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| タイトル： | 公開特許公報(A)_高麗人参薬効成分の製造方法 |
| 出願番号： | 2012020436 |
| 年次： | 2015 |
| IPC分類： | C12P 33/00 |
特許情報キャッシュ
星野 勇介 星野 正美 JP 2015082970 公開特許公報(A) 20150430 2012020436 20120202 高麗人参薬効成分の製造方法 星野科学株式会社 393014682 楠本 高義 100094248 中越 貴宣 100129207 星野 勇介 星野 正美 C12P 33/00 20060101AFI20150403BHJP JPC12P33/00 3 10 ＯＬ 9 4B064 4B064AH07 4B064CA21 4B064CB07 4B064CD22 4B064CD30 4B064DA01 本発明は、薬効に優れた高麗人参薬効成分の製造方法に関する。 古来から、高麗人参エキスは漢方薬として広く使われ、その薬効についても検証が進められている。しかし、高麗人参の一部の主要薬効成分Ｒｂ１は人間が経口摂取しただけでは有効成分が吸収されにくく、摂取された人参エキスの薬効成分が腸内で腸内細菌により分解されることにより吸収されやすいものになるという実験結果が報告されている。つまり、この薬効成分の吸収は腸内細菌頼りということである。 しかし、腸内に存在する細菌は人によって異なり、また、近年高麗人参エキスの成分を分解する細菌をもっていない人も高確率に存在するという調査結果が発表され、これらの人たちは高麗人参を摂取しても効果を得られないのではと懸念されている。 そこで、誰でも有効成分を吸収できるように、有効成分を前もって分解しておけば誰でも吸収できるようになると考えて、細菌で人参を処理し、発酵人参とすることが行われるようになってきた。（例えば、特許文献１、２参照） このような発酵による方法は当然ながら発酵中に菌の育成が必要なため時間がかかり、また、未知の多様な変化も起こる。また、分解の過程で生成する派生化合物には薬効に重要な成分も有り、したがって有効成分の分解が進み低分子化することで、それより高分子側の必要な薬効が失われる懸念がある。さらに発酵による分解が進むにつれて有効成分が低分子化するとともに親水性が失われていく為沈殿が生じやすく、また、工業的な規模の処理においては、付着や吸着などによりこの低分子化した成分が失われる懸念もある。 さらに、図１に示すように、有効成分Ｒｂ１の分解には始めに２つの経路（Ａ１とＢ１）があり、特に薬効の高い成分の一つであるＳ−Ｒｇ３は、はじめの分解でＲｄになるＡ１→Ａ２の経路で生成されるのに対して、はじめの分解でＧｙｐＸＶＩＩになる経路Ｂ１では、その後の段階でＳ−Ｒｇ３が生ずることがない。 吸収改善のためのＲｂ１の分解は、派生化合物に、高麗人参の重要有効成分とされるＳ−Ｒｇ３、Ｓ−Ｒｈ２およびＣｏｍｐｏｕｎｄ Ｋがすべて生成される経路が優先して選択されるように制御されることが望ましい。［特許文献１］特開平３−２７７２４７号公報［特許文献２］特開２００４−４９１５４号公報 本発明は、高麗人参エキスに含まれる有効成分であるＲｂ１をＲｄに変換することで、分解および吸収され易くし、結果としてＳ−Ｒｇ３やＳ−Ｒｈ２およびＣｏｍｐｏｕｎｄ Ｋへの分解生成確率の高い高麗人参薬効成分の製造方法を提供しようとする。 高麗人参エキスは高麗人参を例えばエタノール水溶液などの溶媒に漬けこんで有効成分を溶媒に溶出させて濃縮して得られる。 本発明の目的は、高麗人参エキスに含まれる成分であるＲｂ１をＲｄへと分解する分解ルートで薬効成分へと分解し、ＧｙｐＸＶＩＩへと分解する分解ルートでは分解しない、高麗人参薬効成分の製造方法を提供しようとすることである。 