生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公開特許公報(A)_ＤＮＡの抽出方法 |
| 出願番号： | 2012170881 |
| 年次： | 2014 |
| IPC分類： | C12N 15/09 |
特許情報キャッシュ
斉藤 祐司 ▲高▼城 富美男 JP 2014030364 公開特許公報(A) 20140220 2012170881 20120801 ＤＮＡの抽出方法 セイコーエプソン株式会社 000002369 上柳 雅誉 100095728 宮坂 一彦 100127661 渡辺 和昭 100116665 斉藤 祐司 ▲高▼城 富美男 C12N 15/09 20060101AFI20140124BHJP JPC12N15/00 A 8 ＯＬ 7 4B024 4B024AA20 4B024CA01 4B024HA20 本発明は、ＤＮＡの抽出方法に関する。 シリカ粒子等の核酸結合性固相担体とカオトロピック剤を用いて、生体材料からより簡便に核酸を抽出する方法が、Boomらにより報告された（非特許文献１参照）。このBoomらの方法を含め、シリカ等の核酸結合性固相担体とカオトロピック剤を用いて核酸を担体に吸着させ、抽出する方法は、主に、（１）カオトロピック剤存在下、核酸結合性固相担体に核酸を吸着させる工程（吸着工程）、（２）非特異的に結合した夾雑物及びカオトロピック剤を除くため、洗浄液にて核酸の吸着した担体を洗浄する工程（洗浄工程）、および（３）水または低塩濃度緩衝液にて核酸を担体から溶出させる工程（溶出工程）の３工程からなる。ここで（２）の洗浄液としては、カオトロピック剤を溶かし込み、さらに、核酸の担体からの溶出を防ぐため、従来から、水溶性有機溶媒、特にエタノールを５０〜８０％程度の割合で含有する水または低塩濃度緩衝液が用いられている。 しかしながら、この水溶性有機溶媒が（３）の工程に残留した場合、抽出液を酵素処理する際に酵素反応が阻害されるため、通常、エタノールを含む水溶液での洗浄後は、必要に応じて１００％エタノール、あるいは、さらに揮発性の高いアセトン等で洗浄し、その後、乾燥させて、有機溶媒を系から完全に取り除く操作が行われている。この乾燥は時間を要するのみでなく、乾燥時間が不十分であればエタノールの残留につながり、過度の場合には、核酸が乾燥しすぎて固化するため、溶出が困難になり、結果的に核酸回収量の低下や再現性の低下に繋がることが知られている。このように有機溶媒の使用は、その乾燥の程度を見極めにくいのみならず、エタノールやアセトンといった有機溶媒は引火性及び揮発性を有するため、特に操作の自動化を考えた場合には、出火等の危険性も考えられる。 そこで、核酸を担体に吸着させた後、（２）の洗浄工程で、エタノール等の有機溶媒を全く含まない水または低塩濃度緩衝液で担体を洗浄し、（３）の溶出工程で、５０〜７０℃で、水または低塩濃度緩衝液で核酸を溶出することによって、リボ核酸（ＲＮＡ）を抽出する方法が開発された（特許文献１参照）。特開平１１−１４６７８３号公開公報J.Clin.Microbiol.,vol.28 No.3, p.495-503 (1990) 本発明は、新規なデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の抽出方法を提供することを目的とする。 これまで、Boom法において核酸を担体に吸着させた後、（２）の洗浄工程で、エタノール等の有機溶媒を事実上含まない水または低塩濃度緩衝液で担体を洗浄すると、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は、リボ核酸（ＲＮＡ）より先に担体から遊離するため、（３）の溶出工程で、５０〜７０℃で、水または低塩濃度水溶液で核酸を溶出することによって、ＤＮＡの混入が無くＲＮＡを単離できると考えられていた（特開平１１−１４６７８３号公開公報）。しかしながら、本発明者は、（３）の溶出工程で、８０℃以上で、水または低塩濃度水溶液で核酸を溶出することによって、ＤＮＡが抽出できることを見出し、本発明の完成に至った。 本発明の一実施形態は、ＤＮＡを含む試料に、カオトロピック物質を含有する溶解液および核酸結合性固相担体を混合して、ＤＮＡを前記担体上に吸着させる工程と、前記ＤＮＡを吸着させた前記担体を有機溶媒を含まない洗浄液で洗浄する工程と、前記担体に吸着したＤＮＡを７０℃より高い温度で溶出液中に溶出させる工程と、を含むＤＮＡの抽出方法である。