生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公表特許公報(A)_ＲＮＡ送達に有利なｐＫａ値を有する脂質を含むリポソーム |
| 出願番号： | 2013518814 |
| 年次： | 2013 |
| IPC分類： | A61K 39/00,A61K 9/127,A61K 47/44,A61K 47/28,A61K 47/18,A61K 47/22,A61P 31/04,A61P 31/12,A61P 31/10,A61P 33/00,A61P 37/04,A61P 35/00,C12N 15/09,A61K 48/00,A61K 31/7105 |
特許情報キャッシュ
ギール， アンドリュー JP 2013537518 公表特許公報(A) 20131003 2013518814 20110706 ＲＮＡ送達に有利なｐＫａ値を有する脂質を含むリポソーム ノバルティス アーゲー 504389991 山本 秀策 100078282 森下 夏樹 100113413 ギール， アンドリュー US 61/361,830 20100706 US 61/378,837 20100831 A61K 39/00 20060101AFI20130906BHJP A61K 9/127 20060101ALI20130906BHJP A61K 47/44 20060101ALI20130906BHJP A61K 47/28 20060101ALI20130906BHJP A61K 47/18 20060101ALI20130906BHJP A61K 47/22 20060101ALI20130906BHJP A61P 31/04 20060101ALI20130906BHJP A61P 31/12 20060101ALI20130906BHJP A61P 31/10 20060101ALI20130906BHJP A61P 33/00 20060101ALI20130906BHJP A61P 37/04 20060101ALI20130906BHJP A61P 35/00 20060101ALI20130906BHJP C12N 15/09 20060101ALN20130906BHJP A61K 48/00 20060101ALN20130906BHJP A61K 31/7105 20060101ALN20130906BHJP JPA61K39/00 HA61K9/127A61K47/44A61K47/28A61K47/18A61K47/22A61P31/04A61P31/12A61P31/10A61P33/00A61P37/04A61P35/00C12N15/00 AA61K48/00A61K31/7105 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KM,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PE,PG,PH,PL,PT,RO,RS,RU,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC,VN,ZA,ZM,ZW US2011043105 20110706 WO2012006378 20120112 57 20130218 4B024 4C076 4C084 4C085 4C086 4B024AA01 4B024BA80 4B024CA01 4B024CA11 4B024DA02 4B024DA03 4B024EA02 4B024EA04 4B024GA13 4B024HA17 4C076AA19 4C076AA95 4C076CC31 4C076DD52F 4C076DD60F 4C076DD70F 4C076EE52F 4C076FF16 4C076FF34 4C076FF43 4C084AA13 4C084MA05 4C084MA24 4C084NA11 4C084NA13 4C084ZB331 4C084ZB351 4C084ZB371 4C085AA03 4C085BB23 4C085EE01 4C086AA01 4C086AA02 4C086EA16 4C086MA02 4C086MA05 4C086MA24 4C086NA11 4C086NA13 4C086ZB33 4C086ZB35 4C086ZB37 本出願は、米国仮出願第６１／３６１，８３０号（２０１０年７月６日出願）、および同第６１／３７８，８３７号（２０１０年８月３１日出願）の利益を主張し、上記両方の米国仮出願の全容は、全ての目的のために、参考として本明細書に援用される。 （技術分野） 本発明は、免疫のためのＲＮＡの非ウイルス性送達の分野にある。 （背景技術） 動物を免疫するための核酸の送達は、数年間にわたり目標であった。種々のアプローチが、試験されてきており、それらとしては、ＤＮＡもしくはＲＮＡの使用、ウイルスもしくは非ウイルス性送達ビヒクルの使用（またはさらには「裸の」ワクチンにおいて、送達ビヒクルなし）、複製もしくは非複製ベクターの使用、またはウイルスもしくは非ウイルス性ベクターの使用が挙げられる。 さらに改善された核酸ワクチンへの必要性が存在している。 （発明の開示） 本発明によれば、免疫原をコードするＲＮＡは、免疫の目的で、リポソーム中で送達される。上記リポソームは、５．０〜７．６の範囲のｐＫａを有する脂質を含む。理想的には、この範囲のｐＫａを有する脂質は、三級アミンを有する；このような脂質は、四級アミン基を有する脂質（例えば、ＤＯＴＡＰもしくはＤＣ−Ｃｈｏｌ）とは異なって挙動する。生理学的ｐＨにおいて、５．０〜７．６の範囲のｐＫａを有するアミンは、中性のもしくは低下した表面電荷を有するのに対して、ＤＯＴＡＰのような脂質は、強力にカチオン性である。本発明者らは、四級アミン脂質（例えば、ＤＯＴＡＰ）から形成されるリポソームが、三級アミン脂質（例えば、ＤＬｉｎＤＭＡ）から形成されるリポソームより、免疫原をコードするＲＮＡの送達には適切性において劣ることを見いだした。 従って、本発明は、水性コアを封入する脂質二重層を有するリポソームであって、ここで：（ｉ）上記脂質二重層は、５．０〜７．６の範囲のｐＫａを有する脂質、および好ましくは、三級アミンを有する脂質を含み；そして（ｉｉ）上記水性コアは、免疫原をコードするＲＮＡを含むリポソームを提供する。これらリポソームは、脊椎動物細胞への上記ＲＮＡのインビボ送達に適切であるので、それらは、種々の疾患に対して被験体を免疫するための薬学的組成物における成分として有用である。 本発明はまた、ＲＮＡ含有リポソームを調製するためのプロセスであって、（ａ）ＲＮＡと、脂質とを、上記脂質のｐＫａ未満であるが、４．５を上回るｐＨにおいて混合して、上記ＲＮＡが封入されているリポソームを形成する工程；および（ｂ）得られたリポソーム含有混合物のｐＨを、上記脂質のｐＫａを上回るように上昇させる工程、を包含するプロセスを提供する。 （リポソーム） 本発明は、免疫原をコードするＲＮＡが封入されているリポソームを利用する。従って、上記ＲＮＡは、（天然ウイルスにおけるように）上記リポソームの脂質二重層によって任意の外部媒体（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｍｅｄｉｕｍ）から分離されており、そしてこの方法での封入は、ＲＮａｓｅ消化からＲＮＡを保護することが見いだされた。上記リポソームは、いくらかの外部ＲＮＡ（例えば、それらの表面に）を含み得るが、上記ＲＮＡのうちの少なくとも半分（および理想的には、そのすべて）は、上記リポソームのコアに封入される。リポソーム内の封入は、例えば、参考文献１で開示される脂質／ＲＮＡ複合体とは異なる。 種々の両親媒性脂質は、ＲＮＡ含有水性コアをリポソームとして封入するための水性環境において二重層を形成し得る。これら脂質は、アニオン性、カチオン性もしくは両性イオン性の親水性頭部基を有し得る。本発明のリポソームは、５．０〜７．６の範囲のｐＫａを有する脂質を含み、この範囲のｐＫａを有する好ましい脂質は、三級アミンを有する。例えば、それらは、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ； ｐＫａ ５．８）および／もしくは１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）を含み得る。三級アミンを有する別の適切な脂質は、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎジメチル−３−アミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）である。図３および参考文献２を参照のこと。参考文献３のアミノ酸脂質のうちのいくつかはまた、参考文献４のアミノ脂質のうちの特定のものが使用できるように、使用され得る。それらの頭部基において三級アミンを有するさらに有用な脂質は、参考文献５（その完全な内容は、本明細書に参考として援用される）に開示されている。 本発明のリポソームは、単一の脂質もしくは脂質の混合物から形成され得るが、ただし、上記脂質のうちの少なくとも１種は、５．０〜７．６の範囲のｐＫａ（および好ましくは、三級アミン）を有する。このｐＫａ範囲内では、好ましい脂質は、５．５〜６．７（例えば、５．６〜６．８の間、５．６〜６．３の間、５．６〜６．０の間、５．５〜６．２の間、もしくは５．７〜５．９の間）のｐＫａを有する。上記ｐＫａは、上記脂質が完全に荷電される点と、上記脂質が完全に荷電していない点との間の中間点にある、上記脂質のうちの５０％が荷電しているｐＨである。これは、種々の方法で測定され得るが、好ましくは、標題「ｐＫａ測定」の節において、以下で開示される方法を使用して測定される。上記ｐＫａは、代表的には、他の脂質（例えば、参考文献６において行われるようなものではなく、個々の脂質のｐＫａではなくＳＮＡＬＰのｐＫａにおいてみられる）もまた含む混合物の状況において、上記脂質についてよりむしろ、上記脂質単独について測定されるべきである。 本発明のリポソームが脂質の混合物から形成される場合、所望の範囲内のｐＫａを有するそれら脂質の割合が、脂質の総量のうちの２０〜８０％の間（例えば、３０〜７０％の間、もしくは４０〜６０％の間）であるべきであることは、好ましい。例えば、有用なリポソームは、以下に示され、ここで上記総脂質のうちの４０％もしくは６０％が、所望の範囲にあるｐＫａを有する脂質である。残りは、例えば、コレステロール（例えば、３５〜５０％ コレステロール）および／もしくはＤＭＧ（必要に応じて、ＰＥＧ化される）および／もしくはＤＳＰＣから作製され得る。このような混合物は、以下で使用される。これら％値は、モルパーセンテージである。 リポソームは、親水性部分がＰＥＧ化されている（すなわち、ポリエチレングリコールの共有結合によって改変されている）両親媒性脂質を含み得る。この改変は、上記リポソームの安定性を増大させ得、非特異的吸着を妨げ得る。例えば、脂質は、参考文献６および７において開示されるもののような技術を使用して、ＰＥＧに結合体化され得る。ＰＥＧは、上記リポソームに有利な薬物動態特性を付与し得るコートを提供する。ＲＮＡ（特に、自己複製ＲＮＡ）の効率的封入、５．０〜７．６の範囲のｐＫａを有するカチオン性脂質、およびＰＥＧ化表面の組み合わせは、複数の細胞タイプ（免疫細胞および非免疫細胞の両方を含む）への効率的な送達を可能にし、それによって、ＰＥＧ化なしで四級アミンを使用する場合より強力かつ良好な免疫応答を誘発する。種々の長さのＰＥＧは、例えば、０．５〜８ｋＤａの間で使用され得る。 本発明で使用される脂質は、飽和であっても不飽和であってもよい。リポソームを調製するために少なくとも１種の不飽和脂質を使用することは、好ましい。図３は、３種の有用な不飽和脂質を示す。不飽和脂質が２つの尾部を有する場合、両方の尾部が、不飽和であり得るか、またはそれは、一方に飽和尾部および一方に不飽和尾部を有し得る。 ＤＳＰＣ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＰＥＧ−ＤＭＧおよびコレステロールの混合物は、実施例において使用される。本発明の独立した局面は、ＤＳＰＣ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＰＥＧ−ＤＭＧおよびコレステロールを含むリポソームである。このリポソームは、好ましくは、ＲＮＡ（例えば、自己複製ＲＮＡ（例えば、免疫原をコードする））を封入する。 リポソーム粒子は、通常は、３つの群に分けられる：多層小胞（ＭＬＶ）；小さな単層小胞（ＳＵＶ）；および大きな単層小胞（ＬＵＶ）。ＭＬＶは、各小胞において複数の二重層を有し、いくつかの別個の水性区画を形成する。ＳＵＶおよびＬＵＶは、水性コアを封入する単一の二重層を有する；ＳＵＶは、代表的には、直径≦５０ｎｍを有し、ＬＵＶは、直径＞５０ｎｍを有する。本発明のリポソーム粒子は、理想的には、５０〜２２０ｎｍの範囲の直径を有するＬＵＶである。様々な直径を有するＬＵＶの集団を含む組成物に関しては：（ｉ）少なくとも８０％（数で）は、２０〜２２０ｎｍの範囲の直径を有するべきであり、（ｉｉ）上記集団の平均直径（Ｚａｖ（強度で））は、理想的には、４０〜２００ｎｍの範囲にあり、そして／または（ｉｉｉ）上記直径は、多分散指数＜０．２を有するべきである。参考文献１のリポソーム／ＲＮＡ複合体は、６００〜８００ｎｍの範囲の直径を有し、高い多分散性を有すると予測される。上記リポソームは、実質的に球状であり得る。 適切なリポソームを調製するための技術は、当該分野で周知である（例えば、参考文献８〜１０を参照のこと）。１つの有用な方法は、参考文献１１に記載され、（ｉ）脂質のエタノール溶液、（ｉｉ）核酸の水性溶液、および（ｉｉｉ）緩衝液を混合する工程、続いて、混合、平衡化、希釈および精製の工程を包含する。本発明の好ましいリポソームは、この混合プロセスによって得られ得る。 （混合プロセス） 上記のように、本発明は、ＲＮＡ含有リポソームを調製するためのプロセスであって、（ａ）ＲＮＡと、脂質とを、上記脂質のｐＫａ未満であるが、４．５を上回るｐＨにおいて混合する工程；次いで、（ｂ）上記ｐＨを、上記脂質のｐＫａを上回るように上昇させる工程を包含するプロセスを提供する。 従って、カチオン性脂質は、工程（ａ）におけるリポソーム形成の間に正に荷電されるが、その後の上記ｐＨ変化は、上記正に荷電した基の大部分（もしくはすべて）が中性になることを意味する。このプロセスは、本発明のリポソームを調製するために有利であり、工程（ａ）の間に４．５未満のｐＨを回避することによって、上記封入されたＲＮＡの安定性は、改善される。 工程（ａ）におけるｐＨは、４．５を上回り、理想的には、４．８を上回る。５．０〜６．０の範囲の、もしくは５．０〜５．５の範囲のｐＨを使用すると、適切なリポソームが提供され得る。 工程（ｂ）における増大したｐＨは、上記脂質のｐＫａを上回る。上記ｐＨは、理想的には、９未満、および好ましくは、８未満のｐＨへと上昇する。上記脂質のｐＫａに依存して、工程（ｂ）におけるｐＨは、従って、６〜８の範囲内であるように（例えば、ｐＨ６．５±０．３へと）上昇し得る。工程（ｂ）のｐＨ上昇は、上記リポソームを適切な緩衝液へと（例えば、リン酸緩衝食塩水へと）移すことによって達成され得る。工程（ｂ）のｐＨ上昇は、理想的には、リポソーム形成が起こった後に行われる。 工程（ａ）において使用されるＲＮＡは、上記脂質の有機溶液（例えば、参考文献１１におけるように、エタノール性溶液）と混合する間、水性溶液中に存在し得る。次いで、その混合物は希釈されて、リポソームを形成し得、その後、そのｐＨは、工程（ｂ）において上昇させられ得る。 （ＲＮＡ） 本発明は、免疫原をコードするＲＮＡのインビボ送達に有用である。上記ＲＮＡは、その送達部位において非免疫細胞によって翻訳され、上記免疫原の発現をもたらし、そしてまた、それは、免疫細胞に、Ｉ型インターフェロンおよび／もしくは炎症促進性サイトカイン（これらは、局所的なアジュバント効果を提供する）を分泌させる。上記非免疫細胞はまた、上記ＲＮＡに応答してＩ型インターフェロンおよび／もしくは炎症促進性サイトカインを分泌し得る。 上記ＲＮＡは、プラス鎖であるので、それは、いかなる介在複製ステップ（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ）（例えば、逆転写）も必要とせずに、非免疫細胞によって翻訳され得る。それはまた、免疫細胞によって発現されるＴＬＲ７レセプターに結合し得、それによって、アジュバント効果を開始し得る。 好ましいプラス鎖ＲＮＡは、自己複製性である。