生命科学関連特許情報
| タイトル： | 特許公報(B1)_乳酸菌の製造方法 |
| 出願番号： | 2014161001 |
| 年次： | 2015 |
| IPC分類： | C12N 1/20,A61K 35/74,A61P 37/08,A61P 43/00,A61P 39/02 |
特許情報キャッシュ
福永 肇 江崎 孝行 JP 5778325 特許公報(B1) 20150717 2014161001 20140807 乳酸菌の製造方法 国立大学法人岐阜大学 304019399 小山 有 100085257 福永 肇 江崎 孝行 20150916 C12N 1/20 20060101AFI20150827BHJP A61K 35/74 20150101ALN20150827BHJP A61P 37/08 20060101ALN20150827BHJP A61P 43/00 20060101ALN20150827BHJP A61P 39/02 20060101ALN20150827BHJP JPC12N1/20 AC12N1/20 EA61K35/74 AA61P37/08A61P43/00 111A61P39/02 Ｃ１２Ｎ １／００−７／０８ ＪＳＴＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ） ＰｕｂＭｅｄ Ｇｏｏｇｌｅ Ｓｃｈｏｌａｒ 特開２００４−０２６７２９（ＪＰ，Ａ） 特開２００６−１０９７６１（ＪＰ，Ａ） 国際公開第２００６／０７３１４５（ＷＯ，Ａ１） 特開２０１２−２２９２５８（ＪＰ，Ａ） 特許第５４２０７９１（ＪＰ，Ｂ２） Clin. Exp. Allergy (2002) Vol.32, pp.563-570 Allergy (2012) Vol.67, pp.343-352 Vet. Med.-Czech (2002) Vol.47, No.6, pp.169-180 化学と生物（2012）Vol.50, No.3. pp.182-187 Geun Eog Ji，Probiotics in Primary Prevention of Atopic Dermatitis，Yoshikawa T (ed): Food Factors for Health Promotion. Forum Nutr. Basel, Karger，２００９年，Vol.61，pp.117-128 モダンメディア（2011）Vol.57, No.10, pp.277-287 1 17 20150407 大久保 智之 本発明はＭ細胞に侵入することで免疫機能を改善する乳酸菌の製造方法に関する。 小腸の内側の粘膜固有層にリンパ小節が平板状に集合したパイエル板と呼ばれるリンパ組織がある。このパイエル板の一部で繊毛が未発達の領域に免疫に関して重要な働きをするＭ細胞（Microfold cell）が存在する。このＭ細胞は特殊に分化した腸管の上皮組織の一部と考えられ、腸管内腔側からエンドサイトーシスによって細菌（抗原）を取込み、基底膜（バソラテラル）側で接しているＴ細胞、Ｂ細胞或いはマクロファージに抗原を提示する。 特許文献１には、ＧＰ２がＭ細胞、特にヒトＭ細胞に特異的に発現しており、このＧＰ２をＭ細胞のマーカーとして使用することが提案されている。特許文献２には、ガレクチン−９が免疫細胞に作用し、免疫を抑制する方向に制御し過剰な炎症を抑える機能を有していることが記載されている。 特許文献３には、ＧＰ２とガレクチン−９の関連性について検証し、Ｍ細胞中のＧＰ２をタイトジャンクションに移動させることでシート形成能が発揮され、同時にＭ細胞はアレルゲンや細菌と結合するガレクチン−９を発現するという知見を得、これに基づき、Ｍ細胞を培養することでシート状の人工皮膚とすることを提案している。 