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| タイトル： | 特許公報(B2)_金属サレン錯体誘導体及びその製造方法 |
| 出願番号： | 2012509317 |
| 年次： | 2015 |
| IPC分類： | C12N 9/00,C07F 15/02,C12N 9/50,C07K 14/00,C07K 16/00,A61P 35/00,A61K 38/43,A61K 45/00,A61K 39/395,A61K 39/00,A61K 38/00,A61K 31/7088,A61K 47/48 |
特許情報キャッシュ
石川 義弘 江口 晴樹 佐藤 裕 JP 5736367 特許公報(B2) 20150424 2012509317 20110406 金属サレン錯体誘導体及びその製造方法 株式会社ＩＨＩ 000000099 石川 義弘 505328683 大賀 眞司 100093861 百本 宏之 100129218 石川 義弘 江口 晴樹 佐藤 裕 JP 2010088113 20100406 20150617 C12N 9/00 20060101AFI20150528BHJP C07F 15/02 20060101ALI20150528BHJP C12N 9/50 20060101ALI20150528BHJP C07K 14/00 20060101ALI20150528BHJP C07K 16/00 20060101ALI20150528BHJP A61P 35/00 20060101ALN20150528BHJP A61K 38/43 20060101ALN20150528BHJP A61K 45/00 20060101ALN20150528BHJP A61K 39/395 20060101ALN20150528BHJP A61K 39/00 20060101ALN20150528BHJP A61K 38/00 20060101ALN20150528BHJP A61K 31/7088 20060101ALN20150528BHJP A61K 47/48 20060101ALN20150528BHJP JPC12N9/00C07F15/02C12N9/50C07K14/00C07K16/00A61P35/00A61K37/48A61K45/00A61K39/395 YA61K39/00A61K37/02A61K31/7088A61K47/48 Ｃ１２Ｎ ９／００ Ｃ０７Ｆ １５／０２ ＰｕｂＭｅｄ ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ） ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ） ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ） 特開２００９−１７３６３１（ＪＰ，Ａ） 特開２００９−２７４９６２（ＪＰ，Ａ） Tetrahedron (2007) vol.63, no.28, p.6404-6414 Bioconjug. Chem. (1997) vol.8, no.6, p.789-792 7 JP2011002056 20110406 WO2011125331 20111013 13 20120806 森井 文緒 本発明は、金属サレン錯体の誘導体及びその製造方法に関するものである。 金属サレン錯体として、金属触媒として知られる鉄サレン錯体が知られている。さらに、出願人は、鉄サレン錯体自身が磁性を有すること、さらに、抗腫瘍効果を有することを明らかにし、鉄サレン錯体を人や動物に投与後、体外から磁場を適用することによって、鉄サレン錯体を目的の患部に誘導して鉄サレン錯体の薬理効果を局所に集中することができることを提案した。 さらに、出願人は、鉄サレン錯体に医薬分子を結合することによって、医薬分子を磁場によって患部組織に誘導できることを明らかにした。この鉄サレン錯体は、特開2009-173631、特開2009-196913、特開2009-196914、特開2009-256232、特開2009-256233、そして、特開2009-274962に開示されている。 