自己複製ＲＮＡ分子（レプリコン）は、あらゆるタンパク質なしで脊椎動物細胞に送達される場合でも、上記自己複製ＲＮＡ分子自体からの転写によって（上記自己複製ＲＮＡ分子自体から生成するアンチセンスコピーを介して）、複数の娘ＲＮＡの生成をもたらし得る。自己複製ＲＮＡ分子は、従って、代表的には、細胞へ送達された後に直接翻訳され得るプラス鎖分子であり、この翻訳は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを提供し、次いで、これは、上記送達されたＲＮＡからアンチセンス転写物およびセンス転写物の両方を生成する。従って、上記送達されたＲＮＡは、複数の娘ＲＮＡの生成をもたらす。これら娘ＲＮＡ、ならびに同一線上（ｃｏｌｌｉｎｅａｒ）のサブゲノム転写物は、それ自体が翻訳されて、コードされた免疫原のインサイチュ発現を提供し得るか、または転写されて、上記送達されたＲＮＡと同じセンスのさらなる転写物（上記免疫原のインサイチュ発現を提供するように翻訳される）を提供し得る。この一連の転写の全体的な結果は、上記導入されたレプリコンＲＮＡの数における非常に多くの増幅であり、よって、上記コードされた免疫原は、上記細胞の主なポリペプチド生成物になる。 以下に示されるように、自己複製活性は、ＲＮＡがアジュバント効果を提供するのに必要とされないが、それは、サイトカインのトランスフェクション後分泌を増強し得る。上記自己複製活性は、非免疫細胞による免疫原の高レベル発現を達成するために特に有用である。それはまた、上記非免疫細胞のアポトーシスを増強させ得る。 自己複製を達成するための１つの適切なシステムは、アルファウイルスベースのＲＮＡ複製を使用することである。これらプラス鎖レプリコンは、細胞への送達後に翻訳されて、レプリカーゼ（もしくはレプリカーゼ−転写酵素）を与える。上記レプリカーゼは、上記送達されたプラス鎖ＲＮＡのゲノムマイナス鎖コピーを作り出す複製複合体を提供するように自己切断するポリプロテインとして翻訳される。これらマイナス鎖転写物は、これ自体が、上記プラス鎖親ＲＮＡのさらなるコピーを与え、そしてまた、免疫原をコードするサブゲノム転写物を与えるように転写され得る。従って、上記サブゲノム転写物の翻訳は、上記感染した細胞による上記免疫原のインサイチュ発現をもたらす。適切なアルファウイルスレプリコンは、シンドビス・ウイルス、セムリキ森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスなどに由来するレプリカーゼを使用し得る。変異型ウイルスもしくは野生型ウイルスの配列が使用され得る（例えば、ＶＥＥＶの弱毒化ＴＣ８３変異体は、レプリコンにおいて使用されてきた［１２］）。 好ましい自己複製ＲＮＡ分子は、従って、（ｉ）上記自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写し得るＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、および（ｉｉ）免疫原をコードする。上記ポリメラーゼは、アルファウイルスレプリカーゼ（例えば、アルファウイルスタンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４のうちの１種以上を含む）であり得る。 天然のアルファウイルスゲノムが、上記非構造レプリカーゼポリプロテインに加えて、構造的ビリオンタンパク質をコードするのに対して、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルス構造タンパク質をコードしないことが好ましい。従って、好ましい自己複製ＲＮＡは、細胞においてそれ自体のゲノムＲＮＡコピーの生成をもたらし得るが、ＲＮＡ含有ビリオンの生成はもたらさない。これらのビリオンを生成できないことは、野生型アルファウイルスとは異なり、上記自己複製ＲＮＡ分子が、感染性形態においてそれ自体を永続させられないことを意味する。野生型ウイルスにおいて永続に必要な上記アルファウイルス構造タンパク質は、本発明の自己複製ＲＮＡには存在せず、それらの位置は、上記目的の免疫原をコードする遺伝子によってしめられている。その結果、上記サブゲノム転写物は、上記構造的アルファウイルスビリオンタンパク質ではなく、上記免疫原をコードする。 従って、本発明で有用な自己複製ＲＮＡ分子は、２個のオープンリーディングフレームを有し得る。第１の（５’側）オープンリーディングフレームは、レプリカーゼをコードし；第２の（３’側）オープンリーディングフレームは、免疫原をコードする。いくつかの実施形態において、上記ＲＮＡは、例えば、さらなる免疫原（以下を参照のこと）をコードするために、もしくは補助ポリペプチドをコードするために、さらなる（例えば、下流の）オープンリーディングフレームを有し得る。 自己複製ＲＮＡ分子は、上記コードされたレプリカーゼと適合性である５’配列を有し得る。 自己複製ＲＮＡ分子は、種々の長さを有し得るが、それらは、代表的には、５０００〜２５０００ヌクレオチド長（例えば、８０００〜１５０００ヌクレオチド、もしくは９０００〜１２０００ヌクレオチド）である。従って、上記ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ送達において認められるものより長い。 本発明で有用なＲＮＡ分子は、５’キャップ（例えば、７−メチルグアノシン）を有し得る。このキャップは、上記ＲＮＡのインビボ翻訳を増強し得る。 本発明で有用なＲＮＡ分子の５’ヌクレオチドは、５’トリホスフェート基を有し得る。キャップをしたＲＮＡにおいて、これは、５’から５’への架橋を介して、７−メチルグアノシンに連結され得る。５’トリホスフェートは、ＲＩＧ−Ｉ結合を増強し得、従って、アジュバント効果を促進し得る。 ＲＮＡ分子は、３’ポリＡ尾部を有し得る。それはまた、その３’末端付近にポリＡポリメラーゼ認識配列（例えば、ＡＡＵＡＡＡ）を含み得る。 本発明で有用なＲＮＡ分子は、代表的には、一本鎖である。一本鎖ＲＮＡは、一般に、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＲＮＡヘリカーゼおよび／もしくはＰＫＲに結合することによって、アジュバント効果を開始し得る。二本鎖形態（ｄｓＲＮＡ）で送達されたＲＮＡは、ＴＬＲ３に結合し得、このレセプターはまた、一本鎖ＲＮＡの複製の間か、または一本鎖ＲＮＡの二次構造内のいずれかで形成されるｄｓＲＮＡによって誘発され得る。 本発明で有用なＲＮＡ分子は、便宜上、インビトロ転写（ＩＶＴ）によって調製され得る。ＩＶＴは、細菌においてプラスミド形態において作られ、増やされたか、または合成で作製された（例えば、遺伝子合成および／もしくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）操作法によって）（ｃＤＮＡ）テンプレートを使用し得る。例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、バクテリオファージＴ７、Ｔ３もしくはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）は、ＤＮＡテンプレートからＲＮＡを転写するために使用され得る。適切なキャッピングおよびポリＡ付加反応は、必要時に使用され得る（しかし、上記レプリコンのポリＡは、通常、上記ＤＮＡテンプレート内にコードされる）。これらＲＮＡポリメラーゼは、転写される５’ヌクレオチドについてストリンジェントな要件を有し得、いくつかの実施形態において、これらの要件は、上記ＩＶＴ転写ＲＮＡが、自己がコードするレプリカーゼの基質として効率的に機能し得ることを確実にするために、上記コードされたレプリカーゼの要件とマッチしなければならない。 参考文献１３において考察されるように、上記自己複製ＲＮＡは、（任意の５’キャップ構造に加えて）改変された核酸塩基を有する１個以上のヌクレオチドを含み得る。従って、上記ＲＮＡは、以下を含み得る：ｍ５Ｃ（５−メチルシチジン）、ｍ５Ｕ（５−メチルウリジン）、ｍ６Ａ（Ｎ６−メチルアデノシン）、ｓ２Ｕ（２−チオウリジン）、Ｕｍ（２’−Ｏ−メチルウリジン）、ｍ１Ａ（ｌ−メチルアデノシン）；ｍ２Ａ（２−メチルアデノシン）；Ａｍ（２’−Ｏ−メチルアデノシン）；ｍｓ２ｍ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−メチルアデノシン）；ｉ６Ａ（Ｎ６−イソペンテニルアデノシン）；ｍｓ２ｉ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６イソペンテニルアデノシン）；ｉｏ６Ａ（Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｍｓ２ｉｏ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｇ６Ａ（Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン）；ｔ６Ａ（Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｔ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍ６ｔ６Ａ（Ｎ６−メチル−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン）；ｈｎ６Ａ（Ｎ６．−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｈｎ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；Ａｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシルアデノシン（ホスフェート））；Ｉ（イノシン）；ｍ１１（１−メチルイノシン）；ｍ’Ｉｍ（１，２’−Ｏ−ジメチルイノシン）；ｍ３Ｃ（３−メチルシチジン）；Ｃｍ（２Ｔ−Ｏ−メチルシチジン）；ｓ２Ｃ（２−チオシチジン）；ａｃ４Ｃ（Ｎ４−アセチルシチジン）；ｆ５Ｃ（５−ホルミル（ｆｏｎｎｙｌ）シチジン）；ｍ５Ｃｍ（５，２−Ｏ−ジメチルシチジン）；ａｃ４Ｃｍ（Ｎ４アセチル２ＴＯメチルシチジン）；ｋ２Ｃ（リシジン）；ｍ１Ｇ（１−メチルグアノシン）；ｍ２Ｇ（Ｎ２−メチルグアノシン）；ｍ７Ｇ（７−メチルグアノシン）；Ｇｍ（２’−Ｏ−メチルグアノシン）；ｍ２２Ｇ（Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン）；ｍ２Ｇｍ（Ｎ２，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン）；ｍ２２Ｇｍ（Ｎ２，Ｎ２，２’−Ｏ−トリメチルグアノシン）；Ｇｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシルグアノシン（ホスフェート））；ｙＷ（ワイブトシン）；ｏ２ｙＷ（ペルオキシワイブトシン）；ＯＨｙＷ（ヒドロキシワイブトシン）；ＯＨｙＷ＊（改変下（ｕｎｄｅｒｍｏｄｉｆｉｅｄ）ヒドロキシワイブトシン）；ｉｍＧ（ワイオシン）；ｍｉｍＧ（メチルグアノシン）；Ｑ（キューオシン）；ｏＱ（エポキシキューオシン）；ｇａｌＱ（ガラクトシル（ｇａｌｔａｃｔｏｓｙｌ）−キューオシン）；ｍａｎＱ（マンノシル−キューオシン）；ｐｒｅＱｏ（７−シアノ−７−デアザグアノシン）；ｐｒｅＱｉ（７−アミノメチル−７−デアザグアノシン）；Ｇ（アルカエオシン（ａｒｃｈａｅｏｓｉｎｅ））；Ｄ（ジヒドロウリジン）；ｍ５Ｕｍ（５，２’−Ｏ−ジメチルウリジン）；ｓ４Ｕ（４−チオウリジン）；ｍ５ｓ２Ｕ（５−メチル−２−チオウリジン）；ｓ２Ｕｍ（２−チオ−２’−Ｏ−メチルウリジン）；ａｃｐ３Ｕ（３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン）；ｈｏ５Ｕ（５−ヒドロキシウリジン）；ｍｏ５Ｕ（５−メトキシウリジン）；ｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５−オキシ酢酸）；ｍｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル）；ｃｈｍ５Ｕ（５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン））；ｍｃｈｍ５Ｕ（５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル）；ｍｃｍ５Ｕ（５−メトキシカルボニルメチルウリジン）；ｍｃｍ５Ｕｍ（Ｓ−メトキシカルボニルメチル−２−Ｏ−メチルウリジン）；ｍｃｍ５ｓ２Ｕ（５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン）；ｎｍ５ｓ２Ｕ（５−アミノメチル−２−チオウリジン）；ｍｎｍ５Ｕ（５−メチルアミノメチルウリジン）；ｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン）；ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ（５−メチルアミノメチル−２−セレノウリジン）；ｎｃｍ５Ｕ（５−カルバモイルメチルウリジン）；ｎｃｍ５Ｕｍ（５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン）；ｃｍｎｍ５Ｕ（５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン）；ｃｎｍｍ５Ｕｍ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２−Ｌ−Ｏメチルウリジン）；ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン）；ｍ６２Ａ（Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン）；Ｔｍ（２’−Ｏ−メチルイノシン）；ｍ４Ｃ（Ｎ４−メチルシチジン）；ｍ４Ｃｍ（Ｎ４，２−Ｏ−ジメチルシチジン）；ｈｍ５Ｃ（５−ヒドロキシメチルシチジン）；ｍ３Ｕ（３−メチルウリジン）；ｃｍ５Ｕ（５−カルボキシメチルウリジン）；ｍ６Ａｍ（Ｎ６，Ｔ−Ｏ−ジメチルアデノシン）；ｒｎ６２Ａｍ（Ｎ６，Ｎ６，Ｏ−２−トリメチルアデノシン）；ｍ２’７Ｇ（Ｎ２，７−ジメチルグアノシン）；ｍ２’２’７Ｇ（Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアノシン）；ｍ３Ｕｍ（３，２Ｔ−Ｏ−ジメチルウリジン）；ｍ５Ｄ（５−メチルジヒドロウリジン）；ｆ５Ｃｍ（５−ホルミル−２’−Ｏ−メチルシチジン）；ｍ１Ｇｍ（１，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン）；ｍ’Ａｍ（（１，２−Ｏ−ジメチルアデノシン）イリノメチルウリジン）；ｔｍ５ｓ２Ｕ（Ｓ−タウリノメチル−２−チオウリジン）；ｉｍＧ−１４（４−デメチルグアノシン）；ｉｍＧ２（イソグアノシン）；もしくはａｃ６Ａ（Ｎ６−アセチルアデノシン）、ヒポキサンチン、イノシン、８−オキソ−アデニン、７−置換されたその誘導体、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−アミノウラシル、５−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルウラシル、５−メチルウラシル、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルケニルウラシル、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルキニルウラシル、５−（ヒドロキシメチル）ウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシシトシン、５−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルシトシン、５−メチルシトシン、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルケニルシトシン、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルキニルシトシン、５−クロロシトシン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、Ｎ２−ジメチルグアニン、７−デアザグアニン、８−アザグアニン、７−デアザ−７−置換グアニン、７−デアザ−７−（Ｃ２−Ｃ６）アルキニルグアニン、７−デアザ−８−置換グアニン、８−ヒドロキシグアニン、６−チオグアニン、８−オキソグアニン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，４−ジアミノプリン、２，６−ジアミノプリン、８−アザプリン、置換された７−デアザプリン、７−デアザ−７−置換プリン、７−デアザ−８−置換プリン、または無塩基ヌクレオチド。