生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公開特許公報(A)_分析用生物試料の作製方法及び作製用治具 |
| 出願番号： | 2014101792 |
| 年次： | 2015 |
| IPC分類： | G01N 1/28,G01N 21/35,G01N 21/01 |
特許情報キャッシュ
須田 廣美 伊藤 哲平 JP 2015210261 公開特許公報(A) 20151124 2014101792 20140424 分析用生物試料の作製方法及び作製用治具 学校法人千歳科学技術大学 506056871 須田 廣美 伊藤 哲平 G01N 1/28 20060101AFI20151027BHJP G01N 21/35 20140101ALI20151027BHJP G01N 21/01 20060101ALI20151027BHJP JPG01N1/28 JG01N21/35 ZG01N21/01 B 12 1 書面 8 2G052 2G059 2G052AA28 2G052AD32 2G052AD52 2G052DA07 2G052DA33 2G052EC03 2G052FA03 2G052GA11 2G052JA04 2G052JA11 2G052JA16 2G059AA01 2G059AA06 2G059BB12 2G059CC16 2G059DD01 2G059DD13 2G059EE01 2G059EE03 2G059EE12 2G059HH01 2G059HH06 本発明は、生物試料を分析するための分析用試料の作製方法、及び、そのような分析用試料を作製するための治具に関する。特に、本発明は、定量的な分光分析に好適に使用し得る分析用生物試料の作製方法及び作製用治具に関する。 動物の骨や歯などの生物試料を様々な目的及び手法で分析することが、生命科学あるいは医学の分野で広く行われている。例えば、骨の健康状態を判断するために、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）などの赤外分光法、レーザーラマン分光法などのラマン分光法といった分光分析法を用いて、骨の試料を分析して、骨構造や石灰化度、マイクロダメージなどの骨質を評価することが行われる。 分析用生物試料を作製する方法として、従来、骨などの生物試料をアルコールで固定し、これをポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）などの樹脂で包埋し、包埋された状態の生物試料をミクロトームでスライスして、透過法による赤外分光分析用の薄片試料を作製することなどが行われていた（非特許文献１）。 一方、化学薬品により固定処理がされていない生物試料を作製する方法としては、生物試料を水溶性包埋剤で凍結包埋し、これを切削して凍結切片を作製する方法がある。特開２００２−０３１５８６号公報（特許文献１）には、水溶性包埋剤で凍結包埋した生物試料を生物組織凍結薄切装置の試料台に固定し、凍結切片支持材として試料の所定面に粘着剤を塗布したプラスチックフィルムを貼り付け、プラスチックフィルムが貼り付いた試料を所定の刃物により、プラスチックフィルムが貼り付いた状態で、所定の厚さに薄切する生物組織凍結薄切方法が開示されている。 特開２００２−０３１５８６号公報 「腎と骨代謝」第２２巻第３号第２０７〜２１４頁（２００９年） しかしながら、分析用生物試料をアルコールなどで固定したうえで樹脂で包埋する従来法により分析用生物試料を作製した場合には、試料や分析結果であるスペクトルに対する固定用試薬及び包埋剤の影響を考慮する必要がある。また、包埋剤が試料の細部まで行き渡るようにするため、長時間をかけて撹拌しながら包埋を行い、さらに、包埋剤を重合させるために包埋した試料をインキュベートする必要があるなど、試料作製に長時間を要していた。 一方、プラスチックフィルムが貼り付いた状態で試料を薄切する生物組織凍結薄切法による場合には、試薬等による試料やスペクトルに対する影響は少ないものの、プラスチックフィルムによって試料を支持しながら薄切する必要がある。