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| タイトル： | 公開特許公報(A)_末梢神経毒性の判定方法 |
| 出願番号： | 2012185168 |
| 年次： | 2014 |
| IPC分類： | C12Q 1/02,A61K 45/00,A61P 35/00 |
特許情報キャッシュ
澤口 諭一 上野 哲 山崎 竜太 ▲高▼木 陽光 松崎 健 JP 2014042461 公開特許公報(A) 20140313 2012185168 20120824 末梢神経毒性の判定方法 株式会社ヤクルト本社 000006884 特許業務法人アルガ特許事務所 110000084 高野 登志雄 100077562 中嶋 俊夫 100096736 村田 正樹 100117156 山本 博人 100111028 澤口 諭一 上野 哲 山崎 竜太 ▲高▼木 陽光 松崎 健 C12Q 1/02 20060101AFI20140214BHJP A61K 45/00 20060101ALI20140214BHJP A61P 35/00 20060101ALI20140214BHJP JPC12Q1/02A61K45/00A61P35/00 11 ＯＬ 13 4B063 4C084 4B063QA05 4B063QA18 4B063QQ91 4B063QR77 4B063QX01 4C084AA17 4C084NA07 4C084NA20 4C084ZB26 本発明は、化合物によって引き起こされる末梢神経毒性の発現頻度をｉｎ ｖｉｔｒｏで判定する方法に関する。また、該方法により、末梢神経毒性の発現頻度が低い化合物をスクリーニングする方法に関する。 微小管は、チューブリン分子が管状に重合することにより形成された細胞骨格の一種であり、有糸分裂や神経機能の発現に重要な役割を果たす。微小管作用薬は、有糸分裂紡錘体における微小管に作用することにより細胞周期をＧ２／Ｍ期に停止させ、抗腫瘍効果を発揮する。その一方で、微小管作用薬は神経細胞の神経突起を構成する微小管に作用することで神経突起を破壊し、副作用として末梢神経毒性（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ；ＰＮ）を発現する。 ＰＮは、Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ａｄｖｅｒｓｅ Ｅｖｅｎｔｓ ｖ３．０（ＣＴＣＡＥ）による分類では、表１のようになっている。 微小管作用薬の中でも、パクリタキセルおよびビンクリスチンは、臨床現場において表１のＧｒａｄｅ３、４に該当する重篤なＰＮの発現頻度（Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ；ＦＰＮ）が特に高い（表２）。一方、他の微小管作用薬のＦＰＮについては、コルヒチンはパクリタキセルやビンクリスチンより低く、ドセタキセル、ビンデシンおよびビノレルビンはコルヒチンよりさらに低い（非特許文献１−１０および表２）。このように微小管作用薬ごとにＦＰＮは異なっている。 こうしたＰＮはしばしば微小管作用系抗がん剤の用量規制因子になるため、非臨床試験で予めＰＮを評価することは重要である。かかる観点から、現在、非臨床段階におけるＦＰＮは主にｉｎ ｖｉｖｏモデルで評価されている（非特許文献１１）。また、ＰＮの有無は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することにより評価する方法が提案されている（非特許文献１２、１３）。このｉｎ ｖｉｔｒｏにおける評価方法は、神経細胞に被験成分を接触させて数日培養後の神経突起を有する細胞数を測定することにより行なわれている。Seidman AD et al.J Clin Oncol.1995;13:2575-2581Smith RE et al.J Clin Oncol.1999;17:3403-3411Winer EP et al.J Clin Oncol.2004;22:2061-2068Sarris AH et al.Ann Oncol.2000;11:69-72Kyle RA et al.N Engl J Med.1997;336:1202-1207Okada S et al.Br J Cancer.1999;80:438-443Eigentler TK et al.Melanoma Res.2008;18:353-358Fumoleau P et al.J Clin Oncol.1993;7:1245-1252Vogel C et al.Ann Oncol.1999;10:397-402Zelek L et al.Cancer.2001;92:2267-2272Bacher G.et al.Cancer Res.2001;61:392-399河野 通明ほか，癌と化学療法 2004;31(4):501-506Geldof A.A.et al.J Neurooncol.1998;37:109-113 しかしながら、従来のｉｎ ｖｉｔｒｏの評価系モデルでは、前記表２で示されている臨床試験のＦＰＮとの相関性が低いという問題がある。 