前記洗浄液は、水または低塩濃度水溶液であってもよいが、前記低塩濃度水溶液の塩濃度が１００ｍＭ以下であることが好ましい。また、前記溶出液は、水または低塩濃度水溶液であってもよいが、前記低塩濃度水溶液の塩濃度が１００ｍＭ以下であることが好ましい。前記担体に吸着したＤＮＡは、１００℃未満で溶出させてもよい。前記溶解液は、３〜７Ｍのグアニジン塩、０〜５％の非イオン性界面活性剤、０〜０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０〜０．２Ｍの還元剤を含有する中性溶解液であってもよい。前記担体は、磁性粒子であってもよい。 本発明によって、新規なＤＮＡの抽出方法を提供することが可能になった。本発明の一実施例において、溶出したＤＮＡ収量と溶出温度との相関を示すグラフである。 実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、M. R. Green & J. Sambrook (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (4th edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2012); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。 なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。＝＝ＤＮＡ抽出用試薬など＝＝ 本発明にかかるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の抽出方法は、ＤＮＡを含む試料に、カオトロピック物質を含有する溶解液および核酸結合性固相担体を混合して、ＤＮＡを担体上に吸着させる工程（吸着工程）と、ＤＮＡを吸着させた担体を有機溶媒を含まない洗浄液で洗浄する工程（洗浄工程）と、担体に吸着したＤＮＡを７０℃より高い温度で溶出液中に溶出させる工程（溶出工程）と、を含む。 ＤＮＡを抽出する試料は、ＤＮＡを含んでいれば特に限定されず、細胞や、組織などの細胞塊などの生体試料、ウイルス、合成ＤＮＡ、一旦単離したＤＮＡに不純物や夾雑物が混入した試料などであってもよい。 カオトロピック物質は、水溶液中でカオトロピックイオン（イオン半径の大きな１価の陰イオン）を生じ、疎水性分子の水溶性を増加させる作用を有しており、ＤＮＡの固相担体への吸着に寄与するものであれば、特に限定されない。具体的には、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、過塩素酸ナトリウム等が挙げられるが、これらのうち、タンパク質変成作用の強いグアニジンチオシアン酸塩またはグアニジン塩酸塩が好ましい。これらのカオトロピック物質の使用濃度は、各物質により異なり、例えば、グアニジンチオシアン酸塩を使用する場合には、３〜５．５Ｍの範囲で、グアニジン塩酸塩を使用する場合は、５Ｍ以上で使用するのが好ましい。 溶解液は、このようなカオトロピック物質を含有すれば特に限定されないが、細胞膜の破壊あるいは細胞中に含まれるタンパク質を変性させる目的で界面活性剤を含有させてもよい。この界面活性剤としては、一般に細胞等からの核酸抽出に使用されるものであれば特に限定されないが、具体的には、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘなどのトリトン系界面活性剤やＴｗｅｅｎ２０などのツイーン系界面活性剤のような非イオン性界面活性剤、Ｎ‐ラウロイルサルコシンナトリウム（ＳＤＳ）等の陰イオン性界面活性剤が挙げられるが、特に非イオン性界面活性剤を、０．１〜２％の範囲となるように使用するのが好ましい。さらに、溶解液には、２−メルカプトエタノールあるいはジチオスレイトール等の還元剤を含有させることが好ましい。溶解液は、緩衝液であっても良いが、ｐＨ６〜８の中性であることが好ましい。これらのことを考慮し、具体的には、３〜７Ｍのグアニジン塩、０〜５％の非イオン性界面活性剤、０〜０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０〜０．２Ｍの還元剤などを含有することが好ましい。 核酸結合性固相担体は、カオトロピックイオンの存在下で、核酸を吸着すなわち可逆的な物理的結合により保持することができる親水性表面を有する固体であれば、特に限定されない。