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| タイトル： | 公開特許公報(A)_光学活性アミノ酸の製造法 |
| 出願番号： | 2013141914 |
| 年次： | 2015 |
| IPC分類： | C12P 13/08,C12R 1/01,C12R 1/025,C12R 1/13,C12R 1/38 |
特許情報キャッシュ
野尻 増俊 吉田 文 平井 義則 川野 茂 西山 章 八十原 良彦 JP 2015012838 公開特許公報(A) 20150122 2013141914 20130705 光学活性アミノ酸の製造法 株式会社カネカ 000000941 野尻 増俊 吉田 文 平井 義則 川野 茂 西山 章 八十原 良彦 C12P 13/08 20060101AFI20141219BHJP C12R 1/01 20060101ALN20141219BHJP C12R 1/025 20060101ALN20141219BHJP C12R 1/13 20060101ALN20141219BHJP C12R 1/38 20060101ALN20141219BHJP JPC12P13/08C12P13/08C12P13/08C12P13/08C12P13/08C12R1:01C12R1:025C12R1:13C12R1:38 10 ＯＬ 14 4B064 4B064AE03 4B064CA02 4B064CB11 4B064CB30 4B064CD07 4B064CD12 4B064DA01 本発明は、医薬品中間体として有用な光学活性イソバリンの製造原料の製造法に関する。 光学活性イソバリンの製造原料として有用な光学活性２-エチル-２-メチル-マロン酸モノエステルの製造法として、２-エチル-２-メチルマロン酸ジエチルにブタ肝臓由来エステラーゼを作用させて（Ｓ）-２-エチル-２-メチルマロン酸モノエチルを取得する方法（非特許文献１）があるが、光学純度が１５％ｅｅと十分でない。 また、同じく光学活性イソバリンの製造原料として有用な光学活性２-エチル-２-メチルマロン酸モノアミドの製造法として、２-エチル-２-メチルマロン酸ジニトリルにロドコッカス属微生物（ロドコッカス ロドクロウスＮＢＲＣ１５５６４）を作用させて（Ｓ）-２-エチル-２-メチルマロン酸モノアミドを取得する方法（非特許文献２）があるが、光学純度が１２％ｅｅと非常に低い。 以上のように、現在知られている光学活性２-エチル-２-メチルマロン酸モノエステル或いは光学活性２-エチル-２-メチルマロン酸モノアミドの製造方法は、光学純度が低いため、工業的生産に有利な方法とは言い難い。Tetrahedron 41,1347-1352(1985)Tetrahedron : Asymmetry 15,2817-2820(2004) 上記に鑑み、本発明の目的は、２-エチル-２-メチルマロン酸ジエステルを原料に光学活性２-エチル-２-メチルマロン酸モノエステルを高光学純度にて製造することにあり、これを光学活性２-エチル-２-メチルマロン酸モノアミドに変換し、更にホフマン転位反応することで、医薬品中間体として有用な光学活性イソバリンの製造に繋げる点にある。 また、本発明の目的は、２-エチル-２-メチルマロン酸ジアミドを原料に光学活性２-エチル-２-メチルマロン酸モノアミドを高光学純度にて製造することにあり、これをホフマン転位反応することで、医薬品中間体として有用な光学活性イソバリンの製造に繋げる点にある。 本発明者らは、前記課題に基づき鋭意検討を行った結果、２-エチル-２-メチルマロン酸ジエステルを不斉加水分解して高光学純度の２-エチル-２-メチルマロン酸モノエステルが得られる酵素源を見出し、本発明を完成させるに至った。 また、２-エチル-２-メチルマロン酸ジアミドを不斉加水分解して高光学純度の２-エチル-２-メチルマロン酸モノアミドが得られる酵素源を見出し、本発明を完成させるに至った。 さらに、本発明は、高光学純度のイソバリンの合成も可能にする。 即ち、本発明は[1]下記式（１）；（式中、ＸはＣＯ２Ｒ、又はＣＯＮＨ２を表す。Ｒは置換基を有しても良いＣ１〜Ｃ５のアルキル基を表す）で表される２-エチル-２-メチルマロン酸ジエステル、２-エチル-２-メチルマロン酸ジアミドに酵素源を作用させて下記式（２）；（式中、＊は不斉炭素原子を表す）で表されるモノカルボン酸を製造し、必要に応じて下記式（３）；（式中、＊は不斉炭素原子を表す）で表される２-エチル-２-メチルマロン酸モノアミドに変換し、更にホフマン転位反応することを特徴とする下記式（４）；（式中、＊は不斉炭素原子を表す）で表される光学活性イソバリンの製造法に関する。