従って、臨床におけるＦＰＮと相関性の高いｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＮの評価系の確立が望まれている。 本発明は、被験成分によって引き起こされるＦＰＮをｉｎ ｖｉｔｒｏで評価する方法に関する。また、該方法により、ＦＰＮが低い成分をスクリーニングする方法を提供することに関する。 上記課題に鑑み、種々検討した結果、本発明者は、微小管作用薬により引き起こされるＦＰＮが、従来法のように被験成分の接触による神経突起消失ではなく、その後に、該成分を除去して神経突起の再伸長レベルを測定することによって得られる結果と高い相関を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。 すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔９〕を提供するものである。〔１〕（ａ）神経突起を伸長し得る細胞に被験成分を接触させるステップと、 （ｂ）ステップ（ａ）で接触させた被験成分を除去するステップと、 （ｃ）被験成分除去後に神経突起の再伸長レベルを測定するステップを含む、被験成分の末梢神経毒性評価方法。〔２〕神経突起を伸長し得る細胞が、ラット副腎由来褐色細胞腫のＰＣ−１２細胞またはヒト神経芽細胞腫のＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞である〔１〕に記載の方法。〔３〕被験成分が、微小管に作用する成分である〔１〕又は〔２〕に記載の方法。〔４〕ステップ（ａ）で接触させる被験成分の濃度が、被験成分接触後実質的にすべての細胞の神経突起が消失する濃度である〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。〔５〕被験成分接触後実質的にすべての細胞の神経突起を消失する濃度が、９５％以上の細胞の神経突起が消失する濃度である〔４〕に記載の方法。〔６〕ステップ（ｂ）の除去が、被験成分接触後２４時間以内に行われる〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。〔７〕ステップ（ｃ）の測定が、被験成分除去後０−７２時間に行われる〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法。〔８〕ステップ（ｃ）の測定が、再伸長した細胞数の割合を測定するものである〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の方法。〔９〕ステップ（ｃ）において、被験成分除去後２４−４８時間後の、一定細胞数当たりの神経突起が再伸長した細胞数の割合を、他の被験成分の再伸長した細胞数の割合と比較することで、当該被験成分と当該他の被験成分との末梢神経毒性の発現頻度の相対的な高低を判定する、〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の方法。〔１０〕〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の方法により、末梢神経毒性の発現頻度が低い成分をスクリーニングする方法。〔１１〕〔１０〕に記載のスクリーニング方法により得られた末梢神経毒性の発現頻度が低い成分。 本発明のＰＮの評価方法によれば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、簡便に被験成分のＰＮの有無を調べることができ、かつ、該成分の臨床でのＦＰＮを予測することができる。また、ＦＰＮが低い成分、ＦＰＮが低い微小管作用薬のスクリーニングが可能になる。各種被験成分接触後に神経突起を再伸長したＰＣ−１２細胞の割合を示す（（ａ）は被験成分除去後２４時間後、（ｂ）は被験成分除去後４８時間後。**：ｐ＜０．０１、***：ｐ＜０．００１対パクリタキセル）各種被験成分接触後に神経突起を再伸長したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の割合を示す（（ａ）は被験成分除去後２４時間後、（ｂ）は被験成分除去後４８時間後。*：ｐ＜０．０５、**：ｐ＜０．０１対パクリタキセル） 本発明のＰＮ評価方法は、（ａ）神経突起を伸長し得る細胞に被験成分を接触させるステップと、（ｂ）ステップ（ａ）で接触させた被験成分を除去するステップと、（ｃ）被験成分除去後に神経突起の再伸長レベルを測定するステップとを含む。 本発明に用いられる神経突起を伸長し得る細胞としては、培養可能で培養により神経突起を伸長する細胞であれば良く、特に限定されないが、株化された細胞が入手容易性の点で好ましく、例えばラット副腎由来褐色細胞腫ＰＣ−１２細胞、ヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞が挙げられる。 被験成分としては、微小管に作用する化合物、それらの混合物、及び動物抽出物、植物抽出物等が挙げられる。 ステップ（ａ）における、神経突起を伸長し得る細胞に被験成分を接触させる操作は、具体的には、被験成分を接触させた培地中で神経突起を伸長し得る細胞を培養することにより行うのが好ましい。