例えば、自己複製ＲＮＡは、１つ以上の改変されたピリミジン核酸塩基（例えば、シュードウリジンおよび／もしくは５−メチルシトシン残基）を含み得る。しかし、いくつかの実施形態において、上記ＲＮＡは、改変された核酸塩基を含まず、改変されたヌクレオチドを含まなくてもよい（すなわち、上記ＲＮＡ中のヌクレオチドのすべては、標準的なＡ、Ｃ、ＧおよびＵというリボヌクレオチドである（任意の５’キャップ構造を除く。これは、７’−メチルグアノシンを含み得る））。他の実施形態において、上記ＲＮＡは、７’−メチルグアノシンを含む５’キャップを含み得、最初の１個、２個もしくは３個の５’リボヌクレオチドは、リボースの２’位においてメチル化され得る。 本発明で使用されるＲＮＡは、理想的には、ヌクレオチド間にホスホジエステル結合のみを含むが、いくつかの実施形態において、それは、ホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合、および／もしくはメチルホスホネート結合を含み得る。 理想的には、リポソームは、１０種より少ない異なる種のＲＮＡ（例えば、５種、４種、３種、もしくは２種の異なる種）を含み；最も好ましくは、リポソームは、単一のＲＮＡ種（すなわち、上記リポソーム中のすべてのＲＮＡ分子が、同じ配列および同じ長さを有する）を含む。 １リポソームあたりのＲＮＡの量は変動し得る。１リポソームあたりの個々の自己複製ＲＮＡの数は、代表的には、１リポソームあたり≦５０個（例えば、＜２０個、＜１０個、＜５個、もしくは１〜４個）である。 （免疫原） 本発明で使用されるＲＮＡ分子は、ポリペプチド免疫原をコードする。上記リポソームの投与後に、上記ＲＮＡは、インビボで翻訳され、そして免疫原は、レシピエントにおける免疫応答を誘発し得る。上記免疫原は、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物に対して（あるいは、いくつかの実施形態において、アレルゲンに対して；および他の実施形態において、腫瘍抗原に対して）免疫応答を誘発し得る。上記免疫応答は、抗体応答（通常は、ＩｇＧを含む）および／もしくは細胞媒介性免疫応答を含み得る。上記ポリペプチド免疫原は、代表的には、対応する細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物（またはアレルゲンもしくは腫瘍）ポリペプチドを認識する免疫応答を誘発するが、いくつかの実施形態において、上記ポリペプチドは、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物のサッカリドを認識する免疫応答を誘発するように、ミモトープとして作用し得る。上記免疫原は、代表的には、表面ポリペプチド（例えば、アドヘシン、ヘマグルチニン、エンベロープ糖タンパク質、スパイク糖タンパク質など）である。 自己複製ＲＮＡ分子は、単一のポリペプチド免疫原もしくは複数のポリペプチドをコードし得る。複数の免疫原は、単一のポリペプチド免疫原（融合ポリペプチド）として、または別個のポリペプチドとして提示され得る。免疫原が、別個のポリペプチドとして発現される場合、これらのうちの１種以上は、上流のＩＲＥＳもしくはさらなるウイルスプロモーターエレメントとともに提供され得る。あるいは、複数の免疫原は、短い自己触媒性プロテアーゼ（例えば、口蹄疫ウイルス２Ａタンパク質）に融合された個々の免疫原をコードするポリプロテインから、またはインテインとして発現され得る。 参考文献１および１４とは異なり、上記ＲＮＡは、免疫原をコードする。不確かさを避けるために、本発明は、ホタルルシフェラーゼをコードするＲＮＡ、Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼの融合タンパク質をコードするＲＮＡ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＲＮＡを含まない。また、上記ＲＮＡは、全マウス胸腺ＲＮＡではない。 いくつかの実施形態において、上記免疫原は、これら細菌のうちの１種に対して免疫応答を誘発する： Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ：有用な免疫原としては、膜タンパク質、例えば、アドヘシン、オートトランスポーター、毒素、鉄獲得タンパク質、およびＨ因子結合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。３種の有用なポリペプチドの組み合わせが、参考文献１５に開示される。 Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：有用なポリペプチド免疫原は、参考文献１６に開示される。これらとしては、ＲｒｇＢ線毛サブユニット、β−Ｎ−アセチル−ヘキソサミニダーゼ前駆体（ｓｐｒ００５７）、ｓｐｒ００９６、一般的なストレスタンパク質（ｇｅｎｅｒａｌ ｓｔｒｅｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）ＧＳＰ−７８１（ｓｐｒ２０２１、ＳＰ２２１６）、セリン／スレオニンキナーゼＳｔｋＰ（ＳＰ１７３２）、および肺炎球菌表面アドヘシンＰｓａＡが挙げられるが、これらに限定されない。 Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ：有用な免疫原としては、参考文献１７および１８に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。 Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ：有用な百日咳免疫原としては、百日咳毒素もしくはトキソイド（ＰＴ）、線維状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）、ペルタクチン、ならびに凝集原２および３が挙げられるが、これらに限定されない。 Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ：有用な免疫原としては、参考文献１９に開示されるポリペプチド（例えば、溶血素、ｅｓｘＡ、ｅｓｘＢ、フェリクロム結合タンパク質（ｓｔａ００６）および／もしくはｓｔａ０１１リポプロテイン）が挙げられるが、これらに限定されない。 Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ：代表的な免疫原は、破傷風トキソイドである。 Ｃｏｒｎｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ：代表的な免疫原は、ジフテリアトキソイドである。 Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ：有用な免疫原としては、参考文献２０および２１に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ：有用な免疫原としては、参考文献１７に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。 Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ：有用な免疫原としては、ＰｅｐＡ、ＬｃｒＥ、ＡｒｔＪ、ＤｎａＫ、ＣＴ３９８、ＯｍｐＨ様、Ｌ７／Ｌ１２、ＯｍｃＡ、ＡｔｏＳ、ＣＴ５４７、Ｅｎｏ、ＨｔｒＡおよびＭｕｒＧ（例えば、参考文献２２に開示されるとおり）が挙げられるが、これらに限定されない。ＬｃｒＥ［２３］およびＨｔｒＡ［２４］は、２つの好ましい免疫原である。 Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：有用な免疫原としては、参考文献２５に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。 Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ：有用な免疫原としては、ＣａｇＡ、ＶａｃＡ、ＮＡＰ、および／もしくはウレアーゼ［２６］が挙げられるが、これらに限定されない。 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：有用な免疫原としては、腸毒素産生性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）、腸管凝集性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＡｇｇＥＣ）、分散接着性（ｄｉｆｆｕｓｅｌｙ ａｄｈｅｒｉｎｇ）Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＡＥＣ）、腸病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）、腸管外病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥｘＰＥＣ）および／もしくは腸管出血性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ）に由来する免疫原が挙げられるが、これらに限定されない。ＥｘＰＥＣ株としては、尿路病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＵＰＥＣ）および髄膜炎／敗血症関連Ｅ．ｃｏｌｉ（ＭＮＥＣ）が挙げられる。有用なＵＰＥＣポリペプチド免疫原は、参考文献２７および２８に開示される。有用なＭＮＥＣ免疫原は、参考文献２９に開示される。いくつかのＥ．ｃｏｌｉタイプに有用な免疫原は、ＡｃｆＤである［３０］。 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ：有用な免疫原としては、参考文献３１および３２に開示されるものが挙げられるが、これらに限定されない。 いくつかの実施形態において、上記免疫原は、これらウイルスのうちの１種に対して免疫応答を誘発する： オルソミクソウイルス：有用な免疫原は、インフルエンザＡ、ＢもしくはＣウイルスに由来し得る（例えば、ヘマグルチニン、ノイラミニダーゼもしくはマトリクスＭ２タンパク質）。上記免疫原がインフルエンザＡウイルスヘマグルチニンである場合、それは、任意のサブタイプ（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５もしくはＨ１６）に由来し得る。 パラミクソウイルス科のウイルス：ウイルス免疫原としては、肺炎ウイルス（例えば、ＲＳウイルス、ＲＳＶ）、ルブラウイルス（例えば、ムンプスウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、パラインフルエンザ・ウイルス）、メタニューモウイルスおよびモルビリウイルス（例えば、麻疹）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。 ポックスウイルス科：ウイルス免疫原としては、オルトポックスウイルス（例えば、真正痘瘡（大痘瘡および小痘瘡が挙げられるが、これらに限定されない））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。 ピコルナウイルス：ウイルス免疫原としては、ピコルナウイルス（例えば、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパルナウイルス、カルジオウイルスおよびアフトウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、上記エンテロウイルスは、ポリオウイルス（例えば、１型、２型、および／もしくは３型のポリオウイルス）である。別の実施形態において、上記エンテロウイルスは、ＥＶ７１エンテロウイルスである。別の実施形態において、上記エンテロウイルスは、コクサッキーＡもしくはＢウイルスである。 ブンヤウイルス：ウイルス免疫原としては、オルソブンヤウイルス（例えば、カリフォルニア脳炎ウイルス）、フレボウイルス（例えば、リフトバレー熱ウイルス）、もしくはナイロウイルス（例えば、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。 ヘパルナウイルス：ウイルス免疫原としては、ヘパルナウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。 フィロウイルス：ウイルス免疫原としては、フィロウイルス（例えば、エボラウイルス（ザイールエボラウイルス、アイボリーコーストエボラウイルス、レストンエボラウイルスもしくはスーダンエボラウイルスを含む））またはマールブルグウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。 トガウイルス：ウイルス免疫原としては、トガウイルス（例えば、ルビウイルス、アルファウイルス、もしくはアルテリウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。これは、風疹ウイルスを含む。 フラビウイルス：ウイルス免疫原としては、フラビウイルス（例えば、ダニ媒介脳炎（ＴＢＥ）ウイルス、デング（１、２、３もしくは４型）ウイルス、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、キャサヌール森林ウイルス、ウエストナイル脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、ポワッサン脳炎ウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。 ペスチウイルス：ウイルス免疫原としては、ペスチウイルス（例えば、牛ウイルス性下痢（ＢＶＤＶ）、豚コレラ（ＣＳＦＶ）もしくはボーダー病（ＢＤＶ））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。 ヘパドナウイルス：ウイルス免疫原としては、ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。組成物は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を含み得る。 他の肝炎ウイルス：組成物は、Ｃ型肝炎ウイルス、デルタ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、もしくはＧ型肝炎ウイルスに由来する免疫原を含み得る。 ラブドウイルス：ウイルス免疫原としては、ラブドウイルス（例えば、リッサウイルス（例えば、狂犬病ウイルス）およびベシクロウイルス（ＶＳＶ））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。 カリシウイルス科：ウイルス免疫原としては、カリシウイルス科（例えば、ノーウォークウイルス（ノロウイルス）、およびノーウォーク様ウイルス（例えば、ハワイウイルスおよびスノーマウンテンウイルス））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。 コロナウイルス：ウイルス免疫原は、ＳＡＲＳコロナウイルス、トリ伝染性気管支炎（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、およびブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。上記コロナウイルス免疫原は、スパイクポリペプチドであり得る。 レトロウイルス：ウイルス免疫原としては、オンコウイルス、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２）またはスプマウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。 レオウイルス：ウイルス免疫原としては、オルトレオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、もしくはコルチウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。 