生命科学関連特許情報
| タイトル： | 特許公報(B2)_ビタミンＥの分析方法 |
| 出願番号： | 2012553695 |
| 年次： | 2015 |
| IPC分類： | G01N 30/88,G01N 30/26 |
特許情報キャッシュ
橋本 博之 中上 拓也 渡辺 聡子 JP 5711272 特許公報(B2) 20150313 2012553695 20120116 ビタミンＥの分析方法 築野食品工業株式会社 591066362 岩谷 龍 100077012 橋本 博之 中上 拓也 渡辺 聡子 JP 2011006545 20110117 20150430 G01N 30/88 20060101AFI20150409BHJP G01N 30/26 20060101ALI20150409BHJP JPG01N30/88 CG01N30/26 AG01N30/26 E Ｇ０１Ｎ ３０／００−３０／９６ ＪＳＴＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ） ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ） N.Rodrigo, A.Alegria, R.Barbera, and R.Farre，High-performance liquid chromatographic determination of tocopherols in infant formulas，Journal of Chromatography A，２００２年 ２月１５日，Vol.947, No.1，P.97-102 Lillian Barros, Daniela M.Correia, Isabel C.F.R.Ferreira, Paula Baptista, and Celestino Santos-Buelg，Optimization of the determination of tocopherols in Agaricus sp. edible mushrooms by a normal phase，Food Chemistry，２００８年１０月１５日，Vol.110, No.4，P.1046-1050 Barrie Tan, and Linda Brzuskiewicz，Separation of Tocopherol and Tocotrienol Isomers Using Normal- and Reverse-Phase Liquid Chromatograp，Analytical Biochemistry，１９８９年 ８月 １日，Vol.180, No.2，P.368-373 A.K.Hewavitharana, M.C.Lanari, and C.Becu，Simultaneous determination of Vitamin E homologs in chicken meat by liquid chromatography with fluor，Journal of Chromatography A，２００４年 ２月 ６日，Vol.1025, No.2，P.313-317 厚生労働省，食品衛生検査指針 理化学編 2005，２００５年，P.128-133 インタクト株式会社，Imtakt Technical Information No.TI559E Tocopherols and tocotrienols [online]，２０１２年 ２月１３日，<URL: http://www.imtaktusa.com/site_media/files/technical_information/TI559E.pdf > 2 JP2012050678 20120116 WO2012099037 20120726 8 20141204 黒田 浩一 本発明は、ビタミンＥの分析方法に関し、詳細には、トコフェロールおよびトコトリエノールを含有する油脂中のビタミンＥ同族体の分析方法に関する。 ビタミンＥはα−、β−、γ−、δ−トコフェロールおよびα−、β−、γ−、δ−トコトリエノールの８種類の同族体で構成されている。トコトリエノールは側鎖に３つの二重結合を持つ点でトコフェロールと構造が異なる。この構造の違いに基づいて、トコトリエノールはトコフェロールにはないさまざまな生理機能を持つことが明らかとなっている。例えば、トコトリエノールはトコフェロールの４０〜６０倍の抗酸化作用を有することが知られており、他にもコレステロール低下作用、抗ガン作用、血圧低下作用、神経細胞保護作用など多くの機能を有することが報告されている。トコフェロールの生理機能としては、抗酸化作用を中心とした過酸化脂質の生成抑制作用や血管保護・抗血栓作用などが知られている。 植物油脂には、ビタミンＥとしてトコフェロールを主成分として含有する油脂と、トコフェロールおよびトコトリエノールの両方を主成分として含有する油脂が存在する。前者としては、大豆油、菜種油等が知られており、後者としては、パーム油、米油、アナトー油（ベニノキの種子から抽出される油脂）、ヤシ油、麦ヌカ油などが知られている。トコトリエノールを含有する油脂は、上記のようなトコトリエノールの生理機能の知見増加に伴い、その有用性が注目されている。 