用いられる培地としては、神経突起を伸長し得る細胞が生育できる培地であればよく、例えばＲＰＭＩ１６４０、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ等が用いられる。また、培地には、ウシ血清、ブタ血清等の血清の他、神経突起伸長誘導因子である神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）、トランス−レチノイン酸（Ａｌｌ-Ｔｒａｎｓ Ｒｅｔｉｎｏｉｃ Ａｃｉｄ）等を添加することができる。神経突起を伸長し得る細胞は、培地中に１０〜２００ ｃｅｌｌｓ／μＬ、さらに４０〜１００ ｃｅｌｌｓ／μＬ添加するのが好ましい。 神経突起を伸長し得る細胞のステップ（ａ）における被験成分接触前の培養は、用いる細胞により相違するが、例えば、３０〜４０℃で４８〜９６時間行うのが好ましい。 ステップ（ａ）において、被験成分を接触させれば、被験成分にＰＮがなければ細胞から伸長した神経突起は消失しないが、被験成分がＰＮを有する場合には伸長した神経突起が消失する。神経突起の有無は、顕微鏡観察で行うことができる。 ＰＮを有する被験成分の場合、ステップ（ａ）で接触させる被験成分の濃度は、アポトーシス誘導による非特異的な神経突起消失の影響を避けるために、被験成分接触後実質的にすべての細胞の神経突起が消失する濃度を事前に測定し、当該濃度で被験成分を接触させることが好ましく、被験成分接触後９５％以上の細胞の神経突起が消失する濃度で接触させることがさらに好ましい。また、当該濃度は、被験成分接触後実質的にすべての細胞が神経突起を消失する最低濃度であることが好ましく、被験成分接触後９５％以上の細胞の神経突起が消失する最低濃度であることがさらに好ましい。 ステップ（ｂ）においては、ステップ（ａ）で用いた被験成分を除去する。被験成分の除去は、通常、被験成分を含有しない培地に交換することにより行うことができる。新たな培地は、前記細胞が生育できる培地であればよいが、前記ステップ（ａ）で用いた培地と同様の培地が好ましい。ステップ（ｂ）の被験成分の除去は神経突起消失作用、及びステップ（ｃ）の再伸長の点から、ステップ（ａ）における被験成分と細胞の接触、例えば被験成分接触後２４時間以内、好ましくは１〜２４時間、より好ましくは１２〜２４時間、さらに１８〜２４時間に行うのが好ましい。 ステップ（ｃ）では、被験成分除去後に神経突起の再伸長レベルを測定する。 被験成分を除去すれば、被験成分による神経突起消失作用が解除されるので、細胞から神経突起の再伸長が生じる。当該神経突起の再伸長レベルを測定する。 再伸長レベルの測定は、被験成分除去後０〜７２時間に、さらに０時間（除去直後）と２４〜７２時間に、特に０時間（除去直後）と２４〜４８時間に行うのが好ましい。再伸長レベルは、再伸長した細胞数の割合を測定すること、又は被験成分除去後の重合チューブリン量を測定することによって行うことができる。ここで、再伸長した細胞数の割合の測定は、被験成分除去後一定時間経過後に、顕微鏡観察により一定細胞数当たりの神経突起が再伸長した細胞数の割合を測定することにより行われる。顕微鏡観察時の一定細胞数は、３００個程度が好ましい。一方、重合チューブリン量の測定は、被験成分除去後０〜２４時間に、細胞内総タンパク質に含まれる重合チューブリンを遠心操作により沈殿させ、沈殿画分の重合チューブリン量をウェスタンブロット法等を用いて検出し、被験成分除去直後の重合チューブリン量と対比することにより行われる。 被験成分除去後２４〜７２時間、好ましくは２４〜４８時間に、顕微鏡観察により一定細胞数当たりの神経突起が再伸長した細胞数の割合を、他の被験成分の再伸長した細胞数の割合と比較することで、当該被験成分と当該他の被験成分とのＦＰＮの相対的な高低を判定することができる。即ち、一定細胞数当たりの神経突起が再伸長した細胞数の割合が、他の被験成分の再伸長した細胞数の割合と比較して高い場合には、当該被験成分のＦＰＮが、当該他の被験成分より低いと判定することができ、一定細胞数当たりの神経突起が再伸長した細胞数の割合が、他の被験成分の再伸長した細胞数の割合と比較して低い場合には、当該被験成分のＦＰＮが、当該他の被験成分より高いと判定することができる。ここで、他の被験成分としては、ＦＰＮが不明な被験成分の他に、ＦＰＮが既知の成分を用いることもできる。当該ＦＰＮが既知の成分としては、微小管に作用する既知成分等を用いることができ、具体的には、パクリタキセル、ビンクリスチン、コルヒチン、ドセタキセル、ビンデシン、ビノレルビン等が挙げられる。 本発明の評価方法によるＦＰＮの評価結果は、前記（表２）の臨床におけるＦＰＮと高い相関性を有する。従って、本発明の評価方法によれば、ＦＰＮが低い化合物をスクリーニングすることができる。 次に比較例および実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。