具体的には、二酸化珪素を含有する物質、例えば、シリカ、ガラス、珪藻土、あるいはこれらを化学的修飾により表面処理を施したものが好ましく、磁性体や超常磁性金属酸化物等との複合体がより好ましい。化学的修飾により表面処理を施す場合は、核酸との可逆的な結合を妨げない程度に、適度な陽性電荷を帯びさせてもよい。 また、これらの核酸結合性固相の形態としては、粒子、フィルター、バッグ、ディッシュ、反応容器等が具体的に挙げられるが、特に限定されない。これらのうち、吸着と溶出の効率を考慮すると粒子の形態がより好ましい。その場合の粒径は特に限定されないが、０．０５〜５００μｍであってもよく、好ましくは１〜１００μｍであり、特に好ましくは１〜１０μｍである。 洗浄液は、エタノールやイソプロピルアルコール等の有機溶媒およびカオトロピック物質を事実上含まないものが用いられ、水または低塩濃度水溶液であることが好ましく、低塩濃度水溶液の場合、緩衝液であることが好ましい。低塩濃度水溶液の塩濃度は、１００ｍＭ以下が好ましく、５０ｍＭ以下がより好ましく、１５ｍＭ以下が最も好ましい。また、低塩濃度水溶液の下限は特に無いが、０．１ｍＭ以上であることが好ましく、１ｍＭ以上であることがさらに好ましく、１０ｍＭ以上であることが最も好ましい。また、この溶液はＴｒｉｔｏｎ、Ｔｗｅｅｎ、ＳＤＳなどの界面活性剤を含有しても良く、ｐＨは特に限定されない。緩衝液にするための塩は特に限定されないが、トリス、ヘペス、ピペス、リン酸などの塩が好ましく用いられる。 溶出液も、特に限定されないが、水または低塩濃度水溶液が好ましく、エタノールやイソプロピルアルコール等の有機溶媒およびカオトロピック物質を事実上含まないものがより好ましい。低塩濃度水溶液の場合、緩衝液であることが好ましい。低塩濃度水溶液の塩濃度は、１００ｍＭ以下が好ましく、５０ｍＭ以下がより好ましく、１５ｍＭ以下が最も好ましい。低塩濃度水溶液の下限は特に無いが、０．１ｍＭ以上であることが好ましく、１ｍＭ以上であることがさらに好ましく、１０ｍＭ以上であることが最も好ましい。緩衝液にするための塩は特に限定されないが、トリス、ヘペス、ピペス、リン酸などの塩が好ましく用いられ、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）が最も好ましい。なお、洗浄液と溶出液は、同じであっても異なっていても良い。＝＝ＤＮＡ抽出方法＝＝ 具体的には、以下の様にしてＤＮＡを抽出すれば良い。 まず、溶解工程として、適量の溶解液に、ＤＮＡを抽出する試料及び核酸結合性固相担体を混合し、ホモジェナイザーやボルテックス・ミキサーなどによって試料を破砕し、ＤＮＡを担体に吸着させる。 次に、洗浄工程として、非特異的に担体に吸着した夾雑物を除去するため、ＤＮＡが吸着した担体を、適量の溶解液で洗浄することが好ましい。洗浄回数は特に限定されないが、１回〜数回洗浄すればよい。 ここでいう洗浄とは、ＤＮＡの結合した担体を洗浄液と接触させ、再び分離することにより、担体から、ＤＮＡ以外の非特異的に結合した物質を除去する操作である。具体的な分離方法は、使用する担体の形態により異なるが、担体がビーズなどの粒子形態である場合には、遠心分離、ろ過分離及びカラム操作等を用いることができる。担体が磁性体を含む場合は、磁石等を用いて、簡便に担体を洗浄することができる。 そして、溶出工程として、ＤＮＡが吸着した担体に、適量の溶出液を加え、ボルテックス・ミキサーなどによって混合し、ＤＮＡを担体から溶出させる。この際、溶出液を加熱することにより、ＤＮＡ抽出を促進する。加熱温度は特に限定されないが、７０℃より高ければ良く、８０℃以上が好ましく、９５℃以上がより好ましい。加熱温度の上限は特に限定されないが、２００℃未満であることが好ましく、１５０℃未満であることがより好ましく、１２５℃未満であることがさらに好ましく、１１０℃未満であることがさらに好ましいが、特に２本鎖ＤＮＡを単離したい時には１００℃未満であることが好ましい。加熱方法として、予め加熱した溶出液に担体を加えても良く、溶出液に担体を加えた後で加熱しても良い。加熱時間は特に限定されないが、３０秒〜１０分間程度が好ましい。 なお、ＲＮＡの混入を防ぐため、適量の溶出液を加えた後、一旦７０℃以下に加熱してＲＮＡを溶出し、溶出液を除去し、担体を洗浄液により洗浄した後、新たに適量の溶出液を加え、７０℃より高温に加熱することによって、ＤＮＡを担体から溶出させてもよい。 あるいは、ＲＮＡを除去するために、ＤＮＡ抽出工程のどこかの工程に、ＲＮａｓｅを添加しても良いが、効率よくＲＮＡを分解するため、溶出液に含有させることが好ましく、例えば、溶出液にRibonuclease Aを１０〜２０μｇ／ｍＬ含有させればよい。