[2]Ｒが置換基を有していてもよい炭素数１〜３のアルキル基である[1]に記載の製造法。[3]Ｒがメチル基、又はエチル基である[2]に記載の製造法。[4]Ｒがエチル基である[3]に記載の製造法。[5]酵素源が、アクロモバクター(Achromobacter)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、セルロモナス(Cellulomonas)属、コマモナス(Comamonas)属、カプリアビダス（Cupriavidus）属、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属、又はシュードモナス（Pseudomonas）属からなる群から選択される少なくとも１種の微生物の菌体及び／又はその処理物である[1]〜[4]のいずれかに記載の製造法。[6]酵素源が、アクロモバクター デニトリフィカンス(Achromobacter denitrificans)、ブレビバクテリウム ヨーデナム(Brevibacterium iodinum)、セルロモナス フィミ(Cellulomonas fimi)、コマモナス スピーシーズ(Comamonas sp.)、カプリアビダス メタリデュランス（Cupriavidus metallidurans）、又はカプリアビダス ネケター（Cupriavidus necator）、ミクロバクテリウム ラエバニフォルマンス(Microbacterium laevaniformans)、ミクロバクテリウム テスタセアム(Microbacterium testaceum)、又はシュードモナス スピーシーズ（Pseudomonas sp.）からなる群から選択される少なくとも１種の微生物の菌体及び／又はその処理物である[1]〜[5]のいずれかに記載の製造法。[7]酵素源として、コマモナス(Comamonas)属、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属、又はシュードモナス（Pseudomonas）属からなる群から選択される少なくとも１種の微生物の菌体及び／又はその処理物を用いて絶対配置がＳであるイソバリンを製造する[5]に記載の製造法。[8]酵素源として、コマモナス スピーシーズ(Comamonas sp.)、ミクロバクテリウム ラエバニフォルマンス(Microbacterium laevaniformans)、ミクロバクテリウム テスタセアム(Microbacterium testaceum)、又はシュードモナス スピーシーズ（Pseudomonas sp.）からなる群から選択される少なくとも１種の微生物の菌体及び／又はその処理物を用いて絶対配置がＳであるイソバリンを製造する[7]に記載の製造法。[9]酵素源として、アクロモバクター(Achromobacter)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、セルロモナス(Cellulomonas)属、又はカプリアビダス（Cupriavidus）属からなる群から選択される少なくとも１種の微生物の菌体及び／又はその処理物を用いて絶対配置がＲであるイソバリンを製造する[5]に記載の製造法。[10]酵素源として、アクロモバクター デニトリフィカンス(Achromobacter denitrificans)、ブレビバクテリウム ヨーデナム(Brevibacterium iodinum)、セルロモナス フィミ(Cellulomonas fimi)、コマモナス スピーシーズ(Comamonas sp.)、カプリアビダス メタリデュランス（Cupriavidus metallidurans）、又はカプリアビダス ネケター（Cupriavidus necator）からなる群から選択される少なくとも１種の微生物の菌体及び／又はその処理物を用いて絶対配置がＲであるイソバリンを製造する[9]に記載の製造法。 本発明により、プロキラルな２-エチル-２-メチルマロン酸ジエステル、２-エチル-２-メチルマロン酸ジアミドを原料として、高光学純度で光学活性イソバリンを製造できる。 以下、本発明を、実施形態を用いて詳細に説明する。本発明はこれらにより限定されるものではない。 本発明の原料である２-エチル-２-メチルマロン酸ジエステルは、下記式（５）；（式中、Ｒは置換基を有しても良いＣ１〜Ｃ５のアルキル基を表す）で表され、 ２-エチル-２-メチルマロン酸モノアミドは、下記式（３）；（式中、＊は不斉炭素原子を表す）で表される。 