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布施 千絵 八谷 輝 田口 浩之 JP 2014001248 公開特許公報(A) 20140109 2013212460 20131010 ＩＧＦＢＰ−５発現抑制剤 花王株式会社 000000918 特許業務法人アルガ特許事務所 110000084 高野 登志雄 100077562 中嶋 俊夫 100096736 村田 正樹 100117156 山本 博人 100111028 布施 千絵 八谷 輝 田口 浩之 A61K 36/18 20060101AFI20131206BHJP A61K 8/97 20060101ALI20131206BHJP A61K 36/48 20060101ALI20131206BHJP A61K 36/896 20060101ALI20131206BHJP A61K 36/07 20060101ALI20131206BHJP A61P 17/00 20060101ALI20131206BHJP A61P 19/10 20060101ALI20131206BHJP A61P 35/00 20060101ALI20131206BHJP A61P 43/00 20060101ALI20131206BHJP A61Q 5/00 20060101ALI20131206BHJP JPA61K35/78 CA61K8/97A61K35/78 JA61K35/78 VA61K35/84 AA61P17/00A61P19/10A61P35/00A61P43/00 111A61Q5/00 2 2008327360 20081224 ＯＬ 9 4C083 4C088 4C083AA111 4C083AA112 4C083BB53 4C083CC31 4C083EE22 4C083EE25 4C088AA04 4C088AB12 4C088AB13 4C088AB15 4C088AB19 4C088AB59 4C088AB67 4C088AB85 4C088AB89 4C088AC01 4C088AC03 4C088AC12 4C088AC13 4C088AC17 4C088AC18 4C088BA08 4C088CA08 4C088MA63 4C088NA14 4C088ZA92 4C088ZA97 4C088ZB26 4C088ZC41 本発明は、インスリン様成長因子結合蛋白質−５（Insulin-like growth factor-binding protein-5、以下、「ＩＧＦＢＰ−５」と称する）発現抑制剤に関する。 インスリン様成長因子(Insulin-like growth factor、以下、「ＩＧＦ」と称する)はインスリンと配列が高度に類似したポリペプチドである。細胞培養においては、細胞増殖促進やDNA合成促進などのインスリンと類似した作用を示す。 また、インスリン様成長因子結合蛋白質(ＩＧＦＢＰ)は、ＩＧＦに特異的に結合するタンパク質であり、ＩＧＦの受容体への結合を阻害したり、ＩＧＦの半減期を伸ばしたりすることでＩＧＦの作用を調節する。ＩＧＦＢＰは、6種類の分子種からなるファミリーを形成している。 ＩＧＦＢＰ−５は、主として、前立腺、乳腺、皮膚及び毛包に発現するインスリン様成長因子結合蛋白質であり(非特許文献１及び２)、特に、ヒトの毛包においては、毛乳頭と毛根鞘に発現し、細胞外マトリックスの再構成に重要であることが知られている(非特許文献２)。また、ヒト前立腺ガン細胞に対して増殖亢進作用を有することが知られている(非特許文献３−５)。 また、マウスの骨細胞にＩＧＦＢＰ−５を過剰発現させると、骨石灰化速度と海綿骨が減少すること（非特許文献６)、ＩＧＦＢＰ−５を過剰発現させた遺伝子改変マウスの長骨密度はコントロールマウスの長骨密度と比較して３０％低いこと（非特許文献７）、骨肉腫由来細胞にＩＧＦＢＰ−５を過剰発現させると、その増殖速度が３０％減少すること（非特許文献８）、骨芽様細胞株ＭＣ３Ｔ３にＩＧＦＢＰ−５を過剰発現させると、細胞の分化と石灰化が減少すること（非特許文献９）が知られている。 マウスの体毛はその形状から４種類に分類され、くせ毛様のzigzag hair、auchen hairと直毛のguard hair、awl hairが知られている。 