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原賀 智子 齋藤 伸吾 佐藤 義行 JP 2013170141 公開特許公報(A) 20130902 2012034711 20120221 蛍光性ウラン錯体を形成する化合物、その合成方法、ウラン測定用蛍光プローブ及びウランの測定方法 独立行政法人日本原子力研究開発機構 505374783 国立大学法人埼玉大学 504190548 森川 聡 100145920 小山 卓志 100139103 田中 貞嗣 100139114 南 義明 100157118 原賀 智子 齋藤 伸吾 佐藤 義行 C07D 471/04 20060101AFI20130806BHJP G21C 17/02 20060101ALI20130806BHJP G01N 21/64 20060101ALI20130806BHJP JPC07D471/04 112TC07D471/04G21C17/02 FG01N21/64 F 4 ＯＬ 12 2G043 2G075 4C065 2G043AA01 2G043BA07 2G043CA03 2G043DA01 2G043EA01 2G075AA18 2G075CA40 2G075DA07 2G075FC13 4C065AA04 4C065AA19 4C065BB09 4C065CC09 4C065DD02 4C065EE02 4C065HH08 4C065JJ01 4C065KK01 4C065KK08 4C065LL07 4C065PP03 4C065PP07 4C065PP18 4C065QQ04 4C065QQ05 本発明は、安定な蛍光性ウラン錯体を形成する化合物、その合成方法、当該化合物からなるウラン測定用蛍光プローブ及び当該プローブが使用されるウランの測定方法に関する。 原子力発電所、放射性同位元素を扱う研究施設等の放射性物質を扱う施設から排出される廃液及び廃棄物はウラン化合物を含有し得る。当該廃液及び廃棄物がウラン化合物を含有する場合、当該廃液及び廃棄物が処分される前に、当該廃液及び廃棄物中のウラン濃度が測定されなければならない。従来、当該廃液及び廃棄物中のウランが、イオン交換樹脂、溶媒抽出等の煩雑な分離方法で分離され、当該廃液及び廃棄物中のウラン濃度が質量分析法により定量されていた。質量分析によるウランの検出限界値はｐｐｑ〜ｐｐｔ（１０-12〜１０-10Ｍ）レベルであった。しかし、質量分析法で使用される機器は非常に高価であり、分析設備は廃液及び廃棄物に含まれる様々な放射性核種により広範に放射能汚染されやすい。 一方、「配位部位−スペーサー−蛍光団」の構造よりなる金属測定用蛍光プローブと金属を含む試料が混合され、蛍光性金属錯体が形成され、当該蛍光性金属錯体がゲル中を電気泳動されて、試料中の金属が定性分析及び定量分析される方法が検討された（例えば、特許文献１及び２参照）。本発明の発明者らは、当該方法で使用された２−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−エチレンジアミン四酢酸（ＦＴＣ−ＡＢＥＤＴＡ）、２−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＦＴＣ−ＡＢＤＯＴＡ）、２−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−ジエチレントリアミン五酢酸（ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ）、Ｎ−［（Ｒ）−２−アミノ−３−（ｐ−フルオレセイン−チオカルバミル−フェニル）プロピル］−トランス−（Ｓ，Ｓ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ′，Ｎ′，Ｎ′′，Ｎ′′−五酢酸（ＦＴＣ−ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ）のそれぞれとＵＯ22+イオンからなる蛍光性ウラン錯体を形成し、当該蛍光性ウラン錯体を電気泳動に付して、試料に含まれるウランの定性分析及び定量分析を試みた。しかしながら、こられの蛍光性ウラン錯体は不安定で、短時間プローブと金属に分解してしまい、試料に含まれるウランの定性分析及び定量分析は不可能であった。 ところで、ＵＯ22+イオンと安定な錯体を形成する化合物が検討された（例えば、非特許文献１参照）。