特許文献４には、サルモネラ菌のワクチン株として使われる無害化されたサルモネラ菌（Ty21a)等が知られている。サルモネラ菌（Ty21a)はサルモネラ菌（Ty2)から突然変異（vi抗原の欠損,galE遺伝子の変異）したものであり、Ｍ細胞の機能を強化することが記載されている。 非特許文献１には、乳酸菌（Ｒ２１）のアレルギー抑制機能の報告がなされている。 非特許文献２には、乳酸菌（シロタ株）のアレルギー抑制機能の報告がなされている。 非特許文献３には、アレルギー疾患で増加するIgE抗体とガレクチン-９が結合することについて述べている。 非特許文献４には、乳酸菌とオリゴ糖によりガレクチン-９を増加させ、アレルギー反応を抑制させることについて述べている。特開２００８−１４１９９５号公報ＷＯ２０１２／０７７８１１特許第５１９７８８０号公報特許第５４２０７９１号公報Lactobacillus acidophilus strain L-92 induces CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells and suppresses allergic contact dermatitis. Mohammad Monir Shah et al. Biological and Pharmaceutical BulletinVol. 35 (2012) No. 4 P 612-616.Lactobacillus casei strain Shirota suppresses serum immunoglobulin E and immunoglobulin G1 responses and systemic anaphylaxis in a food allergy model. Shida K et al. Clin Exp Allergy. 2002 Apr;32(4):563-70.Galectin-9 Is a High Affinity IgE-binding Lectin with Anti-allergic Effect by Blocking IgE-Antigen Complex Formation; Toshiro Niki,; Shoko Tsutsui,; Shigeru Hirose,; Sachiko Aradono‡,; Yasushi Sugimoto; Keisuke Takeshita,; Nozomu Nishi and; Mitsuomi Hirashima. J Biol Chemv.284(47); Nov 20, 2009Galectin-9 Induced by Dietary Synbiotics Is Involved in Suppression of Allergic Symptoms in Mice and Humans.S de Kivit, E Saeland, AD Kraneveld. Allergy. 2012;67(3):343-352 上述した先行技術文献から以下のことが判明又は予測されている。（１）Ｍ細胞は粘膜免疫に関する重要な働きをしている。 （２）乳酸菌には免疫調整機能があることが知られているが、どのような成分が免疫に作用するかは不明である。尚、非特許文献４からは乳酸菌によってガレクチン‐９が増加し、アレルギー反応が抑制されることが分かっているが、どのような形態の乳酸菌が有効かについては何ら開示されていない。（３）ガレクチン−９はアレルギー抗体であるIgEに結合することができる。一方、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎、ぜんそく、鼻炎などは、造血幹細胞に由来するマスト細胞表面や腸管粘膜表面に存在しているIgE抗体にアレルゲンが結合し、ヒスタミン等の化学伝達物質を放出することによって発症する。