩＨＣ、ＭＳＩおよび変異分析を含むステップの金額が１試験あたり約３５００ユーロになると推定され、これは、通常の試験としては高価である。 したがって、正確で、より単純であるが、より安価で、人がリンチ症候群に関連しており、それにより、結腸直腸癌ならびにその他の癌の高いリスクにさらされるＭＭＲ遺伝子変異の保因者であるかどうかを特定するために臨床的に適した試験に対して十分に確立し、認識されたニーズがある。 本発明の目的は、対象のＬＳ病歴または癌の予備知識なしでＭＭＲ効率の低下を検出するための正確で単純で安価な臨床的に適した試験を実現するための新規の方法および手段を提供することであり、それにより、診断法の現在の方法の課題を解決する。本発明は、ヒト対象がＤＮＡミスマッチ修復機能障害を有しているかどうかを判別するための定量的方法であって、ａ）前記ヒト対象から得られたサンプルから核抽出物を生成すること、ｂ）それぞれ陽性および陰性対照として、ＭＭＲ能力のあるおよびＭＭＲ欠損のある核タンパク質抽出物を準備すること、ｃ）個別のバイアル中で各核抽出物を少なくとも１つのミスマッチ含有ヘテロ二重鎖ＤＮＡ基質と組み合わせること、ｄ）前記サンプルおよび対照核タンパク質抽出物ならびに前記基質に対してミスマッチ修復アッセイを実施すること、ならびにｅ）前記サンプル核抽出物が前記基質ＤＮＡ分子を修復できるかどうかを判別することを含む、方法に関する。好ましくは、前記サンプルは、構成組織から得られた正常な細胞、より好ましくは、線維芽細胞または血液由来細胞を含む。 本発明の一態様において、前記基質は、配列番号１を有するプラスミドに由来し、好ましくは、前記基質は、配列番号２および配列番号３からなる群から選択される核酸配列をさらに含む。 別の態様において、ＭＭＲ欠損核抽出物は、ＨＣＴ１１６およびＬｏＶｏ細胞からなる群から選択される細胞株に由来する。特定の態様において、バイアル当たりの核抽出物の総量は、５０〜５００μｇ、好ましくは５０〜２００μｇ、より好ましくは７５〜１００μｇの範囲である。 本発明はさらに、機能欠損を有するミスマッチ修復遺伝子を特定するための定量的方法であって、ａ）ヒト対象から得られたサンプルから核タンパク質抽出物を生成すること、ｂ）陽性および陰性対照としてそれぞれ、ＭＭＲ能力のあるおよびＭＭＲ欠損のある核タンパク質抽出物を準備すること、ｃ）少なくとも１つのＭＭＲ欠損核タンパク質抽出物を前記サンプル抽出物と混合すること、ｄ）個別のバイアル中でステップａ〜ｃにおいて準備された各核抽出物を少なくとも１つのミスマッチ含有ヘテロ二重鎖ＤＮＡ基質と組み合わせること、ｅ）前記核抽出物および前記基質に対してミスマッチ修復アッセイを実施すること、ならびにｆ）前記サンプル核抽出物が前記基質を修復でき、前記ＭＭＲ欠損核抽出物を補完できるかどうかを判別することによって前記欠損遺伝子を特定することを含む、方法に関する。好ましくは、前記サンプルは、構成組織から得られた正常な細胞、より好ましくは、線維芽細胞または血液由来細胞を含む。 本発明の一態様において、前記基質は、配列番号１を有するプラスミドに由来し、好ましくは、前記基質は、配列番号２および配列番号３からなる群から選択される核酸配列をさらに含む。 別の態様において、ＭＭＲ欠損核抽出物は、ＨＣＴ１１６およびＬｏＶｏ細胞からなる群から選択される細胞株に由来する。特定の態様において、バイアル当たりの核抽出物の総量は、５０〜２００μｇ、好ましくは７５〜１００μｇの範囲である。 さらに、本発明は、ヒト対象の構成組織から得られた臨床サンプルから、本発明によるＭＭＲアッセイを使用して欠損ＤＮＡミスマッチ修復遺伝子を特定することに基づいて、ヒトのリンチ症候群を診断するための新規の方法に関する。 本発明は、本発明による方法に使用するためのキットであって、少なくとも１つのミスマッチ含有ヘテロ二重鎖ＤＮＡ基質、少なくとも１つのＭＭＲ欠損核抽出物および陽性対照としてＭＭＲ能力のある核抽出物を含む、キットにも関する。好ましくは、前記ＭＭＲ欠損核抽出物は、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６のいずれかについてのＭＭＲ欠損を有する細胞株、好ましくは、ＨＣＴ１１６またはＬｏＶｏ細胞に由来する。 本発明の特定の態様において、本キットは、少なくとも２つのＭＭＲ欠損核抽出物を含む。 さらなる態様において、本キットは、ＭＭＲアッセイを実施するために必要な追加の試薬、たとえば、２００ｍＭのトリス−ＨＣＬ、ｐＨ７．６、４００ｍＭのＫＣｌ、５０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのグルタチオン、ＢＳＡ ５００μｇ／ｍｌ、１ｍＭの各ｄＮＴＰおよび１５ｍＭのＡＴＰ含む１０×ＭＭＲ緩衝液；ならびに４２ｍＭのＥＤＴＡ、１．２％のＳＤＳ、５０．４μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含むＭＭＲアッセイ用停止液も含んでもよい。任意に、本キットは、サンプルを清澄にするための試薬、たとえば、ＴＥ緩衝液、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールおよびクロロホルム；前記サンプルを沈殿させるための試薬、たとえば、ＮａＣｌおよびエタノール；ならびに修復を検出するための試薬、たとえば、ＲＮａｓｅ Ａならびに緩衝液とともに制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏ３１Ｉならびにローディングダイを含んでもよい。 以下に、添付の図面を参照して好適な態様によって、本発明がより詳細に記載される。図１は、本発明の方法の概要である。図２は、ＭＭＲ能力のある細胞株（ＨｅＬａ）から得られる核抽出物および核タンパク質を含まないＭＭＲ欠損アッセイ対照（ＭＯＣＫ）と比較した健康な線維芽細胞核抽出物（ＦＢ−ＷＴ、野生型）のＭＭＲ分析である。図３は、ウエスタンブロット分析であり、ａ）ＭＬＨ１が部分的に発現抑制された線維芽細胞由来細胞株ＦＢ−Ｍ１と比較した健康な線維芽細胞核抽出物（ＦＢ−ＷＴ）のＭＭＲタンパク質含有量（ＭＬＨ１およびその対応物、ＰＭＳ２）ならびにｂ）ＭＳＨ２が部分的に発現抑制された線維芽細胞由来細胞株ＦＢ−ＳＨ１３と比較したＦＢ−ＷＴのＭＭＲタンパク質含有量（ＭＳＨ２およびその対応物、ＭＳＨ６）を示している。図４は、定量的ＭＭＲ分析であり、ＦＢ−Ｍ１におけるＭＬＨ１およびＦＢ−ＳＨ１３におけるＭＳＨ２の欠損が変化する強度で修復効率の低下として検出されることを示している。相対的修復パーセンテージは、ＦＢ−ＷＴの修復効率に対して示される。図５は、定量的ＭＭＲ分析であり、ＭＬＨ１欠損核抽出物ＨＣＴ１１６と組み合わせて使用されると、ＦＢ−ＷＴおよびＦＢ−Ｍ１の異なるＭＭＲ能力が検出されうることを示している。図６-１は、基質調製の図式的な説明であり、ｐＧＥＭ−ＩＤＬ４０、ｐＧＥＭ−ＩＤＬＧＴおよびｐＧＥＭ−ＩＤＬ３９プラスミドの説明ならびにそれらの誘導された構築物、５’ＩＤＬＧＴおよび５’ＩＤＬ１を含む。図６-１の続葉である。発明の詳細な説明 ここで、遺伝性ＭＭＲ欠損を有する、したがって、癌を発症する顕著なリスクがある個人を識別するためにＤＮＡミスマッチ修復（ＭＭＲ）効率の機能評価を使用できることが驚くべきことに発見された。本発明は、新規のＭＭＲアッセイを提供し、これは、ＭＭＲの能力欠損を特定することを目的とする（図１）。本発明によるアッセイは、基礎となるＭＭＲ遺伝子配列もしくは調節変化、家族歴、癌の病歴またはＩＨＣの結果のいかなる事前知識なしに適用でき、したがって、診断用途のための新規のアプローチを成す。本アッセイは、大きな母集団においてＭＭＲ変異保因者をスクリーニングする用途、したがって、癌発症のリスクが高い人を見つけるために理想的である。 ＭＭＲ遺伝子（リンチ症候群）変異保因者を特定するための従来の診断ワークフローは、いくつかの試験を含み、遺伝子異常の検出から、ＭＭＲ能の低下と関連づけられるかの評価に進むのに対して、本発明は、たった１つアッセイからなる単純な試験プロトコルに関する。本発明は、個人が、定量的ＭＭＲアッセイによって判別される生殖細胞系列におけるＭＭＲ異常を持っているかどうかを評価する１ステップの手順を提供する。本発明による方法は、検査される対象から得られた正常な組織サンプル、たとえば、血液、粘膜または線維芽細胞、好ましくは、線維芽細胞もしくはリンパ芽球における低下したＭＭＲ能の検出に基づく。 