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| タイトル： | 公開特許公報(A)_ピロロキノリンキノンの製造方法 |
| 出願番号： | 2013229503 |
| 年次： | 2014 |
| IPC分類： | C07D 471/04,A61P 27/02,A61K 31/4738,A61P 43/00,A61P 35/00,A61P 25/00 |
特許情報キャッシュ
玉腰 優典 坂本 斉 池本 一人 JP 2014193838 公開特許公報(A) 20141009 2013229503 20131105 ピロロキノリンキノンの製造方法 三菱瓦斯化学株式会社 000004466 玉腰 優典 坂本 斉 池本 一人 JP 2013037012 20130227 C07D 471/04 20060101AFI20140912BHJP A61P 27/02 20060101ALI20140912BHJP A61K 31/4738 20060101ALN20140912BHJP A61P 43/00 20060101ALN20140912BHJP A61P 35/00 20060101ALN20140912BHJP A61P 25/00 20060101ALN20140912BHJP JPC07D471/04 102C07D471/04A61P27/02A61K31/4738A61P43/00 107A61P35/00A61P43/00 111A61P25/00 11 ＯＬ 15 4C065 4C086 4C065AA04 4C065AA19 4C065BB04 4C065CC09 4C065DD02 4C065EE02 4C065HH08 4C065JJ01 4C065KK08 4C065LL04 4C065PP01 4C065QQ07 4C086AA03 4C086AA04 4C086CB05 4C086ZA01 4C086ZA33 4C086ZB22 4C086ZB26 4C086ZC20本発明は、式（１）で示す構造を含むピロロキノリンキノンの製造方法に関する。ピロロキノリンキノン（以下、ＰＱＱと略すことがある。）は新しいビタミンの可能性があることが提案されて注目を集めている。ＰＱＱは細菌に限らず、真核生物のカビ、酵母に存在し、補酵素として重要な働きを行っている。また、ＰＱＱについて近年までに細胞の増殖促進作用、抗白内障作用、肝臓疾患予防治療作用、創傷治癒作用、抗アレルギー作用、逆転写酵素阻害作用およびグリオキサラーゼＩ阻害作用−制癌作用、神経線維再生作用など多くの生理活性が明らかにされている。ＰＱＱは、発酵法などにより製造することが可能である。しかし、これらの方法で得られるＰＱＱは水や不純物の含量が多く、安定で純度の高いＰＱＱの結晶を得る技術が求められていた。特に発酵法で作られるＰＱＱは微生物を使用するため、培養液には菌体、菌体破砕物、分泌物に由来する高分子不純物が発生しその除去が課題である。特にタンパク成分が多くその除去が問題であった。また、元の培地からの持ち込みや装置材質の溶解等が原因で、重金属がＰＱＱに混入する場合もある。タンパク成分や重金属成分は精製時の不純物としてカラムクロマトグラフィーへの閉塞やライフ低下等、製造上に問題を生じさせる。また、タンパクは不純物として含有すると、アレルギー成分としてもその除去は求められている。これまでにｐＨを下げることでタンパク質を析出させ、遠心分離によって除去する方法が知られている。（特許文献１）。また、ＰＱＱの培養液はＰＱＱ濃度が薄く、取り扱いが困難であった。特公平７−１１３０２４号公報従来のＰＱＱの製造方法はかなりのタンパク質の残留があり、精製が十分でない。また、カラムクロマトグラフィーの充填物が高価であり、設備が高価になる欠点があった。また、タンパク質以外の不純物に関しても残留しやすい。