ここで、前記ガレクチン−９は、IgE抗体を中和し、ヒスタミンの遊離を阻止することで、アレルギー症状を緩和していることが予測される。またＭ細胞におけるガレクチン−９の発現を増強すれば、アレルギーに対して有効であることも予測できる。Ｍ細胞内にガレクチン−９を増加させることは特許文献で記載されているが、増加したガレクチン−９をどのようにしてアレルギー症状の改善、予防を行えるようにするかは、何れの先行技術にも示唆されていない。 本発明者は実験によって以下の知見を得た。 （１） 乳酸菌をグルコースやガラクトースなどの糖を含まない液体培地で培養すると乳酸菌の形態が変化した。この形態変化として菌体の長さが長くなる（フィラメント化）現象が観察された。一方、培養温度を４８℃以下にするとフィラメント化が促進された。フィラメントに変化した乳酸菌にはガレクチン-９が結合することが観察された。(フィラメント乳酸菌) （２） フィラメント乳酸菌はガレクチン−９が発現しているシート状Ｍ細胞への侵入が観察された。 （３） 試験管内でガレクチン−９を結合させたフィラメント乳酸菌と既定量のIgE抗体を反応させると、試験管の中のIgEが減少した。 （４） OVAで感作したマウス・パイエル板Ｍ細胞にはガレクチン-9とＧＰ２が発現していた。 （５） フィラメント乳酸菌をマウスに３週間経口投与したところ血中IgEが半減した。 上記の知見に基づき本発明をなすに至った。即ち、請求項１に係る発明は上記の知見に基づきなしたものである。即ち、Ｍ細胞シートを通過することでＭ細胞内に発現しているガレクチン−９を吸収結合するフィラメント乳酸菌またはＭ細胞シートを通過するフィラメント乳酸菌を用途とした発明である。 また本発明者は（３）及び（５）の実験により以下の知見も得た。 ガレクチン−９が結合したフィラメント乳酸菌にIgE抗体が結合する能力があるかを測定した。 フィラメント乳酸菌にガレクチン−９を結合させることが可能であり、ガレクチン−９が結合したフィラメント乳酸菌はIgEを吸着結合し、マウスの血中IgE抗体を低下させた。 請求項２に係る発明は、上記ガレクチン-9結合可能なフィラメント乳酸菌を培養する条件を規定したものであり、好ましくはフィラメント形態の乳酸菌は糖を含まない培地で４８℃以下の培養温度で培養される。 本発明者の知見からフィラメント乳酸菌はＭ細胞に発現しているガレクチン-9に結合する。遺伝子組換えや化学物質を用いて作成するのではなく、培地からグルコースやガラクトースなどの糖類を除去し、４８℃以下の高温で培養することで作成されたものである。したがって、安全性は極めて高い。 本発明に係るフィラメント乳酸菌は、経口投与することで、Ｍ細胞に侵入してＭ細胞内のガレクチン‐９を菌体表面に結合する。 ガレクチン‐９を例にとるとＭ細胞で産生されたガレクチン‐９はＭ細胞を通過する細菌や消化食物に結合し、免疫寛容を誘導する。またＭ細胞ポケット（Ｍ細胞の窪みに免疫細胞が集積している特殊な構造）で分泌されたガレクチン‐９は、IgE抗体に結合して不活性化し、その結果、食物アレルギーやアトピー性疾患が改善される。 また、新生児の腸管には母親の産道に由来する乳酸菌が生誕後すぐに定着することが知られている。また、母乳に含まれている特殊な糖は乳酸菌のみが菌体に取り込み利用し、他の細菌では利用することができないことが知られている。このように乳酸菌は我々の生命の営みの中に組み込まれ、我々が気づかないうちに乳酸菌が利用されている。世界中で多くの乳酸菌研究がなされているが具体的な作用を示すには至っていない。また、多くの乳酸菌サプリメントが発売されているが具体的な効用を示した製品はない。