＜比較例１：ＰＣ−１２細胞およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を用いた評価系での検討＞［１］材料および方法（ａ）細胞 ラット副腎由来褐色細胞腫ＰＣ−１２細胞：理研セルバンクより購入 ヒト大腸癌由来ＨＣＴ１１６細胞：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より購入 ヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞：ＡＴＣＣより購入（ｂ）試薬 Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM)（Sigma Aldrich） RPMI1640（Sigma Aldrich） Fetal Bovine Serum (FBS)（Biofill） Horse Serum(HS)（DSP） ペニシリン−ストレプトマイシン（Gibco BRL） 2.5S Nerve Growth Factor (NGF), Mouse（Millipore） Cell Titer 96 aqueous one solution（Promega） Dimethylsulfoxide (DMSO)（和光純薬工業） All-Trans Retinoic Acid (ATRA)（和光純薬工業） WST-8 (KISHIDA)（ｃ）被験薬 Vincristine（Sigma Aldrich） Paclitaxel（Sigma Aldrich） Docetaxel（Fluka） BI2536（ヤクルト本社にて合成） Colchicine（東京化成工業株式会社） Doxorubicin（和光純薬工業） Vindesine（Sigma Aldrich） Vinorelbine（Sigma Aldrich） ＊すべての被験薬はＤＭＳＯにより１０ ｍＭに調製して使用（ｄ）ＰＣ−１２細胞に対する神経突起伸長の誘導および被験薬の接触 １０％ＦＢＳ，５％ＨＳ，ＤＭＥＭに懸濁した対数増殖期のＰＣ−１２細胞を用意し、２０００ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ／５０ μＬでコラーゲンコート９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種した。翌日、５０ ｎｇ／ｍＬ ＮＧＦを含むＤＭＥＭに交換して７２時間インキュベートした。７２時間後に５０ ｎｇ／ｍＬ ＮＧＦを含むＤＭＥＭで適当濃度に希釈した被験薬を５０ μＬ／ｗｅｌｌずつ添加した。（ｅ）ＰＣ−１２細胞の細胞生存率測定 被験薬添加２４時間後にＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ ９６ ａｑｕｅｏｕｓ ｏｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎを１０ μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、２時間インキュベート後にＳｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｐｌｕｓ ３８４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて波長４９０ ｎｍの吸光度を測定した。各被験薬濃度における生存細胞数から、細胞生存率を算出した。（ｆ）ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対する神経突起伸長の誘導および被験薬の接触 １０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０に懸濁した対数増殖期のＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を用意し、５０００ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ／５０ μＬで９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種した。翌日、１ μＬ ＡＴＲＡを含むＲＰＭＩ１６４０に交換して７２時間インキュベートした。７２時間後に１ μＬ ＡＴＲＡを含むＲＰＭＩ１６４０で適当濃度に希釈した被験薬を５０ μＬ／ｗｅｌｌずつ添加した。（ｇ）ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の細胞生存率測定 被験薬添加２４時間後にＷＳＴ−８を１０ μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、２時間インキュベート後にＳｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｐｌｕｓ ３８４を用いて波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。各被験薬濃度における生存細胞数から、細胞生存率を算出した。（ｈ）ＰＣ−１２およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の神経突起評価 被験薬添加２４時間後に各ｗｅｌｌ中の細胞の顕微鏡像（接眼ｘ１０、対物ｘ２０）をデジタルカメラで撮影し、細胞３００個当たりの神経突起を有する細胞の割合を求めた。なお、細胞体の大きさの２倍より長い突起を神経突起と判断した。神経突起を有する細胞の割合は、下式により細胞毒性による神経突起破綻の影響を補正した。