特開２００９−１５０６５０号公報特開２００９−１６８４５０号公報Diane A. Blake 外５名、Biosensors & Bioelectronics 16, 2001, p799-809 近年、ウランを含む廃液及び廃棄物中のウランの安価な装置による定性分析法及び定量分析法が希求されていたが、このような方法は見出されていなかった。 本発明が解決しようとする課題は、安定な蛍光性ウラン錯体を形成する化合物とその合成方法の提供である。 本発明が解決しようとする別の課題は、上記化合物からなるウラン測定用蛍光プローブと当該プローブが使用されるウランの安価な定性及び定量分析方法の提供である。 本発明の発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、特定の化合物がウランと安定な錯体を形成することを見出し、本発明を完成させた。 本発明の化合物は、下記式で示される5-(2-(3-(3-carboxy-4-(3-hydroxy-6-oxo-6H-xanthen-9-yl)phenyl)thioureido)acetamido)1,10-phenanthroline-2,9-dicarboxylic acid（ＦＴＣ−ＰＤＡ）である。 下記工程（ａ）〜（ｄ）が、本発明の化合物の合成方法で実施される。 下記式（１）で示される化合物と水素が反応させられ、下記式（２）で示される化合物が得られる工程（ａ）、 上記式（２）で示される化合物とクロロアセチルクロリドが反応させられ、下記式（３）で示される化合物が得られる工程（ｂ）、 上記式（３）で示される化合物とアンモニア水が反応させられ、下記式（４）で示される化合物が得られる工程（ｃ）、 上記式（４）で示される化合物と下記式（５）で示されるフルオレセイン−４−イソチアネートが反応させられる工程（ｄ） 本発明のウラン測定用蛍光プローブは上記化合物からなる。 下記工程（Ａ）〜（Ｃ）が、本発明のウランの定性及び定量分析方法で実施される。 ウランを含む試料と上記ウラン測定用蛍光プローブが混合され、蛍光性ウラン錯体が混合液中に形成される工程（Ａ）、 蛍光性ウラン錯体を含む混合液がキャピラリー中で電気泳動される工程（Ｂ）、 蛍光強度が測定される工程（Ｃ） 本発明の化合物は、ＵＯ22+イオンと安定な蛍光性ウラン錯体を形成する。本発明のウランの定性及び定量分析方法は、微量の試料と安価な機器で実施可能であり、ウランによる分析設備の汚染は少ない。本発明のウランの定性及び定量分析方法によるウランの検出限界値は数十ｐｐｔレベルである。本発明の化合物の合成方法の一部を示す図本発明の化合物とＵＯ22+イオンからなる蛍光性ウラン錯体を示す図本発明のウランの定性及び定量分析方法で使用されるキャピラリー電気泳動装置を示す図電気泳動図 本発明の化合物の合成方法を、図１により説明する。 まず、上記式（１）で示される化合物が、Bioconjugate Chem., Vol. 15, No. 5, 2004, p1125-1136に記載方法に基づいて合成される。 図１の式（Ａ）で示される２，９−ジメチル−１，１０−フェナントロリンと、硝酸及び硫酸からなる混酸が反応させられ、図１の式（Ｂ）で示される５−ニトロ−２，９−ジメチル−１，１０−フェナントロリンが得られる。５−ニトロ−２，９−ジメチル−１，１０−フェナントロリンは二酸化セレンと反応させられ、図１の式（Ｃ）で示されるジアルデヒド化合物が得られる。当該ジアルデヒド化合物が酸化され、上記式（１）で示される化合物が得られる。 上記式（１）で示される化合物は水素で還元され、上記式（２）で示される化合物が得られる。上記式（２）で示される化合物はクロロアセチルクロリドと反応させられ、上記式（３）で示される化合物が得られる。上記式（３）で示される化合物はアンモニア水と反応させられ、上記式（４）で示される化合物が得られる。上記式（４）で示される化合物は、上記式（５）で示されるフルオレセイン−４−イソチアネートと反応させられ、ＦＴＣ−ＰＤＡが得られる。 ＦＴＣ−ＰＤＡはＵＯ22+イオンと安定な蛍光性ウラン錯体を形成する。光が当該錯体に照射されると、当該錯体は蛍光を発する。そこで、ＦＴＣ−ＰＤＡはウラン測定用蛍光プローブとして使用される。当該錯体は、図２に示されるように、（蛍光部位）−（スペーサー）−（配位部位）からなると考えられる。 図３は、本発明のウランの定性及び定量分析方法で使用されるキャピラリー電気泳動装置を示す図である。最初に、キャピラリー３内が泳動液で洗浄され、キャピラリー３内は泳動液で満たされる。次に、ＦＴＣ−ＰＤＡとＵＯ22+イオンで形成された蛍光性ウラン錯体を含む試料溶液が入った容器が、＋極側の泳動液が入った容器と交換され、圧力差又は落差により、当該試料溶液がキャピラリー３に注入された後、速やかに泳動液が入った容器が元の位置に戻される。