生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公表特許公報(A)_ＦＴＯ（２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼ）活性のアッセイ方法 |
| 出願番号： | 2010512768 |
| 年次： | 2010 |
| IPC分類： | C12Q 1/26,C12N 15/09,A61K 45/00,A61P 3/04,A61P 9/00,A61P 9/12,A61P 3/06,A61P 35/00,A61P 3/10,A61P 11/00,A61P 19/02,A61P 19/06,A61P 19/10,A61P 37/02,A61P 43/00 |
特許情報キャッシュ
アシュクロフト、フランセス、マリー ポンティング、クリストファー、ポール ゲルケン、トーマス スコフィールド、クリストファー、ジョセフ JP 2010530235 公表特許公報(A) 20100909 2010512768 20080620 ＦＴＯ（２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼ）活性のアッセイ方法 アイシス イノベーション リミテッド 507316457 高島 一 100080791 土井 京子 100125070 鎌田 光宜 100136629 田村 弥栄子 100121212 山本 健二 100122688 村田 美由紀 100117743 アシュクロフト、フランセス、マリー ポンティング、クリストファー、ポール ゲルケン、トーマス スコフィールド、クリストファー、ジョセフ GB 0711955.5 20070620 GB 0721944.7 20071108 C12Q 1/26 20060101AFI20100813BHJP C12N 15/09 20060101ALI20100813BHJP A61K 45/00 20060101ALI20100813BHJP A61P 3/04 20060101ALI20100813BHJP A61P 9/00 20060101ALI20100813BHJP A61P 9/12 20060101ALI20100813BHJP A61P 3/06 20060101ALI20100813BHJP A61P 35/00 20060101ALI20100813BHJP A61P 3/10 20060101ALI20100813BHJP A61P 11/00 20060101ALI20100813BHJP A61P 19/02 20060101ALI20100813BHJP A61P 19/06 20060101ALI20100813BHJP A61P 19/10 20060101ALI20100813BHJP A61P 37/02 20060101ALI20100813BHJP A61P 43/00 20060101ALI20100813BHJP JPC12Q1/26C12N15/00 AA61K45/00A61P3/04A61P9/00A61P9/12A61P3/06A61P35/00A61P3/10A61P11/00A61P19/02A61P19/06A61P19/10A61P37/02A61P43/00 111 AP(BW,GH,GM,KE,LS,MW,MZ,NA,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),EP(AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MT,NL,NO,PL,PT,RO,SE,SI,SK,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KM,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PG,PH,PL,PT,RO,RS,RU,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,SV,SY,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC,VN,ZA,ZM,ZW GB2008002119 20080620 WO2008155556 20081224 40 20100217 4B024 4B063 4C084 4B024AA11 4B024BA08 4B024CA04 4B024CA20 4B024DA06 4B024EA04 4B024GA11 4B024GA19 4B024HA03 4B063QA18 4B063QQ22 4B063QQ83 4B063QQ89 4B063QQ93 4B063QR57 4B063QR64 4B063QS38 4B063QS40 4B063QX07 4C084AA17 4C084NA14 4C084ZA36 4C084ZA42 4C084ZA59 4C084ZA70 4C084ZA81 4C084ZA97 4C084ZB07 4C084ZB09 4C084ZB26 4C084ZC31 4C084ZC33 4C084ZC35 本発明は、ＦＴＯタンパク質の活性をモニターするためのアッセイ、特にＦＴＯタンパク質の阻害剤、活性化剤及び基質を同定するためのアッセイに関する。本発明はまた、体重増加、体重減少並びに体重増加及び体重減少に関連する疾患の処置又は予防に関する。発明の背景 肥満は、いくつかの種類の癌、心臓病及び２型糖尿病を含む病気のリスク範囲の増大に関係している。近年、ヒト１６番染色体に位置するＦＴＯ遺伝子の特定のアリルの存在が、肥満及び２型糖尿病に関係していることが報告されている。特に、２型糖尿病の患者は、体重の増加と関係している、特定のＦＴＯバリアント（ｒｓ９９３９６０９ Ａアリル）が増加している可能性があることが見出された（Ｆｒａｙｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７）３１６：８８９−８９４）。３９，０００人を超える個体を含む後の解析は、ＦＴＯアリルが、体重と関連することを明らかにした。２型糖尿病に関連するＦＴＯバリアントを１コピー有する個体は、そのバージョンのコピーを持たない個体に比較して、肥満であるリスクが３０％増加しており、病気に関連したバリアントのコピーを持たない個体よりも、平均して１．２ｋｇを超えて重かった。２コピーのバリアントを有する個体（解析した個体の約１６％）は、肥満であるリスクが７０％増加しており、病気に関連したバリアントのコピーを持たない個体よりも、平均して３ｋｇ重かった。非常に一般的である肥満についてのリスクアリルを同定した先行研究はないことから、この研究は重要である。