そのため、タンパク成分や重金属等不純物を効率よく除去できる方法が求められている。本発明は、タンパク成分や重金属等の不純物を効率よく除去した高純度で高品質のピロロキノリンキノン類又はその塩、及びそれらの製造方法を提供することを課題とする。本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、以下に示す項目によって解決できることを見出した。［１］ピロロキノリンキノン類を含む溶液を樹脂吸着剤又は活性炭と接触させる工程を含む高純度ピロロキノリンキノン類の製造方法。［２］樹脂吸着剤又は活性炭の比表面積が１００ｍ2／ｇ以上であることを特徴とする［１］記載の製造方法。［３］樹脂吸着剤がスチレン系またはアクリル系の骨格を有すること特徴とする［１］又は［２］記載の製造方法。［４］ピロロキノリンキノン類が、式（１）の構造を有する酸化型ＰＱＱ、式（２）の構造を有する還元型ＰＱＱ又はこれらの塩であることを特徴とする［１］から［３］いずれか記載の製造方法。［５］ピロロキノリンキノン類を含む溶液がピロロキノリンキノン培養液であることを特徴とする［１］から［４］いずれか記載の製造方法。［６］ピロロキノリンキノン類を含む溶液がピロロキノリンキノン培養液をｐＨ２から８にして析出物を除去した溶液であることを特徴とする［１］から［４］いずれか記載の製造方法。［７］ピロロキノリンキノン類を含む溶液がピロロキノリンキノン培養液をｐＨ２から８にして析出物を除去した溶液を晶析し、得られた結晶を溶解させた溶液であることを特徴とする［１］から［４］いずれか記載の製造方法。［８］ピロロキノリンキノン類を含む溶液を樹脂吸着剤または活性炭と接触させる工程の後、更にピロロキノリンキノン類を含む溶液を再結晶もしくはカラムクロマトグラフィーで精製する工程を含む請求項１から７いずれか記載のピロロキノリンキノンの製造方法。［９］カラムクロマトグラフィーで精製する工程において、塩基性条件で該ピロロキノリンキノンを脱離させることを特徴とする請求項８記載の製造方法。［１０］樹脂吸着剤又は活性炭と接触させることを特徴とする、ピロロキノリンキノン類と重金属を含む混合溶液からの重金属除去方法。［１１］［１］から［１０］いずれかに記載の方法で作られたピロロキノリンキノンまたはその塩。本発明により、培養液から持ち込まれるタンパク質や重金属等の不純物を除去でき高純度又は高品質のＰＱＱ類又はその塩、及びそれらの製造方法を提供できる。また、これによりカラムクロマトグラフィーにおける樹脂への負荷が下がり、より多くのＰＱＱ類の精製が可能となるため、樹脂の単費を抑制することにも役に立つ。本発明の実施例にて用いた装置例本発明は、樹脂吸着剤又は活性炭にＰＱＱ類を含む溶液を接触させる工程を含む純度６０％以上の高純度又は濃縮したＰＱＱ類の製造方法である。本発明において、ＰＱＱ類とは、式（１）の構造を有する酸化型ＰＱＱ、式（２）の構造を有する還元型ＰＱＱ又はこれらの塩を示す。酸化型ＰＱＱ又は還元型ＰＱＱの塩としては、アルカリ金属塩、アンモニウム塩が挙げられる。アルカリ金属塩の具体例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、リチウム塩が挙げられる。水溶液で使用する際にはこれらのカチオンの混合した状態で使用することもできる。ＰＱＱ類を含む溶液は、ＰＱＱ類を生産する微生物を培養して得られる。特に使用する微生物に制限はないが、例えばハイホミクロビュームメチロボラム、ハイホミクロビュームデチトリフィカンス、メチロバチルス グリコゲネス、メチロバクテリウム エクストロクエンス、メチロバクテリウム オルガノフィラム、メチロバクテリウム ロディウム、メチロバクテリウム、メソフィリカム、メチロバクテリウム ラジオトレランス、ハイホミクロビウム ブルガレ、ハイホミクロビウム メチロボラム、アンシロバクター アキュアティカス、キサントバクター オートトロフィカス、キサントバクター フラバム、アセトバクター メタノリカス、パラコッカス ディニトロフィンカンス、チオバチルス ノベルス、オリゴモナス メタノリカ、メチロファーガ マリーナおよびメチロファーガ サラシカなどの、メタノールを資化し、ＰＱＱ類を生産する微生物を使用することが好ましい。