生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公開特許公報(A)_プロテオグリカンの製造方法 |
| 出願番号： | 2011055916 |
| 年次： | 2012 |
| IPC分類： | C07K 1/14 |
特許情報キャッシュ
澤田 重美 JP 2012176925 公開特許公報(A) 20120913 2011055916 20110225 プロテオグリカンの製造方法 澤田 重美 598040020 澤田 重美 C07K 1/14 20060101AFI20120817BHJP JPC07K1/14 6 2 書面 8 4H045 4H045AA20 4H045BA53 4H045CA40 4H045CA50 4H045EA01 4H045EA15 4H045EA20 4H045FA71 4H045GA01 4H045GA10 4H045GA15 本発明は、医薬品原料、医療用品材料、化粧品原料、食品材料、工業用材料等として有用なプロテオグリカンを含有する生物学的試料、例えば魚類、軟体動物、鳥類及び哺乳類の軟骨組織から抽出し、製造する方法に関する。 従来のプロテオグリカンの製造方法には、鮭の鼻軟骨等の生物学的試料から脱脂処理後、プロテオグリカンをイオン交換樹脂に選択的に吸着させて分離精製する方法（特許文献１参照）がある。また、プロテオグリカンの抽出溶媒として酢酸を用いる方法（特許文献２参照）がある。また、プロテオグリカンの抽出溶媒として無機のアルカリ水溶液を用いる方法（特許文献３）がある。 特開２００１−１７２２９６号公報特許３７３１１５０特許４２１９９７４ 本発明は、魚類、軟体動物、鳥類又は哺乳類、特にそれらの廃棄部位から低コストで経口摂取可能なプロテオグリカンを効率的に製造する方法の開発を課題とするものである。 本発明者らは、製薬業界や清涼飲料業界で使用される酸素系殺菌剤を一定濃度で使用することで、原料の殺菌と同時に、糖タンパク質複合体であるプロテオグリカンを効率よく生物学的試料から回収することができることを見出し、下記の各発明を完成した。（１）プロテオグリカンを含有する生物学的試料を酸素系殺菌剤に浸漬する工程、並びに浸漬後の溶液を回収する工程を含む、プロテオグリカンの製造方法。（２）回収した溶液からプロテオグリカンを分離する工程をさらに含む、（１）に記載の製造方法。（３）酸素系殺菌剤が過酢酸製剤の溶液である、（１）又は（２）に記載の製造方法。（４）過酢酸製剤溶液の組成が、過酢酸５×１０−５〜１重量％、過酸化水素５×１０−５〜１重量％、酢酸３×１０−５〜２重量％である（１）〜（３）の製造方法（５）プロテオグリカンを含有する生物学的試料が、魚類、軟体動物、鳥類若しくは哺乳類の軟骨組織、又は皮である、（１）〜（３）の何れかに記載の製造方法。（６）プロテオグリカンを含有する生物学的試料が、魚類の軟骨組織である、（４）に記載の製造方法。 過酢酸は海外、特に北米ではすでに食品添加物に認定されており、野菜・果物や食肉に直接作用され、微生物制御に定期要している事例もある。製造装置、製造環境や容器包装等の殺菌方法については、種々の殺菌方法が存在するが、なかでも過酸化水素や過酢酸製剤等の酸素系殺菌剤を用いる方法は、微生物に対する殺菌効果が非常に強いのが特徴である。特に過酢酸は、芽包菌を含む細菌、真菌（カビ・酵母）及びウイルスに対して幅広い殺菌性を示し、俗説では過酸化水素の１００〜２００倍の殺菌力があると言われている。 