さらなる研究は、同様の結果を示している（Ｄｉｎａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ（２００７）３９：７２４−７２６；Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７）３１６：１３４１−１３４５）。 ＦＴＯのマウスオーソログであるＦａｔｓｏ（Ｆｔｏ）は、ｆｕｓｅｄ ｔｏｅｓ変異マウスにおいて欠失している遺伝子である（Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｍａｎｎ Ｇｅｎｏｍｅ（２００２）１３：１８６−１８８；ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｏｅｖｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１９９４）１２０：１６０１−２６０７，Ｇｒｏｔｅｗｏｌｄ＆Ｒｕｔｈｅｒ，Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ（２００２）２５１：１２９−１４１；Ａｎｓｅｌｍｅ ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ（２００７）３０４：２０８−２２０）。明確にするために、ＦＴＯに対する後の引用は、ヒトＦＴＯ、非ヒトホモログ及び／又は臨床的に観察される任意の多型を含む。 ＦＴＯ配列の多型は肥満に連関しているが、生化学的、細胞的及び生理的なレベルにおけるそのタンパク質産物の機能については、未だ報告がない。 ＦＴＯと肥満との関係を、体重増加に関連する病気（糖尿病、心臓病、癌、骨粗しょう症及び高血圧（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｔｉｏｎ）など）の処置のために活用可能にするためには、ＦＴＯの構造及びその生化学的、細胞的及び生理的な役割についての知識が必要である。 ２−オキソグルタル酸（２−ＯＧ）及び第一鉄依存性オキシゲナーゼは、ヒドロキシル化、不飽和化及び酸化的閉環反応を含む幅広い範囲の反応を触媒する酵素のスーパーファミリーである（Ｈａｕｓｉｎｇｅｒ（２００４），Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３９，２１−６８；Ｒｙｌｅ＆Ｈａｕｓｉｎｇｅｒ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．６，１９３−２０１；及びＳｃｈｏｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７４，４９−４９）。基質の酸化は、２−ＯＧのコハク酸及び二酸化炭素への変換と共役している。少なくともある場合には、酸素の結合に続く、２−ＯＧの酸化的脱カルボキシル化により、コハク酸、ＣＯ２及び鉄中心における鉄種［Ｆｅ（ＩＶ）＝Ｏ］が生じる。次いで、この高度に反応性の高い中間体は、第一基質中の不活性型のＣ−Ｈ結合を酸化（例えば、ヒトタンパク質のプロリルもしくはアスパラギニル残基の酸化）し得るか、又は、Ｎメチル化型のタンパク質もしくは核酸のメチル基の酸化などの他の酸化反応をもたらし得る。中間体としての証拠は、基質−アナログ研究、モデル化合物及び分光解析から得る。 酸素の結合を引き起こすのに必要な、共基質及び第一基質の連続的結合は、第一基質非存在下において、反応性のある酸化種の生成を制限するのにおそらく重要である。第一基質非共役様式におけるこのような種の生成は、自己酸化を介して２−ＯＧ及び関連するオキシゲナーゼを不活性化し得、時に断片化を導く。典型的には、非共役型の２−ＯＧのターンオーバーは、飽和濃度の第一基質存在下におけるその共役型のターンオーバーの速度のおよそ５％にて起こるが、それより遅い速度又はより速い速度でも起こり得る。 プロコラーゲンプロリルヒドロキシラーゼ、低酸素症誘導因子であるプロリルヒドロキシラーゼ及びアントシアニジンシンセターゼを含む、いくつかの２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼは、十分な触媒活性のために、アスコルビン酸塩を必要とする。アスコルビン酸塩は、Ｆｅ３＋又は他の高価な鉄形態をＦｅ２＋（溶液中に遊離しているか又は活性部位のいずれか）まで還元することによって活性を刺激し得るが、アスコルビン酸塩によるオキシゲナーゼ活性の刺激は、他の機構（例えば、非共役型のサイクルの完了を促進することによって）により起こり得る。第一基質非存在下にてプロコラーゲンプロリルヒドロキシラーゼによって触媒される非共役型の反応サイクルについて、２−ＯＧのコハク酸への酸化は、アスコルビン酸塩と化学量論的に共役していることが示された。さらに、アスコルビン酸塩の活性が、細胞内の２−ＯＧオキシゲナーゼ活性（例えば、低酸素症誘導因子（ＨＩＦ）プロリルヒドロキシラーゼの機能において）を刺激することが示され、ヒト食生活におけるアスコルビン酸塩の欠乏が、低下したプロコラーゲンプロリルヒドロキシラーゼ活性に起因した病気である壊血症を導いている。 いくつかの酵素についての研究が、ある基質アナログ及び変異体もまた、非共役型の２−ＯＧのターンオーバーを刺激し得ることを示している。アスコルビン酸塩そのもの以外の還元剤（アスコルビン酸塩誘導体を含む）が、非共役型のターンオーバー反応における還元剤として機能し得るという文献もまた公知である（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０７（Ｐｔ１），７７−８５及びＭｙｌｌｙｌａ ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８３，４４１−８）。 転写因子ヒドロキシラーゼ（例えば、低酸素症誘導因子プロリル及びアスパラギニルヒドロキシラーゼ、メチル化した核酸デメチラーゼ、メチル化したリシルデメチラーゼ、プロコラーゲンプロリル及びリシルヒドロキシラーゼ、フィタノイル(ｐｈｙｔａｎｏｙｌ）ＣｏＡヒドロキシラーゼ、Ｍｉｎａ５３、ＮＯ６６並びにアルギニルヒドロキシラーゼ（ホスファチジルセリン受容体（Ｊｍｊｄ６））を含む、多くの２−ＯＧオキシゲナーゼが、現在の治療的な興味である。メチルリシルデメチラーゼは、好ましい基質としてメチル化したヒストンを使用してよく、好ましい基質として、全てのトリ、ジ、又はモノがメチル化したリジン残基のうち任意のものを使用してよい。 ヒストンを含む、核酸及び核酸関連酸性タンパク質のメチル化は、エピジェニックな遺伝のための機構であることが公知である。核酸のメチル化もまた、遺伝子の活性及び発現に影響し得る。