最終生成物である光学活性イソバリンは下記式（４）；（式中、＊は不斉炭素原子を表す）で表される。 本発明で用いる「酵素源」は、光学活性な２-エチル-２-メチルマロン酸モノエステルを高光学純度で製造する能力を有する酵素であり、市販酵素、酵素源となる微生物の菌体およびその処理物が含まれる。 「高光学純度」とは、絶対配置がＳである２-エチル-２-メチルマロン酸モノエステルを製造する能力を有する酵素源を用いる場合は、好ましくは２０％ｅｅ以上、より好ましくは８０％ｅｅ以上、更に好ましくは９０％ｅｅ以上、最も好ましくは９５％ｅｅ以上である。 また、本発明で用いる「酵素源」は、光学活性な２-エチル-２-メチルマロン酸モノアミドを高光学純度で製造する能力を有する酵素であり、市販酵素、酵素源となる微生物の菌体およびその処理物が含まれる。 「高光学純度」とは、絶対配置がＳである２-エチル-２-メチルマロン酸モノアミドを製造する能力を有する酵素源を用いる場合は、好ましくは２０％ｅｅ以上、より好ましくは８０％ｅｅ以上、更に好ましくは８５％ｅｅ以上、更により好ましくは９０％ｅｅ以上、最も好ましくは９５％ｅｅ以上である。 また、絶対配置がＲである２-エチル-２-メチルマロン酸モノアミドを製造する能力を有する酵素源を用いる場合は、好ましくは２０％ｅｅ以上、より好ましくは３０％ｅｅ以上である。 「微生物の菌体」とは、菌体そのものの他、菌体を含む培養液あるいは菌体懸濁液を含めて意味する。なお、菌体には、野生株の他、変異を生じさせて有利な性質を得た変異株も含み、さらには、該微生物由来の光学活性な２-エチル-２-メチルマロン酸モノエステル、２-エチル-２-メチルマロン酸モノアミドを製造する活性を有する酵素をコードするＤＮＡが導入された形質転換株も含む。 「菌体の処理物」とは、例えば、粗抽出液、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、又はそれら菌体の破砕物等を意味し、さらには、光学活性な２-エチル-２-メチルマロン酸モノエステル、２-エチル-２-メチルマロン酸モノアミドを製造する能力を有する酵素自体、或いは部分精製酵素であってもよい。さらにそれらは、酵素自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化されて用いることができる。固定化は、当業者に周知の方法（例えば架橋法、物理的吸着法、包括法等）で行うことができる。 本明細書で後述する各微生物は、特許微生物寄託機関やその他研究機関から入手可能であり、更には、自然界から分離することもできる。（例えば、ＮＢＲＣ番号で特定される微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門より入手可能である。） また、２-エチル-２-メチルマロン酸ジエステル、２-エチル-２-メチルマロン酸ジアミドや酵素生産を誘導するための誘導剤を用いて集積培養することにより、自然界から分離することもできる。 本発明は、２-エチル-２-メチルマロン酸ジエステルを不斉加水分解して高光学純度の２-エチル-２-メチルマロン酸モノエステルが得られる酵素源を用いる。 得られた２-エチル-２-メチルマロン酸モノエステルは、化学的に２-エチル-２-メチルマロン酸モノアミドに変換し、更にホフマン転位反応により、光学活性イソバリンを製造できる。 ２-エチル-２-メチルマロン酸ジエステルに不斉加水分解活性を有する酵素源としては例えば、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属由来の酵素源が挙げられる。 前記酵素源のうち、絶対配置がＳである２-エチル-２-メチルマロン酸モノエステルを製造する能力を有する酵素源としては、例えば、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属微生物由来の酵素源が挙げられる。 好ましくはミクロバクテリウム ラエバニフォルマンス(Microbacterium laevaniformans)、又はミクロバクテリウム テスタセアム(Microbacterium testaceum)等の微生物由来の酵素源である。 より好ましくはミクロバクテリウム ラエバニフォルマンス(Microbacterium laevaniformans) ＮＢＲＣ１４４７１、又はミクロバクテリウム テスタセアム(Microbacterium testaceum) ＮＢＲＣ１５３０２由来の酵素源である。 