このため、プラスチックフィルムが相当程度の厚みを有するものでなければならず、得られる試料が厚いものとなるため、光学顕微鏡観察には利用できるにしても、透過による定量的な分光分析に使用するのは難しい。同様の理由から、この手法では、プラスチックフィルムとしてポリ塩化ビニリデンフィルムのようなものを用いる必要があるが、ポリ塩化ビニリデンフィルムは、指紋領域にシグナルを有するものである点で、分光分析には適さない。 本発明は、これら従来技術の課題を解決して、定量的な分光分析に使用して精度の高い測定結果を得ることが可能であり、しかも安価にかつ短時間で分析用生物試料を作製することが可能な、分析用生物試料の作製方法及び作製用治具を提供することを目的とするものである。 すなわち、本発明は、生物試料を分析するための分析用試料の作製方法であって、プラスチックフィルムを用意する工程、前記プラスチックフィルムを治具に固定する工程、前記治具に固定されたプラスチックフィルムに、粘着剤を塗布する工程、前記プラスチックフィルムに塗布した前記粘着剤の上に、凍結処理した生物試料を載置する工程を含み、前記生物試料が骨であり、前記プラスチックフィルムの厚さが１０μｍ未満であることを特徴とする。 本発明の方法において、前記治具は、円形部品と、該円形部品の外周にはめ込むことのできる環状部品とを含み、前記プラスチックフィルムを前記円形部品に載置した後、該円形部品に前記環状部品をはめ込むことにより、前記プラスチックフィルムを前記治具に固定するものであるのが好ましい。 また、前記プラスチックフィルムはポリプロピレンフィルムであるのが好ましい。 さらに、本発明の方法では、前記粘着剤を前記プラスチックフィルムにスピンコーティングすることにより塗布することができる。 また、前記治具はポリテトラフルオロエチレン製であるのが好ましい。 本発明の方法において、前記分析は分光分析であるのが好適である。 本発明はまた、生物試料を分析するための分析用試料を作製するための治具であって、厚さが１０μｍ未満のプラスチックフィルムを固定することにより、固定された該プラスチックフィルムに粘着剤を塗布し、該粘着剤の上に凍結処理した骨である生物試料を載置することができるように構成されているものである。 本発明の治具は、円形部品と、該円形部品の外周にはめ込むことのできる環状部品とを含み、前記プラスチックフィルムを前記円形部品に載置した後、該円形部品に前記環状部品をはめ込むことにより、前記プラスチックフィルムを固定するものであるのが好ましい。 また、前記プラスチックフィルムはポリプロピレンフィルムであるのが好ましい。 さらに、本発明の治具では、前記粘着剤を前記プラスチックフィルムにスピンコーティングすることにより塗布することができる。 また、本発明の治具はポリテトラフルオロエチレン製であるのが好ましい。 本発明の治具の場合、前記分析が分光分析であるのが好適である。 本発明によれば、従来法とは異なり、分析用生物試料をアルコールなどで固定し樹脂で包埋する従来法とは異なり、固定用試薬及び包埋剤の試料やスペクトルに対する影響を考慮する必要がなく。また短時間で試料を作製することができる。 さらに、透過による定量的な分光分析に好適に使用することが可能な、薄くてしかも指紋領域にシグナルを有しない試料を作製することができる。 本発明の分析用生物試料の作製用治具の一態様の構成を示す概略図である。本発明の一態様で使用するプラスチックフィルム（ポリプロピレンフィルム）の赤外スペクトルである。本発明の一態様で使用する粘着剤の赤外スペクトルである。本発明の一態様で作製された分析用試料の赤外スペクトルである。比較例の分析試料（実線）及びＰＭＭＡ（破線）の赤外スペクトルである。 以下、図面を参照しつつ、本発明を実施するための形態について説明する。 図１は、本発明の分析用生物試料の作製用治具の一態様の構成を示す概略図である。 この構成では、本発明の治具１は、円形部品２と、円形部品２の外周にはめ込むことのできる環状部品３とを含む。