また、最近では、ＩＧＦＢＰ−５はマウスの毛乳頭、毛髄質（メデュラ）に発現しており、マウスの毛周期に連動し、その発現量が消長すること(非特許文献１０)、ＩＧＦＢＰ−５は、マウスの体毛の種類のうち、くせ毛様のzigzag hairの曲がり部分のメデュラに強く発現していること、ＩＧＦＢＰ−５過剰発現マウスの毛は、コントロールマウスと比較して曲がりが増強され、本来直毛種であるguard hair、awl hairの形状もくせ毛になることが知られている(非特許文献１１及び１２)。 くせ毛や縮毛は、「髪が広がる」、「好みの髪型が作れない」、「髪の手入れに時間がかかる」といった毛髪に関する悩みの原因の一つとなっており、縮毛矯正剤等を使用して毛髪ケラチンのシスチン結合を切断し、毛髪をまっすぐに伸ばすことが従来から行われている。しかしながら、斯かる薬剤は、少なからず毛髪に損傷を与えるという問題がある。 一方、チャボトケイソウ、スベリヒユ、セッチャ、ブッソウゲ、グンバイナズナ、センブリ、ドクサンラン、サイハイラン、ブクリョウ、ワイルドインディゴ及びハマツゲから選ばれる植物には、利尿作用、抗炎症作用、血行促進作用等種々の薬理作用があることが知られているが、これらの植物にＩＧＦＢＰ−５発現抑制作用があることは、これまで知られていない。Biochem.J.(2006) 395 1-19J. Invest. Dermatol. (1996) 106 471-475Prostate Cancer Prostatic Dis. (2000) 3 S16Endocrinology (2000) 141 2257-2265Canse Res. (2000) 60 3058-3064Endocrinology (2002) 143 3955-3962Endocrinology (2005) 146 931-940Biochem Biophys Res Commun (2001) 288 435-442Bone (2004) 35 1256-1262J. Biol. Chem. (1994) 269 (14) 10891-10898Development (2005) 132 2981-2990Mechanisms of Development (2005) 122 988-997 本発明は、毛髪形状の制御等に有用なＩＧＦＢＰ−５発現抑制剤を提供することに関する。 本発明者らは、ＩＧＦＢＰ−５の発現を抑制する物質について検討を行った結果、チャボトケイソウ、スベリヒユ、セッチャ、ブッソウゲ、グンバイナズナ、センブリ、ドクサンラン、サイハイラン、ブクリョウ、ワイルドインディゴ及びハマツゲから選ばれる植物又はその抽出物が優れたＩＧＦＢＰ−５発現抑制作用を有し、毛髪形状の抑制、ガン細胞の増殖抑制及び骨疾患の予防・改善を目的とした医薬品又は化粧品等として使用できることを見出した。 すなわち、本発明は、チャボトケイソウ、スベリヒユ、セッチャ、ブッソウゲ、グンバイナズナ、センブリ、ドクサンラン、サイハイラン、ブクリョウ、ワイルドインディゴ及びハマツゲから選ばれる植物又はその抽出物を有効成分とするＩＧＦＢＰ−５発現抑制剤に係るものである。 また、本発明は、チャボトケイソウ、スベリヒユ、セッチャ、ブッソウゲ、グンバイナズナ、センブリ、ドクサンラン、サイハイラン、ブクリョウ、ワイルドインディゴ及びハマツゲから選ばれる植物又はその抽出物を有効成分とする毛髪形状制御剤に係るものである。 本発明のＩＧＦＢＰ−５発現抑制剤は、くせ毛改善等の毛髪形状の制御、ガン細胞の増殖の抑制、或いは骨粗しょう症等の骨疾患の予防・改善をするための医薬品又は化粧品等として有用である。PRLP0 RNA 相対発現量及びIGFBP-5/RPLP0 RNA 相対発現量を示した図である。 本発明において、「ＩＧＦＢＰ−５発現抑制」とは、ＩＧＦＢＰ−５遺伝子の発現を抑制すること又はＩＧＦＢＰ−５遺伝子の発現を抑制することによりＩＧＦＢＰ−５の発現を抑制することをいう。 ＩＧＦＢＰ−５とは、インスリン様成長因子結合蛋白質−５を意味し、アミノ酸残基２５２個から成る分泌タンパク質である（J. Biol. Chem. (1994) 269 (14) 10891-10898）。また、ＩＧＦＢＰ−５遺伝子とは、ＩＧＦＢＰ−５をコードする遺伝子をいい、その全塩基配列はJ. Biol. Chem. (1994) 269 (14) 10891-10898に開示されている。 