通常、ＲＮａｓｅが含まれたままで、ＰＣＲなどの操作を行うことができるが、ＲＮａｓｅを除去したい時には、吸着工程−洗浄工程−溶出工程を再度繰り返すか、その他公知の方法によって、ＤＮＡを精製してもよい。 このようにして溶出したＤＮＡは、透析やエタノール沈殿法等の脱塩、濃縮操作を施すことなく、ＰＣＲなどの酵素反応に直接使用することができる。 １．５ｍＬエッペンドルフ・マイクロチューブ（Eppendorf microcentrifuge tube）に入った全血サンプル５０μＬに、３７５μＬの溶解液（８Ｍグアニジン塩酸塩、５０ｍＭ エチレンジアミン四酢酸二水素二水和物（ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ）、１０％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）］を加えて溶解した。得られた細胞溶解液に、磁性シリカ粒子（ＮＰＫ−１０１、東洋紡績社）を２０μＬ添加し、室温で５分間、ボルテックス・ミキサー（Vortex mixer）で撹拌した。その後、マイクロチューブを磁気スタンド（ＭＧＳ−１０１、東洋紡績社）に設置して磁気シリカ粒子を集め、上清を除去した。 次に、マイクロチューブを磁気スタンドから外し、４５０μＬの洗浄液Ｉ（８Ｍグアニジン塩酸塩）を加えて、十分混合した後、再度磁気スタンドに設置して、上清を除去することにより、磁気ビーズを洗浄した。次に、同様にして４５０μＬの洗浄液ＩＩ（５ｍＭトリス塩酸緩衝液）で粒子を洗浄した。最後に、集めた粒子に５０μＬの溶出液（滅菌水）を添加し、粒子を懸濁し、５分間、表１に示す温度に加熱した後、マイクロチューブを磁気スタンドに設置して、上清を回収した。上清中のＤＮＡ量を吸光度によって測定した。図１にその結果を示す。 比較例（従来方法）として、洗浄液ＩＩの代わりに、７０％エタノールで洗浄し、溶出は、室温で５分間、ボルテックス・ミキサーで撹拌することにより行った。 表１には、各温度ごとに、比較例（コントロール）で抽出したＤＮＡ量に対する、本発明の方法で抽出したＤＮＡ量の割合を回収率として示す。 このように、ＤＮＡが結合したシリカを、低塩濃度水溶液で洗浄しても、ＤＮＡはシリカに強固に結合したままであり、７０℃より高い温度、好ましくは８０℃以上に加熱することによって、ＤＮＡを回収することができる。 デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む試料に、カオトロピック物質を含有する溶解液および核酸結合性固相担体を混合して、ＤＮＡを前記担体に吸着させる工程と、 前記ＤＮＡを吸着させた前記担体を、有機溶媒を含まない洗浄液で洗浄する工程と、 前記担体に吸着したＤＮＡを７０℃より高い温度で溶出液中に溶出させる工程と、 を含むＤＮＡの抽出方法。 前記洗浄液が、水または低塩濃度水溶液であることを特徴とする、請求項１に記載の抽出方法。 前記低塩濃度水溶液の塩濃度が１００ｍＭ以下であることを特徴とする、請求項２に記載の抽出方法。 前記溶出液が、水または低塩濃度水溶液であることを特徴とする、請求項１に記載の抽出方法。 前記低塩濃度水溶液の塩濃度が１００ｍＭ以下であることを特徴とする、請求項４に記載の抽出方法。 前記担体に吸着したＤＮＡを１００℃未満で溶出させることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。 前記溶解液が、３〜７Ｍのグアニジン塩、０〜５％の非イオン性界面活性剤、０〜０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０〜０．２Ｍの還元剤を含有する中性溶解液であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。 前記担体が、磁性粒子であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。 【課題】新規なＤＮＡの抽出方法を提供すること。【解決手段】デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む試料に、カオトロピック物質を含有する溶解液および核酸結合性固相担体を混合して、ＤＮＡを担体上に吸着させる工程と、ＤＮＡを吸着させた担体を、有機溶媒を含まない洗浄液で洗浄する工程と、担体に吸着したＤＮＡを７０℃より高い温度で溶出液中に溶出させる工程と、を行う。【選択図】 なし