その補正値から、各被験薬の神経突起に対する５０％阻害濃度（ＩＣ50値）を算出した。 Ａ ＝ Ｂ／Ｃ Ａ：神経突起を有する細胞の割合（補正値） Ｂ：神経突起評価により求めた神経突起を有する細胞の割合 Ｃ：細胞生存率（ｉ）ＨＣＴ１１６細胞に対する細胞増殖阻害活性測定 ＲＰＭＩ１６４０に懸濁した対数増殖期のＨＣＴ１１６細胞を、１０００ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ／５０ μＬで９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種した。翌日、適当濃度に希釈した被験薬を各ｗｅｌｌに５０ μＬずつ添加した。９６時間インキュベート後にＷＳＴ−８を１０ μＬ／ｗｅｌｌずつ添加して２時間インキュベート後、Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｐｌｕｓ ３８４を用いて波長４５０ ｎｍの吸光度を測定した。各被験薬濃度における生存細胞数から、細胞増殖に対するＩＣ50値を算出した。［２］ＰＣ−１２細胞使用時の結果 ラット副腎由来褐色細胞腫であるＰＣ−１２細胞を用いて各種被験薬の神経突起消失作用を確認した。今回、ＰＮを発現する被験薬としてＰａｃｌｉｔａｘｅｌ，Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ，Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ，Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ，ＶｉｎｄｅｓｉｎｅおよびＶｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅの６種を、発現しない被験薬としてＤｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ（Ｓ期停止作用を有するＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼ阻害剤）およびＢＩ２５３６（Ｇ２／Ｍ期停止作用を有するＰＬＫ１阻害剤）を用いた。 ＮＧＦにより神経細胞様に分化させたＰＣ−１２細胞に各被験薬を接触させ、神経突起評価および細胞生存率測定を行った。一般的に、抗がん剤の安全域を求めるためには、毒性を示す濃度域と抗腫瘍活性を示す濃度域とを比較する必要がある。そこで各抗がん剤が有する抗腫瘍活性の指標としてＨＣＴ１１６細胞の細胞増殖阻害活性を測定し、ＩＣ50値を算出した。さらに、各抗がん剤の（１）神経突起に対するＩＣ50値および（２）ＨＣＴ１１６細胞の細胞増殖に対するＩＣ50値より、ＰＮの指標として（１）／（２）の値（以下、ｉｎｄｅｘ ｏｆ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；ＩＮ値と記述）を算出した（表３）。 その結果、ＰＮを発現しない被験薬に比べてＰＮを発現する被験薬はいずれも低いＩＮ値を示した。さらに、ＰＮを発現する被験薬について、臨床におけるＦＰＮは被験薬ごとに異なっている（表３）が、いずれも同等のＩＮ値を示した。よって、本結果からはＰＮの有無は判断できるがＦＰＮを予測することは難しいと考えられた。［３］ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞使用時の結果 ヒト神経芽細胞腫であるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を用いて各種被験薬の神経突起消失作用を確認した。なお、ＰＮを発現する被験薬としてＰａｃｌｉｔａｘｅｌ，Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ，Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ，Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ，ＶｉｎｄｅｓｉｎｅおよびＶｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅの６種を、発現しない被験薬としてＤｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎおよびＢＩ２５３６を用いた。 ＡＴＲＡ処置によりＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に神経突起の伸長を誘導した。神経突起伸長を誘導したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に各被験薬を接触させ、神経突起評価および細胞生存率測定を行った。ＰＮの指標としては、ＰＣ−１２細胞使用時と同様に、ＩＮ値を使用した（表４）。 ＰＮを発現する被験薬はいずれも、ＰＮを発現しないＤｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎおよびＢＩ２５３６に比べて低いＩＮ値を示す傾向が認められた。