ここで使用される場合、「正常な」組織という用語は、任意の健康な非悪性組織、好ましくは、構成組織を含むことが意図される。 ここで使用される場合、「構成組織」という用語は、出生時に受け継いだ遺伝子構成を実質的に表わし、サンプリングに利用できるヒトの体の任意の部分、たとえば、粘膜または線維芽細胞から得られてもよい非悪性細胞の組織を指す。 本発明の試験プロトコルは、定量的方法に関する。ここで使用される場合、「定量的方法」という用語は、変化する強度でＭＭＲ効率の結果を示す方法を指し、すなわち、これは、オン／オフ試験ではない。本発明のＭＭＲアッセイは、修復効率の低下としてＭＭＲタンパク質の欠損を検出する（ＭＬＨ１およびＭＳＨ２に関する図４を参照）。ここで使用される場合、ＭＭＲ遺伝子またはタンパク質は、ＭＭＲプロセスに関与する、たとえば、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＬＨ３、ＭＳＨ３、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２およびＥＸＯ１からなる群から選択されるあらゆる遺伝子またはタンパク質を指す。特定の態様において、ＭＭＲタンパク質、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２および／またはＭＳＨ６の欠損は、本発明の方法または手段によって検出される。実際、たとえば、ＬＳ家族のすべてのＭＭＲ遺伝子変異保因者の正常な細胞の場合と同様に、１つ正常なＭＭＲ対立遺伝子のみが存在する場合またはＭＭＲ遺伝子が部分的に不活化されている場合は、ミスマッチを修正するための一部の能力が依然としてある。比較すると、癌細胞に使用される先行技術の試験は、ＭＭＲが起こる（両野生型対立遺伝子あり）か、またはそれがない（両野生型対立遺伝子なし）かを明らかにするＭＭＲに関するオン／オフ試験ということになる。 ＤＮＡのＭＭＲは、細胞の核内で行われ、核のＭＭＲタンパク質のみが、修復プロセスに関与する。本発明の方法によって、修復作業のために核に向かったこれらのＭＭＲタンパク質の機能をインビボにおいてアッセイすることができる。それは、本方法の出発材料が核抽出物であるためである。それとは逆に、従来のワークフローにおけるＭＭＲアッセイは、構築された変異型ＭＭＲタンパク質生成物のＭＭＲ効率をインビトロにおいて研究するために使用される。これらのインビトロ試験では、もともと核に存在するタンパク質のみを研究する可能性はなく、検査されるタンパク質は核抽出物に人工的に添加される。したがって、核の実際のＭＭＲの能力を明らかにすることによる本発明の病原性試験は、先行技術の機能試験とは異なる。したがって、本発明の方法によって、ＭＭＲタンパク質の核局在化の問題を見つけることも可能である。 先行技術の方法は、核抽出物の代わりに細胞抽出物、すなわち、細胞質抽出物（ＣＥ：cytoplasmic extract）を利用する。細胞質抽出物を用いた試験は、実際に修復プロセスを可能とするＭＭＲタンパク質の量および割合の誤った情報を示す。したがって、細胞質抽出物を用いた試験は、オン／オフ試験にのみ適しており、ＭＭＲの定量的な試験には適していない。 本発明の方法において、ＭＭＲの能力は、任意の間接的な先行技術の検出方法、たとえば、検出がｌａｃＺαの発現によって分類される大腸菌における相補性アッセイを使用することなく、アガロースゲルから直接検出される。 本発明による１ステップアッセイは、望むなら、基礎となる遺伝学的または後成的に欠損した遺伝子を特定するためのステップが任意に続いても、またはそれを含んでもよいが、これは、臨床診断に必須ではない。従来の試験とは違って、本発明による方法は、家族が癌を発症していない、変異試験が検出可能な変化をもたらさないかつ／または基礎となる変化が遺伝子的ではなく、後成的である（制御性）場合であっても、欠損ＭＭＲに起因して癌の易罹患性が高い個人の識別を可能にする。 提案されるアッセイの基本的な原則ならびにさまざまな態様は、表１のアレイ構成に示され、ここで、Ｙは、ＭＭＲ欠損核タンパク質抽出物、Ｘは、試験サンプルの核タンパク質抽出物およびＺは、ＭＭＲ能力のある陽性対照核タンパク質抽出物を指す。 本発明の一態様では、試験サンプルの核タンパク質抽出物（Ｘ）は、検査される対象から得られた培養された正常な細胞、たとえば、線維芽細胞から調製され、本発明によるＭＭＲアッセイは、それぞれＹ（ＭＭＲ欠損核抽出物）、ＸおよびＺ（ＭＭＲ能力のある陽性対照核抽出物）を含むバイアル中で実施される。修復反応は、制限酵素により切断されにくいヘテロ二重鎖を切断されうるホモ二重鎖（homoduplex）に変える。サンプルＸがＭＭＲ能力のある場合、基質ヘテロ二重鎖は、それにより、切断され、直鎖状にされて３つのフラグメントになるのに対して、Ｘが、ＭＭＲ欠損である場合は、直鎖化により１つのみフラグメントがもたらされる。同様に、Ｙは、１つのみのフラグメントをもたらすのに対して、Ｚは、３つもたらす。本発明のこの態様、ＭＭＲ＋／−アッセイ（＋／−は、ＭＭＲ遺伝子のうち一方の対立遺伝子が機能しており、もう一方に欠損があることを示す）は、検査されたヒト対象が損なわれた／欠損したＭＭＲ機能または正常なＭＭＲ機能を有するかの判別を可能にすることになる。 本発明の別の態様において、サンプル核抽出物（Ｘ）は、ＭＭＲ欠損核抽出物（Ｙ）を補完してＸ＋Ｙを形成するために使用される。補完された試験サンプル（Ｘ＋Ｙ）ならびに陽性（Ｚ）および陰性（Ｙ）対照は、その後、ミスマッチを修復する能力を研究するための本発明によるＭＭＲアッセイに使用される。修復効率は、例８および図４に例示されるように参照レベルとして能力のある線維芽細胞核抽出物（Ｚ）の修復効率を使用して切断効率を測定することによって定量される。 欠損（複数可）が特定するのに重要だと考えられるかどうかに応じて、アッセイに含まれるＭＭＲ欠損核抽出物（Ｙn）の数を変えてもよい。本発明による方法の好適な一態様において、Ｙ1は、ＭＬＨ１欠損があり、Ｙ2は、ＭＳＨ２／ＭＳＨ６欠損がある。本発明のさらなる態様において、Ｙ3は、ＰＭＳ２欠損があるであろう。しかしながら、前記ＭＭＲ欠損核抽出物（Ｙn）のうちのいずれか１つが、除外されるか、または追加されて、任意の組合せで使用されるであろう。当業者は、問題の臨床的状況に適した試験パネルを構築することができるであろう。 本発明による典型的な診断アッセイは、以下により詳細に記載されるように実施される。 Ａ．組織サンプル 検査される組織サンプルは、任意の正常な組織であってもよい。これは、容易に得られ、処理される。本発明の特定の一態様において、最適な組織サンプルは、ヒト皮膚パンチまたは切除生検であり、これは、医療分野の当業者に周知の任意の方法によって得られていてもよい。 本発明による方法に使用されてもよいその他の組織サンプルは、血液サンプルおよび粘膜スワブを含む。 Ｂ．サンプル細胞の増殖 細胞のミスマッチ修復（ＭＭＲ）の能力を調べるために、そこから核タンパク質を抽出する前に十分な量の細胞が増殖させられなければならない。細胞は、使用される細胞の種類に適しており、当該技術分野において周知の標準的な細胞培養条件において増殖させられ、その後、穏やかにそれを遠心沈殿することによって回収される。 腫瘍由来の悪性細胞を含む、ヒト対象から採取された臨床サンプル由来の任意の細胞種が本発明による方法に使用されてもよい。本発明による試験への使用に好適な細胞種は、ヒト線維芽細胞である。別の好適な細胞種は、血液由来のヒト細胞、たとえば、リンパ球細胞である。 最も好ましくは、本発明の試験のための細胞は、正常な初代細胞またはトランスフォームされた正常な細胞である。 Ｃ．ヒト線維芽細胞からの核タンパク質の抽出 ＭＭＲタンパク質は、細胞の核から抽出される。細胞は、遠心沈殿され、計数され、あらゆる残存トリプシンを除去するために生理食塩水緩衝液で洗浄される。細胞は、遠心沈殿される前に等張緩衝液でさらに洗浄され、続く低張の洗浄の浸透作用により膨張させられる。顕微鏡下で大半の細胞が溶解したことが確認されるまで細胞膜を破壊するために細い針が使用される。 細胞を遠心沈殿した後、細胞質部分を含む上清が除去される。塩を含む冷えた抽出緩衝液中でインキュベーションすることによって核タンパク質は、残った核部分から抽出され、その後、残存した核のいかなる破片も、遠心沈殿され、残ったペレットとして除去される。