パルボウイルス：ウイルス免疫原としては、パルボウイルスＢ１９に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。 ヘルペスウイルス：ウイルス免疫原としては、ヒトヘルペスウイルス（例えば、例示に過ぎないが、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（例えば、ＨＳＶ１型および２型）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）、およびヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。 パポバウイルス：ウイルス免疫原としては、パピローマウイルスおよびポリオーマウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。上記（ヒト）パピローマウイルスは、血清型１、２、４、５、６、８、１１、１３、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４１、４２、４７、５１、５７、５８、６３もしくは６５のもの（例えば、血清型６、１１、１６および／もしくは１８のうちの１種以上に由来する）であり得る。 アデノウイルス：ウイルス免疫原としては、アデノウイルス血清型３６（Ａｄ−３６）に由来するものが挙げられる。 いくつかの実施形態において、上記免疫原は、魚類に感染するウイルス（例えば：伝染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ）、サケ膵臓病ウイルス（ＳＰＤＶ）、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、アメリカナマズウイルス（ＣＣＶ）、魚類リンホシスチス病ウイルス（ＦＬＤＶ）、伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）、コイヘルペスウイルス、サケピコルナ様ウイルス（大西洋サケピコルナ様ウイルスとしても公知）、ヤマメウイルス（ＬＳＶ）、大西洋サケロタウイルス（ＡＳＲ）、マスイチゴ病ウイルス（ＴＳＤ）、銀ザケ腫瘍ウイルス（ＣＳＴＶ）、もしくはウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ））に対する免疫応答を誘発する。 真菌免疫原は、皮膚糸状菌類（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｒｅｓ）（以下が挙げられる：に由来し得る。 いくつかの実施形態において、上記免疫原は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属（例えば、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅもしくはＰ．ｏｖａｌｅ）に由来する寄生生物に対する免疫応答を誘発する。従って、本発明は、マラリアに対して免疫するために使用され得る。いくつかの実施形態において、上記免疫原は、Ｃａｌｉｇｉｄａｅ科に由来する寄生生物、特に、Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ属およびＣａｌｉｇｕｓ属に由来する寄生生物（例えば、Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ ｓａｌｍｏｎｉｓもしくはＣａｌｉｇｕｓ ｒｏｇｅｒｃｒｅｓｓｅｙｉのようなフナムシ）に対する免疫応答を誘発する。 いくつかの実施形態において、上記免疫原は、以下に対する免疫応答を誘発する：花粉アレルゲン（樹木花粉、草本花粉、雑草の花粉、および草の花粉のアレルゲン）；昆虫もしくは蛛形類のアレルゲン（吸入、唾液および毒液のアレルゲン、例えば、ダニアレルゲン、ゴキブリアレルゲンおよび小虫アレルゲン、膜翅類毒液アレルゲン（ｈｙｍｅｎｏｐｔｈｅｒａ ｖｅｎｏｍ ａｌｌｅｒｇｅｎ））；動物の毛およびふけのアレルゲン（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、マウスなどに由来する）；ならびに食物アレルゲン（例えば、グリアジン）。樹木、草および草本に由来する重要な花粉アレルゲンは、Ｆａｇａｌｅｓ、Ｏｌｅａｌｅｓ、Ｐｉｎａｌｅｓの分類学上の目およびスズカケノキ科（ｐｌａｔａｎａｃｅａｅ）（カバノキ（Ｂｅｔｕｌａ）、ハンノキ（Ａｌｎｕｓ）、ハシバミ（Ｃｏｒｙｌｕｓ）、シデ（Ｃａｒｐｉｎｕｓ）およびオリーブ（Ｏｌｅａ）、シーダー（ＣｒｙｐｔｏｍｅｒｉａおよびＪｕｎｉｐｅｒｕｓ）、プラタナス（Ｐｌａｔａｎｕｓ）が挙げられるが、これらに限定されない）、Ｐｏａｌｅｓの目（属Ｌｏｌｉｕｍ、Ｐｈｌｅｕｍ、Ｐｏａ、Ｃｙｎｏｄｏｎ、Ｄａｃｔｙｌｉｓ、Ｈｏｌｃｕｓ、Ｐｈａｌａｒｉｓ、Ｓｅｃａｌｅ、およびＳｏｒｇｈｕｍの草が挙げられる）、ＡｓｔｅｒａｌｅｓおよびＵｒｔｉｃａｌｅｓの目（属Ａｍｂｒｏｓｉａ、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ、およびＰａｒｉｅｔａｒｉａの草本が挙げられる）から由来するそのようなものである。他の重要な吸入アレルゲンは、属ＤｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓおよびＥｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓのチリダニ類、コナダニ類（ｓｔｏｒａｇｅ ｍｉｔｅ）（例えば、Ｌｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｙｓ、ＧｌｙｃｙｐｈａｇｕｓおよびＴｙｒｏｐｈａｇｕｓ）、ゴキブリ、小虫およびノミに由来するもの（例えば、Ｂｌａｔｅｌｌａ、Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ、ＣｈｉｒｏｎｏｍｕｓおよびＣｔｅｎｏｃｅｐｐｈａｌｉｄｅｓ）、ならびに哺乳動物（例えば、ネコ、イヌおよびウマ）に由来するもの、毒液のアレルゲン（刺咬昆虫（ｓｔｉｎｇｉｎｇ ｏｒ ｂｉｔｉｎｇ ｉｎｓｅｃｔ）に由来するようなもの、例えば、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａの分類学上の目（蜂（Ａｐｉｄａｅ）、スズメバチ（Ｖｅｓｐｉｄｅａ）、およびアリ（Ｆｏｒｍｉｃｏｉｄａｅ）が挙げられる）が挙げられる）に由来するものである。 いくつかの実施形態において、上記免疫原は、以下から選択される腫瘍抗原である：（ａ）がん−精巣（ｃａｎｃｅｒ−ｔｅｓｔｉｓ）抗原、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ２、ＳＣＰ１ならびにＲＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥおよびＭＡＧＥファミリーのポリペプチド（例えば、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、およびＭＡＧＥ−１２）、これらは、例えば、黒色腫、肺、頭頸部、ＮＳＣＬＣ、乳房、胃腸、および膀胱の腫瘍に対処するために使用され得る；（ｂ）変異した抗原、例えば、ｐ５３（種々の固形腫瘍（例えば、結腸直腸がん、肺がん、頭頸部がん）と関連）、ｐ２１／Ｒａｓ（例えば、黒色腫、膵臓がんおよび結腸直腸がんと関連）、ＣＤＫ４（例えば、黒色腫と関連）、ＭＵＭ１（例えば、黒色腫と関連）、カスパーゼ−８（例えば、頭頸部がんと関連）、ＣＩＡ ０２０５（例えば、膀胱がんと関連）、ＨＬＡ−Ａ２−Ｒ１７０１、β−カテニン（例えば、黒色腫と関連）、ＴＣＲ（例えば、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫と関連）、ＢＣＲ−ａｂｌ（例えば、慢性骨髄性白血病と関連）、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ＫＩＡ ０２０５、ＣＤＣ−２７、およびＬＤＬＲ−ＦＵＴ；（ｃ）過剰発現された抗原、例えば、ガレクチン４（例えば、結腸直腸がんと関連）、ガレクチン９（例えば、ホジキン病と関連）、プロテイナーゼ３（例えば、慢性骨髄性白血病と関連）、ＷＴ １（例えば、種々の白血病と関連）、炭酸脱水酵素（例えば、腎がんと関連）、アルドラーゼＡ（例えば、肺がんと関連）、ＰＲＡＭＥ（例えば、黒色腫と関連）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（例えば、乳がん、結腸がん、肺がんおよび卵巣がんと関連）、マンマグロビン、α−フェトプロテイン（例えば、肝がんと関連）、ＫＳＡ（例えば、結腸直腸がんと関連）、ガストリン（例えば、膵臓がんおよび胃がんと関連）、テロメラーゼ触媒タンパク質、ＭＵＣ−１（例えば、乳がんおよび卵巣がんと関連）、Ｇ−２５０（例えば、腎細胞がんと関連）、ｐ５３（例えば、乳がん、結腸がんと関連）、ならびにがん胎児性抗原（例えば、乳がん、肺がん、および胃腸管のがん（例えば、結腸直腸がん）と関連）；（ｄ）共通抗原（ｓｈａｒｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）、例えば、黒色腫−メラノサイト分化抗原、例えば、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ Ａ、ｇｐ１００、ＭＣ１Ｒ、メラノサイト刺激ホルモンレセプター、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質−１／ＴＲＰ１およびチロシナーゼ関連タンパク質−２／ＴＲＰ２（例えば、黒色腫と関連）；（ｅ）前立腺関連抗原（例えば、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＨ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ２（例えば、前立腺がんと関連））；（ｆ）イムノグロブリンイディオタイプ（例えば、骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫と関連）。特定の実施形態において、腫瘍免疫原としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ｐ１５、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０、Ｈ−Ｒａｓ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタイン・バー・ウイルス抗原、ＥＢＮＡ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原（Ｅ６およびＥ７を含む）、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスの抗原、ヒトＴリンパ球向性ウイルス抗原、（Ｍａｃ−２結合タンパク質／シクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳなど。 （薬学的組成物） 本発明のリポソームは、種々の疾患に対して被験体を免疫するための薬学的組成物中の成分として有用である。これらの組成物は、代表的には、上記リポソームに加えて、薬学的に受容可能なキャリアを含む。薬学的に受容可能なキャリアの詳細な考察は、参考文献３３において入手可能である。 本発明の薬学的組成物は、１種以上の低分子免疫強化因子を含み得る。例えば、上記組成物は、ＴＬＲ２アゴニスト（例えば、Ｐａｍ３ＣＳＫ４）、ＴＬＲ４アゴニスト（例えば、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート（例えば、Ｅ６０２０））、ＴＬＲ７アゴニスト（例えば、イミキモド）、ＴＬＲ８アゴニスト（例えば、レシキモド）および／もしくはＴＬＲ９アゴニスト（例えば、ＩＣ３１）を含み得る。任意のこのようなアゴニストは、理想的には、分子量＜２０００Ｄａを有する。ＲＮＡが封入される場合、いくつかの実施形態において、このようなアゴニストもまた、上記ＲＮＡとともに封入されるが、他の実施形態において、それらは、封入されない。ＲＮＡが粒子に吸着させられる場合、いくつかの実施形態において、このようなアゴニストもまた、上記ＲＮＡと一緒に吸着させられるが、他の実施形態において、それらは吸着させられない。 本発明の薬学的組成物は、上記リポソームを、ただの水（ｐｌａｉｎ ｗａｔｅｒ）（例えば、ｗ．ｆ．ｉ．）もしくは緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、もしくはクエン酸緩衝液）中に含み得る。緩衝塩は、代表的には、５〜２０ｍＭ範囲において含まれる。 本発明の薬学的組成物は、５．０〜９．５（例えば、６．０〜８．０）のｐＨを有し得る。 本発明の組成物は、張度を与えるために、ナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含み得る。１０±２ｍｇ／ｍｌ ＮａＣｌの濃度が代表的である（例えば、約９ｍｇ／ｍｌ）。 本発明の組成物は、金属イオンキレート化剤を含み得る。これらは、ホスホジエステル加水分解を加速し得るイオンを除去することによって、ＲＮＡ安定性を延長し得る。従って、組成物は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＢＡＰＴＡ、ペンテト酸などのうちの１種以上を含み得る。このようなキレート化剤は、代表的には、１０〜５００μＭ（例えば、０．１ｍＭ）で存在する。クエン酸塩（例えば、クエン酸ナトリウム）はまた、キレート化剤として作用し得るのと同時に、有利なことには、緩衝化活性も提供し得る。 本発明の薬学的組成物は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ（例えば、２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、もしくは２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇ）の重量オスモル濃度を有し得る。 本発明の薬学的組成物は、１種以上の保存剤（例えば、チオメルサールもしくは２−フェノキシエタノール）を含み得る。水銀非含有組成物が好ましく、保存剤非含有ワクチンが調製され得る。 本発明の薬学的組成物は、好ましくは、無菌である。 本発明の薬学的組成物は、好ましくは、非発熱性である（例えば、１用量あたり＜１ ＥＵ（エンドトキシンユニット、標準尺度）、および好ましくは、１用量あたり＜０．１ ＥＵを含む）。 本発明の薬学的組成物は、好ましくは、グルテンを含まない。 本発明の薬学的組成物は、単位用量形態において調製され得る。いくつかの実施形態において、単位用量は、０．１〜１．０ｍｌ（例えば、約０．５ｍｌ）の容積を有し得る。 上記組成物は、注射物として調製され得る（溶液もしくは懸濁物のいずれかとして）。上記組成物は、微細スプレーを使用する、肺投与（例えば、吸入器による）のために調製され得る。上記組成物は、鼻、耳もしくは眼への投与（例えば、スプレーもしくは滴剤として）のために調製され得る。筋肉内投与のための注射物が、代表的である。 組成物は、免疫学的に有効量のリポソーム、ならびに任意の他の成分（必要であれば）を含む。「免疫学的に有効な量」とは、個体への投与量が、単一用量においてもしくはシリーズのうちの一部としてのいずれかで、処置もしくは予防に有効であることを意味する。この量は、処置されるべき個体の健康状態および身体的状態、処置されるべき個体の年齢、分類学上の群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、上記個体が抗体を合成する免疫系の能力、所望される防御の程度、ワクチンの処方、その処置している医師の医学的状況の評価、および他の関連因子に依存して変動する。上記量は、慣用的な治験を通じて決定され得る比較的広い範囲に入ると予測される。本発明の組成物のリポソームおよびＲＮＡ含有量は、一般に、１用量あたりのＲＮＡの量に関して表される。好ましい用量は、≦１００μｇ ＲＮＡ（例えば、１０〜１００μｇ（例えば、約１０μｇ、２５μｇ、５０μｇ、７５μｇもしくは１００μｇ））を有するが、発現は、遙かに低いレベル、例えば、≦１μｇ／用量、≦１００ｎｇ／用量、≦１０ｎｇ／用量、≦１ｎｇ／用量などにおいてみられ得る。 本発明はまた、本発明の薬学的組成物を含む送達デバイス（例えば、シリンジ、ネブライザ、噴霧器、吸入器、皮膚パッチなど）を提供する。