その後、電源１に電荷が印加されると、当該錯体はキャピラリー３内の泳動液中を−極側の泳動液２’方向へ移動する。レーザー光が移動途中の当該錯体に照射されると、当該錯体は蛍光を発する。当該蛍光の強度が検出され、ウランの定性及び定量分析が実施される。 以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。ＦＴＣ−ＰＤＡの合成 硝酸（和光純薬工業（株）製特級原液）５ｍＬ及び硫酸（和光純薬工業（株）製特級原液）１０ｍＬが混合された混酸が、図１の式（Ａ）で示される２，９−ジメチル−１，１０−フェナントロリン（和光純薬工業（株）製）０．５ｇに加えられ、１１５℃で１時間加熱された。１００ｇの氷が得られた溶液に加えられ、冷却された溶液のｐＨが水酸化ナトリウムで８．０に調整された。生成した沈殿が濾過され、１１０℃で乾燥され、図１の式（Ｂ）で示される５−ニトロ−２，９−ジメチル−１，１０−フェナントロリンが得られた。 次に、１ｇの５−ニトロ−２，９−ジメチル−１，１０−フェナントロリンと１ｇの二酸化セレンの混合物が５ｍＬの９６％ジオキサン水溶液に溶解され、３時間加熱還流され、セライトパッド（登録商標）（Celite Corporation製）で濾過された。図１の式（Ｃ）で示されるジアルデヒド化合物が黄赤色の沈殿として得られた。当該ジアルデヒド化合物が、１０ｍＬの硝酸（和光純薬工業（株）製特級原液）で３時間加熱還流され、得られた溶液が氷で冷却され、沈殿物が得られた。当該沈殿物がテトラヒドロフラン水溶液で再結晶させられ、上記式（１）で示される化合物が得られた。 １１０ｍｇの上記式（１）で示される化合物が５ｍＬのエタノールに溶解され、１５ｍｇのパラジウム触媒（Aldrich社製パラジウム炭素、パラジウムの担持率１０％）が更に添加され、水素ガス圧６０ｐｓｉで水素化還元が実施され、上記式（２）で示される化合物が溶解する溶液が得られた。当該溶液が空気に触れると、当該溶液の色が黄色から鮮紅色に変色した。１０ｍＬの３Ｍ塩酸が変色した溶液に添加され、パラジウム触媒が濾過により除去された。次いで、０℃で減圧が実施され、エタノールが蒸発させられた。２０ｍＬのジクロロメタンで希釈された０.４２ｍＬのクロロアセチルクロリド溶液が、攪拌されている溶液に添加され、溶液は室温で一晩攪拌され続けた。得られた２相の混合物が減圧蒸留され、固体が得られた。当該固体が１０ｍＬの冷水で洗浄され、減圧下で乾燥され、上記式（３）で示される化合物が得られた。 上記式（３）で示される化合物１００ｍｇは２０ｍＬの２５％アンモニア水とシールドチューブの密閉された系内で２５℃で１６時間反応させられ、上記式（４）で示される化合物が得られた。 ６０ｍｇの上記式（４）で示される化合物が２ｍＬの１０-2Ｍマレイン酸緩衝水溶液に懸濁させられ、２ｍＬのテトラヒドロフランが懸濁液に添加されて溶解された。更に、６８ｍｇの上記式（５）で示されるフルオレセイン−４−イソチアネート（Aldrich社製）が混合され、暗所にて４０℃で１２時間加熱された。そして、本発明の化合物であるＦＴＣ−ＰＤＡが、高速液体クロマトグラフィー装置（日本分光（株）製ＨＰＬＣ−２０００）とカラム（サーモサイエンティフィック（株）製Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＢＤＳ Ｃ１８）により、反応生成物から分離された。アセトニトリル（Ａ液）と０．１％トリフルオロ酢酸水溶液（Ｂ液）が移動相として使用され、Ａ液とＢ液の体積比（Ａ／Ｂ）が、開始時５／９５、開始時〜６分後まで５／９５、６分〜１５分後まで４０／６０、１５分〜２０分後まで９０／１０と変化するグラジエント法が採用され、移動相の流量は１．２０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度は３０℃とされた。ピークが開始から１８．４分後に現れ、その時点で集められた溶液の溶媒が減圧下で蒸発させられ、本発明の化合物であるＦＴＣ−ＰＤＡ５２ｍｇが精製された。各種溶液の調製（１）ウラン測定用蛍光プローブ水溶液の調製 精製されたＦＴＣ−ＰＤＡが秤量され、超純水に溶解されて、１０-3Ｍ水溶液が調製された。なお、ＦＴＣ−ＰＤＡが超純水に溶解されない場合、水酸化ナトリウム溶液（関東化学（株）製、等級 Ultrapur）が添加される。（２）ウラン溶液の調製 ＩＣＰ−ＭＳ（誘導結合プラズマ質量分析装置）で検定されたウラン標準溶液が希釈され、２．０×１０-5Ｍのウランを含む０．１Ｍ硝酸溶液が調製された。（３）ホウ酸水溶液の調製 ホウ酸（ＭＥＲＣＫ社製、純度９９．９９９９％）が超純水に溶解され、０．