円形部品２に厚さが１０μｍ未満のプラスチックフィルム４を載置した後、円形部品２に環状部品３をはめ込むことにより、プラスチックフィルムを固定することができる。固定されたプラスチックフィルム４に粘着剤を塗布し、粘着剤の上に凍結処理した骨である生物試料を載置することができる。 本発明の治具を構成する部品の組合せは、一方に他方をはめ込むことによってプラスチックフィルムを固定することができるようなものであれば、上記円形−環状の組合せに限定されず、はめ合わせ部分の形状が四角形状あるいは楕円形状など、他の形状のものであってもよい。プラスチックフィルムを均等に引っ張ることを容易にする観点から、形状は円形であるのが望ましい。 本発明の治具を構成する部品の寸法は、コストの観点からできるだけ小さくするのが望ましいが、円形部品２を環状部品３から押しだす際、両手の親指で押せる幅を確保できる程度の寸法、具体的には、円形部品２の外径あるいは環状部品３の内径を３０ｍｍ〜５０ｍｍ程度とするのが好ましい。 本発明の治具に使用するプラスチックフィルムは、治具を用いて作成した分析用生物試料を透過による定量的な分光分析に好適に使用することが可能となるように、１０μｍ未満の厚さを有する。プラスチックフィルムの厚さは、分析精度への影響などの観点から、７μｍ以下、さらには５μｍ以下であるのが好ましい。 本発明の治具に使用するプラスチックフィルムとしては、ポリエチレンフィルム、ポリプロピレンフィルムなど、オレフィン系ポリマーのフィルムを好適に使用することができる。分光分析のスペクトルに対する影響が少ないこと、安価であることなどから、ポリプロピレンフィルムを使用するのが好ましい。 本発明の治具において、粘着剤をプラスチックフィルムに塗布する方法としては、特に制限はなく、任意の従来の方法を採用することが可能であるが、粘着剤を薄く均一に塗布することができることなどから、粘着剤をスピンコーティングすることによりプラスチックフィルムに塗布するのが好ましい。 また、粘着剤としては、分光分析のスペクトルに対する影響が少ないものを使用するのが望ましく、アクリル系粘着剤を好適に使用することができる。 本発明の治具は、プラスチックや金属など、任意の材料を用いて製造することが可能であるが、プラスチックフィルムとの相性を考慮して、プラスチック製とするのが望ましく、寸法安定性などの観点から、ポリテトラフルオロエチレン製とするのが特に好ましい。 本発明の治具を用いて作成した分析用生物試料は、赤外分光法やラマン分光法などの分光分析、特に定量的な分光分析に好適に使用することができる。 本発明の治具を用いて分析用生物試料を作製するのに使用する凍結処理した骨である生物試料は、従来の方法に従って準備されたものでよい。例えば、骨と凍結用包埋剤とを容器に入れ、急速冷凍した後、ブロック状の凍結試料をミクロトームなどで切削して、凍結処理した骨である生物試料を準備することができる。 以下に実施例および比較例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 まず、分析用試料を作製するため治具を、次のとおり作製した。 ポリテトラフルオロエチレン（バルカー社製、製品名バルフロン▲Ｒ▼シート）製のブロックを用意し、このブロックを加工して、はじめに治具の円形部品を作製した。円形部品は厚さが５ｍｍ、直径が３０ｍｍ程度となるようにした。次いで、同じポリテトラフルオロエチレン製のブロックを加工して、治具の環状部品を作製した。環状部品は厚さが５ｍｍ、外径が４０ｍｍ、内径が３０ｍｍ程度となるようにした。このようにして作製した治具は、環状部品を円形部品の外周にはめ込むことのできるものであった。 次に、プラスチックフィルムとして、厚さが４μｍのポリプロピレンフィルム（ＳＰＥＸ社製、製品名ＵＬＴＲＡＬＥＮＥ▲Ｒ▼）を用意した。このポリプロピレンフィルムの赤外スペクトルを、赤外分析装置（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製、製品名：Ｓｐｏｔｌｉｇｈｔ４００／Ｓｐｅｃｔｒｕｍ４００）により測定したところ、図２に示すような赤外スペクトルが得られた。