このデバイスは、上記組成物を脊椎動物被験体に投与するために使用され得る。 本発明のリポソームは、リボソームを含まない。 （処置方法および医学的使用） 参考文献１４で開示される粒子とは対照的に、本発明のリポソームおよび薬学的組成物は、目的の免疫原に対する免疫応答を誘発するためのインビボでの使用のためのものである。 本発明は、本発明のリポソームもしくは薬学的組成物の有効量を投与する工程を包含する、脊椎動物において免疫応答を惹起するための方法を提供する。上記免疫応答は、好ましくは、防御的であり、好ましくは、抗体および／もしくは細胞媒介性免疫を含む。上記方法は、ブースター応答を惹起し得る。 本発明はまた、脊椎動物における免疫応答を惹起するための方法において使用するための本発明のリポソームもしくは薬学的組成物を提供する。 本発明はまた、脊椎動物における免疫応答を惹起するための医薬の製造における本発明のリポソームの使用を提供する。 これら使用および方法により上記脊椎動物における免疫応答を惹起することによって、上記脊椎動物は、上記で考察されるように、種々の疾患および／もしくは感染から（例えば、細菌疾患および／もしくはウイルス疾患から）防御され得る。上記リポソームおよび組成物は、免疫原性であり、より好ましくは、ワクチン組成物である。本発明に従うワクチンは、予防的である（すなわち、感染を妨ぐ）か、もしくは治療的である（すなわち、感染を処置する）のいずれかであり得るが、代表的には、予防的である。 上記脊椎動物は、好ましくは、哺乳動物、例えば、ヒトもしくは大型の獣医学的哺乳動物（例えば、ウマ、ウシ、シカ、ヤギ、ブタ）である。上記ワクチンが予防的使用のためのものである場合、上記ヒトは、好ましくは、小児（例えば、幼児もしくは乳児）またはティーンエイジャーである；上記ワクチンが治療的使用のためのものである場合、上記ヒトは、好ましくは、ティーンエイジャーもしくは成人である。小児用に意図されたワクチンはまた、例えば、安全性、投与量、免疫原性などを評価するために、成人に投与され得る。 本発明に従って調製されるワクチンは、小児および成人の両方を処置するために使用され得る。従って、ヒト患者は、１歳未満、５歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、もしくは少なくとも５５歳であってもよい。上記ワクチンを受けるのに好ましい患者は、高齢者（例えば、≧５０歳、≧６０歳、および好ましくは、≧６５歳）、若年者（例えば、≦５歳）、入院患者、ヘルスケアワーカー、軍従事者、および軍職員、妊婦、慢性疾患患者、もしくは免疫不全患者である。上記ワクチンは、これら群にのみ適切であるわけではなく、より一般に、集団において使用され得る。 本発明の組成物は、一般に、患者に直接投与される。直接送達は、非経口注射によって達成され得る（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内、もしくは組織の間隙空間に；参考文献１とは異なり、舌内（ｉｎｔｒａｇｌｏｓｓａｌ）注射は、代表的には、本発明で使用されない）。代替の送達経路としては、直腸、経口（例えば、錠剤、スプレー）、口内、舌下、膣、局所、経真皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）もしくは経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、鼻内、眼、耳、肺もしくは他の粘膜投与が挙げられる。皮内および筋肉内投与は、２つの好ましい経路である。注射は、針を介してであってもよい（例えば、皮下針）が、針なしの注射が、代わりに使用され得る。代表的な筋肉内用量は、０．５ｍｌである。 本発明は、全身免疫および／もしくは粘膜免疫を誘発するために、好ましくは、増強された全身免疫および／もしくは粘膜免疫を誘発するために、使用され得る。 投与量は、単一用量スケジュールもしくは複数用量スケジュールによってであり得る。複数用量は、一次免疫スケジュールにおいて、および／もしくはブースター免疫スケジュールにおいて使用され得る。複数用量スケジュールにおいて、種々の用量が、同じ経路もしくは異なる経路（例えば、非経口の一次と粘膜のブースト、粘膜の一次と非経口のブーストなど）によって与えられ得る。複数用量は、代表的には、少なくとも１週間間隔を空けて（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）投与される。一実施形態において、複数用量は、生後約６週間、１０週間、および１４週間で（例えば、世界保健機関のＥｘｐａｎｄｅｄ Ｐｒｏｇｒａｍ ｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ（「ＥＰＩ」）においてしばしば使用されるように、６週齢、１０週齢および１４週齢において）投与され得る。代替の実施形態において、２回の一次用量が、約２ヶ月間隔を空けて（例えば、約７週間、８週間もしくは９週間間隔を空けて）投与され、続いて、１回以上のブースター用量が、２回目の一次用量の約６ヶ月から１年後に（例えば、２回目の一次用量の約６ヶ月後、８ヶ月後、１０ヶ月後もしくは１２ヶ月後）投与される。さらなる実施形態において、３回の一次用量が、約２ヶ月間隔を空けて（例えば、約７週間、８週間もしくは９週間間隔を空けて）投与され、続いて、１回以上のブースター用量が、３回目の一次用量の約６ヶ月後から１年後に（例えば、３回目の一次用量の約６ヶ月後、８ヶ月後、１０ヶ月後もしくは１２ヶ月後）投与される。 （一般） 本発明の粒子は、別段示されなければ、化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の、当該分野の技術内の従来の方法を使用する。このような技術は、文献中に十分に説明されている。例えば、参考文献３４〜４０などを参照のこと。 用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘから専らなってもよいし、何かさらなるものを含んでいてもよい（例えば、Ｘ＋Ｙ）。 数値ｘに関して用語「約」とは、選択的であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。 語句「実質的に」とは、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まない場合もある。必要な場合、語句「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。 電荷、カチオン、アニオン、両性イオンなどへの言及は、ｐＨ７において取り扱われる。 ＴＬＲ３は、Ｔｏｌｌ様レセプター３である。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす一回膜貫通レセプターである。既知のＴＬＲ３アゴニストは、ポリ（Ｉ：Ｃ）を含む。「ＴＬＲ３」は、このレセプターをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名であり、その特有のＨＧＮＣ ＩＤは、ＨＧＮＣ：１１８４９である。ヒトＴＬＲ３遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：２４５９６２５である。 ＴＬＲ７は、Ｔｏｌｌ様レセプター７である。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす一回膜貫通レセプターである。既知のＴＬＲ７アゴニストは、例えば、イミキモドを含む。「ＴＬＲ７」は、このレセプターをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名であり、その特有のＨＧＮＣ ＩＤは、ＨＧＮＣ：１５６３１である。ヒトＴＬＲ７遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：６７９４４６３８である。 ＴＬＲ８は、Ｔｏｌｌ様レセプター８である。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす一回膜貫通レセプターである。既知のＴＬＲ８アゴニストは、例えば、レシキモドを含む。「ＴＬＲ８」は、このレセプターをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名であり、その特有のＨＧＮＣ ＩＤは、ＨＧＮＣ：１５６３２である。ヒトＴＬＲ８遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：２０３０２１６５である。 ＲＩＧ−Ｉ様レセプター（「ＲＬＲ」）ファミリーは、先天的免疫系において重要な役割を果たす種々のＲＮＡヘリカーゼを含む［４１］。ＲＬＲ−１（ＲＩＧ−Ｉもしくはレチノイン酸誘導性遺伝子Ｉとしても公知）は、そのＮ末端付近にある２つのカスパーゼリクルートドメインを有する。上記ＲＬＲ−１ヘリカーゼをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名は、「ＤＤＸ５８」（ＤＥＡＤ（Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ）ボックスポリペプチド５８（ＤＥＡＤ （Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ） ｂｏｘ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ５８）について）であり、その特有のＨＧＮＣ ＩＤは、ＨＧＮＣ：１９１０２である。ヒトＲＬＲ−１遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：７７７３２５１４である。ＲＬＲ−２（ＭＤＡ５もしくは黒色腫分化関連遺伝子５（ｍｅｌａｎｏｍａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ５）としても公知）はまた、そのＮ末端付近にある２つのカスパーゼリクルートドメインを有する。ＲＬＲ−２ヘリカーゼをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名は、「ＩＦＩＨ１」（ヘリカーゼＣドメイン１で誘導されるインターフェロン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ｈｅｌｉｃａｓｅ Ｃ ｄｏｍａｉｎ １）について）であり、特有のＨＧＮＣ ＩＤは、ＨＧＮＣ：１８８７３である。ヒトＲＬＲ−２遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ： ２７８８６５６７である。ＲＬＲ−３（ＬＧＰ２もしくは遺伝学および生理学研究室２（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２）としても公知）は、カスパーゼリクルートドメインを有さない。ＲＬＲ−３ヘリカーゼをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名は、 「ＤＨＸ５８」（ＤＥＸＨ（Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｈｉｓ）ボックスポリペプチド５８について）であり、特有のＨＧＮＣ ＩＤは、ＨＧＮＣ：２９５１７である。ヒトＲＬＲ−３遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：１４９４０８１２１である。 ＰＫＲは、二本鎖ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼである。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす。「ＥＩＦ２ＡＫ２」（真核生物翻訳開始因子２−αキナーゼ２（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２−ａｌｐｈａ ｋｉｎａｓｅ ２）について）は、この酵素をコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名であり、その特有のＨＧＮＣ ＩＤは、ＨＧＮＣ：９４３７である。ヒトＰＫＲ遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：２０８４３１８２５である。図１は、染色されたＲＮＡを有するゲルを示す。レーンは、（１）マーカー、（２）裸のレプリコン、（３）ＲＮａｓｅ処理後のレプリコン、（４）リポソームに封入されたレプリコン、（５）ＲＮａｓｅ処理後のリポソーム、（６）ＲＮａｓｅで処理し、次いで、フェノール／クロロホルム抽出に供したリポソーム、を示す。図２は、リポソームの電子顕微鏡写真である。図３は、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡおよびＤＯＤＭＡの構造を示す。図４は、染色されたＲＮＡを有するゲルを示す。レーンは、（１）マーカー、（２）裸のレプリコン、（３）リポソームに封入されたレプリコン、（４）ＲＮａｓｅで処理し、次いで、フェノール／クロロホルム抽出に供したリポソームを示す。図５は、ビリオンパッケージングされたレプリコン（四角）として、裸のＲＮＡ（菱形）として、もしくはリポソーム中（＋＝０．１μｇ、×＝１μｇ）においてＲＮＡを送達した後、１日目、３日目および６日目でのタンパク質発現を示す。図６は、リポソーム封入ＲＮＡの４種の異なる用量を送達した後、１日目、３日目および６日目でのタンパク質発現を示す。図７は、ビリオンパッケージングされたレプリコン（ＶＲＰもしくはＶＳＲＰ）、１μｇ 裸のＲＮＡ、および１μｇ リポソーム封入ＲＮＡを与えられた動物における抗Ｆ ＩｇＧ力価を示す。図８は、ＶＲＰ、１μｇ 裸のＲＮＡ、および０．１ｇもしくは１μｇのリポソーム封入ＲＮＡを与えられた動物における抗Ｆ ＩｇＧ力価を示す。図９は、ＶＲＰ、または０．１ｇもしくは１μｇのリポソーム封入ＲＮＡのいずれかを与えられた動物における中和抗体力価を示す。図１０は、裸のＲＮＡ（丸）、リポソーム封入ＲＮＡ（三角および四角）、またはリポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）（逆三角）としてレプリコンを送達した後の発現レベルを示す。図１１は、レプリコンを裸のＲＮＡとして（０．０１〜１μｇ）、リポソーム封入ＲＮＡとして（０．０１〜１０μｇ）、またはビリオンとしてパッケージングされたものとして（ＶＲＰ、１０６ 感染単位もしくはＩＵ）、送達した後のＦ特異的ＩｇＧ力価（２回目の用量後２週間）を示す。図１２は、レプリコンを裸のＲＮＡとして（１μｇ）、リポソーム封入ＲＮＡとして（０．１もしくは１μｇ）、またはビリオンとしてパッケージングされたものとして（ＶＲＰ、１０６ ＩＵ）、送達した後のＦ特異的ＩｇＧ力価（丸）およびＰＲＮＴ力価（四角）を示す。ナイーブマウスの力価もまた、示す。実線は、幾何平均を示す。図１３は、２回目の用量の４週間後、Ｆタンパク質中の主要なエピトープを表す合成ペプチドで再刺激した後の細胞内サイトカイン生成を示す。ｙ軸は、ＣＤ８＋ＣＤ４−の％サイトカイン＋を示す。図１４は、仔ウシの免疫後６３日間（図１４Ａ）および２１０日間（図１４Ｂ）にわたるＦ特異的ＩｇＧ力価（平均ｌｏｇ１０力価±標準偏差）を示す。その３つの線は、６３日目において容易に区別され、下から上へ：ＰＢＳ陰性コントロール；リポソーム送達ＲＮＡ；および「Ｔｒｉａｎｇｌｅ ４」製品である。図１４は、仔ウシの免疫後６３日間（図１４Ａ）および２１０日間（図１４Ｂ）にわたるＦ特異的ＩｇＧ力価（平均ｌｏｇ１０力価±標準偏差）を示す。その３つの線は、６３日目において容易に区別され、下から上へ：ＰＢＳ陰性コントロール；リポソーム送達ＲＮＡ；および「Ｔｒｉａｎｇｌｅ ４」製品である。図１５は、上記リポソームにおいて使用される脂質のｐＫａに対する６日目のＳＥＡＰ発現（相対強度）を示す。丸は、ＤＳＰＣを有するリポソームについてのレベルを示し、四角は、ＤＳＰＣなしのリポソームについてのレベルを示す；ときおり、四角と丸は重なっており、上記四角だけが所定のｐＫａについて見えるようにしている。図１６は、Ｆタンパク質をコードするレプリコンの第１の投与の２週間後の、抗Ｆ力価の発現（ＲＶ０１，１００％に対して）を示す。上記力価は、図１５におけるのと同じようにしてｐＫａに対してプロットされている。星印は、他の脂質より高いｐＫａを有するカチオン性脂質を使用したＲＶ０２を示す。三角は、ＤＳＰＣを欠いているリポソームについてのデータを示す；丸は、ＤＳＰＣを含んだリポソームについてのデータである。