しかし、ＰＮを発現し、かつ臨床において高いＦＰＮを示すＰａｃｌｉｔａｘｅｌおよびＶｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅのＩＮ値が大きいこと（表４）から、本結果からはＰＮの有無は判断できるがＦＰＮを予測することは困難と考えられた。＜実施例１：ＦＰＮと高い相関を示す評価系の確立：ＰＣ−１２細胞およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を用いた神経突起の再伸長レベルの評価＞［１］材料および方法（ａ）細胞 ラット副腎由来褐色細胞腫ＰＣ−１２細胞：理研セルバンクより購入 ヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、ＡＴＣＣより購入（ｂ）試薬 Dulbecco's modified eagle's medium(DMEM)（Sigma Aldrich） RPMI1640（Sigma Aldrich） Fetal Bovine Serum(FBS)（Biofill） Horse Serum(HS)（DSP） ペニシリン−ストレプトマイシン（Gibco BRL） 2.5S Nerve Growth Factor(NGF),Mouse（Millipore） Dimethylsulfoxide(DMSO)（和光純薬工業） All-Trans Retinoic Acid(ATRA)（和光純薬工業）（ｃ）被験薬 Vincristine（Sigma Aldrich） Paclitaxel（Sigma Aldrich） Docetaxel（Fluka） Colchicine（東京化成工業株式会社） Vindesine（Sigma Aldrich） Vinorelbine（Sigma Aldrich） ＊すべての被験薬はＤＭＳＯにより１０ ｍＭに調製して使用（ｄ）ＰＣ−１２細胞に対する神経突起伸長の誘導および被験薬の接触 １０％ＦＢＳ、５％ＨＳ、ＤＭＥＭに懸濁した対数増殖期のＰＣ−１２細胞を用意し、２０００ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ／５０ μＬでコラーゲンコート９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種した。翌日、５０ ｎｇ／ｍＬ ＮＧＦを含むＤＭＥＭに交換して７２時間インキュベートした。７２時間後に５０ ｎｇ／ｍＬ ＮＧＦを含むＤＭＥＭで適当濃度に希釈した被験薬を５０ μＬ／ｗｅｌｌずつ添加した。なお、アポトーシス誘導による非特異的な神経突起消失の影響を無視するため、被験薬接触後９５％以上の細胞が神経突起を消失する最低濃度を事前に求め、その濃度で評価を行った。（ｅ）ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対する神経突起伸長の誘導および被験薬の接触 １０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０に懸濁した対数増殖期のＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を用意し、５０００ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ／５０ μＬで９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種した。翌日、１ μＬ ＡＴＲＡを含むＲＰＭＩ１６４０に交換して７２時間インキュベートした。７２時間後に１ μＬ ＡＴＲＡを含むＲＰＭＩ１６４０で適当濃度に希釈した被験薬を５０ μＬ／ｗｅｌｌずつ添加した。なお、アポトーシス誘導による非特異的な神経突起消失の影響を無視するため、被験薬接触後９５％以上の細胞が神経突起を消失する最低濃度を事前に求め、その濃度で評価を行った。（ｆ）神経突起の再伸長レベルの評価 ＰＣ−１２もしくはＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に被験薬を接触させ２４時間後、ＰＣ−１２細胞については５０ ｎｇ／ｍＬ ＮＧＦを含むＤＭＥＭ、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞については１ μＬ ＡＴＲＡを含むＲＰＭＩ１６４０に培地を交換した。培地交換２４および４８時間後に各ｗｅｌｌ中の細胞の顕微鏡像（接眼ｘ１０、対物ｘ２０）をデジタルカメラで撮影し、細胞３００個当たりの神経突起を再伸長した細胞の割合を求めた。なお、細胞体の大きさの２倍より長い突起を神経突起と判断した。［２］ＰＣ−１２細胞使用時の結果 被験薬除去後２４および４８時間において神経突起を再伸長した細胞の割合を図１に示す。評価の結果、Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ接触後に神経突起を再伸長した細胞の割合はＰａｃｌｉｔａｘｅｌ接触後の細胞と同程度であった。また、Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌに比べて、Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ接触後に神経突起を再伸長した細胞の割合は有意に高かった。