プロテオグリカンの製造プロセスは、コア蛋白質の変性を防ぐため、加熱殺菌する工程を入れることができない。このため、抽出原料をいかに無菌の状態にするかが工程の衛生管理の重要なポイントとなってくる。過酢酸を抽出溶媒とすることで、抽出工程が殺菌工程の役割を果たし、なおかつタンパク質を変性させずに効率良くプロテオグリカンを抽出する事が出来るので、通常、加熱殺菌プロセスを入れることのできないプロテオグリカン製造プロセスの衛生管理を容易に維持する事が可能である。なお、抽出溶媒温度は、４〜１５℃程度が望ましい。 一定条件下で過酢酸を用いて生物学的試料から抽出したプロテオグリカンは、精製前から非常に純度の高いプロテオグリカンを得ることが出来る。（図２参照）液体クロマトグラフィ−によるゲル濾過法で分子量分布を分析すると、非常にシャープな単一ピークを得ることが出来る。既に公開されている特許４２１９９７４号のアルカリ抽出法により抽出したプロテオグリカンの分子量分布は、メインピークであるプロテオグリカンの１３０万Ｄａｌｔｏｎ以外に６〜８万Ｄａｌｔｏｎ付近にも５〜１５重量％程度の分子量分布を持つピークが検出されることが確認されている。これはプロテオグリカンの骨格の一部であるコンドロイチン硫酸のピークであり、部分的に分解が生じていることが判る。医薬品の一次原料を目指す場合、一般的に複数の分子量分布を持つことは好ましくないと言われており、過酢酸により抽出したプロテオグリカンは、医薬品一次原料にもなりうる分子量分布と純度を兼ね備えたプロテオグリカンであり、精製プロセスを容易に構築する事が可能である。 過酢酸を抽出溶媒とすることで、抽出工程が殺菌工程の役割を果たし、なおかつタンパク質を変性させずに効率良くプロテオグリカンを抽出する事が出来る。 過酢酸により抽出したプロテオグリカンは、医薬品一次原料にもなりうる単一ビークの分子量分布と純度の高さを兼ね備えており、精製プロセスを容易に構築する事が可能である。 過酢酸製剤、苛性ソーダならびに酢酸を用いたときのウロン酸量（プロテオグリカン量）の回収量の比較を示す図である。過酢酸製剤、苛性ソーダならびに酢酸を用いたときのコンドロイチン硫酸（プロテオグリカン）の純度の比較を示す図である。 以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 −４０℃で冷凍保管したシロサケの頭部から摘出した鼻軟骨を電動のミートチョッパーで細かく破砕しミンチ状にしたものを１００ｇ用意し、出発原料とした。２Ｌの抽出用容器にあらかじめ４℃に冷却しておいた蒸留水７９９．９２ｇを入れ、さらに過酢酸製剤０．０８ｇを投入し、総量８００ｇの過酢酸水溶液を準備した。この抽出用容器に出発原料１００．００ｇを投入し、スターラーを用いて攪拌しながら、２４時間浸漬した。 浸漬終了後、ｈｉｍａｃ ＣＦ７Ｄ２型の遠心分離機を用いて７０００ｒｐｍ、１５分の遠心分離を行い、固形分（ＳＳ分）ならびに油脂分を除去して、プロテオグリカンを含む液相を回収した。 さらに、この液相をフィルターペーパー（アドバンテック社製）を用いて濾過し、日本ミリポア製 Ｂｉｏｍａｘ１００Ｋ膜を用いて濾液の８倍量の蒸留水で、分画と濃縮を同時に行った。 得られた濃縮液を凍結し、真空凍結乾燥した後、乾燥重量を測定した。測定は、乾燥炉（ＹＡＭＡＴＯ ＤＶＳ６０２）により、１０５℃、１６時間乾燥させ、完全に水分を蒸発させた後、残った固形分をデジタル計量器（Ａ＆Ｄ社 ＧＦ−８Ｋ２）で精密に測定した。その結果、１００．００ｇの出発原料から、換算値でその２．２％に相当する２．