抽出された核タンパク質サンプルは、その後、プロテイナーゼ阻害剤の存在下で透析され、−８０℃において保存する前に遠心分離によってさらに澄んだ状態にされる。サンプルのタンパク質含有量は、蛍光光度計によって定量される。 Ｄ．基質調製 本発明によるＭＭＲアッセイに使用するための環状ヘテロ二重鎖プラスミド基質は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）と１つ非相同部位をもつ変性された対応するプラスミドＤＮＡの再アニーリングによって作製される。 ｓｓＤＮＡは、厳しい抗生物質選択下において細菌細胞および市販のヘルパーファージを用いてプラスミドから産生される。細胞の破片は、遠心沈殿され、ファージ粒子は、沈殿およびさらなる遠心分離によって回収される。細菌細胞も、遠心分離によって除去され、残った細菌に由来するあらゆる染色体ＤＮＡも酵素処理を用いて除去される。サンプルを清浄にするときに、プロテイナーゼ酵素によりファージカプシドタンパク質からｓｓＤＮＡが放出される。 ミスマッチエラーを含む二本鎖（ｄｓ）プラスミド鋳型が細菌細胞中で増幅され、そこから精製される。エラーの部位の上流の５’の切れ目をもつように、構築物を直鎖状にするために特定の制限酵素が使用され、その後、サンプルは、沈殿させられ、適切な体積の緩衝液に溶解させられる。 本発明によるＭＭＲアッセイのための、ミスマッチ含有ヘテロ二重鎖基質を作製するために、ｓｓＤＮＡおよび上記の対応するプラスミドＤＮＡが、変性され、ともに再アニールされる。塩およびハイブリット形成していない直鎖状ｄｓＤＮＡならびにハイブリット形成していないｓｓＤＮＡの除去に続く、エタノール沈殿を含む次の洗浄ステップが最終生成物の純度を確保する。分光光度計により、ならびにゲル電気泳動によって濃度が測定され、これも、サンプルの純度を検証するために役に立つ。 Ｅ．本発明によるＭＭＲアッセイ 本発明によるＭＭＲアッセイは、試験サンプルのＭＭＲ機能が欠損しているかどうかを判別することのみに使用されてもよいが、上記のとおり、ＭＭＲ欠損細胞から抽出された核タンパク質のＭＭＲ能力と、ＭＭＲ能力のある細胞から抽出されたＭＭＲ能力とを区別することもできる。ＭＭＲ欠損遺伝子を特定するために、サンプル核抽出物は（Ｘ）は、ＭＬＨ１（Ｙ1）およびＭＳＨ２／ＭＳＨ６（Ｙ2）欠損核抽出物を別々に補完するために使用される。 本発明によるＭＭＲアッセイは、約５０〜５００μｇ、好ましくは、約５０〜２００μｇ、より好ましくは、約７５〜１００μｇの核タンパク質抽出物を過量の環状プラスミド基質（ヘテロ二重鎖）と組み合わせることによって行われるのに対して、欠損を引き起こすＭＭＲ遺伝子を判別するために十分に特徴づけられたＭＭＲ欠損細胞株を補完する場合は、アッセイに使用される２つの抽出物の総量は、２００μｇを超えるべきではない。修復反応は、最適な塩濃度を確保する一方でＡＴＰおよびオキシリボヌクレオチドも提供するＭＭＲ緩衝液の存在下で誘導される。修復反応は、酵素的に終了され、タンパク質は、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール抽出によってサンプルから除去される。 沈殿後、サンプルは、二重消化に供され、これは、修復プロセスが成功した場合、基質のヘテロ二重鎖ＤＮＡを２つのより小さなフラグメントに切断する。これらの２つのより小さなフラグメントは、アガロースゲル電気泳動によって視覚化される。基質のＤＮＡが過剰に添加されるため、直鎖状にされた完全長生成物も常に見えることになる。修復が起こらなかった場合、完全な長さの直鎖状にされたプラスミドＤＮＡのみが見えることになる。 本発明のさらなる目的は、本発明による方法を実施するために必要な試薬を含むキットを提供することである。本発明によるキットは、標準的な試薬、たとえば、必要なミスマッチ含有ヘテロ二重鎖ＤＮＡ基質（複数可）を含む基質；少なくとも１つであるが、好ましくは２つのＭＭＲ欠損核抽出物；および陽性対照としてＭＭＲ能力のある核抽出物を含む。本発明の特定の態様において、前記ＭＭＲ欠損核抽出物は、それぞれＭＬＨ１およびＭＳＨ２／ＭＳＨ６に関する欠損がある細胞株に由来する。さらに具体的には、前記ＭＭＲ欠損核抽出物は、ＨＣＴ１１６およびＬｏＶｏ細胞に由来する。 本発明によるキットに含まれる試薬は、表１に開示される基本的な原則に従って選択されるべきである。一態様において、第１の核抽出物（Ｙ１）は、ＭＬＨ１の欠損があるのに対して、第２の核抽出物（Ｙ２）は、ＭＳＨ２／ＭＳＨ６の欠損がある。検査されるサンプルが前記第１の核抽出物を補完しないが、前記第２の核抽出物を補完する場合、前記試験サンプルは、ＭＬＨ１欠損を示す。しかしながら、前記検査されるサンプルが前記第１の核抽出物を補完するが、前記第２の核抽出物を補完しない場合、前記試験サンプルは、検査される対象がＭＳＨ２またはＭＳＨ６のいずれかの欠損を有することを示す。 任意に、本発明によるキットは、ＭＭＲ欠損核抽出物をさらに含んでもよく、これは、ＭＳＨ２およびＭＳＨ６遺伝子の間の欠損を明確に区別する。そのような核抽出物は、細胞株、たとえば、ＭＳＨ６欠損ＨＣＴ−１５／ＤＬＤ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２２５／２２１）由来のものであってもよい。 任意に、本発明によるキットは、ＭＭＲアッセイを実施するために必要な追加の試薬、たとえば、必要な緩衝液およびヌクレオチドも含んでよい。 本発明によるキットの一例は、下記の例において示される。［実施例］ 以下の例は、本発明の態様をさらに説明するために提供されるが、本発明の範囲を限定する意図はない。技術が進歩するにつれ、本発明の概念は、さまざまな方法で実装できることが当業者に明らかになるであろう。本発明およびその態様は、したがって、ここに記載される例に限定されるものではなく、特許請求の範囲の範囲内で変化してもよい。 例１． 検査される対象から採取された線維芽細胞の培養 線維芽細胞を、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃３１９６６−０２１）中、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーター内で増殖させる。その増殖培地に、１０％のウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃１０１０６−１６９）、２×非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃１０３７０−０７０）および２％のペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃１５０７０−０６３）を補充する。細胞を、およそ８０〜９０％コンフルエントのときに、トリプシン０．２５％ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃２５２００−０７２）を用いて１：２〜１：６に継代する。ＭＬＨ１−欠乏誘導細胞株（depleted derivative cell line）ＦＢ−Ｍ１またはＭＳＨ２−欠乏誘導細胞株ＦＢ−ＳＨ１３の発現抑制を維持するために、１５０μｇ／μｌのハイグロマイシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃１０６８７−０１０）を増殖培地に添加する。核タンパク質の抽出のために、およそ５×１０8〜１０9細胞が収集されるまで、その細胞をフィルターでキャップされた１７５ｃｍ2ボトル（ＮＵＮＣ、カタログ＃１４５−１７８８８３）で処理された培地中で増殖させる。 例２． 細胞株および核抽出物 付着性のヒト癌細胞株ＨｅＬａ、ＬｏＶｏおよびＨＣＴ１１６（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、マナッサス、ＶＡ、米国）を、製造業者の取扱説明書に従って培養する。ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２）は、女性個人の子宮頸部由来のＭＭＲ能力のある上皮細胞であるのに対して、ＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４７）およびＬｏＶｏ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２２９）は、男性個人の結腸由来のＭＭＲ欠損上皮細胞である。