ＰＱＱ類を含む溶液の濃度は０．０１から３０ｇ／Ｌ、好ましくは０．５から１０ｇ／Ｌである。この濃度範囲とすることで、析出することなく、良好な生産性を維持することが出来る。濃度が低い場合にはＰＱＱ類を含む溶液を濃縮してから使用しても構わない。溶媒としては、水、エタノール、メタノール等が挙げられるが、溶解度の観点から水が好ましい。ＰＱＱ類を含む溶液は、菌体を含んだ液を用いても構わないが、菌体やタンパク質成分を除去した液を使用するのが好ましい。溶液に含まれるタンパク量を下げることが出来、処理に使用する樹脂吸着剤または活性炭の寿命を延ばすことが出来る。タンパク質成分の除去は、ｐＨ２から８とすることによって除去可能である。より好ましくはｐＨ３から５にすることによってタンパク質成分が析出し、効果的である。タンパク質成分を除去した液は含まれる高分子成分が低いことから、長時間安定に運転するのに好ましい。さらには再結晶操作により高純度化を行うことは好ましい。ＰＱＱ類を含む溶液中のタンパク質の濃度には制限がないが、好ましくは０．０００１から１０ｇ／Ｌである。この濃度範囲であれば、不溶成分が生じることなく、配管が詰まることなく、好ましい。この範囲より低い場合は、このような方法をとるまでもなく容易に除去出来る。樹脂吸着剤および活性炭は１００ｍ2／ｇから３０００ｍ2／ｇの表面積があることが好ましい。より好ましくは５００ｍ2／ｇから２０００ｍ2／ｇであり、更に好ましくは５００ｍ2／ｇから１３００ｍ2／ｇである。使用量としては、ＰＱＱ１ｇ当たり０．１〜２０ｇが好ましい。樹脂吸着剤であれば１６〜２０ｇがより好ましい。活性炭であれば０．１〜２ｇがより好ましく、更に好ましくは０．１〜１ｇである。比表面積および使用量をこの範囲とすることにより、吸着量が好適となり精製純度が上がる。表面に吸着することにより、タンパク質を除去する。同時に不純物として含まれる脂肪酸、アミノ酸、着色成分及び重金属を除去する。表面積がこの範囲より小さい場合、吸着せず、精製効果は表れない。これよりも大きい場合、除去効果は期待できるが、一般に販売されておらず、また機械強度が低下する。形状は粉末、成形等製造プロセスで最適なものを選べばよい。樹脂吸着剤はスチレン系又はアクリル系の骨格を有することが好ましい。架橋用の成分、極性を制御するハロゲン原子や置換基が導入されていても問題がない。一般的に市販されている樹脂吸着剤として、スチレン系樹脂として三菱化学（株）製のセパビーズＳＰ２０７、ＳＰ７００、ＳＰ８２５、ＨＰ２０、オルガノ社のアンバーライトＸＡＤ４、ＦＰＸ６６、アクリル系樹脂として、アンバーライトＸＡＤ７ＨＰが使用可能である。また、オルガノ社のアンバーライトＩＲＡ９５８、ＩＲ１２４などのイオン交換樹脂、或いは三菱化学（株）のダイヤイオンＣＲ２０などのキレート樹脂も使用可能である。活性炭は石炭系、植物由来系等のいずれかが好ましい。具体的には日本エンバイロケミカルズ社の球状白鷺、粒状白鷺、カルボラフィン、強力白鷺、精製白鷺、特製白鷺、アルデナイト等が使用できる。接触させる方法としては、例えばバッチ方法として不純物を含んだＰＱＱ溶液に樹脂吸着剤または活性炭を加える方法で行うことができる。また、樹脂吸着剤または活性炭をカラムに詰めて連続的に除去させることができる。接触させる時間は不純物の濃度、ＰＱＱ類の濃度を勘案して設定すればよく、１秒から１週間と適宜に決めることができる。本発明の製造方法において、接触させる際のｐＨは２から１１が使用でき、好ましくは３から７である。より好ましくは酸性条件であり、具体的には３から６である。