このことは乳酸菌の効用は乳酸菌単独の影響ではなく、生体との共同での作用が結果的に効果を引き起こしているものと考えることができる。 また、Ｍ細胞内のガレクチン‐９が結合し、Ｍ細胞を通過したフィラメント乳酸菌は、Ｍ細胞近傍に存在するIgE抗体と結合すると考えられる。マウスを用いた投与実験では血中レベルのIgEが減少していることが確認された。本願発明の概要を説明した図左上写真は無害化されたサルモネラ菌（Ty21a) の赤色蛍光写真。中上写真は病原性のサルモネラ菌（Ty2)の赤色蛍光写真。 右上写真は乳酸菌と結合したガレクチン‐９の赤色蛍光写真。 左下図は赤色蛍光結合Ty21aのフローサイトメーターでの分析 右下図は赤色蛍光結合フィラメント乳酸菌のフローサイトメーターでの分析（ａ）は糖類を含まない液体培地(MH培地)で37℃培養したフィラメント乳酸菌の顕微鏡写真 （ｂ）は糖類を含まない液体培地（LCM培地）で44℃培養したフィラメント乳酸菌の顕微鏡写真 （ｃ）は糖類を含む培地（MRS培地）で３７℃培養した乳酸菌の顕微鏡写真本発明に係る乳酸菌を３０℃から５０℃培養（LCM培地）した顕微鏡写真乳酸菌及び大腸菌（E.coli）のシート状Ｍ細胞の侵入状態を説明した図（２時間）Transwell（登録商標）で作成されたＭ細胞シート下層内においてＭ細胞内のガレクチン‐９を吸着結合したフィラメント乳酸菌（48℃、LCM培地）を経時的にフローサイトメーターで分析した図。ガレクチン‐９結合フィラメント乳酸菌のＩｇＥ抗体吸着能を検証した図。動物実験での結果を示した図。 先ず、本発明の概要は、図１に示すように、経口摂取したフィラメント状乳酸菌がＭ細胞に接触し、そのうちのいくつかのフィラメント乳酸菌は Ｍ細胞を通過し、通過する間にＭ細胞中のガレクチン−９を吸着結合する。 このガレクチン−９が結合したフィラメント乳酸菌には図１に示すようにIgE抗体が吸着される。IgE抗体が減少することで、アレルギー症状が緩和される。 次に、個々の操作について詳細に述べる。乳酸菌の鑑別 乳酸菌を他の菌種から鑑別する必要があり、以下の方法を用いて同定を行った。（市販の細菌同定キットによる鑑別） 細菌を鑑別するために多くの市販キットが入手可能である。具体的にはアピ50ＣＨＩ（ビオメリュージャパン、東京）を用いて同定を行った。５０個のプラスチック・ウェルに細菌が分解する可能性のある基質（糖やタンパク質）もしくは菌が合成する可能性があるアミノ酸を検出する試薬をあらかじめウェルに加え乾燥されたものがキットとして用意されている。 目的の細菌が発育可能な寒天培地に接種し、３７℃の培養器で４８時間培養する。発育してきた細菌はコロニー（肉眼で確認できる菌の塊）を形成している。 上記のコロニーの一部を滅菌綿棒で掻き取り、キットに添付されている５ｍｌの生理食塩水容器に均一な細菌の混濁液を作成し、２０個のプラスチック・ウェルに流し込む。２０個のプラスチック・ウェルは１枚のプラスチック・トレイに固定されているため、取り扱いが容易であるように設計されている。このトレイを３７℃の培養器で１８時間培養する。目的とする細菌により利用・分解するパターンが異なっている。このキットを用いて乳酸菌の一種と同定した。ガレクチン-９のサルモネラ菌との結合性 具体的には、ガレクチン‐９遺伝子組み換え体（R&D,USA）を滅菌蒸留水１ｍｌに溶解させ、プロテイン蛍光ラベルキット（モレキュラープローブ、USA）を用いて蛍光色素であるAlexa 594をガレクチン‐９に結合させる。添付の蛍光色素含有チューブに溶解したガレクチン‐９溶液を加え、４℃で1時間、転倒混和させる。この溶液に添付の緩衝溶液を５００ｍｌ加え、蛍光色素結合ガレクチン‐９とした。糖類を含まない培地で培養し、対数増幅期に達した乳酸菌の一部を取り出し、滅菌リン酸緩衝液（PBS）を用いて１０７ CFU/ｍｌの濃度に調整（CFUは菌の数の単位）した。