赤外スペクトルから、このポリプロピレンフィルムには、生物試料の赤外スペクトルを解析するのに重要な１７００〜１６００ｃｍ−１ならびに１１００〜９００ｃｍ−１付近に強い赤外線の吸収がないことを確認した。 さらに、粘着剤として、凍結切片作製用粘着剤（ＳＥＣＴＩＯＮ−ＬＡＢ社製、製品名Ｃｒｙｏｇｌｕｅ ｔｙｐｅ Ｉ）を用意した。この粘着剤の赤外スペクトルを、上記赤外分析装置により測定したところ、図３に示すような赤外スペクトルが得られた。赤外スペクトルから、この粘着剤にも、上記ポリプロピレンフィルム同様、１７００〜１６００ｃｍ−１ならびに１１００〜９００ｃｍ−１付近に強い赤外線の吸収がないことを確認した。 ポリテトラフルオロエチレン製の円形部品の上にポリプロピレンフィルムを載せ、その上からポリテトラフルオロエチレン製の環状部品を円形部品の外周にはめ込んで、ポリプロピレンフィルムを治具に固定したところ、たるみやしわなどがなく均一に固定されていることが確認された。 次いで、治具に固定されたプラスチックフィルムに、上記凍結切片作製用粘着剤を塗布した。粘着剤は、粘着剤に対してｎ−ヘキサン（１級）が９：１になるように溶かし、ポリプロピレンフィルムにスピンコートした。スピンコートは、コーター（ミカサ株式会社製、製品名スピンコーターＭＳ−Ａ１００）を用い、コーティング条件は、室温（２５℃）において、１０００ｒｐｍで７秒回転させた後、２０００ｒｐｍで７秒回転させた。乾燥は、室温（２５℃）において、４時間、空気中で行った。 ポリプロピレンフィルムに塗布した粘着剤の上に、凍結処理した生物試料（マウス大腿骨）を載置することにより、分析用試料を作製した。 凍結処理した生物試料を準備するため、まず、ステンレス製の容器にマウス大腿骨と凍結用包埋剤（ライカ社製、製品名：ＳＣＥＭ）を入れ、検体を包埋した。この容器をデシケター（４℃）に置き、１９．９×１０３Ｐａで陰圧にした状態で１２時間放置した。次いで、容器をドライアイスとｎ−ヘキサンの入った容器の中に入れ、急冷（−８０℃）して、一気に包埋剤を固めた。分析用の凍結切片を作製する際は、ステンレス製の容器からブロック状になった試料を取り出した。試料の凍結片は、ミクロトームを用いて１μｍの厚さで作製した。凍結作製時の温度は、ミクロトーム内を−３０℃、試料を−３０℃にした。 このように作製した分析用試料の赤外スペクトルを、上記赤外分析装置により測定したところ、図４に示すような赤外スペクトルが得られた。得られた分析用試料の赤外スペクトルを、ポリプロピレンフィルム及び粘着剤のスペクトルと対比すると、１７００〜１６００ｃｍ−１ならび１１００〜９００ｃｍ−１に、ポリプロピレンフィルムあるいは粘着剤による強い赤外線の吸収がないため、解析に必要な生物試料（マウス大腿骨）由来のバンドを直接かつ正確に観察することができるとともに、このバンドにおける生物試料由来の吸収が全て吸光度１以下となり、赤外分析装置の検出器の検出限界を超えておらず、分析用試料の赤外スペクトルに定量性があることが確認された。 （比較例） 従来法により、ＰＭＭＡ包埋による分析用試料を作製した。 まず、生物試料（マウス大腿骨）を、７０％エタノールで固定し、検体の脱水作業を行った。真空乾燥機にて０．０５ＭＰａで３０分吸引した後、エタノールを９５％、１００％に交換しながら、それぞれ０．０５ＭＰａで３０分吸引し、さらにアセトンに交換して０．０５ＭＰａで３０分吸引した。次いで、溶媒を混合溶液（アセトン：メチルメタクリレートモノマー＝１：３）に２４時間かけて交換し、さらにメチルメタクリレートモノマーに交換した。 次に、メチルメタクリレートモノマー１２５ｍＬ、ポリメチルメタクリレートビーズ４２ｇ、ベンゾイルパーオキサイド１．６５ｇを用いて、メチルメタクリレート樹脂（ＭＭＡ樹脂）を調合した。 固定した生物試料を包埋用の容器に入れ、調合したメチルメタクリレート樹脂を流し込み、試料を包埋した。容器は冷蔵庫（５℃）に置き、包埋剤が検体の細部に行き渡るように、３日間スターラーで撹拌した。