ＨＣＴ１１６細胞は、ＭＬＨ１が欠如しているのに対して、ＬｏＶｏ細胞では、ＭＳＨ２遺伝子が不活化しており、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３およびＭＳＨ６タンパク質の欠損を引き起こす。ＭＳＨ２の欠如は、その対応物ＭＳＨ３およびＭＳＨ６のタンパク質分解と関連づけられている。 ＨｅＬａ細胞を、２％のＬ−グルタミン、１０％のＦＢＳおよび５％のＰＳを補充したＤＭＥＭ培地中で増殖させる。ＬｏＶｏ細胞を、２％のＬ−グルタミン、１０〜２０％のＦＢＳおよび５％のＰＳを補充したＦ１２（またはＦ１２：ＤＭＥＭ）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃３１７６５−０２７／３１３３１−０２８）中で増殖させるのに対して、ＨＣＴ１１６細胞を、２％のＬ−グルタミン、１０％のＦＢＳおよび５％のＰＳを補充したＭｃＣｏｙｓ５Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃２２３３０−０２１）中で増殖させる。 ＦＢ−Ｍ１細胞株を、ＭｃＤａｉｄら、ＢＪＣ、１０１：４４１〜４５１、２００９に記載されるように作製した。簡単にいうと、ＭＬＨ１を標的とするｓｉＲＮＡを産生する重複オリゴヌクレオチド（overlapping oligonucleotide）ＡＡＣＴＧＴＴＣＴＡＣＣＡＧＡＴＡＣＴＣＡを設計し、市販のｓｈＲＮＡベクターｐＳｉｌｅｎｃｅｒ（商標）（Ａｍｂｉｏｎカタログ＃ＡＭ７２０９）と連結した。直鎖状にし、１μｇのＤＮＡとともに１×１０7の細胞を電気穿孔する前に配列決定によって構築物を確認した。血清を多く含んだ培地をすぐに添加し、１０〜１４日間のハイグロマイシン添加による選択（１５０μｇ／μｌ）の前に、細胞を５×１０5で蒔いた。同様に、ＦＢ−ＳＨ１３細胞株を、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ（商標）ｓｈＲＮＡベクター中の、ＭＳＨ２を標的とするｓｉＲＮＡを産生する重複オリゴヌクレオチドＴＣＴＧＣＡＧＡＧＴＧＴＴＧＴＧＣＴＴを使用して生成した。 同様に、その他のＭＭＲ遺伝子変異、たとえば、発現抑制されたＭＳＨ６を含む線維芽細胞株を、ｓｈＲＮＡベクターｐＳｉｌｅｎｃｅｒ（商標）４．１−ＣＭＶ Ｈｙｇｒｏ（カタログ＃ＡＭ５７７７）を使用して調製してもよい。以下のプロトコルに従って線維芽細胞核抽出物を調製した（Ｌａｈｕｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４５：１６０〜１６４，１９８９）：１． トリプシンにより５×１０8〜１０9の対数期細胞を回収する。２． 細胞を計数する。３． ５００×ｇ、＋４℃において１０分間遠心分離する。４． 細胞ペレットを２０〜３０ｍＬの冷えた１×等張緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、５ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、２５０ｍＭのスクロース、０．２ｍＭのＰＭＳＦ、１×コンプリートＥＤＴＡ−フリープロテアーゼインヒビター混合物（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）、０．２５μｇ・ｍｌ−１のアプロチニン、０．７μｇ・ｍｌ−１のペプスタチン、０．５μｇ・ｍｌ−１のロイペプチン、１ｍＭのＤＴＴ）に再懸濁し、前述のように遠心分離する。５． 血中血球容積を概算し、それを、２０〜３０ｍｌの冷えた１×低張緩衝液（スクロースを含まない等張緩衝液）に再懸濁し、前述のようにすぐに遠心分離する。６． 上清を除去し、細胞ペレットを１×冷えた低張緩衝液に再懸濁して１〜２×１０8細胞／ｍｌの細胞密度を得る。血中血球容積を再懸濁体積から引く。７． 細いゲージの針の付いたシリンジにより細胞をシリンジ中にゆっくりと引き入れ、その後、急速な一押しによりそれらを放出することによって細胞を破壊する。顕微鏡下で確認しながら、８０〜９０％の細胞が溶解するまで細胞破壊を行う（４５μｌのＰＢＳおよび５μｌの細胞を含む５０μｌの０．４％トリパンブルーＰＢＳ）。８． 破壊した細胞を３０００×ｇ、＋４℃において１０分間遠心分離し、上清を除去する。９． 核ペレット体積を概算し、そのペレットの体積に対して１／３から１／５の冷えた抽出緩衝液（２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１０％のスクロース、１ｍＭのＰＭＳＦ、０．５ｍＭのＤＴＴ、１μｇ・ｍｌ−１のロイペプチン）を添加する。ピペットで上下することによってペレットを十分に再懸濁する。１０． 新しい体積を測定し、混合しながら最終濃度の０．１５５ＭまでＮａＣｌを添加する。１１． ４℃において６０分間混合物を循環させる。１２． １４５００×ｇ、２℃において２０分間遠心分離する。１３． サンプルを、３．５００ＭＷＣＯカセットにおいて１Ｌの冷えた透析緩衝液（２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、５０ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８、１０％のスクロース、１ｍＭのＰＭＳＦ、２ｍＭのＤＴＴ、１μｇ・ｍｌ−１のロイペプチン）中で２×５０分間透析する。最初の５０分間の後、緩衝液を変える。１４． ２００００×ｇ、２℃における１５分間の遠心分離によって抽出物を清澄にする。１５． 液体窒素中で核タンパク質を瞬間凍結し（snap freeze）、−８０℃で保存する。 例３． ウエスタンブロット分析 ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動による５０ｍｇの核抽出物（ＮＥ：nuclear extract）および０．１〜５μｌの野生型総タンパク質抽出物を使用したウエスタンブロット分析によって、ＮＥのタンパク質発現量を調査した。そのタンパク質をニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｐｏｎｄ（商標）、ＰＶＤＦ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ウプサラ、スウェーデン）にブロットし、それを、その後、モノクローナル抗体、抗−ＭＳＨ２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、サンディエゴ、ＣＡ、米国、ＭＳＨ２−Ａｂ１、ＮＡ−２６、０．２ｍｇ／ｍｌ）、抗−ＭＳＨ３（ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、レキシントン、ＫＹ、米国、Ｍ９４１２０、２５０ｍｇ／ｍｌ）、抗−ＭＳＨ６（ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ｃｌｏｎｅ ４４、０．０２ｍｇ／ｍｌ）、抗−ＰＭＳ２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ／Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、サンディエゴ、ＣＡ、米国、Ａｂ−１、０．２ｍｇ／ｍｌ）および抗−ＭＬＨ１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、サンディエゴ、ＣＡ、米国、ｃｌｏｎｅ １６８−１５、０．５ｍｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。ローディングコントロール（loading control）として偏在的に発現されるα−チューブリンを使用して、抽出物中のＭＭＲタンパク質量を概算した（抗−α−チューブリン；Ｓｉｇｍａ、ルイス、ＭＯ、米国、ＤＭ１Ａ、０．２ｍｇ／ｍｌ）。 例４． 野生型ヘテロダイマータンパク質複合体の産生。 Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ、米国）昆虫細胞を、野生型（ＷＴ）ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＰＭＳ２またはＭＬＨ１ｃＤＮＡフラグメントを保有するバクミドＤＮＡによりトランスフェクトし、その後、細胞を再感染させてさらに高い収率の組換え型バキュロウイルスを得た（Ｎｙｓｔｒｏｍ−Ｌａｈｔｉら、２００２）。アッセイされるヘテロダイマー複合体を形成するタンパク質：ＭｕｔＬα（ＭＬＨ１＋ＰＭＳ２）、ＭｕｔＳα（ＭＳＨ２＋ＭＳＨ６）およびＭｕｔＳβ（ＭＳＨ２＋ＭＳＨ３）産生のためのＳｆ９細胞を同時感染させるために、これらのＷＴ−組換え型バキュロウイルスを使用した。ヘテロダイマー複合体を総タンパク質抽出物（ＴＥ：total protein extract）として５０ｈ（ＭｕｔＬα）または７２ｈ（ＭｕｔＳαおよびＭｕｔＳβ）で、細胞を溶解させ、遠心沈殿することによって抽出した。 例５． 基質調製 ヘテロ二重鎖分子の調製。ヘテロ二重鎖ＤＮＡ分子は、ミスマッチの部位から４４５ｂｐ上流に一本鎖の切れ目をもつ環状の３１９２ｂｐ長の分子である。これは、完全なＢｇｌＩＩ制限部位を含む。ｐＧＥＭ−ＩＤＬ４０プラスミドからの一本鎖ＤＮＡ（図６）を、同じ構築物ベースのエラー導入プラスミド（error introducing plasmid）（５’ＧＴ基質のためのｐＧＥＭ−ＩＤＬ ＧＴまたは５’ＩＤＬ１基質のためのｐＧＥＭ−ＩＤＬ−３９）とともにアニールすることによってこの分子を作製する。 ｐＧＥＭ ＩＤＬ４０を、Ｍ１３Ｋ０７バクテリオファージ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ピスカタウェイ、ＮＪ、米国）によりトランスフォームされたＸＬ１−ｂｌｕｅ細菌細胞を感染させることによって一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を調製した。これは、その後、細胞から抽出されうるアンチセンス鎖を複製する。Ｍ１３ファージによって増幅される下側の（−）鎖は、配列番号１で表わされる配列を有し、ＢｇｌＩＩ制限部位はアノテーションされる。 ２つの異なるヘテロ二重鎖構築物を調製した；Ｇ−Ｔミスマッチ（５’ＧＴ）および単一ヌクレオチド５’ＩＤＬ１。製造業者の取扱説明書に従ってｐＧＥＭ−ＩＤＬ４０に部位特異的変異誘発を行って（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラホーヤ、ＣＡ、米国）、エラー含有ｐＧＥＭ ＩＤＬＧＴおよびｐＧＥＭ ＩＤＬ３９プラスミドを作製した。 ｓｓＤＮＡをミスマッチ含有ｐＧＥＭ−ＩＤＬＧＴとアニールすることによって５’ＧＴ基質を作製した。直鎖状ｄｓＤＮＡについてのこの３１９２ｂｐ長のベースプラスミド（ｐＧＥＭ−ＩＤＬＧＴ）は、不完全なＢｇｌＩＩ制限部位（ＧＧＡＴＣＴ）を含む。ＢｇｌＩＩ部位において相補的であろうＡに取って代わっているＧを除けば、上側の（＋）鎖は、ＩＤＬ４０から産生されるｓｓＤＮＡと相補的である。ｐＧＥＭ−ＩＤＬＧＴの配列は、配列番号２において表わされ、不完全なＢｇｌＩＩ制限部位はアノテーションされる。 ｓｓＤＮＡをエラー含有ｐＧＥＭ−ＩＤＬ１とアニールすることによって５’ＩＤＬ１基質を作製した。直鎖状ｄｓＤＮＡについてのこの３１９１ｂｐ長のベースプラスミド（ｐＧＥＭ−ＩＤＬ３９）は、不完全なＢｇｌＩＩ制限部位（−ＧＡＴＣＴ）を含む。ＢｇｌＩＩ部位の欠失したＡを除けば、上側の（＋）鎖は、ＩＤＬ４０から産生されるｓｓＤＮＡと相補的である。５’の切れ目を作り出すために、再アニーリングの前に環状の基質をＢａｍＩＩまたはＤｒａＩＩＩにより直鎖状にした。ｐＧＥＭ−ＩＤＬ３９の配列は、配列番号３において表わされ、不完全なＢｇｌＩＩ制限部位はアノテーションされる。 例６． 本発明によるＭＭＲアッセイ 本発明は、以前に示されたインビトロＭＭＲアッセイの修正版であり（Ｎｙｓｔｒｏｍ−Ｌａｈｔｉら、２００２）、核抽出物のＭＭＲ能力を直接アッセイすることを可能にする。さらに、表１に示されるように特徴づけられたＭＭＲ欠損抽出物を補完することによって、サンプル中の離脱されたＭＭＲ遺伝子を特徴づけるために相補性が使用できる。修復反応は、合計７５〜１００μｇのＮＥを含むよう統一する。過量のヘテロ二重鎖ＤＮＡ基質（５’ＧＴまたは５’ＩＤＬ１）は１００ｎｇとする。修復反応を、２０μｌの体積で以下の試薬により実施する：−１００ｎｇのヘテロ二重鎖基質−７５〜１００μｇ核抽出物−２μｌの１０×ＭＭＲ緩衝液（２００ｍＭのトリス−ＨＣＬ、ｐＨ７．６、４００ｍＭのＫＣｌ、５０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのグルタチオン、ＢＳＡ ５００μｇ／ｍｌ、１ｍＭの各ｄＮＴＰ、１５ｍＭのＡＴＰ）−１１０ｍＭの最終濃度になるまでのＫＣｌ−２０μｌ以下のＨ2Ｏの添加。 この反応は、２０μｌの全体積および最終的なＫＣｌ濃度の１１０ｍＭにおいて行われるべきであるため、核抽出物のＫＣｌ含有量を考慮する必要がある（２μｌの１０×ＭＭＲ緩衝液は、反応混合物のＫＣｌ含有量を４０ｍＭにする）。核抽出物のＫＣｌ含有量は、７５ｍＭ／μｌであると推定される。 本発明によるＭＭＲアッセイの典型的なプロトコルは、以下の通りである。１． 修復反応の構成成分をピペットで取り氷上で一緒にし、３７℃において３０分間インキュベートする。２． ３０μｌの新しい停止液（４２ｍＭのＥＤＴＡ、１．２％のＳＤＳ、５０．４μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ）を添加することによって反応を停止させる。３７℃で２０分間インキュベートする。３． １容量（５０μｌ）のｐＨ８．０のＴＥ緩衝液を添加する。４． １容量のフェノール−クロロフォルム−イソアミルアルコール（２５：２４：１）を添加し、１０秒間ボルテックスする。最高速度、室温において１０分間遠心分離する。５． 上相（およそ９０μｌ）を新しいチューブに移し、同量のクロロホルムを添加する。１０秒間ボルテックスし、最高速度、室温において１０分間遠心分離する。６． エタノール沈殿のために８５μｌの上相を新しいチューブに移す。７． １５０ｍＭの最終濃度を得るためにＮａＣｌを、続いて２．５容量の冷えた無水エタノールを添加する。−２０℃において３０分間インキュベートする。８． サンプルをフルスピードで、＋４℃において３０分間遠心分離することによってＤＮＡをペレット化する。９． １５０μｌの７０％エタノールでペレットを洗浄し、フルスピードで１０分間遠心乾燥し、ペレットを６μｌのｄｄＨ２Ｏに再懸濁する。１０． ４μｌの新たに調製された１０×消化混合物（２．５μｌのＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ（登録商標）ＢｇｌＩＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、カタログ＃ＦＤ００８３）、２．５μｌのＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ（登録商標）Ｅｃｏ３１Ｉ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、カタログ＃ＦＤ０２９３）、１０μｌのＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ（登録商標）緩衝液および２５μｌのｄｄＨ２Ｏ）を添加し、３７℃において１０分間インキュベートする。１１． ４０μｇ／ｍｌ以下のＲＮＡｓｅ Ａを添加し、３７℃において１０分間インキュベートする。１２． 修復が起こったかどうかを確認するために、サンプルを１×ＴＡＥとともに作製した１．０％アガロースゲル上に載せる。 修復パーセンテージを、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ（登録商標）４．０（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、シルバースプリング、ＭＤ、米国）を使用して分析する。 ＭＭＲ能力のあるＨｅＬａ ＮＥを陽性対照として使用し、補完されないＭＭＲ欠損ＮＥを陰性対照として使用する。