食品中のビタミンＥの分析方法として、非特許文献１には、カラムに順相シリカカラム、移動相にヘキサン：ＴＨＦ：ＩＰＡ＝９７．５：２：０．５（ｖ／ｖ）を用いて、流速１〜２ｍＬ／分で分析する方法が開示されている。非特許文献２には、カラムに順相シリカカラム、移動相にヘキサン：ＴＨＦ：酢酸＝１０００：６：５（ｖ／ｖ）を用いて、流速１．２ｍＬ／分で分析する方法が開示されている。非特許文献３には、カラムに順相シリカカラム、移動相にヘキサン：ジオキサン＝９６：４（ｖ／ｖ）を用いて、流速２ｍＬ／分で分析する方法が開示されている。しかしこれらの方法を用いて、米油中のビタミンＥを分析しても、トコトリエノールのピークが他の成分のピークと重なり、トコトリエノールを正確に定量することができないという問題があった。 インタクト株式会社は、自社製のカラムを用いて８種類のビタミンＥ同族体の標品を分離可能な分析条件を開示している（非特許文献４参照）。しかしながら、本願出願人が非特許文献４に開示の方法で米油中のビタミンＥを分析したところ、やはりトコトリエノールを正確に定量することができなかった。社団法人日本油化学会編纂「２００３年版基準油脂分析試験法」２．４.１０−２００３（１〜４）厚生労働省監修「食品衛生検査指針理化学編２００５」ｐ１２８−ｐ１３３四国地域イノベーション創出協議会「農水産物・加工食品中の健康機能性成分類の分析マニュアル集」平成２２年３月、ｐ１７−ｐ２１、http://s-innovation.jp/support/food-manual.pdfImtakt Technical Information No.TI559E, Tocopherols and tocotrienols トコフェロール類とトコトリエノール類、http://www.imtaktusa.com/site_media/files/technical_information/TI559E.pdf 本発明は、トコフェロールおよびトコトリエノールを含有する油脂中のビタミンＥ同族体を、同族体ごとに正確に定量可能な分析方法を提供することを目的とする。 本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。［１］トコフェロールおよびトコトリエノールを含有する油脂中のビタミンＥ同族体を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法により定量するビタミンＥの分析方法であって、分離カラムとして順相カラムを用い、移動相としてヘキサン：酢酸エチル：酢酸＝９８．５〜９９．８：０．１〜０．５：０．１〜１（ｖ／ｖ）を用いることを特徴とするビタミンＥの分析方法。［２］α−トコトリエノールの理論段数が２５０００以上を示す分離カラムを用いることを特徴とする前記［１］に記載のビタミンＥの分析方法。 本発明によれば、トコフェロールおよびトコトリエノールを含有する油脂中のビタミンＥ同族体を、同族体ごとに正確に定量することができる。実施例１の蛍光クロマトグラムを示す図である。実施例２の蛍光クロマトグラムを示す図である。比較例１の蛍光クロマトグラムを示す図である。 本発明は、トコフェロールおよびトコトリエノールを含有する油脂中のビタミンＥ同族体を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法により定量するビタミンＥの分析方法を提供する。ビタミンＥ同族体とは、α−、β−、γ−、δ−トコフェロールおよびα−、β−、γ−、δ−トコトリエノールの８種類である。 本発明の分析方法は、分離カラムとして順相カラムを用いることを特徴としている。順相カラムの種類は特に限定されないが、ポリマーカラム、シリカカラム、グラファイトカーボンカラム、ポリマーベースとシリカベースのあるアミノカラム、アミドカラム、ポリアミンカラムなどが挙げられる。中でも、シリカカラム、シリカベースのアミノカラムが好ましい。カラムの形状は特に限定されない。カラム充填剤の粒径は特に限定されないが、５μｍ以下であることが好ましく、３μｍ以下であることがより好ましい。 本発明の分析方法に用いる順相カラムは、α−トコトリエノールの理論段数が２５０００以上を示すことが好ましい。理論段数とは、カラム中における物質のバンドの広がりの度合いを示す値であり、以下の式で定義される。 理論段数＝１６×（ｔＲ／Ｗ）２ ｔＲ：各ピークの保持時間（分） Ｗ：各ピークのピーク幅（分） α−トコトリエノールの理論段数が２５０００以上を示すカラムとは、最適条件で分析を行った際に、α−トコトリエノールの理論段数が２５０００以上を示すことを意味し、本発明の分析方法に含まれる分析条件のすべての範囲でα−トコトリエノールの理論段数が２５０００以上を示すことを要求するものではない。本発明の分析方法に用いる順相カラムのα−トコトリエノールの理論段数は、最適条件において２５０００以上を示すことが好ましく、３００００以上であることがより好ましい。最適条件としては、例えば後述する実施例１の条件が挙げられるが、これに限定されるものではない。 