発明の概要 本発明者らは、２−オキソグルタル酸（２−ＯＧ）依存性オキシゲナーゼとしてＦＴＯを同定し、ＦＴＯが２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼであることを初めて示した。本発明者らは、リコンビナントＦＴＯの精製に成功し、精製したリコンビナントＦＴＯが、２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼとして機能し、かつ公知の２−ＯＧオキシゲナーゼ阻害剤により阻害され得ることを示した。 したがって、本発明は、ＦＴＯ活性をアッセイするための方法を提供し、該方法は、ＦＴＯポリペプチドのオキシゲナーゼ活性をモニターすることを含む。 本発明の方法において、酸素及び／もしくは２−オキソ酸（２−ＯＧなど）が共基質として使用されてよく、並びに／又は、鉄が共因子として使用されてよい。オキシゲナーゼ活性についてのアッセイは、還元剤（アスコルビン酸塩もしくはそのアナログ、チオール又はホスフィンなど）の存在下にて、モニターされてよい。１つの実施態様において、ＦＴＯオキシゲナーゼ活性は、ペプチド又は核酸基質などの基質存在下にて測定される。 本発明の方法において使用されるＦＴＯポリペプチドは、リコンビナントポリペプチドであってよい。１つの実施態様において、ＦＴＯポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも４０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。配列番号１のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも４０％の同一性を有するアミノ酸は、配列番号２から１１のうち任意の１つに示されるアミノ酸配列であってよい。あるいは、配列番号１のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも４０％の同一性を有する酸性配列は、ヒトＦＴＯの天然に生じるバリアント又はヒト以外の種由来のＦＴＯホモログであってよい。 １つの好ましい実施態様において、本発明は、ＦＴＯポリペプチドを試験剤と接触させること；試験剤存在中にてオキシゲナーゼ活性をモニターすること；及び試験剤がＦＴＯ活性の阻害剤又は活性化剤であるかどうかを決定すること、を含む方法を提供する。 試験剤は、ＦＴＯ以外の２−ＯＧオキシゲナーゼの公知の阻害剤、又はこのような阻害剤のアナログもしくはバリアントであってよい。 ＦＴＯ以外の２−ＯＧオキシゲナーゼは、例えば、プロリル、リシル、アルギニル又はアスパラギニルデメチラーゼ、プロコラーゲンプロリルもしくはリシルヒドロキシラーゼ、低酸素症誘導因子プロリルヒドロキシラーゼ、メチル化したリシルデメチラーゼ（ヒストンデメチラーゼを含む）、アスパラギニルヒドロキシラーゼ、ホスファチジルセリン受容体（Ｊｍｊｄ６）、ＡｌｋＢもしくはヒトＡｌｋＢホモログ及び／又はジベレリンＣ−２０オキシダーゼであってよい。公知の２−ＯＧ阻害剤は、Ｎ−オキサリルアミノ酸（Ｎ−オキサリルグリシンもしくはそれらの誘導体など）、グリシンもしくはアラニン誘導体、２−オキソ酸アナログ、フラボノイド又はフラボノイド誘導体（ゲニステインなど）であってよい。 ＦＴＯの阻害剤又は活性化剤を同定するための本発明の方法において、試験剤は、ＦＴＯ活性部位において２−ＯＧもしくはＦＴＯ基質と競合してよく、及び／又はＦＴＯ活性部位において金属と結合してよい。試験剤は、例えば、金属イオンを含んでよい。 １つの実施態様において、試験剤は還元剤であり、還元剤は、ＦＴＯ以外の２−ＯＧオキシゲナーゼの既報の活性化剤であってよい。例えば、試験剤は、アスコルビン酸塩もしくはアスコルビン酸塩アナログ又はチオール（ジチオスレイトールのメンバーなど）もしくはホスフィン化学ファミリーの還元剤であってよい。 本発明の方法において使用したＦＴＯポリペプチドの基質は、核酸、核酸誘導体又はアナログであってよい。例えば、基質は、メチル化した核酸であってよい。メチル化した核酸は、体重調節に関する遺伝子（ａｇｏｕｔｉ遺伝子もしくはニューロペプチドＹ遺伝子、レプチン遺伝子、プロオピオメラノコルチン遺伝子、オレキシン遺伝子、ガラニン遺伝子、ＰＹＹ遺伝子、コレシストキニン遺伝子、グルカゴン関連ペプチド−１遺伝子又はインシュリン遺伝子など）と関連してよい。 １つの実施態様において、本発明は、ＦＴＯの基質を同定する方法を提供し、該方法は、ＦＴＯポリペプチドを試験基質と接触させること；オキシゲナーゼ活性をモニターすること；試験基質がＦＴＯの基質かどうかを決定すること、を含む。試験基質は、ヒト核酸配列（３−メチルチミン塩基、１−メチルアデニン塩基又は３−メチルシトシン塩基を含む核酸配列など）であってよい。あるいは、試験基質は、メチル化したタンパク質又はペプチドであってよい。基質の同定に先だって、ＦＴＯと基質との間の相互作用を安定化させることによって、ＦＴＯ基質の同定を可能にするために、ＦＴＯ阻害剤が使用されてよい。 １つの局面において、本発明は、ＦＴＯを選択的に阻害もしくは活性化する、又はＦＴＯ以外の酵素を活性化もしくは阻害するが、ＦＴＯを活性化もしくは阻害しないような、阻害剤又は活性化剤を同定する方法を提供し、該方法は、試験剤の存在中にてＦＴＯ活性をモニターすること、及びＦＴＯ以外の酵素を使用する方法を繰り返すこと、及び試験剤がＦＴＯ又は他の酵素を選択的に阻害又は活性化するかどうかを決定することを含む。 本発明の１つの実施態様において、ＦＴＯ以外の酵素は、典型的には２−ＯＧオキシゲナーゼ（プロリル、アスパラギニルもしくはリシルヒドロキシラーゼなどの低酸素症誘導因子ヒドロキシラーゼ、コラーゲンもしくはプロコラーゲンプロリルヒドロキシラーゼ、ＡｌｋＢホモログなどの核酸デメチラーゼ、又はトリ、ジもしくはモノメチルリジン、アルギニン、アスパラギンもしくはプロリン残基デメチラーゼなどのタンパク質デメチラーゼ)である。タンパク質デメチラーゼは、メチル化したヒストン又はそれらの断片をヒドロキシル化してよい。 さらなる実施態様において、本発明は、以下を提供する：−ＦＴＯ活性を調節するための、２−ＯＧオキシゲナーゼ活性の阻害剤又は活性化剤の使用；−体重増加もしくは体重減少を処置もしくは予防する方法、又は体重増加もしくは体重減少に関連する病気を処置もしくは予防する方法における使用のための、ＦＴＯオキシゲナーゼ活性の調節剤；−体重増加又は体重減少を処置又は予防することを必要とする個体における体重増加又は体重減少を処置又は予防する方法であって、該方法が、ＦＴＯオキシゲナーゼ活性の阻害剤又は活性化剤の治療上有効量を個体に投与することを含む方法；及び−体重増加又は体重減少を処置又は予防することを必要とする個体における体重増加又は体重減少に関連する病気を処置又は予防する方法であって、該方法が、ＦＴＯオキシゲナーゼ活性の阻害剤又は活性化剤の治療上有効量を個体に投与することを含む方法。