また、得られた（Ｓ）-２-エチル-２-メチルマロン酸モノエステルは、（Ｒ）-２-エチル-２-メチルマロン酸モノアミドに変換後、ホフマン転移反応により、（Ｓ）-イソバリンを合成できる。 また、本発明は、２-エチル-２-メチルマロン酸ジアミドを不斉加水分解して高光学純度の２-エチル-２-メチルマロン酸モノアミドが得られる酵素源を用いる。 得られた２-エチル-２-メチルマロン酸モノアミドは、更にホフマン転位反応により、光学活性イソバリンを製造できる。 ２-エチル-２-メチルマロン酸ジアミドに不斉加水分解活性を有する酵素源としては例えば、アクロモバクター(Achromobacter)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、セルロモナス(Cellulomonas)属、カプリアビダス（Cupriavidus）属、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属、又はシュードモナス（Pseudomonas）属からなる群から選ばれた微生物由来の酵素源が挙げられる。 前記酵素源のうち、絶対配置がＳである２-エチル-２-メチルマロン酸モノアミドを製造する能力を有する酵素源としては、例えば、アクロモバクター(Achromobacter)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、セルロモナス(Cellulomonas)属、コマモナス(Comamonas)属、カプリアビダス（Cupriavidus）属又はシュードモナス（Pseudomonas）属からなる群から選ばれた微生物由来の酵素源が挙げられる。 好ましくは、アクロモバクター デニトリフィカンス(Achromobacter denitrificans)、ブレビバクテリウム ヨーデナム(Brevibacterium iodinum)、セルロモナス フィミ(Cellulomonas fimi)、カプリアビダス メタリデュランス（Cupriavidusmetallidurans）、又はカプリアビダス ネケター（Cupriavidusnecator）等の微生物由来の酵素源である。 より好ましくはアクロモバクター デニトリフィカンス(Achromobacter denitrificans)ＮＢＲＣ１５１２５、ブレビバクテリウム ヨーデナム(Brevibacterium iodinum)ＮＢＲＣ３５５８、セルロモナス フィミ(Cellulomonas fimi)ＮＢＲＣ１５５１３、カプリアビダス メタリデュランス（Cupriavidusmetallidurans）ＮＢＲＣ１０１２７２、カプリアビダス ネケター（Cupriavidusnecator）ＮＢＲＣ１０２５０４由来の酵素源である。 また、得られた（Ｓ）-２-エチル-２-メチルマロン酸モノアミドは、ホフマン転移反応により、（Ｒ）-イソバリンを合成できる。 前記酵素源のうち、絶対配置がＲである２-エチル-２-メチルマロン酸モノアミドを製造する能力を有する酵素源としては、例えば、コマモナス(Comamonas)属、又はシュードモナス（Pseudomonas）属からなる群から選ばれた微生物由来の酵素源が挙げられる。 好ましくは、コマモナス スピーシーズ(Comamonas sp.)、又はシュードモナス スピーシーズ（Pseudomonas sp.）等の微生物由来の酵素源である。 より好ましくはコマモナス エスピー(Comamonas sp.)KNK3-7(NITE BP-963)、又はシュードモナス エスピー（Pseudomonas sp.）KNK24-9(NITE BP-962)由来の酵素源である。 また、得られた（Ｒ）-２-エチル-２-メチルマロン酸モノアミドは、ホフマン転移反応により、（Ｓ）-イソバリンを合成できる。 なお、前記コマモナス エスピー(Comamonas sp.)KNK3-7(NITE BP-963)、又はシュードモナス エスピー（Pseudomonas sp.）KNK24-9(NITE BP-962)は、本発明者らによって土壌から分離された菌株であり、それぞれ前記の受託番号で、平成２２年７月７日付けで、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されている。 また、本発明の酵素源となりうる微生物としては、野生株又は変異株のいずれでもよい。あるいは細胞融合又は遺伝子操作等の遺伝学的手法により誘導される微生物も用いることができる。 