本発明のさらなる目的は、Ｒｂ１をＲｄへと分解し、分解をこの段階にとどめてこれ以上の段階へ分解が進むことのない高麗人参薬効成分の製造方法を提供しようとすることである。 本発明の要旨とするところは、高麗人参エキスを準備する工程、糸状菌、乳酸菌、ビフィズス菌から選択される発酵菌に由来する酵素を該発酵菌から抽出する酵素抽出工程、抽出された前記酵素を前記高麗人参エキスに作用させる酵素作用工程を含む高麗人参薬効成分の製造方法であることにある。 前記発酵菌はトリコデルマ属菌であり得る。 前記高麗人参薬効成分の製造方法においては、前記発酵菌がトリコデルマ属菌以外の糸状菌であり得、前記酵素作用工程が、抽出された前記酵素を、１〜３０重量％濃度のエタノール水溶液に混合された高麗人参エキスに作用させる工程であり得る。 本発明によると、高麗人参エキスに含まれる有効成分であるＲｂ１を短時間でＲｄやＳ−Ｒｇ３やＳ−Ｒｈ２へと分解して効率よくこれらＲｄやＳ−Ｒｇ３やＳ−Ｒｈ２を得ることのできる高麗人参薬効成分の製造方法が提供される。 また、本発明によると、高麗人参エキスに含まれる有効成分であるＲｂ１をＲｄへと分解し、分解をこの段階にとどめてこれ以上の段階へ分解が進むことのない高麗人参薬効成分の製造方法が提供される。Ｒｄリッチのエキスを摂取することにより、腸内で薬効の大きいＳ−Ｒｇ３などを大量に産生することができる。 高麗人参エキスに含まれる成分（プロトキサジオール誘導体）の分解のスキームを示すチャートである。高麗人参エキス標準物質の高速液体クロマトグラフのチャートである。高麗人参エキス標準物質の高速液体クロマトグラフのチャートである。高麗人参エキスの高速液体クロマトグラフのチャートである。高麗人参エキスの酵素処理後の高速液体クロマトグラフのチャートである。高麗人参エキスの酵素処理後の高速液体クロマトグラフのチャートである。高麗人参エキスの酵素処理後の高速液体クロマトグラフのチャートである。高麗人参エキスの酵素処理後の高速液体クロマトグラフのチャートである。高麗人参エキスの酵素処理初期の高速液体クロマトグラフのチャートである。高麗人参エキスの酵素処理後の高速液体クロマトグラフのチャートである。 高麗人参エキスに含まれる成分（プロトキサジオール誘導体）は、図１に示すスキームにより段階的に分解される。図１において、高麗人参エキスに含まれる有効成分Ｒｂ１は、矢印Ａ１→Ａ２→Ａ３→Ａ４の経路でＳ−ＰＰＤへと分解される。あるいは矢印Ｂ１→Ｂ２→Ｂ３→Ｂ４の経路でＳ−ＰＰＤへと分解される。さらに分解経路としてはＦ２を経て矢印Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４から選択される矢印方向を含みＳ−ＰＰＤに至る経路もある。 本願の発明者は、糸状菌、乳酸菌、ビフィズス菌から選択される発酵菌に由来する酵素（以下この酵素を単に酵素とも称する）を用いて高麗人参エキスを処理することによりこの酵素をＲｂ１に作用させてＲｂ１を本願の目的のために分解できることを見出した。すなわち、本願の発明者は、本願に示す方法によればこれら微生物酵素がＡ１を経る経路でＲｂ１を効率よく分解し、Ｂ１を経る経路ではほとんど分解しないことを見出した。 酵素による高麗人参エキスの処理は、発酵による処理に比べて処理時間が短く、かつ、処理液の腐敗のおそれが極めて少ない。また、発酵による処理では図１に示すスキーム以外の反応が起こり、有効成分Ｒｂ１が図１に示す化合物以外の、薬効のない化合物へと分解されてしまうおそれがあり、処理後の処理液は不要な不純物を多く含む。 本発明に用いる酵素は糸状菌、乳酸菌、ビフィズス菌から選択される、Ｒｂ１を分解する酵素を生成する発酵菌を培養した培養液から酵素を抽出することによって得ることができる。これらの発酵菌の培養の培地としては、固形培地、液体培地でその成分が天然物、合成培地、半合成培地その他常用される培地が適宜使用可能である。培養温度や培地のｐＨは、本発明の方法に用いる発酵菌の生育を阻害しない範囲で適宜定めることができる。