図１は、ＦＴＯホモログ配列のｃｌｕｓｔａｌＷアライメントを示す。ヒト ｇｉ｜１２２９３７２６３、チンパンジー ｇｉ｜１１４６６２５２４（＊９９％）、マカク ｇｉ｜１０９１２８５２５（＊９３％）、イヌ ｇｉ｜７３９５０３８４（＊９１％）、ウシ ｇｉ｜１１９９１０１０９（＊８８％）、フクロネズミ ｇｉ｜１２６２９６３３６（＊６５％）、マウス ｇｉ｜１８４９００９７（＊８７％）、マウス２ ｇｉ｜６７５３９１６（＊８７％）、ラット ｇｉ｜８９３３７２６０（＊８７％）、サカナ ｇｉ｜１２５８２１７９６（＊４８％）、カエル ｇｉ｜６２８５９６７１（＊５２％）［＊は、ヒトＦＴＯとの同一性を示す］。図１は、ＦＴＯホモログ配列のｃｌｕｓｔａｌＷアライメントを示す。ヒト ｇｉ｜１２２９３７２６３、チンパンジー ｇｉ｜１１４６６２５２４（＊９９％）、マカク ｇｉ｜１０９１２８５２５（＊９３％）、イヌ ｇｉ｜７３９５０３８４（＊９１％）、ウシ ｇｉ｜１１９９１０１０９（＊８８％）、フクロネズミ ｇｉ｜１２６２９６３３６（＊６５％）、マウス ｇｉ｜１８４９００９７（＊８７％）、マウス２ ｇｉ｜６７５３９１６（＊８７％）、ラット ｇｉ｜８９３３７２６０（＊８７％）、サカナ ｇｉ｜１２５８２１７９６（＊４８％）、カエル ｇｉ｜６２８５９６７１（＊５２％）［＊は、ヒトＦＴＯとの同一性を示す］。図２は、ＡＢＨ３（図５）との、その配列及び２次構造アライメントに基づくＦＴＯのホモロジーモデルである。図３は、ＦＴＯ及びＡＢＨ３についての、配列及び２次構造アライメント（ＦＴＯについて予測した２次構造）を示す。ローマ数字は、８つのコアＤＳＢＨ鎖を示す。ＤＳＢＨドメインに続いてＣ末端へリックスドメインがある。図４は、ＦＴＯの酵素活性を決定するための２−ＯＧターンオーバーアッセイの結果を示す。１１．５μＭ ＦＴＯ、１４４μＭ ２０Ｇ、１６μＭ １４Ｃ−２０Ｇ、８０μＭ （ＮＨ４）２Ｆｅ（ＩＩ）（ＳＯ４）２、４μＭ アスコルビン酸塩及び１ｍＭ ＤＴＴ、並びに（ＮＨ４）２Ｆｅ（ＩＩ）（ＳＯ４）２、アスコルビン酸塩及びＤＴＴのうち１つがアッセイから欠如しているものを使用して、アッセイを行った。アッセイはまた、Ｎ−オキサリルグリシン（ＮＯＧ）の存在下にても、行った。図５は、リコンビナントＦＴＯを有する、オリゴヌクレオチドの脱メチル化についての質量分析（ＭＳ）解析の結果を示す。示したデータは、ＴＴＸ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ（Ｔ＝チミン、Ｘ−メチル化した塩基）について４つの荷電状態についてである。＋ＦＴＯ＝ＦＴＯと、適切な共因子及び共基質とともにインキュベーション。３ＭｅＴ＝３−メチルチミン；１ＭｅＡ＝１−メチルアデニン；３ＭｅＣ＝３−メチルシトシン。図６は、ＦＴＯの２−ＯＧ依存性ＤＮＡデメチラーゼ活性を試験した実験結果を示す：（ａ）１−ｍｅＡの脱メチル化は、２−ＯＧ脱カルボキシル化アッセイにおいてＦＴＯに依存する；（ｂ）３−ｍｅＴ基質に対するＦＴＯ活性の共因子／共基質依存性をＬＣ−ＭＳにて示す。示したデータは、ｓｓ−ＤＮＡにおける３−ｍｅＴに対するチミンの比率を表す。酸素コントロール反応は、＜１％ Ｏ２雰囲気下にて行った；（ｃ）ＦＴＯにより触媒される１−ｍｅＡの阻害。図７は、ＦＴＯによる一本鎖ＤＮＡ基質の脱メチル化についての質量分析解析の結果を示す。ＦＴＯ、共因子及び共基質とともに５’−ＴＴ（メチル化した塩基）ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’の形態の合成１５ｍｅｒオリゴヌクレオチドのインキュベーションについてのＬＣ−ＭＳデータ；脱メチル化した基質についての予測されたピーク位置を点線で示す。反応物のピークよりも大きな質量にあるより小さなピークは、メチル化したオリゴヌクレオチドのＮａ＋及びＫ＋付加物からおそらく生じている。ｍ／ｚ＝質量対荷電比、ダルトン単位で示す；（ｂ）ＦＴＯ反応の化学量論；（ｃ）メチル化したポリ（ｄＡ）及びポリ（ｄＴ）からのホルムアルデヒドの放出。ＦＴＯ及びＡＢＨ３について、［１４Ｃ］でメチル化したポリ（ｄＡ）又は［１４Ｃ］でメチル化したポリ（ｄＴ）（全ｃ．ｐ．ｍ．は各々１０００又は８００）とともに３７℃にて１５分間インキューベーションすることによるデメチラーゼ活性を、アッセイした。エタノール可溶性［１４Ｃ］−ホルムアルデヒドの放出をモニターした。ＦＴＯ−○−、−●−；ＡＢＨ３−△−、−▲−；［１４Ｃ］でメチル化したポリ（ｄＡ）−○−、−△−；［１４Ｃ］でメチル化したポリ（ｄＴ）−●−、−▲−。２−ＯＧなしでは、有意な活性は検出されなかった。図７は、ＦＴＯによる一本鎖ＤＮＡ基質の脱メチル化についての質量分析解析の結果を示す。ＦＴＯ、共因子及び共基質とともに５’−ＴＴ（メチル化した塩基）ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’の形態の合成１５ｍｅｒオリゴヌクレオチドのインキュベーションについてのＬＣ−ＭＳデータ；脱メチル化した基質についての予測されたピーク位置を点線で示す。反応物のピークよりも大きな質量にあるより小さなピークは、メチル化したオリゴヌクレオチドのＮａ＋及びＫ＋付加物からおそらく生じている。ｍ／ｚ＝質量対荷電比、ダルトン単位で示す；（ｂ）ＦＴＯ反応の化学量論；（ｃ）メチル化したポリ（ｄＡ）及びポリ（ｄＴ）からのホルムアルデヒドの放出。ＦＴＯ及びＡＢＨ３について、［１４Ｃ］でメチル化したポリ（ｄＡ）又は［１４Ｃ］でメチル化したポリ（ｄＴ）（全ｃ．ｐ．ｍ．は各々１０００又は８００）とともに３７℃にて１５分間インキューベーションすることによるデメチラーゼ活性を、アッセイした。エタノール可溶性［１４Ｃ］−ホルムアルデヒドの放出をモニターした。ＦＴＯ−○−、−●−；ＡＢＨ３−△−、−▲−；［１４Ｃ］でメチル化したポリ（ｄＡ）−○−、−△−；［１４Ｃ］でメチル化したポリ（ｄＴ）−●−、−▲−。２−ＯＧなしでは、有意な活性は検出されなかった。図８は、非共役型の２−ＯＧターンオーバー実験の結果を示す：（ａ）アッセイは、２−ＯＧターンオーバー法を使用した；メチル化したＤＮＡ基質を添加しなかった。実験の準備及び手順は実施例に説明するとおりである。示した値は、２つの独立した実験の平均値であり、１００％は、［１４Ｃ］−ＣＯ２の１３０，０００カウントに相当する；（ｂ）阻害剤存在中における非共役型の２−ＯＧターンオーバーの減少。ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド。Ｎ−オキサリルグリシンはＦｅ（ＩＩ）をキレートし得るが、Ｎ−オキサリル−Ｄ−フェニルアラニン（１０）（２−ＯＧ依存性アスパラギン−ヒドロキシラーゼの阻害剤）は、Ｎ−オキサリルグリシンと同様にＦｅ（ＩＩ）キレート活性を有するがＦＴＯ活性は阻害しないことから、そのＦＴＯ阻害効果については十分に説明されない。示した値は、２つの独立した実験の平均値であり、１００％は、［１４Ｃ］−ＣＯ２の１３０，０００カウントに相当する；（ｃ）使用した阻害剤の構造。化合物１は、潜在的な２−ＯＧオキシゲナーゼ阻害剤として先に同定されており、Ｆｒａｎｋｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３５３：３３３、並びに標準的な合成方法論を使用して合成されている（Ｂａｎｅｒｊｉ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍ．４３：５４３８）。配列の簡単な説明 配列番号１は、ヒトＦＴＯのアミノ酸配列である（ｇｉ｜１２２９３７２６３）。 配列番号２は、ヒトＦＴＯと９９％配列同一性を有するチンパンジーＦＴＯのアミノ酸配列である（ｇｉ｜１１４６６２５２４）。 配列番号３は、ヒトＦＴＯと９３％配列同一性を有するマカクＦＴＯのアミノ酸配列である（ｇｉ｜１０９１２８５２５）。 配列番号４は、ヒトＦＴＯと９１％配列同一性を有するイヌＦＴＯのアミノ酸配列である（ｇｉ｜７３９５０３８４）。 配列番号５は、ヒトＦＴＯと８８％配列同一性を有するウシＦＴＯのアミノ酸配列である（ｇｉ｜１１９９１０１０９）。 配列番号６は、ヒトＦＴＯと６５％配列同一性を有するフクロネズミＦＴＯのアミノ酸配列である（ｇｉ｜１２６２９６３３６）。 配列番号７は、ヒトＦＴＯと８７％配列同一性を有するマウスＦＴＯのアミノ酸配列である（ｇｉ｜１８４９００９７）。 配列番号８は、ヒトＦＴＯと８７％配列同一性を有するマウスＦＴＯのアミノ酸配列である（ｇｉ｜６７５３９１６）。 配列番号９は、ヒトＦＴＯと８７％配列同一性を有するラットＦＴＯのアミノ酸配列である（ｇｉ｜８９３３７２６０）。 配列番号１０は、ヒトＦＴＯと４８％配列同一性を有するサカナＦＴＯのアミノ酸配列である（ｇｉ｜１２５８２１７９６）。 配列番号１１は、ヒトＦＴＯと５２％配列同一性を有するカエルＦＴＯのアミノ酸配列である（ｇｉ｜６２８５９６７１）。 配列番号１２は、ヒトＡＢＨ３のアミノ酸配列である（ｇｉ｜２１０４０２７５）。発明の詳細な説明 本発明者らは、リコンビナントＦＴＯを精製し、２−オキソグルタル酸（２−ＯＧ）依存性オキシゲナーゼとしてＦＴＯを同定した。したがって、本発明は、ＦＴＯ活性のアッセイ方法を提供し、該方法は、ＦＴＯポリペプチドのオキシゲナーゼ活性をモニターすることを含む。本発明はまた、ＦＴＯオキシゲナーゼ活性の調節剤及びＦＴＯによって酸化される基質を同定するためのアッセイ法におけるＦＴＯポリペプチドの使用も提供する。 本発明者らは、ＦＴＯが、ヒトＤＮＡデメチラーゼ、ＡＢＨ３（１−メチルアデニン及び３−メチルシトシン核酸塩基に対するデメチラーゼとして公知の活性を有する）と特に高い配列類似性を有するＦｅ（ＩＩ）及び２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼのホモログであることを見出した。本発明における使用のためのＦＴＯポリペプチドは、典型的にＦｅ２＋に結合する。それゆえ、本発明の１つの局面において、ＦＴＯ活性のアッセイ方法における共因子として、鉄が使用される。 本発明にしたがう使用のためのＦＴＯポリペプチドは、典型的に２−ＯＧ及び酸素をコハク酸及び二酸化炭素へと変換する能力を有している。したがって、本発明の１つの局面において、ＦＴＯ活性のアッセイ方法は、共基質として酸素及び／又は２−ＯＧを使用する。 ＦＴＯポリペプチドは、配列番号１に示した配列、又は２本鎖ベータへリックス（ＤＳＢＨ）ドメインにおいて配列番号１と少なくとも４０％配列同一性を有するアミノ酸配列（例えば、少なくとも４５％配列同一性）、又は配列番号１のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも約４０％（例えば、少なくとも約５０％又は約６０％）、典型的には７０％又は８０％を超えるか、より典型的には約９０％又は９５％（約９９％など）を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでよい。 配列同一性は、任意の適切なアルゴリズムを使用して計算されてよい。例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、ホモロジーを推測するために使用され得るＢＥＳＴＦＩＴプログラム（例えば、その初期設定にて使用される）を提供する（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２，ｐ３８７−３９５）。ＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ホモロジーを推測したり、又は配列を並べるのに使用され得（典型的に、それらの初期設定において）、例えば、Ｌａｔｃｈｅｄ（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ ３６：２９０−３００又はＬａｔｃｈｅｄ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０に説明されている。 ＦＴＯポリペプチドは、任意の天然に生ずるＦＴＯ遺伝子によってコードされるポリペプチドであってよい。天然に生ずるＦＴＯ遺伝子は、配列番号１にて示された配列を含んでよく、又は配列番号１のバリアントであってよい。このようなバリアントは、ポリペプチドが２−ＯＧオキシゲナーゼ活性を保持する限り、アリルバリアント、及びタンパク質配列内の単一アミノ酸又はアミノ酸群の欠失、修飾又は付加を含んでよい。ポリペプチドはまた、特にポリペプチドの活性が細胞を基準としたアッセイを使用してモニターされる場合には、好ましくは核局在シグナルも有する。核局在シグナルは、ＦＴＯの核局在シグナル配列又は他のペプチド由来の核局在シグナル配列であってよい。 ＦＴＯポリペプチドは、非ヒト種由来のＦＴＯホモログ（ＦＴＯの、チンパンジー（配列番号２）、マカク（配列番号３）、イヌ（配列番号４）、ウシ（配列番号５）、フクロネズミ（配列番号６）、マウス（配列番号７又は８）、ラット（配列番号９）、サカナ（配列番号１０）、カエルホモログ（配列番号１１）、又は他の生物（緑藻類など）由来のホモログであってよい。ＦＴＯホモログは、天然に生ずるタンパク質であってよい。ＦＴＯポリペプチドは、自然には起こらないが、天然に生ずるＦＴＯ配列に比較すると単一アミノ酸又はアミノ酸群の欠失、修飾又は付加を含むようなアミノ酸配列を有してよい。