図１７は、左から右に、ＲＶ０１、ＲＶ１６、ＲＶ１７、ＲＶ１８もしくはＲＶ１９を使用するリポソームにおけるレプリコン送達後の、総ＩｇＧ力価を示す。バーは、平均値を示す。各場合における上側のバーは、２ｗｐ２（すなわち、第２の投与の２週間後）であるのに対して、下側のバーは、２ｗｐ１である。図１８は、１３のマウス群におけるＩｇＧ力価を示す。各々の丸は、個々のマウスであり、実線は、幾何平均を示す。水平な破線は、アッセイの検出限界である。上記１３の群は、左から右に、以下に示されるようにＡからＭである。図１９は、ｐＤＣによって放出された（Ａ）ＩＬ−６および（Ｂ）ＩＦＮα（ｐｇ／ｍｌ）を示す。４対のバーがあり、左から右に：コントロール；ＲＮＡ＋ＤＯＴＡＰで免疫；ＲＮＡ＋リポフェクタミンで免疫；およびリポソーム中のＲＮＡで免疫である。各対において、その黒いバーは、野生型マウスであり、灰色は、ｒｓｑ１変異体である。 （ＲＮＡレプリコン） 種々のレプリコンは、以下で使用される。一般に、これらは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）に由来する非構造タンパク質、シンドビス・ウイルス由来のパッケージングシグナル、およびシンドビス・ウイルスもしくはＶＥＥＶ変異体に由来する３’ＵＴＲを有するハイブリッドアルファウイルスゲノムに基づく。上記レプリコンは、約１０ｋｂ長であり、ポリＡ尾部を有する。 アルファウイルスレプリコンをコードするプラスミドＤＮＡ（名称：ｐＴ７−ｍＶＥＥＶ−ＦＬ．ＲＳＶＦもしくはＡ３１７；ｐＴ７−ｍＶＥＥＶ−ＳＥＡＰもしくはＡ３０６；ｐＳＰ６−ＶＣＲ−ＧＦＰもしくはＡ５０）を、インビボでのＲＮＡ合成のテンプレートとして供した。上記レプリコンは、ＲＮＡ複製に必要とされるアルファウイルス遺伝的エレメントを含むが、粒子アセンブリに必要な遺伝子産物をコードするエレメントを欠いている；構造タンパク質は、代わりに、目的のタンパク質（レポーター（例えば、ＳＥＡＰもしくはＧＦＰ）または免疫原（例えば、全長ＲＳＶ Ｆタンパク質）のいずれか）によって置き換えられるので、上記レプリコンは、感染性粒子の生成を誘導できない。上記アルファウイルスｃＤＮＡの上流にあるバクテリオファージ（Ｔ７もしくはＳＰ６）プロモーターは、インビトロで上記レプリコンＲＮＡの合成を促進し、上記ポリ（Ａ）尾部の直ぐ下流にあるデルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイムは、その自己切断活性を介して正確な３’末端を生成する。 適切な制限エンドヌクレアーゼで上記ＨＤＶリボザイムの下流で上記プラスミドＤＮＡを直線状にした後に、ランオフ転写物（ｒｕｎ−ｏｆｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）を、Ｔ７もしくはＳＰ６バクテリオファージ由来ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、インビトロで合成した。転写を、製造業者（Ａｍｂｉｏｎ）によって提供される指示書に従って、ヌクレオシドトリホスフェート（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ）の各々の７．５ｍＭ（Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ）もしくは５ｍＭ（ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）の存在下で、３７℃において２時間にわたって行った。転写の後、上記テンプレートＤＮＡを、ＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ）で消化した。上記レプリコンＲＮＡを、ＬｉＣｌで沈殿させ、ヌクレアーゼ非含有水中で再構成した。キャップのないＲＮＡを、ＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｍ７Ｇキャッピングシステム（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ユーザーマニュアルに概説されるとおり、ワクシニアキャッピング酵素（ＶＣＥ）で転写後にキャップした；このようにキャップしたレプリコンに、「ｖ」の接頭文字を付ける（例えば、ｖＡ３１７は、ＶＣＥによってキャップされたＡ３１７レプリコンである）。転写後キャップされたＲＮＡを、ＬｉＣｌで沈殿させ、ヌクレアーゼ非含有水中で再構成した。上記ＲＮＡサンプルの濃度を、ＯＤ２６０ｎｍを測定することによって決定した。上記インビトロ転写物の完全性を、変性アガロースゲル電気泳動によって確認した。 （リポソーム封入） ＲＮＡを、参考文献１１および４２の方法によって作製したリポソーム中に封入した。上記リポソームを、１０％ ＤＳＰＣ（両性イオン性）、４０％ ＤＬｉｎＤＭＡ（カチオン性）、４８％ コレステロールおよび２％ ＰＥＧ結合体化ＤＭＧ（２ｋＤａ ＰＥＧ）から作製した。これら割合は、総リポソーム中の％モルに言及する。 ＤＬｉｎＤＭＡ（１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン）を、参考文献６の手順を使用して合成した。ＤＳＰＣ（１，２−ジアステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）を、Ｇｅｎｚｙｍｅから購入した。コレステロールを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た。ＰＥＧ結合体化ＤＭＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール），アンモニウム塩）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン，塩化物塩）およびＤＣ−ｃｈｏｌ（３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロールヒドロクロリド）は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓからであった。 簡潔には、脂質をエタノール（２ｍｌ）中に溶解し、ＲＮＡレプリコンを、緩衝液（２ｍｌ，１００ｍＭ クエン酸ナトリウム，ｐＨ６）中に溶解し、これらを２ｍｌの緩衝液と混合し、続いて、１時間平衡化させた。上記混合物を６ｍｌの緩衝液で希釈し、次いで、濾過した。得られた生成物は、リポソームを含み、約９５％の封入効率であった。 例えば、１つの特定の方法において、新鮮な脂質ストック溶液を、エタノール中で調製した。３７ｍｇのＤＬｉｎＤＭＡ、１１．８ｍｇのＤＳＰＣ、２７．８ｍｇのコレステロールおよび８．０７ｍｇのＰＥＧ−ＤＭＧを秤量し、７．５５ｍＬのエタノール中に溶解した。新たに調製した脂質ストック溶液を、３７℃において約１５分間にわたって穏やかに振盪して、均質な混合物を形成した。次いで、７５５μＬの上記ストックを、１．２４５ｍＬ エタノールに添加して、作業脂質ストック溶液２ｍＬを作製した。この脂質量を使用して、２５０μｇ ＲＮＡを有するリポソームを形成した。ＲＮＡの２ｍＬ 作業溶液をまた、１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）中の約１μｇ／μＬのストック溶液から調製した。３つの２０ｍＬ ガラスバイアル（撹拌子有り）を、ＲＮａｓｅ Ａｗａｙ溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）ですすぎ、使用前に多量のＭｉｌｌｉＱ水で洗浄して、上記バイアルのＲＮａｓｅの汚染を除去した。上記バイアルのうちの１つを、上記ＲＮＡ作業溶液に使用し、他のものを脂質およびＲＮＡ混合物を集めるために使用した（後に記載されるとおり）。作業脂質溶液およびＲＮＡ溶液を、３７℃において１０分間にわたって加熱し、その後、３ｃｃ ルーアーロックシリンジに入れた。２ｍＬ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）を、別の３ｃｃ シリンジに入れた。ＲＮＡおよび脂質を含むシリンジを、ＦＥＰチューブ（フッ化エチレン−プロピレン；使用したすべてのＦＥＰチューブは、２ｍｍ内径および３ｍｍ外径を有する）を使用して、Ｔミキサー（ＰＥＥＫＴＭ ５００μｍ ＩＤ接合部，Ｉｄｅｘ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ）に接続した。上記Ｔミキサーからの出口もまた、ＦＥＰチューブであった。上記クエン酸緩衝液を含む第３のシリンジを、別個の１つのＦＥＰチューブに接続した。次いで、すべてのシリンジを、流量７ｍＬ／分においてシリンジポンプを使用して作動させた。上記チューブ出口を、２０ｍＬ ガラスバイアルに上記混合物を集めるように配置した（撹拌しながら）。上記撹拌子を取り出し、上記エタノール／水性溶液を、室温へと１時間にわたって平衡化させた。上記混合物のうちの４ｍｌを、５ｃｃ シリンジに入れ、これを、ＦＥＰチューブの１つに接続し、別の５ｃｃ シリンジを、等しい長さのＦＥＰチューブに接続し、等量の１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）を入れた。上記２本のシリンジを、上記シリンジポンプを使用して７ｍＬ／分の流量において作動させ、最終の混合物を、２０ｍＬ ガラスバイアルに集めた（撹拌しながら）。次に、第２の混合工程（リポソーム）から集めた上記混合物を、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ膜（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから得られる、結合してアニオン性分子を除去するアニオン交換支持体）を通過させた。上記リポソームに関してこの膜を使用する前に、４ｍＬの１Ｍ ＮａＯＨ、４ｍＬの１Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＬの１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）が、連続してこの膜を通過した。リポソームを、１０分間にわたって３７℃において加温し、その後、上記膜を通過させた。次に、接線流濾過を使用することによって、リポソームを２ｍＬに濃縮し、１０〜１５容積の１×ＰＢＳに対して透析し、その後、最終生成物を収集した。上記ＴＦＦシステムおよび中空ファイバー濾過膜を、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ（Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ）から購入し、上記製造業者のガイドラインに従って使用した。１００ｋＤ孔サイズカットオフおよび８ｃｍ２ 表面積を有するポリスルホン中空ファイバー濾過膜を使用した。インビトロおよびインビボ実験に関しては、処方物を、１×ＰＢＳで、必要とされるＲＮＡ濃度へと希釈した。 図２は、これら方法によって調製されるリポソームの例示的な電子顕微鏡写真を示す。これらリポソームは、封入された、全長ＲＳＶ Ｆ抗原をコードするＲＮＡを含む。１つのバッチの動的光散乱は、平均直径１４１ｎｍ（強度で）もしくは７８ｎｍ（数で）を示した。 封入されたＲＮＡのパーセンテージおよびＲＮＡの濃度を、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡ試薬キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって、製造業者の指示書に従って決定した。上記キット中に提供されたリボソームＲＮＡ標準を使用して、標準曲線を作成した。リポソームを、１×ＴＥ緩衝液（キットから）中で、１０×もしくは１００×に希釈し、その後、色素を添加した。別個に、リポソームを、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘを含む１×ＴＥ緩衝液中で１０×もしくは１００×に希釈し、その後、色素を添加した（上記リポソームを破壊するため。従って、総ＲＮＡをアッセイするため）。その後、等量の色素を各溶液に添加し、次いで、色素添加後の約１８０μＬの各溶液を、二連において、９６ウェル組織培養プレートに入れた。蛍光（励起４８５ｎｍ，発光５２８ｎｍ）を、マイクロプレートリーダーで読み取った。すべてのリポソーム処方物を、封入されたＲＮＡの量に基づいて、インビボで投与した。 リポソームにおける封入は、ＲＮａｓｅ消化からＲＮＡを保護することを示した。実験では、３．８ｍＡＵのＲＮａｓｅ Ａ／μｇ ＲＮＡを使用し、３０分間にわたって室温においてインキュベートした。ＲＮａｓｅを、プロテイナーゼＫで、５５℃において１０分間にわたって不活性化した。次いで、サンプル 対 ２５：２４：１ ｖ／ｖ／ｖ，フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールの１：１ ｖ／ｖ混合物を添加して、上記ＲＮＡを上記脂質から水相へと抽出した。サンプルを、数秒間にわたってボルテックスすることによって混合し、次いで、１２ｋ ＲＰＭにおける１５分間にわたる遠心分離に置いた。上記水相（上記ＲＮＡを含む）を取り出し、上記ＲＮＡを分析するために使用した。ローディング前に（４００ｎｇ ＲＮＡ／ウェル）、上記サンプルすべてを、ホルムアルデヒドローディング色素とともにインキュベートし、１０分間にわたって６５℃において変性させ、室温へと冷却した。Ａｍｂｉｏｎ Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍマーカーを使用して、上記ＲＮＡ構築物の分子量を概算した。上記ゲルを、９０Ｖにおいて泳動した。上記ゲルを、室温において１時間にわたって振盪することによって、製造業者のガイドラインに従って、水中の０．１％ ＳＹＢＲゴールドを使用して染色した。図１は、封入の非存在下でＲＮａｓｅがＲＮＡを完全に消化することを示す（レーン３）。ＲＮＡは、封入後に検出不能であり（レーン４）、これらリポソームがＲＮａｓｅで処理されても全く変化が認められない（レーン４）。ＲＮａｓｅ処理リポソームをフェノール抽出に供した後、消化されていないＲＮＡが認められる（レーン６）。４℃において１週間後ですら、上記ＲＮＡを、いかなるフラグメント化もなしに認めることができた（図４，矢印）。インビボでのタンパク質発現は、４℃において６週間および１回の凍結融解サイクル後にも変化しなかった。従って、リポソーム封入ＲＮＡは安定である。 上記ＲＮＡのインビボ発現を評価するために、免疫原ではなく、レポーター酵素（ＳＥＡＰ；分泌型アルカリホスファターゼ）を、上記レプリコン中にコードさせた。発現レベルを、化学発光アルカリホスファターゼ基質を使用して、１×Ｐｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔ希釈緩衝液中で１：４希釈した血清中で測定した。８〜１０週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（５匹／群）に、０日目に、０．１μｇもしくは１μｇ ＲＮＡ用量で５０μｌ／脚を筋肉内に注射した。同じベクターを、１μｇにおいて上記リポソームなしで（ＲＮａｓｅ非含有１×ＰＢＳ中で）も投与した。ビリオンパッケージングされたレプリコンもまた、試験した。本明細書で使用したビリオンパッケージングされたレプリコン（「ＶＲＰ」と呼ぶ）を、参考文献４３の方法によって得た。ここでアルファウイルスレプリコンは、変異ＶＥＥＶに由来するか、またはシンドビスウイルスの３’ＵＴＲおよびシンドビスウイルスパッケージングシグナル（ＰＳ）を含むように操作されたＶＥＥＶのゲノムから得られるキメラであり、シンドビスウイルスキャプシドおよび糖タンパク質遺伝子をコードする欠損性ヘルパーＲＮＡと共にＢＨＫ細胞へと共エレクトロポレーション（ｃｏ−ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｎｇ）することによってパッケージングした。 図５に示されるように、封入は、１μｇ用量においてＳＥＡＰレベルを約１／２対数増大させ、６日目において、０．１μｇ 封入用量からの発現は、１μｇ 非封入用量で認められたレベルに匹敵した。３日目までに、発現レベルは、ＶＲＰで達成されたものを超えた（四角）。従って、発現は、裸のＲＮＡコントロールと比較して、１０×低用量においてすら、上記ＲＮＡが上記リポソーム中に処方された場合に増大された。発現はまた、上記ＶＲＰコントロールと比較して高かったが、発現の動態は、非常に異なっていた（図５を参照のこと）。