蛍光色素結合ガレクチン‐９の５０μｌを調整した菌液１ｍｌに加え、４℃で４８時間、転倒混和させる。この一部をコラーゲン固定した共焦点顕微鏡用カバーグラスにとり、乾燥させた後、共焦点顕微鏡で観察した。同様に,サルモネラ菌ワクチン株（Ty21a）サルモネラ菌（Ty2）を観察した。 図２に示すように、サルモネラ菌ワクチン株（Ty21a）はVi抗原が欠損しているため、ガレクチン‐９が結合できず染色されていないため暗く写っている。一方、 サルモネラ・チフス菌（Ty2）は表面にVi抗原からなるガラクトースポリマーが形成されており、このガラクトースポリマーがガレクチン‐９の結合によって赤色に染色されている。ガレクチン−９を結合可能な乳酸菌 乳酸菌の一般的な形状は図３（ｃ）に示すような桿菌であるが、図３(ａ)、図（ｂ）に示すフィラメント状の乳酸菌にすることで、ガレクチン‐９が結合可能なフィラメント乳酸菌とすることができる。 ガレクチン−９を結合できるフィラメント状の乳酸菌を２つの方法で作成した。 ・ 糖類を含まない液体培地（MH培地）を用いて３７℃で培養する。 ・ 糖類を含まない液体培地（LCM培地）を用いて４８℃までの高温で培養する。 ・ においては乳酸菌の発育が遅く、ガレクチン−９の結合割合は７０％ぐらいである（図２）。 ・ においては４８℃でも発育するが、発育できる菌量が減少する。図４に示すように、４４℃の培養条件で最長の長さのフィラメンタ状の乳酸菌になった。ガレクチン−９を結合した乳酸菌 遺伝子組み換えした組換え体のガレクチン-9（Ｒ＆Ｄ；ＵＳＡ）を滅菌蒸留水１ｍｌに溶解させる。（100μg/ml） 滅菌リン酸緩衝液（PBS）を用いて１０７ CFU/ｍｌの濃度に調整した上記記載の乳酸菌の菌液１ｍｌに調整したガラクチン−９溶液５０μlを加え、４℃、２０時間、振盪混和させる。 Ｍ細胞に侵入した乳酸菌の検出 次に、本発明に係る乳酸菌のＭ細胞に対する侵入に関して、ガレクチン-9結合フィラメント乳酸菌、フィラメント乳酸菌、糖を含む液体培地で培養した乳酸菌及び陰性対象として大腸菌（E. coli）と比較した。 尚、実験にはシート状Ｍ細胞を用いた。このシート状Ｍ細胞は本発明者が開発したもので、以下の手順によって作製する。 先ず、Ｍ細胞をTranswell（登録商標）のフィルター上に培養する。この培養は、先ずＭ細胞の濃度を8×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌに調整し、培養容器４ｃｍ２に対し２ｍｌの割合で細胞溶液をTranswellのフィルター上に加えた。上層及び下層には２０％ウシ胎児血清を含んだ細胞培養溶液を加えた。当初４日目に上下層の細胞培養溶液を新しい溶液を交換し、次の４日目に再度、細胞培養溶液を交換した。更に２日後にM細胞がフィルター面いっぱいに増えていることを確認した。Ｍ細胞が培養容器全面に広がった時点で、上下層の細胞培養溶液を血清成分がない細胞培養液に交換し、下層には抗ＬＴβＲ抗体２０μｌを添加した。この抗ＬＴβＲ抗体の刺激により、細胞内のＧＰ２が細胞間接着部（タイトジャンクション）に移動し、細胞同士の結合が強固になる。２日後に培養液を交換、以降２日毎に細胞培養液を交換し６日後にＭ細胞シートが完成した。 Ｍ細胞内に侵入した細菌数を定量する方法として以下の方法を実施した。菌液を５０μｌ加え、３７℃、５％炭酸ガスの培養器に2時間静置した。Transwellを３７℃に加温した血清成分のない細胞培養溶液で其々のウエルの上下層を３回洗浄し、添加した余分の細菌を除去した。更に血清成分のない細胞培養溶で抗生物質ゲンタマイシン２５０μｇ/ｍｌ濃度溶液を作成し、Transwellの上下層にそれぞれ２ｍｌを加え、３７℃、５％炭酸ガスの培養器で２時間静置した。 