例えば、遺伝子操作された微生物であれば、上記で例示した微生物から、２-エチル-２-メチルマロン酸ジエステル、２-エチル-２-メチルマロン酸ジアミドを不斉水解しうる酵素を単離及び／又は精製して酵素のアミノ酸配列の一部又は全部を決定する工程、このアミノ酸配列に基づいて酵素をコードするＤＮＡ配列を得る工程、このＤＮＡを他の微生物に導入して組換え微生物を得る工程、及びこの組換え微生物を培養して、本酵素を得る工程を含有する方法等により得ることができる。これらの各工程は、当業者に周知の遺伝子操組換え技術により、実施することができる。 上記のような組換え微生物としては、前記不斉水解酵素をコードするＤＮＡを有するプラスミドで形質転換された形質転換微生物が挙げられる。また、宿主微生物としてはエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）が好ましい。 酵素源として用いる微生物の為の培養培地は、その微生物が増殖し得るものである限り特に限定されない。例えば、炭素源として、グルコース、シュークロース等の糖質、エタノール、グリセロール等のアルコール類、オレイン酸、ステアリン酸等の脂肪酸及びそのエステル類、菜種油、大豆油等の油類、窒素源として、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、ふすま、酵母エキスなど、無機塩類として、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、燐酸１水素カリウム、燐酸２水素カリウムなど、他の栄養源として、麦芽エキス、肉エキス等を含有する通常の液体培地を使用することができる。 また、微生物の酵素生産を誘導するために誘導剤を培地に添加してもよい。誘導剤としては、エステル、ニトリル、ラクタム化合物、アミド等が挙げられる。例えば、エステルとしては、２-エチル-２-メチルマロン酸ジエステルなどが挙げられ、ニトリルとしては、アセトニトリル、イソバレロニトリル、プロピオニトリル、ピバロニトリル、ｎ−ブチロニトリル、イソブチロニトリル、ｎ−カプロニトリル、３−ペンテンニトリルなどが挙げられ、ラクタム化合物としては、γ−ブチロラクタム、δ−バレロラクタム、ε−カプロラクタムなどが挙げられ、アミドとしては、クロトンアミド、ベンズアミド、プロピオンアミド、アセトアミド、ｎ−ブチルアミド、イソブチルアミド、ｎ−バレルアミド、ｎ−カプロンアミド、メタクリルアミド、フェニルアセトアミド、シクロヘキサンカルボキサミド、２-エチル-２-メチルマロン酸ジアミドなどが挙げられる。 これら誘導剤の培地への添加量は０．０５％〜２．０％、好ましくは０．１％〜１．０％である。培養は好気的に行い、通常、培養時間は１〜５日間程度、培地のｐＨが３〜９、培養温度は１０〜５０℃で行うことができる。 本発明において、２-エチル-２-メチルマロン酸ジエステル或いは２-エチル-２-メチルマロン酸ジアミド（１）の立体選択的な加水分解反応は、適当な溶媒中に原料である２-エチル-２-メチルマロン酸ジエステル或いは２-エチル-２-メチルマロン酸ジアミド（１）、及び前記微生物の菌体又はその処理物等を添加し、ｐＨ調整下攪拌することにより行うことができる。 反応条件は用いる酵素、微生物又はその処理物、基質濃度等によって異なるが、通常、基質濃度は約０．１〜９９重量％、好ましくは１〜６０重量％であり、反応温度は１０〜６０℃、好ましくは２０〜５０℃であり、反応のｐＨは４〜１１、好ましくは６〜９であり、反応時間は１〜１２０時間、好ましくは１〜７２時間で行うことができる。基質は一括、又は連続的に添加して行うことができる。反応はバッチ方式又は連続方式で行うことができる。 反応で生じた光学活性２-エチル-２-メチルマロン酸モノエステル或いは光学活性２-エチル-２-メチルマロン酸モノアミドは、常法により、それぞれを単離、精製できる。例えば、加水分解反応で生じた光学活性２-エチル-２-メチルマロン酸モノエステル或いは光学活性２-エチル-２-メチルマロン酸モノアミドを含む反応液を、酢酸エチル、トルエン等の有機溶媒で抽出し、有機溶媒を減圧下で留去した後、蒸留、再結晶、又は、クロマトグラフィー等の処理を行うことにより、単離、精製できる。また、反応液から微生物菌体を除去したろ液を、硫酸等を用いて中和晶析し、析出した目的物をろ別することによっても単離、精製できる。 以下に実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。 （実施例１） ２-エチル-２-メチルマロン酸ジエチルエステルの立体選択的加水分解 表１に示した各微生物を、試験管内で滅菌した８ｍｌの培地（ペプトン１．０％、イーストエキス０．２％、硫酸マグネシウム７水和物０．