包埋剤を重合させるため、容器ごと試料をインキュベータに入れ、１０日間、３０〜４０℃に暖めた。得られたブロックを、不要な部分を切断して出来るだけ小さく成形した。このブロックから、ミクロトームを用いて厚さ３μｍの薄切片を作製し、これをフッ化バリウム（ＢａＦ２）製の窓板にマウントして分析用試料を作製した。 このように作製した従来のＰＭＭＡ包埋による分析用試料の赤外スペクトルを、上記赤外分析装置により測定し、これをＰＭＭＡについてのスペクトルと対比すると、図５のようになった。図５から、分析用試料のスペクトルについて、１１００〜９００ｃｍ−１付近に現れているＰＭＭＡ由来のショルダを除去するバックグラウンド補正を行う必要性があることが確認された。 １：治具２：円形部品３：環状部品４：プラスチックフィルム 生物試料を分析するための分析用試料の作製方法であって、以下の工程： プラスチックフィルムを用意する工程、 前記プラスチックフィルムを治具に固定する工程、 前記治具に固定されたプラスチックフィルムに、粘着剤を塗布する工程、 前記プラスチックフィルムに塗布した前記粘着剤の上に、凍結処理した生物試料を載置する工程、を含み、 前記生物試料が骨であり、前記プラスチックフィルムの厚さが１０μｍ未満であることを特徴とする、前記方法。 前記治具が、円形部品と、該円形部品の外周にはめ込むことのできる環状部品とを含み、前記プラスチックフィルムを前記円形部品に載置した後、該円形部品に前記環状部品をはめ込むことにより、前記プラスチックフィルムを前記治具に固定することを特徴とする、請求項１に記載の方法。 前記プラスチックフィルムがポリプロピレンフィルムであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。 前記粘着剤を前記プラスチックフィルムにスピンコーティングすることにより塗布することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。 前記治具がポリテトラフルオロエチレン製であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。 前記分析が分光分析であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。 生物試料を分析するための分析用試料を作製するための治具であって、 厚さが１０μｍ未満のプラスチックフィルムを固定することにより、固定された該プラスチックフィルムに粘着剤を塗布し、該粘着剤の上に凍結処理した骨である生物試料を載置することができるように構成されていることを特徴とする、前記治具。 前記治具が、円形部品と、該円形部品の外周にはめ込むことのできる環状部品とを含み、前記プラスチックフィルムを前記円形部品に載置した後、該円形部品に前記環状部品をはめ込むことにより、前記プラスチックフィルムを固定することを特徴とする、請求項７に記載の治具。 前記プラスチックフィルムがポリプロピレンフィルムであることを特徴とする、請求項７又は８に記載の治具。 前記粘着剤を前記プラスチックフィルムにスピンコーティングすることにより塗布することを特徴とする、請求項７〜９のいずれか１項に記載の治具。 ポリテトラフルオロエチレン製であることを特徴とする、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の治具。 前記分析が分光分析であることを特徴とする、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の治具。 【課題】定量的な分光分析に使用して精度の高い測定結果を得ることが可能であり、しかも安価にかつ短時間で分析用生物試料を作製することが可能な、分析用生物試料の作製方法及び作製用治具を提供する。【解決手段】治具１に、円形部品２と環状部品３を用いてプラスチックフィルム４を固定し、プラスチックフィルム上に粘着剤を塗布し、凍結処理後にミクロトームで切削した骨等の生物試料を載置する。プラスチックフィルムは厚さ１０μｍ未満のものを用いる。【選択図】図１