これによりＭ細胞周辺の余分な細菌が殺菌され、Ｍ細胞に侵入した乳酸菌だけを検出できる。（抗生物質ゲンタマイシンは細胞に取り込まれない性質がある。この性質を利用し、細胞侵入性細菌を定量検出することができる。 ２時間後、細胞周辺のゲンタマイシンを滅菌PBSで３回洗浄する。細胞内に生きている細菌を取り出すため、界面活性剤Triton-X 100 0.1％溶液でＭ細胞を溶解させ、細菌を回収。滅菌PBSで希釈系列を作成し、MRS寒天培地に接種した。３７℃の５%炭酸ガス培養器内に４８時間静置。発育してきた細菌のコロニーをカウントし、希釈倍率を加味して、Ｍ細胞内に侵入した細菌を定量検出した。 結果を図５に示した。この図５から、乳酸菌は２時間でシート状Ｍ細胞に侵入できないが、フィラメント状になると乳酸菌はＭ細胞に侵入できることがわかる。 また、ガレクチン‐９が結合したフィラメント乳酸菌はガレクチン‐９が結合していないフィラメント乳酸菌と比較するとＭ細胞侵入能は低下するが、対照の糖を含む液体培地で発育した乳酸菌と比較して十分なＭ細胞侵入能を有している。 MH培地で３７℃培養（上段）、ＬＭＣ培地で４４℃培養（下段）したフィラメント乳酸菌のＭ細胞に侵入したフィラメント乳酸菌の数（ＣＦＵ／ｍｌ）。Ｍ細胞シートを通過した乳酸菌の検出 Transwell のフィルター上にＭ細胞シートを作成した。シートに隙間が開いていないかを確認するため細胞間抵抗測定装置（Millicell; Millipore）を用いて電気抵抗を測定した。電気抵抗値が200Ω・cm2 以上であることを確認することでシートに隙間が無いと判断した。このＭ細胞シートを形成したTranswellの上層からフィラメント乳酸菌を加えた。加えた時間から２時間後、Transwellの下層の培養液を回収した。回収液に含まれているフィラメント乳酸菌を計数した。 同時に再度、Ｍ細胞シートの電気抵抗を測定し、変化の無いことを確認した。このことより、検出されたフィラメント乳酸菌はＭ細胞内を通過してきたと断定した。 対数増幅期の乳酸菌及び陰性コントロールとして大腸菌(E. coli)を１０７CFU/mlに調整し、それぞれを別のＭ細胞シートが形成されたウエルの上層に菌液を５０μl加えた。３７℃、５％炭酸ガスの培養器に静置。滅菌ピペットで下層の培養溶液を回収。滅菌PBSで希釈系列を作成し、ＭＲＳ寒天培地に接種。３７℃の恒温培養器内に４８時間静置した。発育してきた細菌のコロニーをカウントし、希釈倍率を加味して、Ｍ細胞内を通過した細菌を定量検出した。Ｍ細胞シートを通過した乳酸菌に結合したガレクチン-9の検出 Ｍ細胞シートを通過してきた乳酸菌にＭ細胞内のガレクチン-９が結合したかを測定するためフローサイトメーター（MC800: SONY ）を使用した。Ｍ細胞シートの下層から回収した溶液２mlに蛍光標識した抗ガレクチン-9抗体を５０μｌ加え反応させた。２時間後サンプル（２ｈ）、１０時間後サンプル（１０h）、２４時間後サンプル(２４h)とした。Ｍ細胞シートを通過させていない乳酸菌を陰性コントロール。横軸は蛍光の強さ、縦軸はその蛍光を示したフィラメント乳酸菌の数を示している（図6）。乳酸菌は糖を含まない培地（LCM培地）で４８℃の培養条件で２４時間培養したものを用いた。ガレクチン-9を結合した乳酸菌へのIgE抗体の結合能力 市販のIgE抗体（100ng/ml）（シバヤギ）をリン酸緩衝液で希釈し、25ng/mlの濃度溶液を作成した。抗体溶液60μlにガレクチン-9結合乳酸菌10μｌ（106個）を加え、２時間室温に静置。その後、遠心機で遠心（3000rpm 10分間、４℃）、乳酸菌に結合したIgE抗体と結合していないIgE抗体を分離した。