この範囲とすることによりＰＱＱ類が分解したり析出することなく溶解度が適切である。樹脂粒や活性炭粒の空隙に残留したＰＱＱ類を押し出すためのリンス液も同様のｐＨの水溶液を使用するのが望ましい。ｐＨ調整或いはリンスのために加える酸の種類は特に制限されないが、塩酸、臭化水素酸、沃化水素酸、過塩素酸、硝酸、硫酸などの無機酸、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸などが挙げられ、その中でも塩酸が好ましい。ｐＨ調整のために加える塩基の種類は特に制限されないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、アンモニア、炭酸アンモニウム、コリン、テトラメチルアンモニウムハイドロキサイド等が使用できる。接触させた後の溶液に含まれるタンパク量は低く、その後の精製は一般的なカラムクロマトグラフィーや再結晶法を用いることができる。カラムクロマトグラフィーとしては、例えば、ＤＥＡＥーＳｅｐｈａｄｅｘ（ジエチルアミノエチル系陰イオン交換樹脂−セフアデツクス 以下同様、フアルマシア社、登録商標）Ａ−２５カラムに吸着後、ＫＣｌ溶液で溶出する方法（M.Ameyama et al.,Agric.Biol.Chem.,第48巻、p.561〜565（1984））のようなイオン交換樹脂での精製が可能である。カラムクロマトグラフィーを用いてＰＱＱ類を吸着させ、塩基性条件で該ピロロキノリンキノン類を脱離させ、ＰＱＱ類の精製、濃縮を行うこともできる。さらにその後、塩化ナトリウムや塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウムを使用する塩析による溶解度を下げる方法、エタノール、メタノール、プロパノール、アセトニトリルのような貧溶媒を加えて結晶を析出させる方法が使用できる。または懸濁又は溶液状態でｐＨを変えて溶解度を調整して析出させる方法も使用できる。本発明は、接触時のｐＨ等の条件を適宜変えることにより、ＰＱＱ類の濃縮も可能である。ＰＱＱ溶液のｐＨを２−５の範囲として溶解度を下げた状態で接触させることでＰＱＱ類を樹脂等に吸着させることが出来る。ｐＨ調整に使用する酸は特に制限はないが、塩酸、臭化水素酸、沃化水素酸、過塩素酸、硝酸、硫酸などの無機酸、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸などが挙げられ、その中でも塩酸が好ましい。その後アルカリ性溶液や有機溶媒を含む溶液を用いて塩基性条件で洗浄することで脱着させて、２ｇ／Ｌ以上の濃度のＰＱＱ類濃縮液を作ることが出来る。溶離に使用するアルカリ性溶液もまた、特に制限はないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、アンモニア、炭酸アンモニウム、コリン、テトラメチルアンモニウムハイドロキサイド等が使用できる。この工程を行うことによりその後の晶析工程において、結晶純度並びに工程収率を向上させることが可能である。本発明は、活性炭又は樹脂吸着剤を複数組み合わせることにより、更なる純度の向上又はＰＱＱ類の濃縮を行うことができる。２段階目に使用する樹脂の種類については制限がなく、１段階目と２段階目とで同じ樹脂でも異なる樹脂でも構わない。本発明は、重金属を除去することも可能である。重金属の例としては、カドミニウム、クロム、銅、鉄、マンガン、ニッケルが挙げられる。これらの金属は、体内に侵入することで毒性を示すため、除去しておくことが望ましい。処理前の重金属濃度としては、２０〜５０００ｐｐｂの範囲の濃度であれば、除去しやすい。重金属の除去は、ＰＱＱ類の純度の向上又は濃縮の際の製造方法と同様に実施することが出来、特に、活性炭又は樹脂吸着剤と接触させる際のｐＨは４から８が好ましい。本発明により得られる高純度のＰＱＱ類は、医薬、機能性食品、化粧品又は飼料等の有効成分とすることができる。