また、出願人は、特開2009-287949号公報に、鉄サレン錯体にビオチン−アビジン反応により抗体及び抗原を接続することによって、結合型抗原又は抗体と、遊離型抗原又は抗体とを磁気によって分離できる、抗体又は抗原の定量方法を提案した。特開2009-173631号公報特開2009-196913号公報特開2009-196914号公報特開2009-256232号公報特開2009-256233号公報特開2009-274962号公報特開2009-287949号公報 しかしながら、前記先行技術では、金属サレン錯体と医薬分子、抗原、抗体等とを十分結合できず、金属サレン錯体の誘導体の収率や安定性に難があった。そこで、本発明は、収率や安定性の点において優れた金属サレン錯体の誘導体を提供すること、そして、この金属サレン錯体の製造方法を提供することを目的とするものである。 前記目的を達成するために本発明は、金属サレン錯体に、酵素、抗体、抗原、ペプチド、アミノ酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質、核酸、及び、医薬分子の少なくとも一つからなる機能性分子を、ジスルフィド結合、エーテル結合、エステル結合、アミド結合の少なくとも一つを介して結合させた金属サレン錯体の誘導体及びその製造方法であることを特徴とするものである。好適には、金属サレン錯体と機能性分子の結合は両者を架橋する架橋剤を介して生成される。 すなわち、本発明は、Ａ−Ｂ−Ｃ（Ａ：金属サレン錯体、Ｂ：ジスルフィド結合、エーテル結合、エステル結合、アミド結合の少なくとも一つを備える結合領域、Ｃ：酵素、抗体、抗原、ペプチド、アミノ酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質、核酸、及び、医薬分子の少なくとも一つからなる機能性分子）で表わされる、金属サレン錯体誘導体であることを特徴とする。 本発明の好適な形態は、前記結合領域（Ｂ）は前記金属サレン錯体（Ａ）と前記機能性分子（Ｃ）とを架橋する架橋剤分子を備え、前記金属サレン錯体（Ａ）と前記架橋剤分子とがジスルフィド結合、エーテル結合、エステル結合、又は、アミド結合によって結合し、前記架橋剤分子と前記機能性分子（Ｃ）とがジスルフィド結合、エーテル結合、エステル結合、又は、アミド結合によって結合されている。 前記金属サレン錯体（Ａ）は、特に限定されるものではなく、例えば、下記（Ｉ）式によって示されるものである。（Ｉ） ａ〜ｈの少なくとも一つが前記（「−Ｂ−Ｃ」であり、残りは、水素又は任意の置換基である。置換基は、架橋剤分子及び／又は機能性分子と結合領域が形成できるものであればよく、例えば、水酸基、アミド基、カルボキシル基、ＳＨ基の少なくとも一つである。なお、金属サレン錯体としては、（Ｉ）で示されるような単量体のものと、互いに、金属原子の部分で直接又は他の原子（酸素など）を介して結合した、２量体を含む多量体が選択可能である。 Ｍは金属原子であり、例えば、Ｆｅ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｏ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ｎｄ、Ｓｍ、Ｅｕ、又は、Ｇｄである。 前記ジスルフィド結合領域（Ｂ）は、前記金属サレン錯体（Ａ）に置換基として導入されたＳＨ基と前記機能性分子（Ｃ）のＳＨ基とが結合して得られたものであるか、又は、前記金属サレン錯体（Ａ）又は前記機能性分子（Ｃ）のＳＨ基と前記架橋剤分子のＳＨ基とが結合して得られたものである。 前記エーテル結合領域（Ｂ）は、前記金属サレン錯体（Ａ）に置換基として導入された水酸基と前記機能性分子（Ｃ）の水酸基とが結合して得られたものであるか、又は、前記金属サレン錯体（Ａ）又は前記機能性分子（Ｃ）の水酸基と前記架橋剤分子の水酸基とが結合して得られたものである。 前記エステル結合領域（Ｂ）は、前記金属サレン錯体（Ａ）に置換基として導入された水酸基又はカルボキシル基と、前記機能性分子（Ｃ）のカルボキシル基と水酸基とが結合して得られたものであるか、又は、前記金属サレン錯体（Ａ）又は前記機能性分子（Ｃ）の水酸基又はカルボキシル基と、前記機能性分子（Ｃ）のカルボキシル基又は水酸基とが結合して得られたものである。 