培養においては、溶存酸素濃度、ｐＨ、栄養成分、水分含量等を適宜制御しながら培養を行うこともできる。 例えば糸状菌については固体培養、液体培養のどちらでもよく、培地としては、炭素源としてグルコース、グリセロール、スターチなどの炭水化物を含有するものと、無機もしくは有機窒素源（例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、カゼインの加水分解物、酵母抽出物、ポリペプトン、バクトトリプトン、ビーフ抽出物等）を含んでいてもよい。 本発明において用いられる乳酸菌は、グルコースを資化して乳酸を生成する乳酸菌であれば特に制限されない。公知の乳酸菌を使用してもよい。培養条件については、使用する乳酸菌によって異なり、一律に規定することはできないが、培養温度としては２０〜４５℃、培養時間については、通常１２〜１２０時間である。液体培養が好ましい。培地としては、従来から用いられているカビ、放線菌、酵母、細菌用培地等を使用できる。 ビフィズス菌についても培地としては、特に制限されるものではなく、通常のビフィズス菌の培養に用いられる液体培地が例示される。例えば、炭素源、窒素源、無機質その他の添加剤としてペプトン、肉エキス、酵母エキス、グルコース、リン酸水素カリウムおよび精製水などからなる液体培地を用いることができる。 これらの発酵菌の培地にはさらに必要に応じて他の栄養源（例えば、無機塩、ビタミン類（例えば、ビタミンＢ１）、抗生物質（例えば、アンピシリン，カナマイシン）など）を添加してもよい。 発酵菌からの酵素の抽出は常法により行うことができる。例えば、固体培養であれば培養物より水、生理食塩水または緩衝液などを用いて抽出を行い、固形分を除いて培養抽出液を得る。液体培養であれば培養された発酵菌を含有する液をろ過しあるいは遠心分離機にかけて上清を集め培養抽出液を得る。抽出液にエタノールを添加して静置して酵素を沈殿させ、沈殿物に揮発性の溶媒を加えて洗浄ろ過する。ろ過した粗酵素沈殿を少量の揮発性の溶媒で洗うようにしてろ紙からシャーレに集め乾燥して酵素を得ることができる。 高麗人参エキスを処理すると、分解により有効成分Ｒｂ１を矢印Ａ１→Ａ２→Ａ３→Ａ４の経路および矢印Ａ１→Ｃ１→Ｃ３→Ａ４およびＡ１→Ｃ１→Ｃ４→Ｂ４の経路でＳ−ＰＰＤへと分解することができる。この場合、Ｒｂ１がすべてＰＰＤに分解されるのではなく、ＲｄあるいはＳ−Ｒｇ３あるいはＳ−Ｒｈ２およびＣｏｍｐｏｕｎｄ Ｋに分解された段階でとどまっているものもある。すなわち、処理液にはＲｄ、Ｓ−Ｒｇ３、Ｓ−Ｒｈ２、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｋが相当量含まれることになる。本発明による酵素処理により、ＲｄとＳ−Ｒｇ３とＳ−Ｒｈ２とＣｏｍｐｏｕｎｄ Ｋを高い比率で含む高麗人参薬効成分の製造方法が提供される。Ｓ−Ｒｇ３とＳ−Ｒｈ２は特に抗腫瘍の薬効が報告されている。 さらに、トリコデルマ属菌由来の酵素により高麗人参エキスを処理すると、有効成分Ｒｂ１を矢印Ａ１の経路でＲｄへと分解し分解がその先すなわち、Ａ２以降には容易には進まないことがわかった。すなわち、本発明による酵素を用いた酵素処理により有効成分Ｒｂ１のほとんどの分解をＲｄへの分解にとどめてＲｄリッチの高麗人参エキスを得ることができる。この場合、トリコデルマ属菌以外の微生物由来の分解酵素を用いた場合には、高麗人参エキスの処理においては、処理液に１〜３０重量％の濃度でエタノールを含有させておくことが必要であることがわかった。処理液におけるエタノールの濃度が３０重量％を超えるとＲｂ１からＲｄへの分解反応が抑制され、Ｒｄの収率が悪い。エタノールの濃度が１重量％を下回るとＲｄ以降の分解が進行し、また、Ｂ１経路の分解反応も進行し、Ｒｄの収率が下がる。 本発明の効果は以下の実験例、実施例で確認される。 