２ｇの乾燥固形分を得ることができた。 また、ケルダール法により乾燥固形分中の窒素量を定量し、タンパク質量を算出するとともに、ガランボス法によりウロン酸量を定量（図１参照）してプロテオグリカン量を計算した。さらに高速液体クロマトグラフィ装置（日立製作所、カラムＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ４０００ＰＷＸＬ）を用いて、プロテオグリカンの分子量を測定した。 これらの分析の結果、固形分中にタンパク質２５．０％、コンドロイチン硫酸（以下：ＣＳ）７２．２％、脂質０．０５％が存在することが判った。特許文献１によれば、プロテオグリカンのコアタンパク質の重量比はＧＡＧに対して約７．０％と記載されており、従って本発明におけるプロテオグリカンは、ＣＳが７２．２％であることから計算して、純度は約７７．３％（ＣＳ×１．０７）と推定（図２参照）される。またプロテオグリカンの重量平均分子量は約１２９万Ｄａであった。 −４０℃で冷凍保管したシロサケの頭部から摘出した鼻軟骨を電動のミートチョッパーで細かく破砕しミンチ状にしたものをアセトンに浸漬し、鼻軟骨から脱脂及び脱水を行った。処理後の鼻軟骨を減圧乾燥したもの１２．００ｇを出発原料とした。３Ｌの抽出用容器にあらかじめ１０℃に冷却しておいた蒸留水１６７８．３ｇを入れ、さらに液状の過酢酸製剤（三菱ガス化学：ダイヤパワー）１．６８ｇを投入し、総量１６８０ｇ（０．１％）の過酢酸製剤溶液を準備した。この抽出容器に出発原料１２．００ｇを投入し、スターラーを用いて攪拌しながら、４８時間浸漬した。 浸漬終了後、ｈｉｍａｃ ＣＦ７Ｄ２型の遠心分離機を用いて７０００ｒｐｍ、１５分の遠心分離を行い、固形分（ＳＳ分）ならびに油脂分を除去して、プロテオグリカンを含む液相を回収した。 さらに、この液相をフィルターペーパー（アドバンテック社製）を用いて濾過し、日本ミリポア製 Ｂｉｏｍａｘ１００Ｋ膜を用いて濾液の８倍量の蒸留水で、分画と濃縮を同時に行った。 得られた濃縮液を凍結し、真空凍結乾燥した後、乾燥重量を測定した。測定は、乾燥炉（ＹＡＭＡＴＯ ＤＶＳ６０２）により、１０５℃、１６時間乾燥させ、完全に水分を蒸発させた後、残った固形分をデジタル計量器（Ａ＆Ｄ社 ＧＦ−８Ｋ２）で精密に測定した。その結果、１２ｇの出発原料から、換算値でその３２％に相当する３．８４ｇの乾燥固形分を得ることができた。 また、ケルダール法により乾燥固形分中の窒素量を定量し、タンパク質量を算出するとともに、ガランボス法によりウロン酸量を定量してプロテオグリカン量を計算した。 さらに高速液体クロマトグラフィ装置（日立製作所、カラムＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ４０００ＰＷＸＬ）を用いて、プロテオグリカンの分子量を測定した。 これらの分析の結果、固形分中にタンパク質１６．０％、コンドロイチン硫酸（以下：ＣＳ）８３．２％、脂質０．０５％が存在することが判った。特許文献１によれば、プロテオグリカンのコアタンパク質の重量比はＧＡＧに対して約７．０％と記載されており、従って本発明におけるプロテオグリカンは、ＣＳが８３．２％であることから計算して、純度は約８９％と推定される。またプロテオグリカンの重量平均分子量は約１２７万Ｄａであった。 −４０℃で冷凍保管したシロサケの頭部から摘出した鼻軟骨を電動のミートチョッパーで細かく破砕しミンチ状にしたものをアセトンに浸漬し、鼻軟骨から脱脂及び脱水を行った。