本発明におけるチャボトケイソウとは、トケイソウ科のPassiflora incarnataを意味し、スベリヒユとは、スベリヒユ科のPortulaca oleracea L.を意味し、セッチャとは、ムシゴケ科のThamnolia vermicularis (Ach.) Asahinaを意味し、ブッソウゲとは、アオイ科のHibiscus rosa-sinensis L.を意味し、グンバイナズナとは、アブラナ科のThlaspi arvenseを意味し、センブリとは、リンドウ科のSwertia japonicaを意味する。 また、ドクサンランとは、ラン科のPleione bulbocodiodes (French.)Rolfeを意味し、サイハイランは、同じくラン科のCremastra appendiculata (D.Don) Makinoを意味する。両者の鱗茎は、サンジコ（山慈姑）として使用される。 また、ブクリョウとは、サルノコシカケ科のPoria cocosを意味し、ワイルドインディゴとは、マメ科のBaptisia tinctoriaを意味し、ハマツゲとは、カヤツリグサ科のCyperus rotundus L.を意味する。 本発明における植物は、その植物の全草、葉、茎、芽、花、木質部、樹皮、地衣体、根、根茎、仮球茎、球茎、塊茎、種子、果実、菌核及び樹脂等をそのまま又は粉砕して使用できるが、チャボトケイソウについては全草を、スベリヒユについては全草を、セッチャについては地衣体を、ブッソウゲについては花を、グンバイナズナについては全草を、センブリについては全草を、ドクサンラン及びサイハイランについては仮球茎を、ブクリョウについては菌核を、ワイルドインディゴについては根茎を、ハマツゲについては球茎を使用するのが好ましい。 本発明における抽出物とは、上記植物を常温又は加温下にて抽出するか又はソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて抽出すること等により得られる各種溶媒抽出液、その希釈液、その濃縮液又はその乾燥末を意味するものである。 本発明の植物抽出物を得るために用いられる抽出溶剤としては、極性溶剤、非極性溶剤のいずれをも使用することができる。当該抽出溶剤の具体例としては、例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；スクワラン、ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；トルエン等の芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類；及び二酸化炭素等が挙げられ、これらは混合物として用いることができる。 また、上記抽出溶剤のうち、本発明の抽出溶剤としては、エタノール、プロピレングリコール、ブチレングリコールと水の混合物が好ましい。また、抽出溶剤の使用量としては、植物１ｇに対して１〜１００ｍＬが好ましく、抽出時間としては、１時間〜１００日が好ましく、抽出温度としては、５〜８０℃が好ましい。 上記の植物抽出物は、そのまま用いることもできるが、当該抽出物を希釈、濃縮若しくは凍結乾燥した後、粉末又はペースト状に調製して用いることもできる。 また、上記の植物抽出物は、クロマトグラフィー液々分配等の分離技術により、上記抽出物から不活性な夾雑物を除去して用いることもできる。尚、本発明の植物若しくはそれらの抽出物は、２種以上を混合して用いてもよい。 本発明の植物又はその抽出物は、後記実施例に示すように、優れたＩＧＦＢＰ−５発現抑制作用を有する。従って、当該植物又はその抽出物は、ＩＧＦＢＰ−５発現抑制剤として使用することができ、また、当該ＩＧＦＢＰ−５発現抑制剤を製造するために使用することができる。 前述したとおり、ＩＧＦＢＰ−５は、毛の形状に非常に重要な因子であり(前掲、非特許文献６及び７)、ガン細胞に対して増殖亢進作用を有し(前掲、非特許文献３−５)、骨石灰化・骨密度減少作用を有する（前掲、非特許文献６−９）。 従って、本発明の植物又はその抽出物は、毛髪形状の制御、ガン細胞の増殖抑制、骨粗しょう症等の骨疾患の予防・改善をするための、ヒト又は動物用の医薬品、医薬部外品及び化粧品等として使用できる。 本発明の植物又はその抽出物を、医薬品として使用する場合、任意の投与形態で投与することができる。投与形態としては、経口投与、並びに経皮、経毛、経腸、経粘膜及び注射等の非経口投与が挙げられる。 