例えば、ＦＴＯポリペプチドは、配列番号１から１１の任意の１つと、少なくとも約４０％（少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％など）配列同一性を有してよい。 配列番号１から１１の任意の１つのアミノ酸置換は、例えば、約１、２又は３個から約１０、２０又は３０個まで置換されてよい。保存的な置換は、例えば、以下の表にしたがってなされてよい。同一ブロック中の第２カラムのアミノ酸、及び好ましくは同一ライン中の第３カラムのアミノ酸は、互いに置換されてよい。 本発明の視野内にあるバリアントポリペプチドは、任意の適切な方法、例えば、遺伝子シャッフリング技術によって生成されてよい。 本発明はまた、本発明のポリペプチドの活性部分、断片、誘導体及び機能的な模倣体の使用も含む。ポリペプチドの「活性部分」とは、該全長ポリペプチドよりは短いが、２−ＯＧオキシゲナーゼ活性を保持しているペプチドを意味する。ＦＴＯの活性断片は、以下により詳細に説明する２−ＯＧオキシゲナーゼ活性についてモニターすることによって、典型的に同定されてよい。このような活性断片は、融合タンパク質の一部（例えば、異なるもの（すなわちヘテロなリガンド）に対する結合部分を含む）として、含まれてよい。 断片は、少なくとも約５０アミノ酸又は約６０、７０、８０、１００、１５０、２００、４００もしくは５００アミノ酸までを有してよい。排他的ではないが、特に、本発明のこの局面は、タンパク質が完全なＦＴＯタンパク質配列の断片である状況を包含しており、２−ＯＧをコハク酸及び二酸化炭素に変換することができる触媒領域を表してよい。ヒト、チンパンジー、マカク、イヌ、ウシ、フクロネズミ、マウス、ラット、サカナ及びカエルのＦＴＯ触媒コアは、配列番号１から１１に示される。１つの実施態様において、断片は、触媒コアと、触媒コアのＮ末端に隣接して存在するヌクレオチド認識位とを含んでよい。 断片は、配列番号１に示すアミノ酸配列の約アミノ酸１から約５０５までの任意の領域（アミノ酸２、３、４、５又は１０からアミノ酸４９５、５００、５０１、５０２、５０３又は５０４までなど）を含んでよい。有用な断片は、Ｎ末端が切断された断片（すなわち、配列番号１に示すアミノ酸配列の残基３０から５０５又は６０から５０５を含む断片などのＮ末端欠失を含む断片）、及びＮ末端及びＣ末端切断の両方を含む断片（配列番号１に示すアミノ酸配列の残基３０から３３又は６０から３３０を含む断片など）を含む。他の適切な断片は、例えば、ＦＴＯアミノ酸配列と、１以上の公知の２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼのアミノ酸配列とを比較し、どの領域が触媒活性を有する領域と相同でないかを同定することによって、容易に同定され得る。触媒活性を有する領域は、典型的には活性断片中に含まれる。このような断片は、キメラ分子を構築するために使用され得る。 配列番号１におけるアミノ酸配列カラムに対して、少なくとも約６０％（少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％など）の配列同一性を有する任意のＦＴＯポリペプチド断片（例えば、配列番号２から１１のうち任意の１つの断片を含む、上に記載した、任意の天然に生ずる又は遺伝的に操作した配列の断片）であって、オキシゲナーゼ活性を有する該断片もまた、本発明のアッセイにおいて使用されてもよく、本明細書中にて使用する用語「ＦＴＯポリペプチド」に包含される。 ＦＴＯポリペプチドは、合成的に作製されてよい。ポリペプチドは、化学的又は生化学的に修飾（例えば、翻訳後修飾）されてよい。例えば、グリコシル化されてよく、修飾されたアミノ酸残基を含んでよい。ポリペプチドはまた、精製を補助するための、ヒスチジン残基（典型的に６個）、もしくは他の配列タグ（マルトース結合タンパク質タグ又はインテイン（ｉｎｔｅｉｎ）タグなど）の付加，又は核もしくはミトコンドリアへの移行を促進するための核局在配列の付加、及びもしくはヒドロキシル化もしくはリン酸化を含む翻訳後修飾によって修飾されてもよい。本発明のポリペプチドは、ＧＳＴ又は他の適切な融合ポリペプチドであってよい。ＦＴＯポリペプチドはまた、細胞又はオルガネラ内部において可視化するために、又はタンパク質もしくはＦＴＯを発現している細胞の精製を助けるために、蛍光タグ（グリーン蛍光タンパク質など）の付加によって修飾されてもよい。このような修飾されたポリペプチドは、用語「ＦＴＯポリペプチド」の範囲内にある。 本発明のポリペプチドは、部分的に精製した形態又は実質的に単離した形態にて存在してよい。ポリペプチドの意図された使用を妨害せずに、実質的に単離されたと見なされる場合には、ポリペプチドは担体又は希釈剤と混合されてよい。ポリペプチドはまた、実質的に精製した形態であってもよく、この場合には、一般に、タンパク質、ポリヌクレオチド、細胞又は調製物の乾燥重量の、少なくとも約９０％、例えば、少なくとも約９５％、９８％又は９９％を含むであろう。 本発明のポリペプチドは、２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼ活性のアッセイにおいて、例えば、調節剤（ヒドロキシラーゼ活性の阻害剤又は活性化剤など）を同定するために、使用されてよい。阻害剤は、選択的な阻害剤又は活性化剤であってよい。 ＦＴＯポリペプチドは、第一基質（すなわち、２−ＯＧ基質でない）非存在下にて、２−ＯＧオキシゲナーゼ活性のアッセイにおいて使用されてよい。ＦＴＯポリペプチドはまた、１以上の適切な基質存在中にてオキシゲナーゼ活性を決定するために使用されてよい。さらに、本発明は、ＦＴＯ基質の同定方法を提供する。 本発明の方法にて使用するＦＴＯは、リコンビナントＦＴＯ又は天然に生ずるＦＴＯであってよい。好ましくは、リコンビナントＦＴＯは、大量のタンパク質（＞１ｍｇ）を必要とする目的のためにＦＴＯが必要とされる場合（生物物理学的アッセイ又はハイスループット解析など）に特に使用される。リコンビナントＦＴＯは、ＦＴＯをコードするヌクレオチド配列を含む標準的な発現ベクターを使用して生成されてよい。このような発現ベクターは、分子生物学分野において日常的に構築されており、例えば、プラスミドＤＮＡ並びに適切なイニシエーター、プロモーター、エンハンサー及び他のエレメント（例えば、必要であれば、ポリアデニル化シグナルなど）の使用を含んでよく、タンパク質発現を可能にするために、これらは正しい方向に配置される。他の適切なベクターは、当業者には明らかであろう。この件に関するさらなる例としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．１９８９を引用する。 本発明の方法は、本明細書中において定義したＦＴＯポリペプチドを発現するために改変された細胞を利用してよい。