前記アミド結合領域（Ｂ）は、前記金属サレン錯体（Ａ）に置換基として導入されたアミド基又はカルボキシル基と、前記機能性分子（Ｃ）のカルボキシル基又はアミド基とが結合して得られたものであるか、又は、前記金属サレン錯体（Ａ）又は前記機能性分子（Ｃ）のカルボキシル基又はアミド基と、前記機能性分子（Ｃ）のアミド基とカルボキシル基とが結合して得られたものである。 以上説明したように、本発明によれば、収率や安定性が良好な、医薬分子等機能性分子と金属サレン錯体との結合体とからなる金属サレン錯体誘導体を提供することができる。 ジスルフィド結合領域（Ｂ）は、例えば、下記（ＩＩ）式の構造からなる架橋剤分子を備える。 （ＩＩ） （ＩＩ）の「・Ｏ−」に金属サレン錯体（Ａ）が結合し、ｉとｊの少なくとも一つに前記機能性分子（Ｃ）に結合するジスルフィド基（−Ｓ−Ｓ−）が結合している。 前記ジスルフィド結合領域（Ｂ）の架橋剤分子の他の例は下記（ＩＩＩ）の構造からなる。 （ＩＩＩ） （ＩＩＩ）の「・Ｃ（Ｏ）−」に金属サレン錯体（Ａ）が結合し、ｉとｊの少なくとも一つに前記機能性分子（Ｃ）に結合するジスルフィド基が結合している。 前記ジスルフィド結合領域（Ｂ）の更に他の架橋剤は、下記（ＩＶ）の構造からなる。 （ＩＶ） 前記（ＩＶ）の「・ＣＨ２−」に金属サレン錯体（Ａ）が結合し、ｉとｊの少なくとも一つに前記機能性分子（Ｃ）に結合するジスルフィド基が結合している。 金属サレン錯体に酵素等の機能性分子（Ｃ）を直接結合する好適な形態に、金属サレン錯体と縮合助剤分子とを脱水縮合して、両者の活性エステル（中間体）を生成し、活性エステルに機能性分子（Ｃ）のアミノ基を反応させることにより、活性エステルの縮合助剤分子を置換して、アミド結合を形成し、アミド結合を介して金属サレン錯体と目的成分とを結合することがある。これを示すと、次の反応式に示すとおりである。 金属サレン錯体（Ａ） 活性エステル 目的成分（Ｃ） ここで、N,N´−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）は脱水縮合剤分子であり、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド( H ONSu)は縮合助剤分子である。 既述の縮合助剤分子（H ONSu）を架橋剤分子として、金属サレン錯体（Ａ）と機能性分子（Ｃ）とを結合することもできる。金属サレン錯体と縮合助剤分子とを縮合し、縮合助剤分子のＳＨ基と機能性分子のＳＨ基とを反応させることによりジスルフィド結合を形成し、ジスルフィド結合を介して金属サレン錯体と機能性分子とを結合する。 金属サレン錯体は、架橋剤分子と縮合するために、、既述のａ−ｈの側鎖の少なくとも一つに、架橋剤分子の官能基と縮合するための官能基を備える。例えば、金属サレン錯体は、架橋剤分子（縮合助剤分子：H ONSu)）と結合するために、既述のａ−ｈの側鎖の少なくとも一つに、架橋剤分子の水酸基と脱水縮合する官能基（カルボキシル基又は水酸基）を下記のとおり有している。 架橋剤分子（縮合助剤分子）としては、例えば、次のものがある。 カルボジイミド系縮合剤 ジイソプロピルカルボジイミド(DIPC) １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド(EDC=WSCI)、 １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩(WSCI・HCl)、 ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC) フルオロホスフェート系縮合剤 ［Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、ベンゾトリアゾール−１−イル−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロリン化物塩(BOP) その他 ジフェニルホスホリルアジド(DPPA) 既述の縮合助剤として、次のものがある。 Ｎ−ヒドロキシ多価カルボン酸イミド類 Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド(HONS u)、 Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド（HONB） Ｎ−ヒドロキシトリアゾール類 １−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)、 その他 ３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアジン(HO Obt)、 ２−ヒドロキシイミノ−２−シアノ酢酸エチルエステル p-ニトロフェノール(HONp)、 ペンタフルオロフェノール(HOPfp) 金属サレン錯体と縮合助剤と縮合剤の配分は例えば次のようである。