処理後の鼻軟骨を減圧乾燥したもの１２．００ｇを出発原料とした。３Ｌの抽出用容器にあらかじめ９℃に冷却しておいた蒸留水１６７８．３ｇを入れ、さらに液状の過酢酸製剤（三菱ガス化学：ダイヤパワー）１．６８ｇを投入し、総量１６８０ｇ（０．１％）の過酢酸製剤溶液を準備した。この抽出容器に出発原料１２．００ｇを投入し、スターラーを用いて攪拌しながら、４８時間浸漬した。 浸漬終了後、ｈｉｍａｃ ＣＦ７Ｄ２型の遠心分離機を用いて７０００ｒｐｍ、１５分の遠心分離を行い、固形分（ＳＳ分）ならびに油脂分を除去して、プロテオグリカンを含む液相を回収した。 さらに、この液相をフィルターペーパー（アドバンテック社製）を用いて濾過し、日本ミリポア製 Ｂｉｏｍａｘ１００Ｋ膜を用いて濾液の８倍量の蒸留水で、分画と濃縮を同時に行った。 得られた濃縮液の液量に対し２〜４倍量のエタノールと混合した後、塩析させ沈殿物を減圧乾燥で乾燥させ、乾燥重量を測定した。測定は、乾燥炉（ＹＡＭＡＴＯ ＤＶＳ６０２）により、１０５℃、１６時間乾燥させ、完全に水分を蒸発させた後、残った固形分をデジタル計量器（Ａ＆Ｄ社 ＧＦ−８Ｋ２）で精密に測定した。その結果、１２ｇの出発原料から、換算値でその２５％に相当する３．３６ｇの乾燥固形分を得ることができた。 また、ケルダール法により乾燥固形分中の窒素量を定量し、タンパク質量を算出するとともに、ガランボス法によりウロン酸量を定量してプロテオグリカン量を計算した。 さらに高速液体クロマトグラフィ装置（日立製作所、カラムＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ４０００ＰＷＸＬ）を用いて、プロテオグリカンの分子量を測定した。 これらの分析の結果、固形分中にタンパク質１８．０％、コンドロイチン硫酸（以下：ＣＳ）８１．２％、脂質０．０２％が存在することが判った。特許文献１によれば、プロテオグリカンのコアタンパク質の重量比はＧＡＧに対して約７．０％と記載されており、従って本発明におけるプロテオグリカンは、ＣＳが８１．２％であることから計算して、純度は約８６．９％と推定される。またプロテオグリカンの重量平均分子量は約１２７万Ｄａであった。 国内産鶏ヤゲン軟骨から手作業で肉片を除去した後、電動のミートチョッパーで細かく破砕しミンチ状にしたものをアセトンに浸漬し、鶏ヤゲン軟骨から脱脂及び脱水を行った。処理後の軟骨を減圧乾燥したもの１２．０ｇを出発原料とした。３リットルの抽出用容器にあらかじめ１２℃に冷却しておいた蒸留水１６７８．３ｇを入れ、さらに液状の過酢酸製剤１．１８ｇを投入し、総量１６８０ｇ（０．０７％）の過酢酸水溶液を準備した。この抽出容器に出発原料１２．０ｇを投入し、スターラーを用いて攪拌しながら、２４時間浸漬した。 浸漬終了後、ｈｉｍａｃ ＣＦ７Ｄ２型の遠心分離機を用いて７０００ｒｐｍ、１５分の遠心分離を行い、固形分（ＳＳ分）ならびに油脂分を除去して、プロテオグリカンを含む液相を回収した。 さらに、この液相をフィルターペーパー（アドバンテック社製）を用いて濾過し、日本ミリポア製 Ｂｉｏｍａｘ１００Ｋ膜を用いて濾液の８倍量の蒸留水で、分画と濃縮を同時に行った。 得られた濃縮液の液量に対し２〜４倍量のエタノールと混合した後、塩析させ沈殿物を減圧乾燥で乾燥させ、乾燥重量を測定した。測定は、乾燥炉（ＹＡＭＡＴＯ ＤＶＳ６０２）により、１０５℃、１６時間乾燥させ、完全に水分を蒸発させた後、残った固形分をデジタル計量器（Ａ＆Ｄ社 ＧＦ−８Ｋ２）で精密に測定した。その結果、１２ｇの出発原料から、換算値でその２２．