さらに、Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅに比べて、Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ，ＶｉｎｄｅｓｉｎｅおよびＶｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ接触後に神経突起を再伸長した細胞の割合はさらに高かった。［３］ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞使用時の結果 ＰａｃｌｉｔａｘｅｌとＶｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅは同程度の再伸長レベルを示した。一方、Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌに比べて、Ｄｏｃｅｔａｘｅｌは有意ではないが高い再伸長レベルを、ＶｉｎｄｅｓｉｎｅおよびＶｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅは有意に高い再伸長レベルを示した。［４］臨床でのＦＰＮとの相関 各被験薬のＦＰＮ、および今回の評価結果より得たＰＣ−１２細胞の神経突起の再伸長レベルを表５に示した。なお、神経突起の再伸長レベルは、被験薬除去後４８時間においてＰａｃｌｉｔａｘｅｌに比べて有意に再伸長レベルが高かった順に＋＋＋（Ｐ＜０．００１）、＋＋（Ｐ＜０．０１）、＋（Ｐ＜０．０５）もしくは−（ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）で示した。ＰＣ−１２細胞を用いた評価結果より、評価した全ての被験薬について、ＦＰＮと神経突起の再伸長レベルは逆相関していた。なお、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を用いた評価結果においても、ＦＰＮと神経突起の再伸長レベルは逆相関している傾向が認められ、本結果と臨床におけるＦＰＮ値に高い相関があることが確認された。このことから、本試験方法を用いることで、ＰＮの有無のみならず、ＦＰＮも予測することが可能である。 （ａ）神経突起を伸長し得る細胞に被験成分を接触させるステップと、 （ｂ）ステップ（ａ）で接触させた被験成分を除去するステップと、 （ｃ）被験成分除去後に神経突起の再伸長レベルを測定するステップを含む、被験成分の末梢神経毒性評価方法。 神経突起を伸長し得る細胞が、ラット副腎由来褐色細胞腫のＰＣ−１２細胞またはヒト神経芽細胞腫のＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞である請求項１に記載の方法。 被験成分が、微小管に作用する成分である請求項１又は２に記載の方法。 ステップ（ａ）で接触させる被験成分の濃度が、被験成分接触後実質的にすべての細胞の神経突起が消失する濃度である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。 被験成分接触後実質的にすべての細胞の神経突起を消失する濃度が、９５％以上の細胞の神経突起が消失する濃度である請求項４に記載の方法。 ステップ（ｂ）の除去が、被験成分接触後２４時間以内に行われる請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。 ステップ（ｃ）の測定が、被験成分除去後０−７２時間に行われる請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。 ステップ（ｃ）の測定が、再伸長した細胞数の割合を測定するものである請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。 ステップ（ｃ）において、被験成分除去後２４−４８時間後の、一定細胞数当たりの神経突起を再伸長した細胞数の割合を、他の被験成分の再伸長した細胞数の割合と比較することで、当該被験成分と当該他の被験成分との末梢神経毒性の発現頻度の相対的な高低を判定する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。 請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法により、末梢神経毒性の発現頻度が低い成分をスクリーニングする方法。 請求項１０に記載のスクリーニング方法により得られた末梢神経毒性の発現頻度が低い成分。 【課題】被験成分によって引き起こされる末梢神経毒性の発現頻度をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価する方法に関する。また、該方法により、末梢神経毒性の発現頻度が低い成分をスクリーニングする方法の提供。【解決手段】 （ａ）神経突起を伸長し得る細胞に被験成分を接触させるステップと、 （ｂ）ステップ（ａ）で接触させた被験成分を除去するステップと、 （ｃ）被験成分除去後に神経突起の再伸長レベルを測定するステップを含む、被験成分の末梢神経毒性評価方法。【選択図】なし