非経口投与のための製剤の剤型としては、塗布剤及び貼付剤等の外用剤、静脈内注射用、筋肉内注射用、皮下注射用及び点滴注射用等の注射剤、吸入、輸液、坐剤、吸入薬、経皮吸収剤、点眼剤、点鼻剤等が挙げられる。 経口投与のための製剤の剤型としては、例えば錠剤、被覆錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、徐放性製剤、懸濁液、エマルジョン剤、内服液、糖衣錠、丸剤、細粒剤、シロップ剤、エリキシル剤等が挙げられる。 また、斯かる製剤では、本発明の植物又はその抽出物と、薬学的に許容される担体とを組み合わせて使用してもよい。斯かる担体としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、流動性促進剤、吸収助剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、防腐剤、安定化剤、酸化防止剤、着色剤、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、光沢剤、活性増強剤、抗炎症剤、殺菌剤、矯味剤、矯臭剤、増量剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、香料、被膜剤等が挙げられる。 これらの投与形態のうち、外用剤が好ましく、外用剤として用いる場合の該製剤中の本発明の植物又はその抽出物の含有量は、通常、製剤全質量の０．０００１〜１０質量％であり、０．００１〜５質量％が好ましく、０．０１〜５質量％がより好ましい。 上記製剤の投与量は、患者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与の場合の成人１人当たりの１日の投与量は、通常、植物又はその抽出物として０．０１〜１ｇが好ましい。また、上記製剤は、任意の投与計画に従って投与され得るが、１日１回〜数回に分けて投与することが好ましい。 また、本発明の植物又はその抽出物を医薬部外品や化粧品として用いる場合は、皮膚外用剤、洗浄剤、メイクアップ化粧料とすることができ、使用方法に応じて、美容液、化粧水、マッサージ剤、ローション、乳液、ゲル、クリーム、軟膏剤、粉末、パック、顆粒、ファンデーション、口紅、入浴剤、シャンプー、ヘアコンディショナー、ヘアトニック、錠剤、カプセル、吸収性物品、シート状製品等の種々の剤型で提供することができる。このような種々の剤型の医薬部外品や化粧料は、本発明の植物又はその抽出物を単独で、又は医薬部外品、皮膚化粧料及び洗浄料に配合される、油性成分、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、可溶化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、増粘剤、薬効成分、香料、樹脂、防菌防黴剤、植物抽出物、アルコール類等を適宜組み合わせることにより調製することができる。 当該医薬部外品及び化粧品中の本発明の植物又はその抽出物の含有量は、０．００１〜５質量％とするのが好ましく、０．０１〜５質量％とするのがより好ましい。 以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。製造例１ チャボトケイソウ、スベリヒユ、セッチャ、ブッソウゲ、グンバイナズナ、センブリ、ドクサンラン、ブクリョウ、ワイルドインディゴ及びハマツゲの抽出物を調製した。 チャボトケイソウは、全草40gを細切りし、50％エタノール400mLを加え、室温で22日間抽出後、濾過して抽出物を得た（収量２７０mL,蒸発残分1.06w/v%）。その他の植物については、表１に示す条件で、チャボトケイソウと同様にして抽出物を得た。実施例１ １）正常ヒト表皮角化細胞 以下の２種類の正常ヒト表皮角化細胞を用いた。 i）正常ヒト新生児包皮由来表皮角化細胞 KK-4009 ロット番号 5C0759 クラボウ ii）正常ヒト成人男性包皮由来表皮角化細胞 KJB-100 ロット番号FOR21M1105 コージンバイオ株式会社 ２）培地やその他の試薬 正常ヒト表皮角化細胞増殖用無血清液体培地（EpiLife-KG2 M-EPI-2150S クラボウ）を用いた。