１Ｍホウ酸水溶液が調製され、当該水溶液のｐＨが水酸化ナトリム溶液（関東化学（株）製、等級 Ultrapur）で１０．０に調整された。（４）トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣｙＤＴＡ）水溶液の調製 ＣｙＤＴＡ（（株）同人化学研究所製、純度９９．０％）が超純水に溶解され、１０-3ＭのＣｙＤＴＡ水溶液が調製された。なお、ＣｙＤＴＡが超純水に溶解されない場合、水酸化ナトリウム水溶液が添加される。試料溶液の調製 上記ウラン測定用蛍光プローブ水溶液、ウラン溶液及びホウ酸水溶液が混合され、３Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（関東化学（株）製、等級 Ultrapur）が添加され、ウラン測定用蛍光プローブ濃度が５．０×１０-7Ｍ、ウラン濃度が５．０×１０-8Ｍ、ホウ酸濃度が２．０×１０-2Ｍ、ｐＨが９．６〜１０．０である試料溶液が調製された。泳動液の調製 上記ホウ酸水溶液及びＣｙＤＴＡ水溶液が混合され、上記３Ｍ水酸化ナトリウム水溶液が添加され、ホウ酸濃度が２．０×１０-2Ｍ、ＣｙＤＴＡ濃度が２．５×１０-5Ｍ、ｐＨが１０．０である泳動液が調製された。キャピラリー電気泳動 電気泳動装置はAgilent Technologies社製Ｇ７１００、検出器はレーザー励起蛍光検出器（Picometrics社製ZETALIF Discovery）、レーザー光源はMelles Griot社製Blue Solid-State Laser System 85-Z48804、励起波長は４８８ｎｍであった。キャピラリーは集光レンズ付き溶融シリカキャピラリー（Picometrics社製、内径５０μｍ、外径３７５μｍ、全長６９ｃｍ、有効長５０ｃｍ）であった。 キャピラリーが１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液で２０分間、超純水で２０分間、上記泳動液で１０分間順次洗浄された。次に、キャピラリー内が上記泳動液で満たされ、５ｎＬの試料溶液が圧力５０ｍｂａｒ、注入時間５秒で加圧法により＋極側からキャピラリー内に注入され、２０ｋＶの電圧が印加され、電気泳動装置の温度が２５℃とされて電気泳動が実施された。レーザー励起蛍光検出器のレーザー出力は８ｍＡ、光電子倍増管の電圧は５７０Ｖであった。図４は電気泳動図である。ＦＴＣ−ＰＤＡとＵＯ22+イオンで形成された蛍光性ウラン錯体のピーク（図４のＵＯ22+）及びＦＴＣ−ＰＤＡのピーク（図４のＬ）が検出され、ＦＴＣ−ＰＤＡがウラン測定用蛍光プローブとされるキャピラリー電気泳動法で、ウランの定性分析が可能であるとわかった。 更に、検量線法による定量分析も可能であるとわかった。検出限界値は３．５×１０-10Ｍ程度であった。なお、上記泳動液による洗浄が分析と別の分析の間に５分間実施された。 本発明の化合物は、ＵＯ22+イオンと安定な蛍光性ウラン錯体を形成する。当該錯体はキャピラリー中で電気泳動され、当該錯体が発する蛍光の強度が測定される。従って、本発明の化合物は、安価な電気泳動装置が用いられるウランの定性及び定量分析方法で使用される蛍光プローブとして使用され得る。１…電源、２，２’…泳動液、３…キャピラリー 下記式で示される化合物。 下記式（１）で示される化合物と水素が反応させられ、下記式（２）で示される化合物が得られる工程（ａ）、 上記式（２）で示される化合物とクロロアセチルクロリドが反応させられ、下記式（３）で示される化合物が得られる工程（ｂ）、 上記式（３）で示される化合物とアンモニア水が反応させられ、下記式（４）で示される化合物が得られる工程（ｃ）、 上記式（４）で示される化合物と下記式（５）で示されるフルオレセイン−４−イソチアネートが反応させられる工程（ｄ）が実施される、請求項１に記載された化合物の合成方法。 請求項１に記載された化合物からなるウラン測定用蛍光プローブ。 ウランを含む試料と請求項３に記載されたウラン測定用蛍光プローブが混合され、蛍光性ウラン錯体が混合液中に形成される工程（Ａ）、 蛍光性ウラン錯体を含む混合液がキャピラリー中で電気泳動される工程（Ｂ）、 蛍光強度が測定される工程（Ｃ）が実施される、ウランの定性及び定量分析方法。 【課題】ウランを含む廃液及び廃棄物中のウランの安価な装置による定性分析法及び定量分析法で使用されるウラン測定用蛍光プローブとなる化合物を提供する。【解決手段】 下記式で示される化合物。【化１】【選択図】なし

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