金属サレン錯体：縮合助剤：縮合剤＝１：１〜２：１〜２ 目的成分が金属サレン錯体と結合したことは、質量分析で確認可能である。アミド結合、ジスルフィド結合が生じていることは、質量分析、ＩＲ分光法で確認できる。 金属サレン錯体の製造例 次に、以下に説明するように、アミノ基を置換基として有する金属サレン錯体を製造した。Step 1: 4-（ニトロフェノール）nitrophenol (25g, 0.18mol)、（ヘキサメチレン−テトラミン）hexamethylene tetramine (25g,0.18mol)、（ポリリン酸）polyphosphoric acid (200ml)の混合物を１時間１００℃で攪拌した。その後、その混合物を500mlの酢酸エチルと１Lの水の中に入れ、完全に溶解するまで攪拌した。さらにその溶液に400mlの酢酸エチルを追加で加えたところその溶液は２つの相に分離し、水の相を取り除き、残りの化合物を塩性溶剤で２回洗浄し、無水MgSO4で乾燥させた結果、化合物2が１７ｇ（収率57%）合成できた。Step 2: 化合物2 (17g, 0.10mol), （無水酢酸）acetic anhydride (200ml), 硫酸（少量：約15ml）を室温で１時間攪拌させた。得られた溶液は、氷水（２L）の中に0.5時間混ぜ、加水分解を行った。得られた溶液をフィルターにかけ、大気中で乾燥させたところ白い粉末状のものが得られた。酢酸エチルを含む溶液を使ってその粉末を再結晶化させたところ、２４ｇの化合物3（収率76%）の白い結晶を得ることができた。Step 3: 化合物3 (24g, 77mmolとメタノール(500ml)に10%のパラジウムを担持したカーボン(2.4g)の混合物を一晩1.5気圧の水素還元雰囲気で還元した。終了後、フィルターでろ過したところ茶色油状の化合物4 (21g)が合成できた。Step 4, 5: 無水ジクロメタン(DCM) (200ml)に化合物4 (21g, 75mmol), 二炭酸ジ-tert-ブチル（di(tert-butyl) dicarbonate）(18g, 82mmol)を窒素雰囲気で一晩攪拌した。得られた溶液を真空中で蒸発させた後、メタノール(100ml)で溶解させた。その後、水酸化ナトリウム(15g, 374mmol)と水(50ml)を加え、5時間還流させた。その後冷却し、フィルターでろ過し、水で洗浄後、真空中て乾燥させたところ茶色化合物がえられた。得られた化合物は、シリカジェルを使ったフラッシュクロマトグラフィーを２回行うことで、10gの化合物6（収率58%）が得られた。Step 6: 無水エタノール400mlの中に化合物 6 (10g, 42mmol)を入れ、加熱しながら還流させ、無水エタノール20mlにエチレンジアミン(1.3g, 21mmol)を0.5時間攪拌しながら数滴加えた。そして、その混合溶液を氷の容器に入れて冷却し15分間かき混ぜた。その後、200mlのエタノールで洗浄しフィルターをかけ、真空で乾燥させたところ化合物7が8.5g （収率82%）で合成できた。鉄サレン錯体とたんぱく質の結合例（ジスフィルド結合）STEP 1:化合物７Ａ化合物８ 化合物８を、Manfred T. Reetz, Martin Rentzsch, Andreas Pletsch, Matthias Maywald, Peter Maiwald, Jerome j.-P. Peyralans, Andrea Maichele, Yu Fu, Ning Jiao, Frank Hollmann, Regis Mondiere and Andreas Taglieber, ‘Direct evolution of enantioselective hybrid catalysis: a novel concept in asymmetric catalysis’, Tetrahedron 63 (2007) 6404-6414、を参照して準備する。