添加剤として、終濃度10μg/mLインスリン(INS)、0.1ng/mLヒト組換え型上皮成長因子(hEGF)、0.5μg/mLハイドロコーチゾン(HC)、抗菌剤(50μg/mLゲンタマイシン、50ng/mLアンフォテリシンB)、0.4%V/Vウシ脳下垂体抽出液(BPE)を加えた。なお、増殖用培地は、上記の添加剤を全て添加した培地(EpiLife-KG2(+))とした。植物エキス添加時の培地は、上記の添加剤のうちINS、HC、抗菌剤を添加した培地(EpiLife-KG2(-))とした。継代には、0.025％W/Vのトリプシンと0.01%W/VのEDTAを含むトリプシン/EDTA溶液(HK-3120)とFBSを10%含むトリプシン中和液(HK-3220)を用いた。 ３）スクリーニング スクリーニングでは、6穴プレート又は12穴プレートに正常ヒト表皮角化細胞を1.0〜1. 5×104cm2にて播種し、EpiLife-KG2(+)を用いて37℃、5%CO2濃度のもと培養した。1〜3日培養し、50%〜60%コンフルエントになるのを確認した。PBSで2回細胞を洗浄した後、EpiLife-KG2(-)に交換した。24時間後、植物エキス(植物抽出物)を終濃度0.5%V/V又は0.1%V/V含むEpiLife-KG2(-)を作製した培地に交換、24時間培養した。 669種の植物エキスを細胞へ、終濃度1.0%V/V、0.5%V/Vとして添加した。なお、コントロールとしては、それぞれの植物エキスの抽出溶媒を用いた。また、細胞への植物エキス添加はN=1である。 PBSで2回細胞を洗浄し、アイソジェン(311-02501 ニッポンジーン)を添加し、細胞を回収した。ニッポンジーン社が提示する標準的な方法に従い、細胞からRNAを抽出、精製した。 それぞれ精製したRNAの濃度の測定には、吸光分光度計及びQuant-iTTM RiboGreen RNA Reagent and kit(R11490 インビトロジェン)を用いた。インビトロジェン社が提示する標準的な方法に従い、RNAを測定した。濃度を測定後、QuantiTect Reverse Transcript (205311 キアゲン)を用いた。キアゲン社が提示する標準的な方法に従い、RNAからcDNAへ変換した。 アプライドバイオシステムズ 7500 Fast リアルタイムPCRシステムを用いて、IGFBP-5遺伝子と内部標準遺伝子としてRibosomal Protein large PO遺伝子のRNAの発現量を定量した。アプライドバイオシステムズ社が提示する標準的な方法に従い、Universal Master Mix (4304437 アプライドバイオシステムズ)、TaqMan（登録商標） Gene Expression Assays(IGFBP-5: Hs00181213_mL、RPLP0: Hs99999902_mL アプライドバイオシステムズ)を用いた。各遺伝子について検量線法による絶対定量を行なった。結果を図１に示す。また、PRLP0 RNA 相対発現量を四角、IGFBP-5/RPLP0 RNA 相対発現量を棒グラフで示す。 評価においては、IGFBP-5遺伝子のRNA発現量を内部標準遺伝子であるRPLP0遺伝子のRNA発現量で補正した。また、コントロールを添加した細胞から抽出したRNA発現量を１とした。 図１からわかるように、チャボトケイソウ、スベリヒユ、セッチャ、ブッソウゲ、グンバイナズナ、センブリ、ドクサンラン、ブクリョウ、ワイルドインディゴ、ハマツゲいずれにおいても、優れたIGFBP-5遺伝子発現抑制作用が確認された。 スベリヒユ、ブッソウゲ、グンバイナズナ、ブクリョウ、ワイルドインディゴ、ハマツゲ、ドクサンラン及びサイハイランから選ばれる植物又はその抽出物を有効成分とするＩＧＦＢＰ−５発現抑制剤。 スベリヒユ、ブッソウゲ、グンバイナズナ、ブクリョウ、ワイルドインディゴ、ハマツゲ、ドクサンラン及びサイハイランから選ばれる植物又はその抽出物を有効成分とする毛髪形状制御剤。 【課題】毛髪形状の制御等に有用なＩＧＦＢＰ−５発現抑制剤の提供。【解決手段】スベリヒユ、ブッソウゲ、グンバイナズナ、ブクリョウ、ワイルドインディゴ、ハマツゲ、ドクサンラン及びサイハイランから選ばれる植物又はその抽出物を有効成分とするＩＧＦＢＰ−５発現抑制剤。【選択図】なし

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