酵素−１の調整 糸状菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｇｅｒ ＮＢＲＣ４４１４）を５００ｍｌの振盪用フラスコにＷａｋｓｍａｎ培地７０ｍｌ入れて殺菌したものに植菌し、３０℃で４８時間振盪培養したのち、培養液をろ過したろ過液を集めて、８０％飽和硫酸アンモニウムで酵素を沈殿させ、集めた沈殿物を少量の蒸留水に溶かし、精製水で透析して硫酸アンモニウムを除去し、凍結乾燥して酵素粉末とした。 酵素−２の調整 トリコデルマ属菌（Ｔｒｉｋｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ ＮＢＲＣ５７２０）を５００ｍｌの振盪用フラスコにＷａｋｓｍａｎ培地７０ｍｌ入れて殺菌したものに植菌し、３０℃で４８時間振盪培養したのち、培養液をろ過したろ過液を集めて、８０％飽和硫酸アンモニウムで酵素を沈殿させ、集めた沈殿物を少量の蒸留水に溶かし、精製水で透析して硫酸アンモニウムを除去し、凍結乾燥して酵素粉末とした。 高麗人参エキスの調整 市販紅参を濃度３０重量％のエタノール水溶液に３０℃で２週間浸漬したのち、抽出エタノール液を集めて濃縮し、Ｂｒｉｘ８０の高麗人参エキスを得た。 高麗人参エキスの酵素処理 処理−１ 高麗人参エキス１０ｇを１９０ｃｃの蒸留水に投入し、採取した酵素−１を５０ｍｇ加えよく混合し、５０℃で２４時間静置した。 処理−２（実施例−１） 高麗人参エキス１０ｇを濃度１０重量％のエタノール水溶液１９０ｇに投入し、採取した酵素−１を５０ｍｇ加えてよく混合し５０℃で２４時間静置した。 処理−３（実施例−２） 高麗人参エキス１０ｇを濃度２０重量％のエタノール水溶液１９０ｇに投入し、採取した酵素−１を５０ｍｇ加えてよく混合し５０℃で２４時間静置した。 処理−４ 高麗人参エキス１０ｇを濃度３０重量％のエタノール水溶液１９０ｇに投入し、採取した酵素−１を５０ｍｇ加えてよく混合し５０℃で２４時間静置した。 処理−５（実施例−３）高麗人参エキス１０ｇを１９０ｇの精製水に加えて混合し採取した酵素−２を５０ｍｇ加えてよく混合し５０℃で２４時間静置した。 標準物質及び処理液の高速液体クロマトグラフィのチャートを図２〜図１０に示す。 図２はＲｂ１の標準物質の１００ｐｐｍ濃度のチャートである。 図３はＲｄの標準物質の１００ｐｐｍ濃度のチャートである。 図４は酵素添加無の高麗人参エキスのチャートである。 図５は処理−１における酵素処理終了後の処理液のチャートである。 図６は処理−２における酵素処理終了後の処理液のチャートである。 図７は処理−３における酵素処理終了後の処理液のチャートである。 図８は処理−４における酵素処理終了後の処理液のチャートである。 図９は処理−５における酵素処理初期（酵素添加後約１時間）の処理液のチャートである。 図１０は処理−５における酵素処理終了後の処理液のチャートである。 なお、処理液の測定（図４〜図８）は、処理液を１２．５重量倍に希釈した試料について行った。すなわち、処理のため高麗人参エキスが２０重量倍に希釈され、さらに測定のため１２．５重量倍に希釈され、もとの高麗人参エキスに対しては２５０重量倍に希釈された試料についてＨＰＬＣ測定を行った。 チャート中Ｒｂ１→はＲｂ１のピークをＲｄ→はＲｄのピークを示す。 その他の→は、Ｒｂ１及びＲｄ以外のプロトキサジオール誘導体のピークである。 表１に、各チャートからＲｂ１とＲｄのピークを濃度に換算して数値化した結果を示す。表中の変換率は、減少したＲｂ１がＲｄに変わる比率を表したもので、分子量の減少分も補正した値である。表中、変換率は処理により増加したＲｄ量を処理により減少したＲｂ１量で割った値をモル比率に換算したものである。 処理―１では、Ｒｂ１は分解されて減少したものの、様々な分解生成化合物となり、Ｒｄの増加は僅かで、Ｒｂ１からの変換率は8％と小さい。 処理―２、３では、Ｒｂ１が分解され減少し、Ｒｄ含量が増加しており、Ｒｂ１からのＲｄへの変換率も高くなっている。