５％に相当する２．７ｇの乾燥固形分を得ることができた。 また、ケルダール法により乾燥固形分中の窒素量を定量し、タンパク質量を算出するとともに、ガランボス法によりウロン酸量を定量してプロテオグリカン量を計算した。 さらに高速液体クロマトグラフィ装置（日立製作所、カラムＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ４０００ＰＷＸＬ）を用いて、プロテオグリカンの分子量を測定した。 これらの分析の結果、固形分中にタンパク質３０．５０％、コンドロイチン硫酸（以下：ＣＳ）５７．８％、脂質０．５％が存在することが判った。特許文献１によれば、プロテオグリカンのコアタンパク質の重量比はＧＡＧに対して約７．０％と記載されており、従って本発明におけるプロテオグリカンは、ＣＳが５７．８％であることから計算して、純度は約６１．８％と推定される。またプロテオグリカンの重量平均分子量は約９２万Ｄａ（１５％）、４６万Ｄａ（７０％）、７万Ｄａ（１５％）の主に３成分から成っていた。 ガンギエイ（カスベ）から手作業で摘出した軟骨を電動のミートチョッパーで細かく破砕しミンチ状にしたものをアセトンに浸漬し、脱脂及び脱水を行った。処理後の軟骨を通風又は減圧乾燥したもの１２．００ｇを出発原料とした。３リットルの抽出用容器にあらかじめ８℃に冷却しておいた蒸留水１６７８．７４ｇを入れ、さらに液状の過酢酸製剤１．５１ｇを投入し、総量１６８０．００ｇ（０．０９％）の過酢酸水溶液を準備した。この抽出容器に出発原料１２．００ｇを投入し、スターラーを用いて攪拌しながら、２４時間浸漬した。 浸漬終了後、ｈｉｍａｃ ＣＦ７Ｄ２型の遠心分離機を用いて７０００ｒｐｍ、１５分の遠心分離を行い、固形分（ＳＳ分）ならびに油脂分を除去して、プロテオグリカンを含む液相を回収した。 さらに、この液相をフィルターペーパー（アドバンテック社製）を用いて濾過し、日本ミリポア製 Ｂｉｏｍａｘ１００Ｋ膜を用いて濾液の８倍量の蒸留水で、分画と濃縮を同時に行った。 得られた濃縮液を真空凍結乾燥した後、乾燥重量を測定した。測定は、乾燥炉（ＹＡＭＡＴＯ ＤＶＳ６０２）により、１０５℃、１６時間乾燥させ、完全に水分を蒸発させた後、残った固形分をデジタル計量器（Ａ＆Ｄ社 ＧＦ−８Ｋ２）で精密に測定した。その結果、１２．０ｇの出発原料から、換算値でその１８．７％に相当する２．２４ｇの乾燥固形分を得ることができた。 また、ケルダール法により乾燥固形分中の窒素量を定量し、タンパク質量を算出するとともに、ガランボス法によりウロン酸量を定量してプロテオグリカン量を計算した。さらに高速液体クロマトグラフィ装置（日立製作所、カラムＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ４０００ＰＷＸＬ）を用いて、プロテオグリカンの分子量を測定した。 これらの分析の結果、固形分中にタンパク質４５．２％、コンドロイチン硫酸（以下：ＣＳ）３８．０％、脂質０．３％が存在することが判った。特許文献１によれば、プロテオグリカンのコアタンパク質の重量比はＧＡＧに対して約７．０％と記載されており、従って本発明におけるプロテオグリカンは、ＣＳが３８．０％であることから計算して、純度は約４０．７％（ＣＳ×１．０７）と推定される。またプロテオグリカンの重量平均分子量は約１５３万Ｄａ（８５％）、７万Ｄａ（１５％）の主に２成分から成っていた。 サメから手作業で摘出した軟骨を電動のミートチョッパーで細かく破砕しミンチ状にしたものをアセトンに浸漬し、脱脂及び脱水を行った。