本発明の分析方法で使用できるカラムとしては、例えば、Ｕｎｉｓｏｎ ＵＫ−Ｓｉｌｉｃａ、Ｕｎｉｓｏｎ ＵＫ−Ａｍｉｎｏ（以上、インタクト株式会社）、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＳＩＬ、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＳＩＬ０６、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＮＨ２、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＰｏｌｙａｍｉｎｅＩＩ（以上、ＹＭＣ株式会社）、Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＨＲＣ ＳｉＬ、Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＨＲＣ ＮＨ２（以上、島津製作所株式会社）、シリカ ５ＳｉＬ ４Ｅ（昭和電工株式会社）、Ｌｕｎａ Ｓｉｌｉｃａ、Ｌｕｎａ ＮＨ２（以上、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ株式会社）、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＳＩＬ−１００Ａ、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＮＨ２（以上、ＧＬサイエンス株式会社）、ＴＳＫｇｅｌ ＮＨ２−１００ ３μｍ（東ソー株式会社）、Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｓｉｌｉｃａ（シグマアルドリッチ株式会社）、Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ Ｓｉ、Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ Ａｍｉｎｏ（以上、アジレントテクノロジー株式会社）、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ３０、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ６０、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ １００、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＮＨ２（以上、野村化学株式会社）、Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ（ケムコ株式会社）などの市販カラムが挙げられるが、これらに限定されるものではない。中でも、Ｕｎｉｓｏｎ ＵＫ−Ｓｉｌｉｃａ（インタクト社）、Ｕｎｉｓｏｎ ＵＫ−Ａｍｉｎｏ（インタクト社）が好ましい。 移動相は、順相カラムでの使用に適した溶媒であれば特に限定されず、具体的には、ヘキサン、ＴＨＦ、酢酸エチル、ジオキサン、アセトン、クロロホルム、エーテル類、アルコール類、ベンゼン、トルエン、アセトニトリル、ジクロロメタン、酢酸、ギ酸、トリフルオロ酢酸などが挙げられ、これらを単独または混合して使用することができる。本発明の分析方法においては、ヘキサン：酢酸エチル：酢酸＝９８．５〜９９．８：０．１〜０．５：０．１〜１（ｖ／ｖ）を用いることが好ましい。より好ましくは、ヘキサン：酢酸エチル：酢酸＝９９．１〜９９．６：０．２〜０．３：０．４〜０．６（ｖ／ｖ）である。移動相に用いる有機溶媒は、ＨＰＬＣグレード以上であることが好ましく、必要に応じて酸化防止剤を添加してもよい。添加する酸化防止剤としては、例えばピロガロール（ピロガロール酸）、３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、２−＆３−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ｔ−ブチルハイドロキノン（ＴＢＨＱ）、エトキシキンなどが挙げられる。 カラム温度は、通常約１０〜５０℃の範囲で用いられ、約２０〜４０℃の範囲が好ましく、約２５〜３５℃の範囲がより好ましい。流速はカラムの性能上問題ない範囲であれば特に限定されない。検出器はビタミンＥを検出できるものであれば特に限定されない。具体的には、蛍光（ＦＬ）検出器、紫外可視光（ＵＶ-Ｖｉｓ）検出器、フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器、蒸発光散乱（ＥＬＳＤ）検出器、ＭＳ検出器、電気化学（ＥＣ）検出器、示差屈折率（ＲＩ）検出器、電気電導度（ＣＤ）検出器、コロナＣＡＤ検出器などが挙げられる。中でも、ビタミンＥに対する特異性の点で、蛍光検出器を用いることが好ましい。 本発明の分析方法における分析対象であるトコフェロールおよびトコトリエノールを含有する油脂は、トコフェロールおよびトコトリエノールを含有し得る油脂であればよい。つまり、分析対象油脂は、トコフェロールおよびトコトリエノールを含有することが既に確認されている油脂に限定されるものではなく、トコトリエノールを含油することが未確認であるが含有する可能性のある油脂も分析対象油脂として好適である。