即ち、皮膚外用剤、注射剤、経口剤、坐剤等の形態、あるいは、日常食する飲食物、栄養補強食、各種病院食等の形態で提供可能である。なお、調製の際に使用される添加剤としては、液剤としては水、果糖、ブドウ糖等の糖類、落下生油、大豆油、オリーブ油等の油類、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等のグリコール類を用いることができる。錠剤、カプセル剤、顆粒剤などの固形剤の賦型剤としては乳糖、ショ糖、マンニット等の糖類、滑沢剤としてはカオリン、タルク、ステアリン酸マグネシウム等、崩壊剤としてデンプン、アルギン酸ナトリウム、結合剤としてポリビニルアルコール、セルロース、ゼラチン等、界面活性剤としては脂肪酸エステル等、可塑剤としてグリセリン等を例示することができるが、これらに限定されるものではない。必要に応じて溶解促進剤、充填剤等を加えてもよい。ＰＱＱ類は、単独でも、他の素材と組み合わせても使用できる。組み合わせ可能な素材としては、ビタミンＢ群、ビタミンＣおよびビタミンＥ等のビタミン類、アミノ酸類、アスタキサンチン、α-カロテン、β-カロテン等のカロテノイド類、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸等のω３脂肪酸類、アラキドン酸等のω６脂肪酸類などが例示されるが、これらに限定されるものではない。以下に実施例及び参考例を揚げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例および参考例のみに限定されるものではない。実施例では特に断りがない限り、和光製試薬を使用した。本実施例および比較例において、ＵＶ測定は、ＨＩＴＡＣＨＩ Ｕ−２０００ ＳＰｅｃｔｒｏｐＨｏｔｏｍｅｔｅｒを使用して測定した。［ＰＱＱ類の分析］装置： 島津製作所、高速液体クロマトグラフィー、ＬＣ−２０Ａカラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＴＭＳ（５μｍ）、１５０x４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ.測定温度：４０℃検出：２６０ｎｍにおける吸光度溶離液：１００ｍＭ ＣＨ3ＣＯＯＨ／１００ｍＭ ＣＨ3ＣＯＯＮＨ4 (３０／７０, ｐＨ５．１)溶出速度：１．５ｍＬ／ｍｉｎ［タンパク分析］Ｂｒａｄｆｏｒｄ法Ｂｉｏ−ｒａｄ社Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬を使用し５９５ｎｍ吸光度を測定し、その値からタンパク含量を決定した。なお、検量線はγ-グロブリンの希釈系列液で作成した。［ＰＱＱ純度の計算］サンプル中のＰＱＱ純度については、以下の通りに計算した。ＰＱＱ純度（％）＝１００×ＰＱＱ濃度／全有機固形分濃度 ＰＱＱ濃度：ＨＰＬＣで測定したＰＱＱ濃度（ｇ／Ｌ） 全有機固形分濃度：Ｂｒａｄｆｏｒｄ法で測定したタンパク濃度（ｇ／Ｌ）と 、ＰＱＱ濃度（ｇ／Ｌ）をＰＱＱのＨＰＬＣ純度（％）で割った値（ｇ／Ｌ） の和［重金属濃度の測定］ＩＣＰ法装置：バリアン、ＩＣＰ装置、ＶＩＳＴＡ−ＰＲＯカドミウム濃度は、２２７ｎｍの強度を元に求めた。クロム濃度は、２６７ｎｍの強度を元に求めた。銅濃度は、３２７ｎｍの強度を元に求めた。鉄濃度は、２３８ｎｍの強度を元に求めた。マンガン濃度は、２５８ｎｍの強度を元に求めた。ニッケル濃度は、２３０ｎｍの強度を元に求めた。参考例１ ＰＱＱ類含有溶液の作製特許第２６９２１６７号公報の実施例１に基づき、ＤＳＭ株を培養し、３Ｌジャーを使用して培養液を得た。得られた培養液は５０００Ｇで遠心分離して、菌体を除去し、ＰＱＱを含有する培養液を得た。実施例１ 培養ブロス上清のバッチ式活性炭処理参考例１で得られた培養液を遠心分離によって菌体除去した上清（ＰＱＱ濃度１．