１％、２-エチル-２-メチルマロン酸ジエチルエステル０．１％、ｐＨ７．０）に植菌して、３０℃で４６時間、振とう培養した。培養終了後、遠心分離により菌体を集め、２ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。 この菌体懸濁液１ｍｌと、（参考例１）に記載した方法で合成した基質２-エチル-２-メチルマロン酸ジエチルエステル５ｍｇを混合し、３０℃にて２４時間振とうした。反応終了後、遠心分離にて固形物を除去し、反応液中の基質及び生成物を高速液体クロマトグラフィーにて分析することにより、変換率（％）及び２-エチル-２-メチルマロン酸モノエチルエステルの光学純度（％ｅｅ）を求めた。 その結果を表１に示す。・変換率（％）＝生成物量／（基質量＋生成物量）×１００・光学純度（％ｅｅ）＝（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）×１００ （Ａ及びＢは対応する鏡像異性体量を表し、Ａ＞Ｂである） ＜高速液体クロマトグラフィー分析条件＞［変換率の分析］・カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、ナカライテスク社製）・溶離液：２０ｍＭリン酸水溶液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝４／６・流速：０．５ｍｌ／分、カラム温度：３０℃、測定波長：２０５ｎｍ［光学純度の分析］・カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ ＯＪ−ＲＨ（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、ダイセル社製）・溶離液：２０ｍＭリン酸水溶液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝８／２・流速：０．５ｍｌ／分、カラム温度：３０℃、測定波長：２１０ｎｍ （実施例２） （Ｓ）-２-エチル-２-メチルマロン酸モノエチルを原料とした（Ｒ）-２-エチル-２-メチルマロン酸モノアミドの合成、（Ｓ）-イソバリンの合成実施例１記載の微生物ミクロバクテリウム ラエバニフォルマンス(Microbacterium laevaniformans) ＮＢＲＣ１４４７１を用いて調製した（Ｓ）-２-エチル-２-メチルマロン酸モノエチル２ｇ（１１．５ｍｍｏｌ）を用いて、２０重量％アンモニア／メタノール溶液１９．６ｇ（２３０ｍｍｏｌ）とともにオートクレーブ容器に密封し、１００℃にて３０時間撹拌した。反応液に水１０ｇを加え、減圧濃縮してメタノールを留去した。この水溶液を分析したところ、表題化合物である（Ｒ）-２-エチル-２-メチルマロン酸モノアミドが１．６ｇ（１０．８ｍｍｏｌ、収率７０％）含まれていた。この水溶液に３０重量％水酸化ナトリウム水溶液４．６ｇ（３４．５ｍｍｏｌ）を加え、３℃に冷却し、１３％次亜塩素酸水溶液６．６ｇ（１１．５ｍｍｏｌ）を３０分かけて滴下した。３℃で１時間撹拌した後、２５℃に昇温し５時間撹拌した。反応液のｐＨが２．５になるまで濃塩酸を加え、酢酸エチルでこれを洗浄した。この水溶液を分析したところ、表題化合物である（Ｓ）-イソバリンを塩酸塩換算で１．７ｇ（１０．９ｍｍｏｌ、収率９５％）含んでいた。高速液体クロマトグラフィーにて分析することにより、光学純度（％ｅｅ）を求めた結果、９９（％ｅｅ）であった。 ＜高速液体クロマトグラフィー分析条件＞［イソバリンの光学純度の分析］・カラム：ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＡ−７０００（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、住化分析センター社製）・溶離液：２ｍＭ硫酸銅水溶液／メタノール＝９７／３・流速：０．５ｍｌ／分、カラム温度：４０℃、測定波長：２５４ｎｍ （実施例３） ２-エチル-２-メチルマロン酸ジアミドの立体選択的加水分解 表２及び表３に示した各微生物を、試験管内で滅菌した８ｍｌの培地（グリセロール１．０％、ペプトン０．５％、モルトエキス０．３％、イーストエキス０．３％、シクロヘキサンカルボキサミド０．１％、ｐＨ７．０）に植菌して、３０℃で４６時間、振とう培養した。培養終了後、遠心分離により菌体を集め、２ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。 