また、本来トコトリエノールを含有しない油脂にトコトリエノールを添加した油脂も、本発明の分析方法における分析対象として好適である。トコフェロールおよびトコトリエノールを含有することが確認されている油脂としては、パーム油、米油、アナトー油、麦ぬか油、ヤシ油などが挙げられ、本発明の分析方法は、これらの油脂の分析に特に有効に適用できる。 分析用試料溶液の調製方法は、特に限定されないが、油脂の溶解性が高く、かつ移動相に近い極性を持つ有機溶媒にて分析対象油脂を溶解することが好ましい。好適な有機溶媒としては、ヘキサン、ＴＨＦ、酢酸エチル、ジオキサン、アセトン、クロロホルム、エーテル類、アルコール類、ベンゼン、トルエン、アセトニトリル、ジクロロメタン、酢酸、ギ酸、トリフルオロ酢酸などが挙げられ、これらを単独または混合して使用することができる。分析用試料溶液調製用の有機溶媒は、ＨＰＬＣグレード以上であることが好ましく、必要に応じて酸化防止剤を添加してもよい。添加する酸化防止剤としては、例えばピロガロール（ピロガロール酸）、３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、２−＆３−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ｔ−ブチルハイドロキノン（ＴＢＨＱ）、エトキシキンなどが挙げられる。 以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。〔実施例１〕 １０ｍＬ褐色メスフラスコに米サラダ油（築野食品工業製）１ｇを正確に測りとり、ヘキサンを加えて１０ｍＬとした（０．１ｇ／ｍＬヘキサン溶液）。試料注入量５μＬ（米サラダ油５００μｇ相当）としてＨＰＬＣ法により分析を行った。ＨＰＬＣの分析装置には、ＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅＨＰＬＣシステム（ＬＣ−２０ＡＢ、島津製作所）を用いた。検出器には、蛍光検出器ＲＦ−１０ＡｘＬ（励起波長／蛍光波長＝２９８／３２５ｎｍ、島津製作所）を、カラムには、インタクト社製「Ｕｎｉｓｏｎ ＵＫ−Ｓｉｌｉｃａ」（４．６×２５０ｍｍ、粒子径３μｍ）を用いた。移動相は、ヘキサン：酢酸エチル：酢酸＝９９．２５：０．２５：０．５（ｖ／ｖ）とした。カラム温度３０℃、流速１ｍＬ／分とした。 標品としてはビタミンＥ同族体８種類の標準品をそれぞれ１０〜１００μｇ／ｍＬのヘキサン溶液として調製し、褐色瓶に保存して使用した。試料中の各ビタミンＥ同族体のピークの保持時間、ピーク面積、ピーク幅を測定し、絶対検量法により定量を行い、各ピークの理論段数を次式により求めた。 理論段数＝１６×（ｔＲ／Ｗ）２ ｔＲ：各ビタミンＥ同族体のピークの保持時間（分） Ｗ：各ビタミンＥ同族体のピークのピーク幅（分）〔実施例２〕 実施例１において、移動相をヘキサン：酢酸エチル：酢酸＝９９：０．５：０．５（ｖ／ｖ）に変更し、カラム温度を４０℃に変更した以外は実施例１と同様に行った。〔比較例１〕 実施例１において、移動相を非特許文献４に開示された組成（ヘキサン：酢酸エチル：酢酸＝９６．９：３：０．１（ｖ／ｖ））とし、カラム温度を４０℃に変更した以外は実施例１と同様に行った。〔結果〕（１）蛍光検出器によるクロマトグラム 実施例１のクロマトグラムを図１に、実施例２のクロマトグラムを図２に、比較例１のクロマトグラムを図３にそれぞれ示した。実施例１および実施例２では、α−、β−、γ−トコフェロール（Ｔ）、α−、β−、γ−トコトリエノール（Ｔ３）のピークが分離し、定量可能であった。また各同族体の分離は実施例１がより好ましかった。一方、比較例１では、α−トコトリエノールとγ−トコフェロールには不純物のピークが重なっており、また、β−トコフェロールとβ−トコトリエノールは不純物に埋没してピークが確認できず、各ビタミンＥ同族体の定量ができなかった。 実施例１、２および比較例１におけるα−トコトリエノールおよびγ−トコトリエノールの理論段数を表１に示した。用いた分離カラム（インタクト社製「Ｕｎｉｓｏｎ ＵＫ−Ｓｉｌｉｃａ」（４．６×２５０ｍｍ、粒子径３μｍ））は、実施例１の条件において、α−トコトリエノールの理論段数が２５０００以上であることが示された。 実施例１におけるビタミンＥ同族体８種の定量値を表２に示した。 なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。 トコフェロールおよびトコトリエノールを含有する油脂中のビタミンＥ同族体を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法により定量するビタミンＥの分析方法であって、 分離カラムとして順相カラムを用い、移動相としてヘキサン：酢酸エチル：酢酸＝９８．５〜９９．８：０．１〜０．５：０．１〜１（ｖ／ｖ）を用いることを特徴とするビタミンＥの分析方法。 α−トコトリエノールの理論段数が２５０００以上を示す分離カラムを用いることを特徴とする請求項１に記載のビタミンＥの分析方法。