処理後の軟骨を減圧乾燥したもの１２．００ｇを出発原料とした。３リットルの抽出用容器にあらかじめ５℃に冷却しておいた蒸留水１６７８．７４ｇを入れ、さらに液状の過酢酸製剤２．０２ｇを投入し、総量１６８０．００ｇ（０．１５％）の過酢酸水溶液を準備した。この抽出容器に出発原料１２．００ｇを投入し、スターラーを用いて攪拌しながら、４８時間浸漬した。 浸漬終了後、ｈｉｍａｃ ＣＦ７Ｄ２型の遠心分離機を用いて７０００ｒｐｍ、１５分の遠心分離を行い、固形分（ＳＳ分）ならびに油脂分を除去して、プロテオグリカンを含む液相を回収した。 さらに、この液相をフィルターペーパー（アドバンテック社製）を用いて濾過し、日本ミリポア製 Ｂｉｏｍａｘ１００Ｋ膜を用いて濾液の８倍量の蒸留水で、分画と濃縮を同時に行った。 得られた濃縮液を真空凍結乾燥した後、乾燥重量を測定した。測定は、乾燥炉（ＹＡＭＡＴＯ ＤＶＳ６０２）により、１０５℃、１６時間乾燥させ、完全に水分を蒸発させた後、残った固形分をデジタル計量器（Ａ＆Ｄ社 ＧＦ−８Ｋ２）で精密に測定した。その結果、１２．０ｇの出発原料から、換算値でその１３．２％に相当する１．５６ｇの乾燥固形分を得ることができた。 また、ケルダール法により乾燥固形分中の窒素量を定量し、タンパク質量を算出するとともに、ガランボス法によりウロン酸量を定量してプロテオグリカン量を計算した。さらに高速液体クロマトグラフィ装置（日立製作所、カラムＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ４０００ＰＷＸＬ）を用いて、プロテオグリカンの分子量を測定した。 これらの分析の結果、固形分中にタンパク質３９．５％、コンドロイチン硫酸（以下：ＣＳ）３８．７％、脂質０．２％が存在することが判った。特許文献１によれば、プロテオグリカンのコアタンパク質の重量比はＧＡＧに対して約７．０％と記載されており、従って本発明におけるプロテオグリカンは、ＣＳが３８．７％であることから計算して、純度は約４１．４％（ＣＳ×１．０７）と推定される。またプロテオグリカンの重量分子量は約１４５万Ｄａであった。 本発明によれば、殺菌工程と抽出工程を同時に実施でき、しかもプロテオグリカンを変性させずに高純度に抽出することが可能となり、各種の生物学的試料からプロテオグリカンを分離精製することに適用可能である。 プロテオグリカンを含有する生物学的試料を酸素系殺菌剤に浸漬する工程、並びに浸漬後の溶液を回収する工程を含む、プロテオグリカンの製造方法。 回収した溶液からプロテオグリカンを分離する工程をさらに含む、請求項１に記載の製造方法。 酸素系殺菌剤が過酢酸製剤の溶液である、請求項１又は請求項２に記載の製造方法。 過酢酸製剤溶液の組成が、過酢酸５×１０−５〜１重量％、過酸化水素５×１０−５〜１重量％、酢酸３×１０−５〜２重量％である請求項１〜請求項３の製造方法 プロテオグリカンを含有する生物学的試料が、魚類、軟体動物、鳥類若しくは哺乳類の軟骨組織、又は皮である、請求項１〜請求項３の何れかに記載の製造方法。 プロテオグリカンを含有する生物学的試料が、魚類の軟骨組織である、請求項４に記載の製造方法。 【課題】 天然資源からのプロテオグリカンの回収を、効率的かつ安価に行う方法を提供する。【解決手段】プロテオグリカンを含有する生物学的試料から過酢酸等の酸素系殺菌剤を含む水溶液を抽出溶媒としてプロテオグリカンを抽出することを特徴とするプロテオグリカンの製造方法。【選択図】図２