ＦＴＯはまた、細胞抽出物又は部分的にもしくは実質的に精製した形態において、存在してもよい。精製したＦＴＯを得る方法 本発明者らは、改変した発現及び精製法を使用して、リコンビナントＦＴＯを可溶かつ活性のある形態にて発現させることが可能であることを見出した。本発明者らはまた、精製したリコンビナントＦＴＯが２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼであることも示した。したがって、本発明は、精製したＦＴＯを得る方法及び精製したＦＴＯのオキシゲナーゼ活性をアッセイする方法を提供する。 精製したＦＴＯポリペプチドは、ＦＴＯポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、宿主細胞に導入することによって得られてよい。 発現ベクターは、当該分野にて日常的に構築されており、例えば、プラスミドＤＮＡ並びに適切なイニシエーター、プロモーター、エンハンサー及び他のエレメント（例えば、必要であれば、ポリアデニル化シグナルなど）の使用を含んでよく、タンパク質の十分な発現を可能にするために、これらは正しい方向に配置される。適切なベクターは、当業者には非常に容易に明らかであろう。プロモーター配列は、選択したアッセイフォーマットに依存して、誘導可能なプロモーター又は構成プロモーターであってよい。プロモーターは、組織特異的であってよい。したがって、ベクター中のコード配列は、コード配列の発現を提供するように、該エレメントに機能的に連結される（典型的には細胞内）。用語「機能的に連結される」は、説明した構成要素が、意図された様式にて機能することを可能にするような関係にあるように、並べることを指す。 ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス又はバキュロウイルスベクターであってよい。ベクターは、典型的には細菌細胞（Ｅ．ｃｏｌｉなど）において使用されるように適合される。ベクターは、複製開始点を有していてよい。ベクターは、１以上の選択マーカー遺伝子（例えば、細菌プラスミドの場合には、アンピシリン耐性遺伝子、又は真菌ベクターについては耐性遺伝子）を含んでよい。ベクターは、宿主細胞（例えば、細菌宿主細胞、真菌宿主細胞、昆虫宿主細胞、哺乳類（例えば、ヒト宿主細胞）又はバキュロウイルス宿主細胞）を形質導入又は形質転換するために使用されてよい。細菌宿主細胞は、好ましくはＥ．ｃｏｌｉ株（例えば、ＢＬ２１（ＤＥ３））である。 精製したＦＴＯポリペプチドの作製方法が本発明によって提供される。該方法は典型的にはＦＴＯポリペプチドをコードする発現ベクターを含む宿主細胞を培養すること、及び細胞からＦＴＯポリペプチドを単離することを含む。宿主細胞は、典型的には、例えば、約１５℃から約３７℃の温度にて培養されてよい。ポリペプチドは、細胞を溶解すること、及び溶解緩衝液からタンパク質を抽出することによって、単離されてよい。溶解緩衝液は典型的には、約２５０ｍＭから約７００ｍＭの塩（例えばＮａＣｌ）（約４００ｍＭから約６００ｍＭなど、例えば、５００ｍＭ）を含む。本発明にしたがうＦＴＯポリペプチドの作製方法は、本発明にしたがうポリヌクレオチド又はベクターを、宿主細胞に導入することをさらに含んでよい。ＦＴＯポリペプチドは、細胞培養物を溶解して得られる可溶性画分中に含まれる。ポリペプチドは、例えばアフィニティー精製（切断された２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼに融合したアフィニティータグを介してなど）によって、可溶性画分からさらに精製されてよい。 宿主細胞にポリペプチド及びベクターを導入する方法は当該分野において周知であり、制限なしに、エレクトロポレーション及び熱ショック技術を含む。次いで、切断されたポリペプチドの発現は、適切な温度にて宿主細胞を培養することによって得られてよい。リコンビナントＦＴＯを発現する細胞は、リコンビナントＦＴＯの発現を誘導するために、好ましくは約１５℃と約３０℃の間（例えば、約２０℃又は約２８℃）に維持される。宿主細胞が細菌（Ｅ．ｃｏｌｉなど）の場合には、細胞は、２ＴＹ培地において培養されてよい。インキュベーションの時間（もしくは増殖時間）をとおして、又はインキュベーション時間の最後の段階のいずれかにおいて、ＩＰＴＧが培養培地に添加されてよい。 高い塩含量を含む溶解緩衝液は、典型的には、細胞培養培地を除去するために細胞を遠心分離した後に、細胞を溶解するために使用される。緩衝液は典型的には、約２５０ｍｍｏｌの塩（例えばＮａＣｌ）から約７００ｍｍｏｌの塩（例えば、約４００から約６００ｍｍｏｌ ＮａＣｌ（約５００ｍｍｏｌ ＮａＣｌなど））を含む。抽出緩衝液は、界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及び／もしくはＳＤＳ（典型的に１％）、並びに／又はリゾチームなど）を含んでよい。グリセロールは、典型的に約５％から約２０％（約１０％など）の濃度にて、溶解緩衝液中に存在してよい。溶解緩衝液は典型的に、約７．５を超えるｐＨ（例えば、約７．６から約８．１、約７．８から約８．０、より好ましくは約７．９）を有している。溶解緩衝液は、細胞の超音波処理に適切であってよい。トリスは溶解緩衝液中に、例えば、約１０ｍｍｏｌから約１００ｍｍｏｌ（約２０ｍｍｏｌなど）の濃度にて存在してよい。 溶解後、細胞は遠心分離されて良い。遠心分離後、上清は可溶性画分を表す。可溶性画分に存在するタンパク質濃度は、使用した抽出緩衝液の量に依存する。ＦＴＯは、精製されるに十分な量にて、可溶性画分中に存在する。これは、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって決定され得る。ＳＤＳ ＰＡＧＥによって切断された酵素を検出することが可能であれば、精製のために十分な酵素が存在しているということである。 本発明のＦＴＯポリペプチドは、当該分野にて公知の標準的な技術によって精製されてよい。例えば、ポリペプチドがＨｉｓタグを含む場合には、製造業者の指示書（例えば、Ｎｏｖａｇｅｎ）にしたがってｈｉｓ結合樹脂を使用して、又はイオン交換クロマトグラフィーなどの他の手段によって、精製してよい。精製手順は、以下の工程を含んでよい。本発明のリコンビナントポリペプチドを発現する細胞をペレットにして、適切な緩衝液中に再懸濁し、次いで細胞を破壊するために超音波処理してよい。細胞の破片は遠心分離によって可溶性物質から分離し、可溶性画分をｈｉｓ結合カラム上に載せる。結合緩衝液及び洗浄緩衝液にてカラムを洗浄した後に、結合したタンパク質は溶出緩衝液を使用してカラムから溶出する。結合、洗浄及び溶出緩衝液は各々典型的には０．