この菌体懸濁液１ｍｌと、（参考例２）に記載した方法で合成した基質２-エチル-２-メチルマロン酸ジアミド２ｍｇを混合し、３０℃にて２４時間振とうした。反応終了後、遠心分離にて固形物を除去し、反応液中の基質及び生成物を高速液体クロマトグラフィーにて分析することにより、変換率（％）及び２-エチル-２-メチルマロン酸モノアミドの光学純度（％ｅｅ）を求めた。 その結果を表２及び表３に示す。・変換率（％）＝生成物量／（基質量＋生成物量）×１００・光学純度（％ｅｅ）＝（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）×１００ （Ａ及びＢは対応する鏡像異性体量を表し、Ａ＞Ｂである） ＜高速液体クロマトグラフィー分析条件＞［変換率、光学純度の分析］・カラム：ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＡ−７０００（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、住化分析センター社製）・溶離液：２０ｍＭリン酸水溶液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝８／２・流速：０．７ｍｌ／分、カラム温度：３０℃、測定波長：２１０ｎｍ （実施例４） （Ｓ）-２-エチル-２-メチルマロン酸モノアミドを原料とした（Ｒ）-イソバリンの合成 実施例３記載の微生物ブレビバクテリウム ヨーデナム(Brevibacterium iodinum)ＮＢＲＣ３５５８を用いて調製した（Ｓ）-２-エチル-２-メチルマロン酸モノアミド２ｇ（１３．８ｍｍｏｌ）を含む水溶液１０ｇに、３０重量％水酸化ナトリウム水溶液５．５ｇ（４１．３ｍｍｏｌ）を加え、３℃に冷却し、１３％次亜塩素酸水溶液９．５ｇ（１６．６ｍｍｏｌ）を３０分かけて滴下した。３℃で１時間撹拌した後、２５℃に昇温し６時間撹拌した。反応液のｐＨが４．０になるまで濃塩酸を加え、得られた水溶液を分析したところ、表題化合物である（Ｒ）-イソバリンを塩酸塩換算で２．０ｇ（１３．２ｍｍｏｌ、収率９６％）含んでいた。高速液体クロマトグラフィーにて分析することにより、光学純度（％ｅｅ）を求めた結果、９８（％ｅｅ）であった。 ＜高速液体クロマトグラフィー分析条件＞［イソバリンの光学純度の分析］・カラム：ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＡ−７０００（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、住化分析センター社製）・溶離液：２ｍＭ硫酸銅水溶液／メタノール＝９７／３・流速：０．５ｍｌ／分、カラム温度：４０℃、測定波長：２５４ｎｍ （参考例１）２-エチル-２-メチルマロン酸ジエチルエステルの合成 ｔｅｒｔ−ブトキシカリウム７．１ｇ（６３．１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２９ｍｌ）に懸濁し、０℃に冷却して、市販の２-エチルマロン酸ジエチルエステル１０ｇ（５７．４ｍｍｏｌ）を１時間かけて滴下し、さらに１時間撹拌した。臭化エチル８．１ｇ（７４．６ｍｍｏｌ）を滴下後２５℃に昇温し２０時間撹拌した。反応液に水（２０ｍｌ）加え、水層を分離した。有機層を減圧濃縮することで表題化合物である２-エチル-２-メチルマロン酸ジエチルエステル１０．８ｇ（５３．５ｍｍｏｌ、収率９３％）を得た。 （参考例２）２-エチル-２-メチルマロン酸ジアミドの合成参考例１の方法で調製した２-エチル-２-メチルマロン酸ジエチルエステル１０．８ｇ（５３．５ｍｍｏｌ）と、２０重量％アンモニア／メタノール溶液２２．８ｇ（２６７ｍｍｏｌ）、ホルムアミド７．２ｇ（１６０ｍｍｏｌ）、２８重量％ナトリウムメトキシド／メタノール溶液７．７ｇ（４０．１ｍｍｏｌ）からなる溶液を３０℃、２０時間撹拌した。反応液にトルエン（１９ｍｌ）を滴下し、２０℃で１時間撹拌後、５℃に冷却してさらに１時間撹拌した。析出した結晶をろ別し、トルエンで洗浄後乾燥させることで、表題の化合物である２-エチル-２-メチルマロン酸ジアミド６．０g（４７．９ｍｍｏｌ、収率９０％）を得た。下記式（１）；（式中、ＸはＣＯ２Ｒ、又はＣＯＮＨ２を表す。Ｒは置換基を有しても良いＣ１〜Ｃ５のアルキル基を表す。）で表される群から選択される少なくとも１種の対象化合物に酵素源を作用させて下記式（２）；（式中、＊は不斉炭素原子を表す。）で表されるカルボン酸を製造し、必要に応じて下記式（３）；（式中、＊は不斉炭素原子を表す。）