エレクトロポレーションを用いた上記ＲＮＡの送達は、上記裸のＲＮＡコントロールと比較して増大した発現を生じたが、これらレベルは、リポソームでのものより低かった。 上記リポソーム群において認められる効果が、上記リポソームの成分にのみ起因したのか、または上記封入に関連していたのかを評価するために、上記レプリコンを、封入形態（２種の異なる精製プロトコルで，０．１μｇ ＲＮＡ）において、または上記リポソームの形成後にそのリポソームと混合して（非封入「ｌｉｐｏｐｌｅｘ」，０．１μｇ ＲＮＡ）、または裸のＲＮＡ（１μｇ）として、投与した。図１０は、上記ｌｉｐｏｐｌｅｘが、最低レベルの発現を与えたことを示し、これは、封入が強力な発現に必須であることを示す。 リポソーム送達を使用するインビボ研究から、これら知見が確認された。マウスには、（ｉ）全長ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする自己複製ＲＮＡレプリコン、（ｉｉ）自己複製ＧＦＰコードＲＮＡレプリコン、（ｉｉｉ）自己複製を排除するｎｓＰ４においてノックアウトを有するＧＦＰコードＲＮＡレプリコン、（ｉｖ）全長ＲＳＶ Ｆタンパク質の種々の組み合わせを与えた。合計１３群に与えた： 図１８における結果は、Ｆ特異的ＩｇＧ応答は、単なる共送達よりむしろ上記リポソーム中の封入を必要としたことを示す（群Ｃおよび群Ｄを比較のこと）。群Ｋ、群Ｌおよび群Ｍの比較は、上記ＲＮＡは、共送達されたタンパク質に対してアジュバント効果を提供し、この効果は、複製ＲＮＡおよび非複製ＲＮＡの両方で認められたことを示す。 さらなるＳＥＡＰ実験から、インビボで明らかな用量応答が示された。発現は、１ｎｇほどのＲＮＡの送達後にも認められた（図６）。封入レプリコンからの発現と裸のレプリコンからの発現とを比較するさらなる実験から、０．０１μｇ 封入ＲＮＡは、１μｇの裸のＲＮＡに等しいことが示された。ＲＮＡの０．５μｇ用量において、上記封入物質は、６日目において１２倍高い発現を与えた；０．１μｇ用量レベルでは、６日目において２４倍高かった。 上記群において平均レベルで調べるだけでなく、個々の動物もまた研究した。いくらかの動物は、裸のレプリコンに対して非応答者であったのに対して、封入は、非応答者を排除した。 さらなる実験では、ＤＬｉｎＤＭＡをＤＯＴＡＰで置換した。ＤＯＴＡＰリポソームは、裸のレプリコンより良好な発現を与えたが、それらは、ＤＬｉｎＤＭＡリポソームより劣っていた（１日目において２〜３倍の差異）。ＤＯＴＡＰは、四級アミンを有し、それゆえ送達の点において正電荷を有するのに対し、ＤＬｉｎＤＭＡは、三級アミンを有する。 インビボでの免疫原性を評価するために、レプリコンを構築して、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）に由来する全長Ｆタンパク質を発現させた。これを、裸（１μｇ）、リポソーム中に封入（０．１もしくは１μｇ）、またはビリオン中でパッケージング（１０６ ＩＵ；「ＶＲＰ」）で、０日目および２１日目に送達した。図７は、２回目の用量の２週間後の抗ＦのＩｇＧ力価を示す。上記リポソームは、明らかに免疫原性を増強する。図８は、２週間後の力価を示す。この時点までに、０．１μｇの上記封入ＲＮＡと、１μｇの上記封入ＲＮＡと、上記ＶＲＰ群との間に統計学的差異は何らなかった。中和力価（６０％のプラーク減少として測定，「ＰＲＮＴ６０」）は、２回目の用量の２週間後に、これら３群において有意差はなかった（図９）。図１２は、２回目の用量の４週間後のＩｇＧ力価およびＰＲＮＴ力価の両方を示す。 図１３は、上記ＲＮＡが堅調なＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘発することを確認する。 さらなる実験において、ＶＲＰ、０．１μｇ リポソーム封入ＲＮＡ、もしくは１μｇ リポソーム封入ＲＮＡを与えられたマウスにおけるＦ特異的ＩｇＧ力価を比較した。２回目の用量の後の種々の時点での力価比（ＶＲＰ：リポソーム）は、以下のとおりであった： 従って、上記リポソーム封入ＲＮＡは、ビリオン送達で認められるのと本質的に同程度の免疫応答を誘導する。 さらなる実験から、優れたＦ特異的ＩｇＧ応答が１０μｇ用量で示され、これは、１μｇおよび０．１μｇ用量についての応答と等しく、０．０１μｇ用量ではより低い応答が示された。図１１は、３種の異なる用量における裸の形態において、４種の異なる用量におけるリポソームにおいて、もしくはＶＲＰ（１０６ ＩＵ）として、上記レプリコンを与えられた動物におけるＩｇＧ力価を示す。１μｇ リポソーム封入ＲＮＡで認められた応答は、ＶＲＰと比較した場合に統計的に有意ではなかった（ＡＮＯＶＡ）が、１０μｇ リポソーム封入ＲＮＡで認められたより高い応答は、これらの群の両方と比較した場合、統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。 さらなる研究から、上記０．１μｇのリポソーム封入ＲＮＡは、０．１μｇの送達されたＤＮＡより遙かに高い抗Ｆ ＩｇＧ応答を与え（２回目の用量の１５日後）、さらに、エレクトロポレーション（ＥｌｇｅｎＴＭ ＤＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｉｎｏｖｉｏ）によって送達された、上記Ｆ抗原をコードする２０μｇ プラスミドＤＮＡより免疫原性であることが確認された。 さらなる研究を、マウスの代わりにコットンラット（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ ｈｉｓｐｉｄｉｓ）において行った。１μｇ用量において、リポソーム封入は、裸のＲＮＡと比較して、Ｆ特異的ＩｇＧ力価を８．３倍増大させ、ＰＲＮＴ力価を９．５倍増大させた。上記抗体応答の大きさは、５×１０６ ＩＵ ＶＲＰにより誘導されたものに等しかった。裸のＲＮＡおよびリポソーム封入ＲＮＡはともに、ＲＳＶチャレンジ（１×１０５ プラーク形成単位）から上記コットンラットを防御することができ、肺ウイルス負荷を少なくとも３．５ ｌｏｇ減少させた。封入は、約２倍の減少を増大させた。 大動物研究を、ウシにおいて行った。ウシを、０日目および２１日目に、リポソーム内部に処方した、６６μｇの、全長ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードするレプリコンで免疫した。ＰＢＳ単独を、陰性コントロールとして使用し、承認されたワクチンを陽性コントロールとして（Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅの「Ｔｒｉａｎｇｌｅ ４」，死滅ウイルスを含む）使用した。図１４は、１回目の免疫から始まって６３日間の期間にわたるＦ特異的ＩｇＧ力価を示す。上記ＲＮＡレプリコンは、ウシにおいて免疫原性であったが、承認されたワクチンより低い力価を与えた。すべてのワクチン接種したウシは、２回目の投与の後にＦ特異的抗体を示し、力価は、上記２回目の投与の２〜６週間後の期間に非常に安定であった（そして上記ＲＮＡワクチンに関しては特に安定であった）。 （作用機構） 骨髄由来樹状細胞（ｐＤＣ）を、野生型マウスもしくは「Ｒｅｓｑ」（ｒｓｑ１）変異系統から得た。上記変異系統は、そのＴＬＲ７レセプターのアミノ末端において点変異を有し、これは、リガンド結合に影響を及ぼさずにＴＬＲ７シグナル伝達を破壊する［４４］。上記細胞を、ＤＯＴＡＰ、リポフェクタミン２０００で処方したレプリコンＲＮＡもしくはリポソーム内のレプリコンＲＮＡで刺激した。図１９に示されるように、ＩＬ−６およびＩＮＦαは、ＷＴ細胞において誘導されたが、この応答は、変異マウスにおいてほぼ完全に排除された。これらの結果は、ＴＬＲ７が、免疫細胞におけるＲＮＡ認識のために必要とされ、そしてリポソーム封入レプリコンが、免疫細胞に高レベルのインターフェロンおよび炎症促進性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインの両方を分泌させ得ることを示す。 （ｐＫａ測定） 脂質のｐＫａを、標準の温度および圧力の水において、以下の技術を使用して測定する：・エタノール中の脂質の２ｍＭ溶液を、上記脂質を秤量し、エタノール中に溶解することによって調製する。エタノール：メタノール ９：１中の蛍光プローブトルエンニトロスルホン酸（ＴＮＳ）の０．３ｍＭ溶液を、最初にメタノール中のＴＮＳの３ｍＭ溶液を作製し、次いで、エタノールで０．３ｍＭに希釈することによって調製する。・それぞれ、濃度２０ｍＭ、２５ｍＭ、２０ｍＭおよび１５０ｍＭのリン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、および塩化ナトリウムを含む水性緩衝液を、調製する。上記緩衝液を、８つの部分に分け、そのｐＨを、１２Ｎ ＨＣｌもしくは６Ｎ ＮａＯＨのいずれかで、４．４４〜４．５２、５．２７、６．１５〜６．２１、６．５７、７．１０〜７．２０、７．７２〜７．８０、８．２７〜８．３３および１０．４７〜１１．１２へと調整する。４００μＬの２ｍＭ脂質溶液および８００μＬの０．３ｍＭ ＴＮＳ溶液を混合する。・７．５μＬのプローブ／脂質混合物を、１ｍＬ ９６ウェルプレートの中の２４２．５μＬの緩衝液に添加する。これを、８つすべての緩衝液で行う。混合した後、１００μＬの各プローブ／脂質／緩衝液混合物を、クリアボトム（ｃｌｅａｒ ｂｏｔｔｏｍ）２５０μＬ黒色９６ウェルプレート（例えば、モデルＣＯＳＴＡＲ ３９０４， Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移す。この混合を行う便利な方法は、Ｔｅｃａｎ Ｇｅｎｅｓｉｓ ＲＳＰ１５０ハイスループット液体ハンドラーおよびＧｅｍｉｎｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用することである。・各プローブ／脂質／緩衝液混合物の蛍光を、３２２ｎｍ励起、４３１ｎｍ発光（オートカットオフ４２０ｎｍ）で測定する（例えば、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５分光光度計およびＳｏｆｔＭａｘ ｐｒｏ ５．２ソフトウェアで）。・測定後、上記９６ウェルプレートにおける空のウェルのバックグラウンド蛍光値を、各プローブ／脂質／緩衝液混合物から差し引く。次いで、その蛍光強度値を、最低ｐＨにおける値に対して正規化する。次いで、正規化した蛍光強度を、ｐＨに対してプロットし、最適の線を、提供する。・上記正規化した蛍光強度が０．５に等しい最適の線上の点を、見いだす。０．５に等しい正規化した蛍光強度に対応するｐＨを見いだし、上記脂質のｐＫａとみなす。 この方法は、ＤＬｉｎＤＭＡについてｐＫａ ５．８を与える。参考文献５のカチオン性脂質についてのこの方法によって測定されたｐＫａ値は、以下に含まれる。 （代替のカチオン性脂質を使用するリポソーム中の封入） ＤｌｉｎＤＭＡを使用する代わりとして、参考文献５のカチオン性脂質を使用する。これら脂質を、参考文献５に開示されるように合成しうる。 ＤｌｉｎＤＭＡを使用して上記で形成されたリポソームを、これ以降、「ＲＶ０１」シリーズと言及する。上記ＤｌｉｎＤＭＡを、シリーズ「ＲＶ０２」〜「ＲＶ１２」において以下で記載されるように、種々のカチオン性脂質で置き換えた。２％ ＰＥＧ２０００−ＤＭＧと、（０１）４０％の上記カチオン性脂質、１０％ ＤＳＰＣ、および４８％ コレステロール、または（０２）６０％の上記カチオン性脂質および３８％ コレステロールのいずれかとを使用して、各リポソームの２つの異なるタイプを形成した。従って、（０１）リポソームと（０２）リポソームとの比較は、中性の両性イオン性脂質の効果を示す。 ＲＶ０２リポソームを、以下のカチオン性脂質（ｐＫａ＞９，三級アミンなし）を使用して作製した： ＲＶ０３リポソームを、以下のカチオン性脂質（ｐＫａ ６．４）を使用して作製した： ＲＶ０４リポソームを、以下のカチオン性脂質（ｐＫａ ６．６２）を使用して作製した： ＲＶ０５リポソームを、以下のカチオン性脂質（ｐＫａ ５．８５）を使用して作製した： ＲＶ０６リポソームを、以下のカチオン性脂質（ｐＫａ ７．２７）を使用して作製した： ＲＶ０７リポソームを、以下のカチオン性脂質（ｐＫａ ６．８）を使用して作製した： ＲＶ０８リポソームを、以下のカチオン性脂質（ｐＫａ ５．７２）を使用して作製した： ＲＶ０９リポソームを、以下のカチオン性脂質（ｐＫａ ６．０７）を使用して作製した： ＲＶ１０リポソームを、以下のカチオン性脂質（ｐＫａ ７．８６）を使用して比較のために作製した： ＲＶ１１リポソームを、以下のカチオン性脂質（ｐＫａ ６．４１）を使用して作製した： ＲＶ１２リポソームを、以下のカチオン性脂質（ｐＫａ ７）を使用して作製した： ＲＶ１６リポソームを、以下のカチオン性脂質（ｐＫａ ６．１）を使用して作製した［４５］： ＲＶ１７リポソームを、以下のカチオン性脂質（ｐＫａ ６．１）を使用して作製した［４５］： ＲＶ１８リポソームを、ＤＯＤＭＡを使用して作製した。ＲＶ１９リポソームを、ＤＯＴＭＡを使用して作製し、ＲＶ１３リポソームを、ＤＯＴＡＰで作製した。これらはともに、四級アミン頭部基を有する。 これらリポソームを特徴付けし、上に記載されるＳＥＡＰレポーターで試験した。以下の表は、上記リポソームのサイズ（Ｚ平均および多分散性指数）、各リポソームにおけるＲＮＡ封入の％と、注射後１日目および６日目に検出されたＳＥＡＰ活性とを示す。ＳＥＡＰ活性は、ＤＬｉｎＤＭＡ、コレステロールおよびＰＥＧ−ＤＭＧから作製された「ＲＶ０１（０２）」リポソームに関連する： 図１５は、上記カチオン性脂質のｐＫａに対する、６日目のＳＥＡＰレベルをプロットする。最良の結果は、上記脂質が５．６〜６．８の間、および理想的には、５．６〜６．３の間のｐＫａを有する場合に認められる。 これらリポソームはまた、全長ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードするレプリコンを送達するために使用した。第１の用量（２ｗｐ１）の２週間後の、Ｆタンパク質に対する総ＩｇＧ力価を、図１６においてｐＫａに対してプロットする。最良の結果は、上記ｐＫａが、上記カチオン性脂質が５．７〜５．９の間のｐＫａを有するが、ｐＫａ単独が、高い力価を保証するには十分でない（例えば、上記脂質は、なおリポソーム形成を支援しなければならない）場合に認められる （ＲＳＶ免疫原性） さらなる研究は、ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする自己複製レプリコン（ｖＡ３１７）で行った。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたり４匹もしくは８匹の動物）に、０日目および２１日目に、上記レプリコン（１μｇ）単独を、あるいは上記ＲＶ０１脂質もしくはＲＶ０５脂質（上記を参照のこと；ｐＫａ ５．８もしくは５．８５）で、またはＲＶ１３でリポソームとして処方されたレプリコンを、両側の筋肉内にワクチン接種（５０μＬ／脚）した。上記ＲＶ０１リポソームは、４０％ ＤＬｉｎＤＭＡ、１０％ ＤＳＰＣ、４８％ コレステロールおよび２％ ＰＥＧ−ＤＭＧを有したが、ＲＮＡの量は異なった。上記ＲＶ０５（０１）リポソームは、４０％ カチオン性脂質、４８％ コレステロール、１０％ ＤＳＰＣ、および２％ ＰＥＧ−ＤＭＧを有した；上記ＲＶ０５（０２）リポソームは、６０％ カチオン性脂質、３８％ コレステロール、および２％ ＰＥＧ−ＤＭＧを有した。上記ＲＶ１３リポソームは、４０％ ＤＯＴＡＰ、１０％ ＤＰＥ、４８％ コレステロールおよび２％ ＰＥＧ−ＤＭＧを有した。比較のために、同じＲＳＶ−Ｆ抗原を発現する裸のプラスミドＤＮＡ（２０μｇ）を、エレクトロポレーションを使用するか、またはＲＶ０１（１０）リポソーム（０．１μｇ ＤＮＡ）によるかのいずれかで送達した。４匹のマウスを、ナイーブコントロール群として使用した。 リポソームを、方法（Ａ）もしくは方法（Ｂ）によって調製した。方法（Ａ）において、エタノール中の新たな脂質ストック溶液を調製した。３７ｍｇのカチオン性脂質、１１．８ｍｇのＤＳＰＣ、２７．８ｍｇのコレステロールおよび８．０７ｍｇのＰＥＧ−ＤＭＧを秤量し、７．５５ｍＬのエタノールに溶解した。新たに調製した脂質ストック溶液を、３７℃において約１５分間にわたって穏やかに振盪して、均質な混合物を形成した。次いで、２２６．７μＬの上記ストックを、１．７７３ｍＬ エタノールに添加して、作業脂質ストック溶液２ｍＬを作製した。この量の脂質を使用して、７５μｇ ＲＮＡを有するリポソームを形成し、８：１ 窒素 対 ホスフェート比（ＲＶ０１（０８）およびＲＶ０１（０９）においては、この比が、４：１もしくは１６：１に改変されたことを除く）を与えた。