６g／Ｌ、純度５４％、タンパク濃度１．０g／Ｌ）に、日本エンバイロケミカルズ社の活性炭カルボラフィンR(比表面積１０００ｍ2／ｇ)を０．２ｇ／Ｌになるように追加、ｐＨ６〜８で２時間室温で攪拌し、遠心分離した。その上清のＰＱＱ濃度は１．７ｇ／Ｌ（純度６１％）で、タンパク濃度は０．７８ｇ／Ｌであった。タンパク除去率は２２％であった。実施例２ 培養ブロス上清のバッチ式活性炭処理実施例１と同様に、培養液を遠心分離によって菌体除去した上清（ＰＱＱ濃度１．６g／Ｌ、純度５４％、タンパク濃度１．０g／Ｌ）に、日本エンバイロケミカルズ社の活性炭カルボラフィンR(比表面積１０００ｍ2／ｇ)を０．９ｇ／Ｌになるように追加、ｐＨ６〜８で２時間室温で攪拌し、遠心分離した。その上清のＰＱＱ濃度は１．６ｇ／Ｌ（純度６４％）で、タンパク濃度は０．６４ｇ／Ｌであった。タンパク除去率は３６％であった。比較例１参考例１と同様の方法で得られた培養液を遠心分離によって菌体除去したＰＱＱを含有する上清について、活性炭を用いない場合の結果を比較例１とした。結果を表１に示す。これより、タンパク質含量の少なく高純度のＰＱＱ溶液を作ることができた。実施例３ 樹脂吸着材による精製使用する装置を図１に示す。カラム１にはポンプ２よりタンク３からのタンパク含有液が入る。カラム1を通過した液は、精製液としてタンク４に回収される。カラムには樹脂吸着剤としてセパビーズRＳＰ２０７(三菱化学製、比表面積６００ｍ2／ｇ)２０ｍｌ（樹脂重量は１６ｇ）を使用した。参考例1で得られたＰＱＱを含有する液に硫酸を加えｐＨを４に調整して室温で1日保存した。これを濾過して析出物を除去し、ＰＱＱ濃度が１．０ｇ／Ｌになるように純水で希釈した。この時、ＰＱＱ純度７５％でタンパク量０．１３ｇ／Ｌであった。なお、ここで酸性にした理由は、樹脂接触法による精製はｐＨ弱酸性条件の方が高い純度が得られるためである。溶出量１６０ｍｌ／ｈ(液と樹脂の接触時間は７．５分)に調製した溶液を先に述べた樹脂吸着剤で充填したカラムに、ｐＨ４で４００ｍｌ通過させた。カラムから溶出される液は、はじめの２０ｍｌは廃棄し、それ以降より精製液として回収を行った。最後に８５ｐｐｍリン酸水溶液４０ｍｌ通液し、そこでカラムから溶出した液も精製液に合一した。結果を表２に示す。不純物量は、(１００−カラム処理後純度（％）)／（１００−カラム処理直前純度（％））×１００で計算した。 ＰＱＱ回収率１００％でタンパク濃度は０．００５ｇ／Ｌであった。タンパク除去率は９６％であり、原料よりも高純度で且つはるかにタンパク含量の少ないＰＱＱ溶液を作ることができた。不純物全体の量も、４４％カットできていた。実施例４，５ 樹脂吸着材による精製表２に示す各樹脂を用いた他は、実施例３と同様にしてＰＱＱ純度７５％でタンパク量０．１３ｇ／ＬのＰＱＱ液を精製した。結果を表２に示す。 実施例３〜５では、処理前ＰＱＱ純度７５％の原液が、８０％以上の純度に向上した。不純物成分として除去が最も求められているタンパク質は除去率８０％以上であり、非常に有効な手段であった。実施例６ ２段精製によるＰＱＱの濃縮精製セパビーズRＳＰ２０７(三菱化学製、比表面積６００ｍ2／ｇ)１０ｍｌをカラムに充填した。次に、実施例３で得たＰＱＱ精製液（ＰＱＱ濃度１．０ｇ／Ｌ）を、硫酸を用いてｐＨ２．５に調節し、６０ｍｌ／ｈ(液と樹脂の接触時間は１０分)の速度で１５０ｍｌ、カラムに通過させた。原液通過時、溶出液は全量廃棄した。アプライ後、０．４％苛性ソーダ水溶液(ｐＨ１３)を２０ｍｌ／ｈ(液と樹脂の接触時間は３０分)で1時間カラムに通過させ、ＰＱＱが含まれていないはじめの１０ｍｌの溶出液は廃棄した後、カラム溶出液の高ＰＱＱ濃度部分４３ｍｌを精製液として回収した。その結果、ＰＱＱ濃度３．５ｇ／Ｌ（純度８８％）のＰＱＱ溶液が得られた。ＰＱＱの純度改善と濃縮に成功した。 その後、同様の操作で得た濃縮液（ＰＱＱ濃度３．