STEP 2: 化合物７Ａ(134mg,0.338mmol)、化合物８(122mg,0.721mmol)：架橋剤分子、diisopropylcarbodiimide (ジイソプロピルカーボジイミド)(170μmol)：脱水縮合剤、NaHCO3 (75mg; 0.89mmol)をTHF（テトラヒドロフラン）(20mL)にN, N-4-（ジメチルアミノピリジン）dimethylaminopyridinを 0.1Mを溶かした溶液に入れ、室温で２時間攪拌した。溶液は、エチルアセテートとヘキサンを１：１で混ぜた溶液に混ぜてシリカゲル（２０ｇ）を用いたクロマトグラフィーで化合物９（黄色、115ｇ、収率62％）を得た。化合物９STEP３： 化合物９（17mg,31μmol）、FeCl3(11mg,)をメタノール(4mL)にいれ、室温、大気中で１６時間攪拌した。茶色の化合物が得られた。その後、真空中で乾燥させた。得られた化合物はジクロロメタン400mlで希釈し、塩性溶液で２回洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、真空中で乾燥させたところ化合物１０（18mg、収率90％）が得られた。化合物１０STEP4: 化合物１０とシグマアルドリッチから購入したたんぱく質（papain-lyophilisate, 10mg）とL-cysteine (10mg)を水（H2O、1mL)に３０分入れて攪拌した。その後、リン酸緩衝液（300μL、１M）、ｐH=7.01で攪拌した。そして、攪拌から６時間後化合物１１及び化合物１２（両方のＳＨ基にPapainが結合）が合成された。化合物１１化合物１２ ３ヒドロキシ安息香酸を出発物質として、既述の工程にしたがって、カルボキシル基を有する鉄サレン錯体を生成した。次いで、鉄サレン錯体と、N´−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）と、ヒドロキシコハク酸イミド(HONSu)と、を反応させて活性エステルを生成させ、これに、たんぱく質（papain-lyophilisate）：目的物質を反応させると、タンパク質がヒドロキシコハク酸イミドを置換して、鉄サレン錯体にアミド結合を介して結合した。アミド結合は赤外分光光度計によって確認された。 Ａ−Ｂ−Ｃ（Ａ：金属サレン錯体、Ｂ：結合領域、Ｃ：酵素、抗体、抗原、ペプチド、アミノ酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質、核酸、及び、医薬分子の少なくとも一つからなる機能性分子）で表わされ、 前記結合領域（Ｂ）は前記金属サレン錯体（Ａ）と前記機能性分子（Ｃ）とを架橋する架橋剤分子を備え、前記金属サレン錯体（Ａ）は前記架橋剤分子と結合し、前記架橋剤分子に付加されているＳＨ基と前記機能性分子（Ｃ）に付加されているＳＨ基とがジスルフィド結合によって結合した、金属サレン錯体誘導体。 前記金属サレン錯体（Ａ）は下記（Ｉ）式によって示されるものであり、 （Ｉ） ａ〜ｈの少なくとも一つが前記−Ｂ−Ｃを含み、 残りは、水素又は任意の置換基であり、 Ｍは金属原子である請求項１に記載の金属サレン錯体誘導体。 前記金属サレン錯体のａ〜ｈの少なくとも一つが前記架橋剤分子と結合可能な置換基を有し、この置換基と前記架橋剤分子とが脱水縮合によって結合した請求項２に記載の金属サレン錯体誘導体。 前記架橋剤分子がＮ−ヒドロコハク酸イミドである請求項２又は請求項３に記載の金属サレン錯体誘導体。 金属サレン錯体と縮合助剤分子とを脱水縮合して両者の活性エステルを生成し、当該活性エステルに酵素、抗体、抗原、ペプチド、アミノ酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質、核酸、及び、医薬分子の少なくとも一つからなる機能性分子を反応させることにより、前記活性エステルを形成する前記縮合助剤分子を前記機能性分子で置換して、前記金属サレン錯体と前記機能性分子とを結合する金属サレン錯体誘導体の製造方法。 前記縮合助剤分子がＮ−ヒドロキシコハク酸イミドである、請求項５に記載の金属サレン錯体誘導体の製造方法。 前記金属サレン錯体と機能性分子とがアミド結合によって前記縮合剤分子を介することなく直接結合されている請求項５又は請求項６に記載の金属サレン錯体誘導体の製造方法。