で表される２-エチル-２-メチルマロン酸モノアミドに変換し、更にホフマン転位反応することを特徴とする、下記式（４）；（式中、＊は不斉炭素原子を表す。）で表される光学活性イソバリンの製造法。Ｒが置換基を有していてもよい炭素数１〜３のアルキル基である請求項１に記載の製造法。Ｒがメチル基、又はエチル基である請求項２に記載の製造法。Ｒがエチル基である請求項３に記載の製造法。酵素源が、アクロモバクター(Achromobacter)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、セルロモナス(Cellulomonas)属、コマモナス(Comamonas)属、カプリアビダス（Cupriavidus）属、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属、又はシュードモナス（Pseudomonas）属からなる群から選択される少なくとも１種の微生物の菌体及び／又はその処理物である請求項１〜４のいずれかに記載の製造法。酵素源が、アクロモバクター デニトリフィカンス(Achromobacter denitrificans)、ブレビバクテリウム ヨーデナム(Brevibacterium iodinum)、セルロモナス フィミ(Cellulomonas fimi)、コマモナス スピーシーズ(Comamonas sp.)、カプリアビダス メタリデュランス（Cupriavidus metallidurans）、又はカプリアビダス ネケター（Cupriavidus necator）、ミクロバクテリウム ラエバニフォルマンス(Microbacterium laevaniformans)、ミクロバクテリウム テスタセアム(Microbacterium testaceum)、又はシュードモナス スピーシーズ（Pseudomonas sp.）からなる群から選択される少なくとも１種の微生物の菌体及び／又はその処理物である請求項１〜５のいずれかに記載の製造法。酵素源として、コマモナス(Comamonas)属、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属、又はシュードモナス（Pseudomonas）属からなる群から選択される少なくとも１種の微生物の菌体及び／又はその処理物を用いて絶対配置がＳであるイソバリンを製造する請求項５に記載の製造法。酵素源として、コマモナス スピーシーズ(Comamonas sp.)、ミクロバクテリウム ラエバニフォルマンス(Microbacterium laevaniformans)、ミクロバクテリウム テスタセアム(Microbacterium testaceum)、又はシュードモナス スピーシーズ（Pseudomonas sp.）からなる群から選択される少なくとも１種の微生物の菌体及び／又はその処理物を用いて絶対配置がＳであるイソバリンを製造する請求項７に記載の製造法。酵素源として、アクロモバクター(Achromobacter)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、セルロモナス(Cellulomonas)属、又はカプリアビダス（Cupriavidus）属からなる群から選択される少なくとも１種の微生物の菌体及び／又はその処理物を用いて絶対配置がＲであるイソバリンを製造する請求項５に記載の製造法。酵素源として、アクロモバクター デニトリフィカンス(Achromobacter denitrificans)、ブレビバクテリウム ヨーデナム(Brevibacterium iodinum)、セルロモナス フィミ(Cellulomonas fimi)、コマモナス スピーシーズ(Comamonas sp.)、カプリアビダス メタリデュランス（Cupriavidus metallidurans）、又はカプリアビダス ネケター（Cupriavidus necator）からなる群から選択される少なくとも１種の微生物の菌体及び／又はその処理物を用いて絶対配置がＲであるイソバリンを製造する請求項９に記載の製造法。 【課題】医薬品中間体として有用な光学活性イソバリンの高光学純度で製造する方法を提供する。【解決手段】入手容易な２-エチル-２-メチルマロン酸ジエステルから高光学純度の２-エチル-２-メチルマロン酸モノエステルに変換可能な酵素源、または２-エチル-２-メチルマロン酸ジアミドから高光学純度の２-エチル-２-メチルマロン酸モノアミドに変換可能な酵素源を取得する。各酵素源を用いた反応後、更にホフマン転位反応等により光学活性イソバリンの製造が可能となる。【選択図】なし