５g／L、純度８８％）を１００ｍｌ取り、食塩を６ｇ加えた後、硫酸を加えてｐＨを３．５にした。３時間攪拌後、ＰＱＱが析出した。この操作によりＰＱＱ純度は９３％となった。また、この晶析でのＰＱＱ減少は３％であった。また、得られたＰＱＱ量１ｇに対し、使用した食塩の量は１７ｇである。ＰＱＱ濃度が１．０ｇ／Ｌのまま濃縮せずに上記の通りに塩析すると、ＰＱＱ１ｇに対し６２ｇの食塩が必要となる。濃縮によって使用食塩量が大幅に削減され、コストダウンにつながる。また、同じ食塩濃度・ｐＨで塩析をする場合、塩析上清に残るＰＱＱ量は変わらないので、原液を濃縮することによって結果的に塩析工程のＰＱＱ回収率は向上する。実施例７〜１１、比較例２ 重金属除去 設備配管などから重金属分が混入したＰＱＱジナトリウムを溶解し、２５％苛性ソーダでｐH６〜８に調節した水溶液（ＰＱＱ濃度４．５ｇ／Ｌ、カドミウム濃度２．２ｐｐｂ、クロム濃度１８０ｐｐｂ、銅濃度２５ｐｐｂ、鉄濃度３７０ｐｐｂ、マンガン濃度２１０ｐｐｂ、ニッケル濃度１６ｐｐｂ）に、日本エンバイロケミカルズ社の活性炭カルボラフィンR（実施例7）、三菱化学社製合成吸着材セパビーズRＳＰ２０７（実施例８）、キレート樹脂ダイヤイオンRＣＲ２０（実施例９）、オルガノ社製強塩基性陰イオン交換樹脂アンバーライトRＩＲＡ９５８（実施例１０）、強酸性陽イオン交換樹脂アンバーライトRＩＲ１２４（実施例１１）を表３のように混合し、５時間静置した後、沈降上清を取った。また、活性炭等を用いることなく、そのまま放置した場合の結果を比較例２とした。結果を表３、４に示す。これより、重金属が含まれるＰＱＱ溶液から重金属を除去できたことが分かった。本発明は、食品、医薬品、化粧品、飼料等の分野で有効である。１：カラム２：ポンプ３：タンク（原料）４：タンク（ろ液）ピロロキノリンキノン類を含む溶液を樹脂吸着剤又は活性炭と接触させる工程を含む高純度ピロロキノリンキノン類の製造方法。樹脂吸着剤又は活性炭の比表面積が１００ｍ2／ｇ以上であることを特徴とする請求項１記載の製造方法。樹脂吸着剤がスチレン系またはアクリル系の骨格を有すること特徴とする請求項１又は２記載の製造方法。ピロロキノリンキノン類が、式（１）の構造を有する酸化型ＰＱＱ、式（２）の構造を有する還元型ＰＱＱ又はこれらの塩であることを特徴とする請求項１から３いずれか記載の製造方法。ピロロキノリンキノン類を含む溶液がピロロキノリンキノン培養液であることを特徴とする請求項１から４いずれか記載の製造方法。ピロロキノリンキノン類を含む溶液がピロロキノリンキノン培養液をｐＨ２から８にして析出物を除去した溶液であることを特徴とする請求項１から４いずれか記載の製造方法。ピロロキノリンキノン類を含む溶液がピロロキノリンキノン培養液をｐＨ２から８にして析出物を除去した溶液を晶析し、得られた結晶を溶解させた溶液であることを特徴とする請求項１から４いずれか記載の製造方法。ピロロキノリンキノン類を含む溶液を樹脂吸着剤または活性炭と接触させる工程の後、更にピロロキノリンキノン類を含む溶液を再結晶もしくはカラムクロマトグラフィーで精製する工程を含む請求項１から７いずれか記載のピロロキノリンキノンの製造方法。カラムクロマトグラフィーで精製する工程において、塩基性条件で該ピロロキノリンキノンを脱離させることを特徴とする請求項８記載の製造方法。樹脂吸着剤又は活性炭と接触させることを特徴とする、ピロロキノリンキノン類と重金属を含む混合溶液からの重金属除去方法。請求項１から１０いずれかに記載の方法で作られたピロロキノリンキノンまたはその塩。 【課題】タンパク成分や重金属等の不純物を効率よく除去した高純度で高品質のピロロキノリンキノン類又はそれらの塩、及びそれらの製造方法を提供することを課題とする。【解決手段】ピロロキノリンキノン類を含む溶液を樹脂吸着剤又は活性炭を用いて精製する工程を行うことにより、上記課題を解決した。【選択図】 なし