基質をＥｃｏ３１Ｉ制限酵素により直鎖状にする。修復反応は、ＧＴヘテロ二重鎖をＡＴホモ二重鎖に変えるか、１または２ｎｔループ構造を埋めて、ＢｇｌＩＩ制限部位を再生するため、修復効率は、二重消化の効率によって測定されてもよい。 例７． 本発明によるＭＭＲアッセイに使用される線維芽細胞 この例は、ＭＭＲアッセイが正常な組織、たとえば、線維芽細胞に対して実施できることを示すために実施した。例２に記載されるように調製された野生型線維芽細胞核抽出物（ＦＢ−ＷＴ：Wild-type fibroblast nuclear extract）、ＭＭＲ能力のあるＨｅＬａ細胞からの核抽出物およびタンパク質を含まない陰性対照（ＭＯＣＫ）を、例３に記載されるような本発明によるＭＭＲアッセイに供した。 修復反応を行わせた後、基質ＤＮＡの二重消化は、修復が起こらなかった場合、およそ３０００ｂｐの１つのより大きなバンドを、修復が起こった場合、さらに２つのより小さな（およそ１８００および１３００ｂｐの）フラグメントをもたらすことになる。基質ＤＮＡは、常に過剰に添加されるため、ＭＭＲ能力のある抽出物でも、二重の切断フラグメントに加えて直鎖状にされた基質が存在することになる。 このアッセイの結果を図２に示し、これは、ＭＯＣＫ細胞を含むレーン１は、１つの大きなバンドのみを有する（＝修復なし）のに対して、それぞれＦＢ−ＷＴおよびＨｅＬａ核抽出物を含むレーン２および３は、修復反応を示す２つの追加のより小さなバンドを示すことを示している。 したがって、この例は、正常な線維芽細胞からの核抽出物が、ＭＭＲ能力のある対照細胞株（ＨｅＬａ）のＭＭＲ能力と同等のＭＭＲ能力を有していることを明白に示しており、これは、本発明によるアッセイによって確認できる。 例８． 部分的に発現抑制されたＭＭＲ遺伝子をもつヒト線維芽細胞は、本発明によるＭＭＲアッセイにおいてＭＭＲ能力の低下を示す この例は、それぞれＭＬＨ１遺伝子またはＭＳＨ２遺伝子が（ｓｈ）ＲＮＡ技術によって部分的に発現抑制されたヒト線維芽細胞株ＦＢ−Ｍ１およびＦＢ−ＳＨ１３（例２に記載される）が、ＭＭＲ能力に明らかな低下を示すことを示している。 最初に、野生型線維芽（ＦＢ−ＷＴ）細胞およびＦＢ−Ｍ１細胞またはＦＢ−ＷＴおよびＦＢ−ＳＨ１３細胞からの同量の核抽出物に対してウエスタンブロットを実施した。結果として（図３）、ＦＢ−ＳＨ１３細胞におけるＭＳＨ２の量と同様に、ＦＢ−ＷＴと比較した場合、ＦＢ−Ｍ１細胞におけるＭＬＨ１タンパク質の量が明らかに減少していることがわかる。ローディングコントロールとしてα−チューブリンが含まれている。 次に、例６に記載されるように、同量の以下の同じ核抽出物を使用してＭＭＲアッセイを実施した：ＭＯＣＫ−核抽出物を含まない陰性アッセイ対照；ＦＢ−ＷＴ−野生型ヒト線維芽細胞核抽出物（陽性対照）；およびＦＢ−Ｍ１−部分的に発現抑制されたＭＬＨ１をもつヒト線維芽細胞からの核抽出物；またはＦＢ−ＳＨ１３−部分的に発現抑制されたＭＳＨ２をもつヒト線維芽細胞からの核抽出物。 このアッセイの結果は、１つの重要なＭＭＲタンパク質の濃度の低下が離脱されたＭＭＲ機構と関連づけられることを示している。この結果は図４に示されており、本発明によるＭＭＲアッセイは、野生型ヒト線維芽細胞核抽出物と比較して、ＭＬＨ１およびＭＳＨ２の欠損を修復効率の低下として検出することを明らかに示している。さらに、ＭＭＲ欠損核抽出物のＭＭＲ能力は、図５に示され、表１に示され、１０〜１１ページに記載される試験によって示されるように、野生型またはＭＭＲが部分的に欠損した核抽出物とともに（この場合、ＦＢ−ＷＴまたはＦＢ−Ｍ１を含むＨＣＴ１１６）アッセイされると、差次的に回復されうる。 本発明によるＭＭＲアッセイにおいて、修復効率は、反応における全基質ＤＮＡのうち修復されたＤＮＡのパーセンテージと見なされる。重要なＭＭＲタンパク質の不足は、修復効率を変化する強度で低下させるのに対して、重要なＭＭＲタンパク質の完全な欠如は、修復効率を検出不可能なレベルにまで低下させる。 例９． ＭＭＲにおける異常を診断するためのアッセイに使用するためのキット 本発明によるキットは、ＭＭＲアッセイを実施するための全試薬を予め入れたバイアルとして好ましくは提供される。試験サンプル核抽出物のみが添加される。本発明の一態様では、検査される異なるＭＭＲ欠損のために個別のバイアルが提供される。 この例は、対象がＭＬＨ１遺伝子に、またはＭＳＨ２もしくはＭＳＨ６遺伝子のいずれかに異常があるかどうかを判別することによって、後者の間の区別はせずに、前記対象がリンチ症候群であるかどうかを判別するためのキットについて記載する。そのようなキットは、少なくとも５個の個別のバイアルを有する。 前記バイアルに含まれる試薬は以下のものである：−基質のヘテロ二重鎖−核抽出物（ＨＣＴ１１６、ＬｏＶｏまたはＦＢ−ＷＴ）−１０×ＭＭＲ緩衝液（２００ｍＭのトリス−ＨＣＬ、ｐＨ７．６、４００ｍＭのＫＣｌ、５０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのグルタチオン、ＢＳＡ ５００μｇ／ｍｌ、１ｍＭの各ｄＮＴＰ、１５ｍＭのＡＴＰ）。 これに加えて、ＭＭＲアッセイ用停止液（４２ｍＭのＥＤＴＡ、１．２％のＳＤＳ、５０．４μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ）が必要とされ、したがって、キットとともに提供されてもよいであろう。 さらに、前記キットは、サンプルを清澄にするため（ＴＥ緩衝液、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールおよびクロロホルム）、それを沈殿させるため（ＮａＣｌおよびエタノール）ならびに修復を検出するため（ＲＮａｓｅ Ａならびに緩衝液とともに制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏ３１Ｉならびにローディングダイ）に必要とされる試薬を任意に含んでもよい。 キットのさらなる任意の構成要素は、サンプル核タンパク質が抽出される細胞を培養するために必要とされる試薬ならびにそこから核タンパク質を抽出するために必要とされる試薬である（例２を参照）。 本発明によるキットは、いかなる特定のバイアルの形態または種類にも制限されない。例６に記載されるような取り扱いおよびインキュベーションに適した任意の種類のバイアル、たとえば、ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）チューブが適している。 ヒト対象がＤＮＡミスマッチ修復機能障害を有しているかどうかを判別するための定量的方法であって、ａ）前記ヒト対象から得られたサンプルから核タンパク質抽出物を生成すること、ｂ）陽性および陰性対照としてそれぞれ、ＭＭＲ能力のあるおよびＭＭＲ欠損のある核タンパク質抽出物を準備すること、ｃ）個別のバイアル中で各核抽出物を少なくとも１つのミスマッチ含有ヘテロ二重鎖ＤＮＡ基質と組み合わせること、ｄ）前記サンプルおよび対照核タンパク質抽出物ならびに前記基質に対してミスマッチ修復アッセイを実施すること、ならびにｅ）前記サンプル核抽出物が前記基質ＤＮＡ分子を修復できるかどうかを判別することを含む、方法。 前記サンプルは、構成組織から得られた正常な細胞を含む、請求項１に記載の方法。 前記正常な細胞は、線維芽細胞である、請求項２に記載の方法。 前記正常な細胞は、血液由来細胞である、請求項２に記載の方法。 前記基質は、配列番号１を有するプラスミドに由来する、請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。 前記基質は、配列番号２および配列番号３からなる群から選択される核酸配列をさらに含む、請求項５に記載の方法。 前記ＭＭＲ欠損核抽出物は、ＨＣＴ１１６およびＬｏＶｏ細胞からなる群から選択される細胞株に由来する、請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。 バイアル当たりの核抽出物の総量は、５０〜５００μｇ、好ましくは５０〜２００μｇ、より好ましくは７５〜１００μｇの範囲である、請求項７に記載の方法。 