図６や７にはＲｄ以外のサポニン誘導体のピークがほとんどみられず、アルコール存在下の反応では、Ｒｂ１が分解されてできるサポニン誘導体のうちでＲｄに優先的に分解される比率が処理−１におけるよりも高いことを示している。 処理―４では、処理−２、処理−３に比べ処理によりＲｂ１が分解される度合いが小さい。アルコール濃度が30％を越えると酵素反応が阻害されることを示している。 処理―５では、酵素を添加した約１時間後の図9において、すでにＲｂ１の半分が分解されており、その変換率も、極めて大きい。反応終了図１０において、処理された液はＲｂ１のピークがきわめて小さくなっており、処理−５により、Ｒｂ１のほんどがＲｄに分解されたことが示されまた、処理された液には、処理−１における処理された液のチャートにおけるようなＲｂ１以外及びＲｄ以外のサポニン誘導体のピークが全くと言っていいほどみられない。また変換率が１０５％と、分解されたＲｂ１よりも多いＲｄが検出されており、処理―５では、エキス中に存在するＲｂ１と異なるＲｄより分子量の大きい派生誘導体（例えばマロニル体）が分解されてＲｄで止まっていることが予想される。また、Ｒｄの分解はほとんど無いと考えられる。処理−５は処理−２、処理−３に比べさらにＲｄが生成される度合いが大きい。 実施例−４ 乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）を５００ｍｌのフラスコ中でロゴサ培地で温度３７℃で１２時間静置培養し培養液を得た。培養した培養液をろ過したろ過液を遠心分離して上清を集め、エタノールを添加して静置し、酵素を沈殿させ、沈殿物を洗浄ろ過した。ろ過した粗酵素沈殿を少量のエチルエーテルで洗うようにしてろ紙からシャーレに集め乾燥して酵素を採取した。 高麗人参エキスの酵素処理 処理−６ 実施例１で用いたと同様の高麗人参エキス１０ｇを１９０ｃｃの１０重量％濃度のエタノール水溶液に投入し、３７℃で２４時間静置した。 処理によりＲｂ１がＲｄ、Ｓ−Ｒｇ３、ＳＲｈ２、Ｓ−ＰＰＤに分解されたことを液体クロマトグラフのピークにより確認した。ＧｙｐＸＶＩＩ、ＧｙｐＬＸＸＶ、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｋのピークはほとんど認められなかった。 比較例−１ 実施例１で用いたと同様の高麗人参エキス１０ｇを１９０ｃｃの蒸留水で希釈し、実施例１で用いたと同様の糸状菌を加え５０℃で２４時間静置し培養した。 培養液には、Ｒｄのほかに、Ｓ−Ｒｇ３、ＳＲｈ２、Ｓ−ＰＰＤ、ＧｙｐＸＶＩＩ、ＧｙｐＬＸＸＶ、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｋのピークが認められた。 本発明の高麗人参薬効成分の製造方法はサポニン誘導体からなる生理活性薬の製造に好適に適用できる。高麗人参エキスを準備する工程、糸状菌、乳酸菌、ビフィズス菌から選択される発酵菌に由来する酵素を該発酵菌から抽出する酵素抽出工程、抽出された前記酵素を前記高麗人参エキスに作用させる酵素作用工程を含む高麗人参薬効成分の製造方法。前記発酵菌がトリコデルマ属菌である請求項１に記載の高麗人参薬効成分の製造方法。前記発酵菌がトリコデルマ属菌以外の糸状菌であり、前記酵素作用工程が、抽出された前記酵素を、１〜３０重量％濃度のエタノール水溶液に混合された高麗人参エキスに作用させる工程である請求項１に記載の高麗人参薬効成分の製造方法。 【課題】高麗人参エキスに含まれる成分であるＲｂ１をＲｄへと分解する分解ルートで薬効成分へと分解し、ＧｙｐＸＶＩＩへと分解する分解ルートでは分解しない、高麗人参薬効成分の製造方法を提供しようとする。【課題を解決するための手段】糸状菌、乳酸菌、ビフィズス菌から選択される発酵菌に由来する酵素を該発酵菌から抽出し、抽出された前記酵素を高麗人参エキスに作用させる高麗人参薬効成分製造方法である。【選択図】 図１０