乳酸菌に結合したIgE抗体は沈渣として回収され、結合していないIgE抗体は上清中に残ったままであるが、沈渣として回収された分だけ減少している。この減少分をELISA法で検出した（図７）。動物実験OVA感作マウス 生後3週目になったBALB/cマウス（メス）を購入（中部科学資材）。ＳＰＦ（無菌動物飼育施設）に搬入。１週間その環境に順化させた。その後、Ｐ２レベル実験室に移動させた。カプセル化したＯＶＡ1gとアジュバンドとしてコレラトキシンBサブユニット2μｇ/ｍｌを週一回同時投与し、５週間感作した。その後、カプセルに封入したフィラメント乳酸菌（３７℃）を３週間、食餌として一日一回与えた。カプセルには乳酸菌が１０５個を含んでいる。採血後マウスを解剖し、パイエル板、肝臓、脾臓を10％緩衝ホルマリン液で４８時間固定し、パラフィン包埋後、薄切切片を作成した。薄切切片をキシレン、アルコールで脱パラフィンを行い、抗マウス・ガレクチン-9ラット抗体（Biolegend, USA）、抗マウスＧＰ２ラビット抗体（ＢＭＬ、東京）を一次抗体、２次抗体としてAlexa 594ラベル抗ラット抗体、Alexa 488ラベル抗ラビット抗体を用いて蛍光免疫染色を実施した。核染色としてHoechist 33258(Invitrogen, USA)を用いて染色した。 結果を図８上段に示す。OVAで感作されたマウスのパイエル板にガレクチン-9（赤色）が発現し、ＧＰ２を発現している細胞（緑色）においてもガレクチン-9の発現が認められている。ＧＰ２はＭ細胞のマーカーとして知られていることからＭ細胞を通過したフィラメント乳酸菌にガレクチン-9が結合したこと推察される。 フィラメント乳酸菌を投与した場合（図左）のガレクチン-9の発現がフィラメント乳酸菌投与しない陰性コントロール（図中）に比べ減少していた。アレルギーモデルマウス OVAに対するIgE抗体を持続的に作るOVA-IgEマウスを購入（日本クレア：東京）。生後６週目になったメスをＳＰＦ（無菌動物飼育施設）に搬入。１週間その環境に順化させた。その後、Ｐ２レベル実験室に移動させ、カプセルに封入したフィラメント乳酸菌（３７℃）を３週間、食餌として一日一回与えた（３匹）。カプセル１ｇには乳酸菌が１０５個を含んでいる。 フィラメント乳酸菌投与を３週間行った後、採血を行い血清中のOVAに対するIgE抗体を測定した（乳酸菌を投与しなかったマウスからも採血し、投与群と比較した）。 投与しなかったマウス（３匹）の平均OVA特異的ＩｇＥを100％とした場合、フィラメント乳酸菌を投与したマウス（３匹）平均OVA特異的ＩｇＥでは22.8％のＩｇＥであった。 本発明に係る乳酸菌は、その用途をＭ細胞に発現しているガレクチン−９を結合し、更にガレクチン−９にアレルギー抗体であるIgEが結合することで、今までに想定することができなかったアレルギー疾患のIgE抗体を減少させる効果を発揮する。したがって、食物アレルギーやアトピー性皮膚炎などの治療法の開発が可能となる。 乳酸菌を糖を含まない培地で３７℃以上４８℃以下の培養温度で培養することで、Ｍ細胞（Microfold cell）に侵入可能で、ガレクチン-９が結合可能で且つＭ細胞通過後にアレルギー抗体であるＩｇＥ抗体を吸収結合する能力を有するフィラメント形態の乳酸菌を得ることを特徴とする乳酸菌の製造方法。【課題】 食物アレルギーなどのアレルギーを引き起こすIgE抗体を減少させることにより、食物アレルギーの症状を改善させるための乳酸菌を提供する。【解決手段】 Ｍ細胞に侵入可能な乳酸菌であり、さらにフィラメント化することによりガレクチン−９が結合することが可能となり、Ｍ細胞を通過することによりＭ細胞に発現しているガレクチン−９がフィラメント乳酸菌に結合する。更にガレクチン−９結合フィラメント乳酸菌がIgE抗体を結合できる形態にする。【選択図】 図１