機能欠損を有するミスマッチ修復遺伝子を特定するための定量的方法であって、ａ）ヒト対象から得られたサンプルから核タンパク質抽出物を生成すること、ｂ）陽性および陰性対照としてそれぞれ、ＭＭＲ能力のあるおよびＭＭＲ欠損のある核タンパク質抽出物を準備すること、ｃ）少なくとも１つのＭＭＲ欠損核タンパク質抽出物を前記サンプル抽出物と混合すること、ｄ）個別のバイアル中でステップａ〜ｃにおいて準備された各核抽出物を少なくとも１つのミスマッチ含有ヘテロ二重鎖ＤＮＡ基質と組み合わせること、ｅ）前記核抽出物および前記基質に対してミスマッチ修復アッセイを実施すること、ならびにｆ）前記サンプル核抽出物が前記基質を修復でき、前記ＭＭＲ欠損核抽出物を補完できるかどうかを判別することによって前記欠損遺伝子を特定することを含む、方法。 前記サンプルは、構成組織から得られた正常な細胞を含む、請求項９に記載の方法。 前記正常な細胞は、線維芽細胞である、請求項１０に記載の方法。 前記正常な細胞は、血液由来細胞である、請求項１０に記載の方法。 前記基質は、配列番号１を有するプラスミドに由来する、請求項９〜１２の何れか１項に記載の方法。 前記基質は、配列番号２および配列番号３からなる群から選択される核酸配列をさらに含む、請求項１３に記載の方法。 前記ＭＭＲ欠損核抽出物は、ＨＣＴ１１６およびＬｏＶｏ細胞からなる群から選択される細胞株に由来する、請求項９〜１４の何れか１項に記載の方法。 バイアル当たりの核抽出物の総量は、５０〜５００μｇ、好ましくは５０〜２００μｇ、より好ましくは７５〜１００μｇの範囲である、請求項１５に記載の方法。 請求項９〜１６の何れか１項に記載の方法を使用して欠損ＤＮＡミスマッチ修復遺伝子を特定することにより、ヒトのリンチ症候群を診断するための方法であって、前記サンプルは、ヒト対象の構成組織から得られた臨床サンプルである、方法。 請求項１〜１７の何れか１項に記載の方法に使用するためのキットであって、少なくとも１つのミスマッチ含有ヘテロ二重鎖ＤＮＡ基質、少なくとも１つのＭＭＲ欠損核抽出物および陽性対照としてＭＭＲ能力のある核抽出物を含む、キット。 前記ＭＭＲ欠損核抽出物は、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６のいずれかについてのＭＭＲ欠損を有する細胞株から得た、請求項１８に記載のキット。 少なくとも２つのＭＭＲ欠損核抽出物を含む、請求項１９に記載のキット。 前記ＭＭＲ欠損核抽出物は、それぞれＭＬＨ１およびＭＳＨ２／ＭＳＨ６についてのＭＭＲ欠損を有する細胞株に由来する、請求項２０に記載のキット。 前記ＭＭＲ欠損核抽出物は、それぞれＨＣＴ１１６およびＬｏＶｏ細胞に由来する、請求項１８〜２１の何れか１項に記載のキット。 前記ＭＭＲアッセイを実施するために必要な追加の試薬をさらに含む、請求項１８〜２２の何れか１項に記載のキット。 ２００ｍＭのトリス−ＨＣＬ、ｐＨ７．６、４００ｍＭのＫＣｌ、５０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのグルタチオン、ＢＳＡ ５００μｇ／ｍｌ、１ｍＭの各ｄＮＴＰおよび１５ｍＭのＡＴＰを含む１０×ＭＭＲ緩衝液；ならびに４２ｍＭのＥＤＴＡ、１．２％のＳＤＳ、５０．４μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含むＭＭＲアッセイ用停止液をさらに含む、請求項２３に記載のキット。 前記サンプルを清澄にするための試薬、たとえば、ＴＥ緩衝液、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールおよびクロロホルム；前記サンプルを沈殿させるための試薬、たとえば、ＮａＣｌおよびエタノール；ならびに修復を検出するための試薬、たとえば、ＲＮａｓｅ Ａならびに緩衝液とともに制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏ３１Ｉならびにローディングダイを含む、請求項２３〜２４の何れか１項に記載のキット。 本発明は、ヒト対象がＤＮＡミスマッチ修復機能障害を有しているかどうかを判別するための定量的方法に関する；前記ヒトから採取された診断用サンプルを準備し、前記サンプルから核抽出物を生成すること；陽性および陰性対照としてそれぞれ、ＭＭＲ能力のあるおよびＭＭＲ欠損のある核抽出物を準備すること；各核抽出物を少なくとも１つのミスマッチ含有基質のＤＮＡ分子と組み合わせること；ミスマッチ修復アッセイを実施すること；および前記サンプル核抽出物が前記基質ＤＮＡ分子を修復できるかどうかを判別すること；ここで、前記サンプルは、正常で、非悪性の構成細胞、たとえば、線維芽細胞を含む。本発明はさらに、前記方法に使用するために必要な試薬を提供するキットに関する。 配列表20140314A16333全文3 ヒト対象がＤＮＡミスマッチ修復機能障害を有しているかどうかを判別するための定量的方法であって、ａ）前記ヒト対象から得られたサンプルから核タンパク質抽出物を生成すること、ｂ）陽性および陰性対照としてそれぞれ、ＭＭＲ能力のあるおよびＭＭＲ欠損のある核タンパク質抽出物を準備すること、ｃ）個別のバイアル中で各核抽出物を少なくとも１つのミスマッチ含有ヘテロ二重鎖ＤＮＡ基質と組み合わせること、ｄ）前記サンプルおよび対照核タンパク質抽出物ならびに前記基質に対してミスマッチ修復アッセイを実施すること、ならびにｅ）前記サンプル核抽出物が前記基質ＤＮＡ分子を修復できるかどうかを判別することを含む、方法。 機能欠損を有するミスマッチ修復遺伝子を特定するための定量的方法であって、ａ）ヒト対象から得られたサンプルから核タンパク質抽出物を生成すること、ｂ）陽性および陰性対照としてそれぞれ、ＭＭＲ能力のあるおよびＭＭＲ欠損のある核タンパク質抽出物を準備すること、ｃ）少なくとも１つのＭＭＲ欠損核タンパク質抽出物を前記サンプル抽出物と混合すること、ｄ）個別のバイアル中でステップａ〜ｃにおいて準備された各核抽出物を少なくとも１つのミスマッチ含有ヘテロ二重鎖ＤＮＡ基質と組み合わせること、ｅ）前記核抽出物および前記基質に対してミスマッチ修復アッセイを実施すること、ならびにｆ）前記サンプル核抽出物が前記基質を修復でき、前記ＭＭＲ欠損核抽出物を補完できるかどうかを判別することによって前記欠損遺伝子を特定することを含む、方法。 前記サンプルは、構成組織から得られた正常な細胞を含む、請求項１または２に記載の方法。 前記正常な細胞は、線維芽細胞である、請求項３に記載の方法。 前記正常な細胞は、血液由来細胞である、請求項３に記載の方法。 前記基質は、配列番号１を有するプラスミドに由来する、請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。 前記基質は、配列番号２および配列番号３からなる群から選択される核酸配列をさらに含む、請求項６に記載の方法。 請求項２〜７の何れか１項に記載の方法を使用して欠損ＤＮＡミスマッチ修復遺伝子を特定することにより、ヒトのリンチ症候群を診断するための方法であって、前記サンプルは、ヒト対象の構成組織から得られた臨床サンプルである、方法。 請求項１〜８の何れか１項に記載の方法に使用するためのキットであって、少なくとも１つのミスマッチ含有ヘテロ二重鎖ＤＮＡ基質、少なくとも１つのＭＭＲ欠損核抽出物および陽性対照としてＭＭＲ能力のある核抽出物を含む、キット。 前記ＭＭＲ欠損核抽出物は、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６のいずれかについてのＭＭＲ欠損を有する細胞株から得た、請求項９に記載のキット。 少なくとも２つのＭＭＲ欠損核抽出物を含む、請求項１０に記載のキット。 前記ＭＭＲ欠損核抽出物は、それぞれＭＬＨ１およびＭＳＨ２／ＭＳＨ６についてのＭＭＲ欠損を有する細胞株に由来する、請求項１１に記載のキット。 前記ＭＭＲアッセイを実施するために必要な追加の試薬をさらに含む、請求項９〜１２の何れか１項に記載のキット。 ２００ｍＭのトリス−ＨＣＬ、ｐＨ７．６、４００ｍＭのＫＣｌ、５０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのグルタチオン、ＢＳＡ ５００μｇ／ｍｌ、１ｍＭの各ｄＮＴＰおよび１５ｍＭのＡＴＰを含む１０×ＭＭＲ緩衝液；ならびに４２ｍＭのＥＤＴＡ、１．２％のＳＤＳ、５０．４μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含むＭＭＲアッセイ用停止液をさらに含む、請求項１３に記載のキット。 