ＲＮＡの２ｍＬの作業溶液（もしくはＲＶ０１（１０）については、ＤＮＡ）をまた、１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）中の約１μｇ／μＬのストック溶液から調製した。３本の２０ｍＬ ガラスバイアル（撹拌子つき）を、ＲＮａｓｅ Ａｗａｙ溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）ですすぎ、使用前に多量のＭｉｌｌｉＱ水で洗浄して、上記バイアルのＲＮａｓｅの汚染を除去した。上記バイアルのうちの１本を、上記ＲＮＡ作業溶液に対して使用し、他のものを、上記脂質およびＲＮＡ混合物を集めるために使用した（後に記載されるとおり）。上記作業脂質およびＲＮＡ溶液を、３７℃において１０分間にわたって加熱し、その後、３ｃｃ シリンジに詰めた。２ｍＬのクエン酸緩衝液（ｐＨ６）を、別の３ｃｃ シリンジに詰めた。ＲＮＡおよび上記脂質を含むシリンジを、ＦＥＰチューブを使用して、Ｔミキサー（ＰＥＥＫＴＭ ５００μｍ ＩＤ接合部）に接続した。上記Ｔミキサーからの出口もまた、ＦＥＰチューブであった。上記クエン酸緩衝液を含む第３のシリンジを、ＦＥＰチューブの別個の部分に接続した。次に、すべてのシリンジを、シリンジポンプを使用して流速７ｍＬ／分で運転した。そのチューブの出口を、２０ｍＬ ガラスバイアル中に上記混合物を集める（撹拌しながら）ように配置した。撹拌子を取り出し、エタノール／水性溶液を、室温へと１時間にわたって平衡化させた。次いで、上記混合物を、ＦＥＰチューブの部分に取り付けた５ｃｃ シリンジに詰め、そして、等しい長さのＦＥＰチューブを有する別の５ｃｃ シリンジには、、等容積の１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）を詰めた。上記２本のシリンジを、シリンジポンプを使用して７ｍＬ／分の流速で運転し、最終の混合物を、２０ｍＬ ガラスバイアルに集めた（撹拌しながら）。次に、リポソームを２ｍＬに濃縮し、ＴＦＦを使用して１０〜１５容積の１×ＰＢＳに対して透析し、その後、最終生成物を回収した。上記ＴＦＦシステムおよび中空ファイバー濾過膜を、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓから購入し、上記製造業者のガイドラインに従って使用した。１００ｋＤ孔サイズカットオフおよび２０ｃｍ２表面積を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）中空ファイバー濾過膜（部品番号 Ｐ−Ｃ１−１００Ｅ−１００−０１Ｎ）を、使用した。インビトロ実験およびインビボ実験に関しては、処方物を、１×ＰＢＳで必要とされるＲＮＡ濃度へと希釈した。 調製法（Ｂ）は、２つの手段において方法（Ａ）とは異なる。まず、上記２０ｍＬ ガラスバイアル中での収集後（しかし、ＴＦＦ濃縮前）に、上記混合物を、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ膜（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡから得られる、アニオン性分子を結合して除去するアニオン交換支持体）を通過させた。この膜を、最初に４ｍＬの１Ｍ ＮａＯＨで、次に、４ｍＬの１Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＬの１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）で洗浄し、リポソームを、１０分間にわたって３７℃において加温し、その後、濾過した。第２に、上記中空ファイバー濾過膜は、ポリスルホン（部品番号 Ｐ／Ｎ： Ｘ１ＡＢ−１００−２０Ｐ）であった。 上記リポソームのＺ平均粒子直径、多分散指数、および封入効率は、以下のとおりであった： 血清を、１４日目、３６日目および４９日目に抗体分析のために集めた。脾臓を、４９日目に、Ｔ細胞分析のためにマウスから採取した。 Ｆ特異的血清ＩｇＧ力価（ＧＭＴ）は、以下のとおりであった： サイトカイン陽性であり、かつＲＳＶ Ｆ５１−６６ペプチドに対して特異的なＴ細胞の割合は、以下のとおりであり、統計的に有意にゼロを上回る数字のみを示す： 従って、上記リポソーム処方物は、増大したＦ特異的ＩｇＧ力価およびＴ細胞頻度によって決定される場合、上記裸のＲＮＡコントロールと比較して免疫原性を顕著に増大した。リポソームとともに処方したか、またはエレクトロポレーションを使用して裸で送達されたプラスミドＤＮＡは、リポソーム処方された自己複製ＲＮＡより顕著に免疫原性が低かった。 上記ＲＶ０１ ＲＮＡワクチンおよびＲＶ０５ ＲＮＡワクチンは、上記ＲＶ１３（ＤＯＴＡＰ）ワクチンより免疫原性が強かった。これら処方物は、匹敵する物理的特徴を有し、同じ自己複製ＲＮＡで処方したが、それらは、異なるカチオン性脂質を含む。ＲＶ０１およびＲＶ０５はともに、頭部基にｐＫａ 約５．８の三級アミンを有し、かつまた、不飽和アルキル尾部を含む。ＲＶ１３は、不飽和アルキル尾部を有するが、その頭部基は、四級アミンを有し、カチオン性が非常に強い。これら結果から、５．０〜７．６の範囲のｐＫａを有する、三級アミンを有する脂質が、ＤＯＴＡＰのような脂質（これらは、ＲＮＡのためのリポソーム送達系において使用される場合に、カチオン性が強い）より優れていることが示唆される。 （ＤＬｉｎＤＭＡのさらなる代替） ＲＶ０１リポソームにおけるカチオン性脂質（ＤＬｉｎＤＭＡ）は、ＲＶ１６、ＲＶ１７、ＲＶ１８もしくはＲＶ１９で置き換えられた。総ＩｇＧ力価を、図１７に示す。最低の結果は、ＲＶ１９（すなわち、ＤＯＴＭＡ四級アミン）で認められる。 （ＢＨＫ発現） 異なる脂質を有するリポソームを、ＢＨＫ細胞とともに一晩インキュベートし、タンパク質発現効力について評価した。ＲＶ０５脂質発現でのベースラインから、１０％ １，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）を上記リポソームに添加することによって１８×、１０％ １８：２（ｃｉｓ） ホスファチジルコリンを添加することによって１０×、および代わりにＲＶ０１を使用することによって９００×増大し得た。 （様々なマウス系統におけるＲＳＶ免疫原性） レプリコン「ｖＡ１４２」は、ＲＳＶの全長野生型表面融合（Ｆ）糖タンパク質をコードするが、その融合ペプチドは欠失しており、その３’末端は、リボザイム媒介性切断によって形成される。これを、３種の異なるマウス系統において試験した。 ＢＡＬＢ／ｃマウスに、０日目および２２日目に、両側の筋肉内ワクチン接種（５０μＬ／脚）を与えた。動物を、８つの試験群（１群あたり５匹の動物）およびナイーブコントロール（２匹の動物）へと分けた：群１には、裸のレプリコン（１μｇ）を与えた。群２には、４０％ ＤｌｉｎＤＭＡ、１０％ ＤＳＰＣ、４８％ Ｃｈｏｌ、２％ ＰＥＧ結合体化ＤＭＧを有するリポソーム「ＲＶ０１（３７）」中で送達した１μｇ レプリコンを与えた。群３には、群２と同じものを与えたが、０．１μｇ ＲＮＡであった。群４には、「ＲＶ１７（１０）」リポソーム（４０％ ＲＶ１７（上記を参照のこと）、１０％ ＤＳＰＣ、４９．５％ コレステロール、０．５％ ＰＥＧ−ＤＭＧ）中において１μｇ レプリコンを与えた。群５には、「ＲＶ０５（１１）」リポソーム（４０％ ＲＶ０７脂質、３０％ １８：２ ＰＥ（ＤＬｏＰＥ）、２８％ コレステロール、２％ ＰＥＧ−ＤＭＧ）中において１μｇ レプリコンを与えた。群６には、「ＲＶ１７（１０）」リポソーム中において０．１μｇ レプリコンを与えた。群７には、水酸化アルミニウムをアジュバント添加した５μｇ ＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質を与えた。群８は、ナイーブコントロール（２匹の動物）であった。 血清を、１４日目、３５日目および４９日目に、抗体分析のために集めた。Ｆ特異的血清ＩｇＧ ＧＭＴは、以下であった： ３５日目において、Ｆ特異的ＩｇＧ１力価およびＩｇＧ２ａ力価（ＧＭＴ）は、以下のとおりであった： ３５日目および４９日目のＲＳＶ血清中和抗体力価は、以下のとおりであった（データは、２〜５匹のマウスプール（１群あたり１プール）の６０％ プラーク減少中和力価である）： ４９日目に、Ｔ細胞分析のために脾臓を採取した。平均の正味Ｆ特異的サイトカイン陽性Ｔ細胞頻度（ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋）は、以下のとおりであった（これは、統計的に有意にゼロを上回った（ＣＤ４＋についてはＲＳＶペプチドであるＦ５１−６６、Ｆ１６４−１７８、Ｆ３０９−３２３、またはＣＤ８＋についてはペプチドＦ８５−９３およびＦ２４９−２５８に対して特異的）数字のみを示す）： Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、同じように免疫したが、第９の群には、ＲＳＶの全長野生型表面融合糖タンパク質（融合ペプチド欠失）を発現するＶＲＰ（１×１０６ ＩＵ）を与えた。 血清を、１４日目、３５日目および４９日目に、抗体分析のために集めた。Ｆ特異的ＩｇＧ力価（ＧＭＴ）は、以下であった： ３５日目において、Ｆ特異的ＩｇＧ１力価およびＩｇＧ２ａ力価（ＧＭＴ）は、以下のとおりであった： ３５日目および４９日目のＲＳＶ血清中和抗体力価は、以下のとおりであった（データは、２〜５匹のマウスプール（１群あたり１プール）の６０％ プラーク減少中和力価である）： ４９日目に、Ｔ細胞分析のために脾臓を採取した。平均の正味Ｆ特異的サイトカイン陽性Ｔ細胞頻度（ＣＤ８＋）は、以下のとおりであった（これは、統計的に有意にゼロを上回った（ＲＳＶペプチドＦ８５−９３およびＦ２４９−２５８に対して特異的）数字のみを示す）： Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスの９群を、同じようにして免疫した。Ｆ特異的ＩｇＧ力価（ＧＭＴ）は、以下であった： ３５日目において、Ｆ特異的ＩｇＧ１力価およびＩｇＧ２ａ力価（ＧＭＴ）は、以下のとおりであった： ３５日目および４９日目のＲＳＶ血清中和抗体力価は、以下のとおりであった： 従って、３種の異なる脂質（ＲＶ０１、ＲＶ０５、ＲＶ１７；ｐＫａは、５．８、５．８５、６．１）を、３種の異なる近交系のマウス系統において試験した。３種の系統すべてに関して、ＲＶ０１がＲＶ１７より有効であった；ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ３Ｈ系統に関しては、ＲＶ０５は、ＲＶ０１およびＲＶ１７よりも有効性が低かったが、Ｂ６系統においては、より有効であった。しかし、すべての場合において、上記リポソームは、並行して試験した２種のカチオン性ナノエマルジョンより有効であった。 （ＣＭＶ免疫原性） ＤＬｉｎＤＭＡをカチオン性脂質として有するＲＶ０１リポソームを使用して、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）糖タンパク質をコードするＲＮＡレプリコンを送達した。「ｖＡ１６０」レプリコンは、全長糖タンパク質ＨおよびＬ（ｇＨ／ｇＬ）をコードするのに対して、「ｖＡ３２２」レプリコンは、可溶性形態（ｇＨｓｏｌ／ｇＬ）をコードする。上記２種のタンパク質は、単一のレプリコン中の別個のサブゲノムプロモーターの制御下にある；２種の別個のベクター（１つは、ｇＨをコードし、１つは、ｇＬをコードする）の共投与は、良好な結果を与えなかった。 ＢＡＬＢ／ｃマウス（１０匹／群）に、０日目、２１日目および４２日目に、ｇＨ／ｇＬを発現するＶＲＰ（１×１０６ ＩＵ）、ｇＨｓｏｌ／ｇＬを発現するＶＲＰ（１×１０６ ＩＵ）およびコントロールとしてＰＢＳを、両側の筋肉内ワクチン接種（５０μＬ／脚）で与えた。２つの試験群に、リポソーム（４０％ ＤｌｉｎＤＭＡ、１０％ ＤＳＰＣ、４８％ Ｃｈｏｌ、２％ ＰＥＧ−ＤＭＧ；上記で議論した方法（Ａ）を使用するが、１５０μｇ ＲＮＡバッチサイズを用いて作製した）中に処方した、１μｇの上記ｖＡ１６０レプリコンもしくはｖＡ３２２レプリコンを与えた。 上記ｖＡ１６０リポソームは、Ｚａｖ直径 １６８ｎｍ、ｐｄＩ ０．１４４、および８７．４％ 封入を有した。上記ｖＡ３２２リポソームは、Ｚａｖ直径 １６２ｎｍ、ｐｄＩ ０．１３１、および９０％ 封入を有した。 上記レプリコンは、単一のベクターから２種のタンパク質を発現できた。 ６３日目（３ｗｐ３）に、血清を、免疫学的分析のために集めた。ＣＭＶ中和力価（コントロールと比較して、陽性ウイルスフォーカス／ウェルの数において５０％減少を生じる血清希釈の逆数）は、以下のとおりであった： 全長もしくは可溶性形態の上記ＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ複合体のいずれかを発現するＲＮＡは、従って、上皮細胞でアッセイされる場合、高い力価の中和抗体を誘発した。上記リポソーム封入ＲＮＡによって誘発された平均力価は、その対応するＶＲＰについてのものと少なくとも同程度に高かった。 本発明は、例示によって記載されてきたに過ぎず、本発明の範囲および趣旨内に留まりながら、改変が行われ得ることは、理解される。水性コアを封入する脂質二重層を有するリポソームであって、ここで：（ｉ）該脂質二重層は、５．０〜７．６の範囲のｐＫａを有する脂質を含み；そして（ｉｉ）該水性コアは、免疫原をコードするＲＮＡを含む、リポソーム。５．０〜７．６の範囲のｐＫａを有する前記脂質は、三級アミンを有する、請求項１に記載のリポソーム。５．０〜７．６の範囲のｐＫａは、５．７〜５．９の間である、前記請求項のいずれかに記載のリポソーム。５．０〜７．６の範囲のｐＫａを有する前記脂質は、ＲＶ０１、ＲＶ０２、ＲＶ０３、ＲＶ０４、ＲＶ０５、ＲＶ０６、ＲＶ０７、ＲＶ０８、ＲＶ０９、ＲＶ１１、ＲＶ１２、ＲＶ１６もしくはＲＶ１７について本明細書で示される式を有する、請求項１に記載のリポソーム。２０〜２２０ｎｍの範囲の直径を有する、前記請求項のいずれかに記載のリポソーム。前記ＲＮＡ分子は、（ｉ）該ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写し得るＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、および（ｉｉ）免疫原をコードする、前記請求項のいずれかに記載のリポソーム。前記ＲＮＡ分子は、２個のオープンリーディングフレームを有し、そのうちの第１のものは、アルファウイルスレプリカーゼをコードし、そのうちの第２のものは、前記免疫原をコードする、請求項５に記載のリポソーム。前記ＲＮＡ分子は、９０００〜１２０００ヌクレオチド長である、前記請求項のいずれかに記載のリポソーム。前記免疫原は、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物に対してインビボで免疫応答を誘発し得る、前記請求項のいずれかに記載のリポソーム。前記免疫原は、呼吸器系合胞体ウイルス糖タンパク質Ｆに対してインビボで免疫応答を誘発し得る、前記請求項のいずれかに記載のリポソーム。前記請求項のいずれかに記載のリポソームを含む、薬学的組成物。脊椎動物において防御的免疫応答を惹起するための方法であって、該方法は、該脊椎動物に、有効量の、請求項１〜１０に記載のリポソーム、または請求項１１に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。ＲＮＡ含有リポソームを調製するためのプロセスであって、該プロセスは、リポソーム処方の間に、（ａ）ＲＮＡと、脂質とを、該脂質のｐＫａ未満であるが４．５を上回るｐＨにおいて混合する工程；次いで、（ｂ）該ｐＨを、該脂質のｐＫａを上回るように上昇させる工程、を包含する、プロセス。請求項１３に記載のプロセスであって、ここで、工程（ａ）において使用されるＲＮＡは、前記脂質の有機溶液と混合して、混合物を与える間、水性溶液中に存在し、該混合物は、次いで、希釈されて、リポソームを形成し；そして前記ｐＨは、リポソーム形成後に、工程（ｂ）において上昇させられる、プロセス。 免疫原をコードするＲＮＡは、免疫の目的で、リポソーム中で送達される。上記リポソームは、５．０〜７．６の範囲のｐＫａおよび好ましくは、三級アミンを有する脂質を含む。これらリポソームは、生理学的ｐＨにおいて本質的に中性表面電荷を有し得、免疫に有効である。一実施形態において、水性コアを封入する脂質二重層を有するリポソームが提供され、ここで：（ｉ）該脂質二重層は、５．０〜７．６の範囲のｐＫａを有する脂質を含み；そして（ｉｉ）該水性コアは、免疫原をコードするＲＮＡを含む。