前記サンプルを清澄にするための試薬、たとえば、ＴＥ緩衝液、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールおよびクロロホルム；前記サンプルを沈殿させるための試薬、たとえば、ＮａＣｌおよびエタノール；ならびに修復を検出するための試薬、たとえば、ＲＮａｓｅ Ａならびに緩衝液とともに制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏ３１Ｉならびにローディングダイを含む、請求項１３〜１４の何れか１項に記載のキット。A16330００１８3 本発明を導く研究は、贈与契約Ｎｏ．２３２６３５に基づき、欧州連合第７フレームワーク計画（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｕｎｉｏｎ Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ Ｐｒｏｇｒａｍ）（ＦＰ７／２００７−２０１３）からの助成金を得て行われた。 本発明の目的は、対象のＬＳ病歴または癌の予備知識なしでＭＭＲ効率の低下を検出するための正確で単純で安価な臨床的に適した試験を実現するための新規の方法および手段を提供することであり、それにより、診断法の現在の方法の課題を解決する。本発明は、ヒト対象がＤＮＡミスマッチ修復機能障害を有しているかどうかを判別するための定量的方法であって、ａ）前記ヒト対象から得られたサンプルから核抽出物を生成すること、ｂ）それぞれ陽性および陰性対照として、ＭＭＲ能力のあるおよびＭＭＲ欠損のある核タンパク質抽出物を準備すること、ｃ）個別のバイアル中で各核抽出物を少なくとも１つのミスマッチ含有ヘテロ二重鎖ＤＮＡ基質と組み合わせること、ｄ）前記サンプルおよび対照核タンパク質抽出物ならびに前記基質に対してミスマッチ修復アッセイを実施すること、ならびにｅ）前記サンプル核抽出物が前記基質ＤＮＡ分子を修復できるかどうかを判別することを含む、方法に関する。好ましくは、前記サンプルは、構成組織から得られた正常な細胞、より好ましくは、線維芽細胞または血液由来細胞を含む。A16330０１２３3 本発明によるキットは、いかなる特定のバイアルの形態または種類にも制限されない。例６に記載されるような取り扱いおよびインキュベーションに適した任意の種類のバイアル、たとえば、ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）チューブが適している。 以下に、出願当初の請求項を実施態様として付記する。 （１） ヒト対象がＤＮＡミスマッチ修復機能障害を有しているかどうかを判別するための定量的方法であって、ａ）前記ヒト対象から得られたサンプルから核タンパク質抽出物を生成すること、ｂ）陽性および陰性対照としてそれぞれ、ＭＭＲ能力のあるおよびＭＭＲ欠損のある核タンパク質抽出物を準備すること、ｃ）個別のバイアル中で各核抽出物を少なくとも１つのミスマッチ含有ヘテロ二重鎖ＤＮＡ基質と組み合わせること、ｄ）前記サンプルおよび対照核タンパク質抽出物ならびに前記基質に対してミスマッチ修復アッセイを実施すること、ならびにｅ）前記サンプル核抽出物が前記基質ＤＮＡ分子を修復できるかどうかを判別することを含む、方法。 （２） 前記サンプルは、構成組織から得られた正常な細胞を含む、（１）に記載の方法。 （３） 前記正常な細胞は、線維芽細胞である、（２）に記載の方法。 （４） 前記正常な細胞は、血液由来細胞である、（２）に記載の方法。 （５） 前記基質は、配列番号１を有するプラスミドに由来する、（１）〜（４）の何れか１項に記載の方法。 （６） 前記基質は、配列番号２および配列番号３からなる群から選択される核酸配列をさらに含む、（５）に記載の方法。 （７） 前記ＭＭＲ欠損核抽出物は、ＨＣＴ１１６およびＬｏＶｏ細胞からなる群から選択される細胞株に由来する、（１）〜（６）の何れか１項に記載の方法。 （８） バイアル当たりの核抽出物の総量は、５０〜５００μｇ、好ましくは５０〜２００μｇ、より好ましくは７５〜１００μｇの範囲である、（７）に記載の方法。 （９） 機能欠損を有するミスマッチ修復遺伝子を特定するための定量的方法であって、ａ）ヒト対象から得られたサンプルから核タンパク質抽出物を生成すること、ｂ）陽性および陰性対照としてそれぞれ、ＭＭＲ能力のあるおよびＭＭＲ欠損のある核タンパク質抽出物を準備すること、ｃ）少なくとも１つのＭＭＲ欠損核タンパク質抽出物を前記サンプル抽出物と混合すること、ｄ）個別のバイアル中でステップａ〜ｃにおいて準備された各核抽出物を少なくとも１つのミスマッチ含有ヘテロ二重鎖ＤＮＡ基質と組み合わせること、ｅ）前記核抽出物および前記基質に対してミスマッチ修復アッセイを実施すること、ならびにｆ）前記サンプル核抽出物が前記基質を修復でき、前記ＭＭＲ欠損核抽出物を補完できるかどうかを判別することによって前記欠損遺伝子を特定することを含む、方法。 （１０） 前記サンプルは、構成組織から得られた正常な細胞を含む、（９）に記載の方法。 （１１） 前記正常な細胞は、線維芽細胞である、（１０）に記載の方法。 （１２） 前記正常な細胞は、血液由来細胞である、（１０）に記載の方法。 （１３） 前記基質は、配列番号１を有するプラスミドに由来する、（９）〜（１２）の何れか１項に記載の方法。 （１４） 前記基質は、配列番号２および配列番号３からなる群から選択される核酸配列をさらに含む、（１３）に記載の方法。 （１５） 前記ＭＭＲ欠損核抽出物は、ＨＣＴ１１６およびＬｏＶｏ細胞からなる群から選択される細胞株に由来する、（９）〜（１４）の何れか１項に記載の方法。 （１６） バイアル当たりの核抽出物の総量は、５０〜５００μｇ、好ましくは５０〜２００μｇ、より好ましくは７５〜１００μｇの範囲である、（１５）に記載の方法。 （１７） （９）〜（１６）の何れか１項に記載の方法を使用して欠損ＤＮＡミスマッチ修復遺伝子を特定することにより、ヒトのリンチ症候群を診断するための方法であって、前記サンプルは、ヒト対象の構成組織から得られた臨床サンプルである、方法。 （１８） （１）〜（１７）の何れか１項に記載の方法に使用するためのキットであって、少なくとも１つのミスマッチ含有ヘテロ二重鎖ＤＮＡ基質、少なくとも１つのＭＭＲ欠損核抽出物および陽性対照としてＭＭＲ能力のある核抽出物を含む、キット。 （１９） 前記ＭＭＲ欠損核抽出物は、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６のいずれかについてのＭＭＲ欠損を有する細胞株から得た、（１８）に記載のキット。 （２０） 少なくとも２つのＭＭＲ欠損核抽出物を含む、（１９）に記載のキット。 （２１） 前記ＭＭＲ欠損核抽出物は、それぞれＭＬＨ１およびＭＳＨ２／ＭＳＨ６についてのＭＭＲ欠損を有する細胞株に由来する、（２０）に記載のキット。 （２２） 前記ＭＭＲ欠損核抽出物は、それぞれＨＣＴ１１６およびＬｏＶｏ細胞に由来する、（１８ょ〜（２１）の何れか１項に記載のキット。 （２３） 前記ＭＭＲアッセイを実施するために必要な追加の試薬をさらに含む、（１８）〜（２２）の何れか１項に記載のキット。 （２４） ２００ｍＭのトリス−ＨＣＬ、ｐＨ７．６、４００ｍＭのＫＣｌ、５０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのグルタチオン、ＢＳＡ ５００μｇ／ｍｌ、１ｍＭの各ｄＮＴＰおよび１５ｍＭのＡＴＰを含む１０×ＭＭＲ緩衝液；ならびに４２ｍＭのＥＤＴＡ、１．２％のＳＤＳ、５０．４μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含むＭＭＲアッセイ用停止液をさらに含む、（２３）に記載のキット。 （２５） 前記サンプルを清澄にするための試薬、たとえば、ＴＥ緩衝液、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールおよびクロロホルム；前記サンプルを沈殿させるための試薬、たとえば、ＮａＣｌおよびエタノール；ならびに修復を検出するための試薬、たとえば、ＲＮａｓｅ Ａならびに緩衝液とともに制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏ３１Ｉならびにローディングダイを含む、（２３）〜（２４）の何れか１項に記載のキット。