５Ｍ ＮａＣｌを含む。さらに塩を追加する必要はない。次いで溶出したタンパク質を濃縮して、トロンビンとともに（典型的には１Ｕｍｇ−１の濃度にて、４℃にて１６時間にて）インキュベートする。消化したタンパク質はゲルろ過カラムを使用して分離し、カラムから溶出するＦＴＯは、一般に少なくとも９０％、又は少なくとも９５％純粋である。本明細書中に説明した様々なアッセイにおいて使用するために、精製したタンパク質は脱塩してよい。アッセイ 我々のデータは、ＦＴＯが、２−ＯＧのコハク酸及び二酸化炭素への変換を触媒することを示している。この新たに発見したＦＴＯ活性は、初めてＦＴＯ活性の阻害剤又は刺激剤／活性化剤を同定するアッセイが行われ得ることを意味している。ＦＴＯの２−ＯＧオキシゲナーゼ活性をブロック又は活性化すれば、体重を調節する結果となるであろう。任意の適切なアッセイが、ＦＴＯオキシゲナーゼ活性、特に２−ＯＧオキシゲナーゼ活性の調節剤を同定するために行われ得る。適切なアッセイについての多くの異なる例を、以下に説明する。１つの実施態様において、本明細書中に説明するように、アッセイはヒトＦＴＯポリペプチドを利用する。ＦＴＯポリペプチドは、例えば、細胞抽出物として、又はこのような抽出物から関連ポリペプチドを精製することによって、精製又は未精製の形態のいずれかにて提供されてよい。あるいは、関連構成要素は、リコンビナント発現技術を使用して発現され得、及びアッセイにて使用するために精製され得る。あるいは、構成要素は、細胞に基づくアッセイにて使用するために、細胞にてリコンビナントに発現されてよい。アッセイ方法 ＦＴＯポリペプチドは、オキシゲナーゼ活性（２−ＯＧオキシゲナーゼ活性など）アッセイにおいて使用されてよい。これらのポリペプチドもまた、ＦＴＯオキシゲナーゼ活性を調節する（阻害する又は活性化するなど）薬剤を同定するアッセイにおいて有用である。該方法は、１以上の共基質及び任意に第一基質の存在中にて、ＦＴＯポリペプチドと試験物質（潜在的な阻害剤など）とを接触させることを含む。試験物質及びＦＴＯポリペプチドは、典型的にはオキシゲナーゼ活性に適切な条件下にて接触される。適切な共基質は、酸素（例えば、二酸素）、及び２−オキソ酸（２−ＯＧなど）を含む。好ましくは、共基質は２−ＯＧである。酸素又は２−オキソ酸に加えて、還元剤（アスコルビン酸塩など）もまた、共基質として使用されてもよい。アッセイの構成要素は、試験物質非存在下にて、酵素が共基質に作用するような条件下にて接触されて、共基質修飾の程度を決定する。あるいは、第一基質の酸化がモニターされてよい。触媒的なターンオーバー非存在下にて、ＦＴＯに対する結合を検出するアッセイがまた、使用されてよい。このようなアッセイは、クロマトグラフィー、ＮＭＲ、ＭＳ又は蛍光分光法などの技術を用いてよい。共基質は、ＦＴＯによって修飾(例えば、２−ＯＧ)又は消費（例えば、酸素又はアスコルビン酸塩）されてよい。脱メチル化活性は、ホルムアルデヒドの放出を測定することによってモニターされてよく、ホルムアルデヒドの放出を測定する適切な方法は、当該分野にて公知である。このような方法は、例えば、Ｋｌｅｅｂｅｒｇ ａｎｄ Ｋｌｉｎｇｅｒ（１９８２）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８：１９−３１，Ｔｒｅｗｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ ４１９：１７４−１７８及びＴｓｕｋａｄａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４３９：８１１−８１６に記載されている。アッセイはまた、活性の増加についてのアッセイによって、２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼの活性を増加させる物質を検出するために使用されてもよい。適切なアッセイは、他の２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼについての分野において説明されている。 本発明のこのようなアッセイは、オキシゲナーゼ活性の阻害剤を同定するために使用されてよく、次いで、試験物質非存在下を含む、オキシゲナーゼとしてＦＴＯが活性である条件下において、好ましくは行われる。試験物質存在下におけるＦＴＯオキシゲナーゼ活性は、試験物質がＦＴＯオキシゲナーゼ活性の阻害剤であるかどうかを決定するために、試験物質非存在下におけるＦＴＯオキシゲナーゼ活性と比較される。あるいは、アッセイを、ＦＴＯオキシゲナーゼ活性の促進剤を探すために（例えば、試験物質非存在下にて行ったアッセイと比較して、共基質の変換及び／又は基質のヒドロキシル化の増加について探すことによって）使用されてよい。アッセイはまた、オキシゲナーゼ活性が減少するか又は存在しない条件下（低酸素条件下など）にて行われてもよく、このような条件下にて、活性の存在又は増加した活性がモニターされ得る。 本発明のアッセイはまた、ＦＴＯ特異的で、かつ他の２−ＯＧオキシゲナーゼ（例えば、プロコラーゲンヒドロキシラーゼ、ヒトＡＢＨ（ＡｌｋＢと相同）、メチルリジンデメチラーゼ、低酸素症誘導因子（ＨＩＦ）アスパラギニル又はプロリルヒドロキシラーゼなど）に対しては活性がないか又は活性が低いような、阻害剤又は活性化剤を同定するために使用されてもよい。反対に言えば、本発明のアッセイは、ＦＴＯを阻害しない、１以上の２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼ（例えば、ＨＩＦアスパラギニル又はプロリルヒドロキシラーゼなど）に特異的な阻害剤又は活性化剤を同定するために使用されてよい。 本発明のアッセイはまた、特定の基質又は基質内の残基にて、ＦＴＯ活性に特異的である阻害剤又は活性化剤を同定するために使用されてもよい。 医薬的適用において、例えば、単一の酵素又は酵素群のオキシゲナーゼ活性を調節することは、しばしば有利である。それゆえ、本発明のアッセイは、第２の２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼ（リシル、プロリル、アスパラギニル及びアルギニルデメチラーゼ、ＨＩＦヒドロキシラーゼ（ＦＩＨ、ＰＨＤ１、ＰＨＤ２及びＰＨＤ３を含む）、ＡｌｋＢ、ＡＢＨ１、ＡＢＨ２、ＡＢＨ３、プロコラーゲンプロリル及びリシルヒドロキシラーゼ、ホスファチジルセリン受容体（Ｊｍｊｄ６）、Ｍｉｎａ５３及び（ＳＭＡＲＴデータベースにしたがうＪｍｊドメインタンパク質（リシルデメチラーゼを含むがこれに限定しない）として同定された）２−ＯＧオキシゲナーゼを含むがこれに限定しない）に関連するＦＴＯ活性を選択的に調節する薬剤を同定するために使用されてよい。 このような選択的スクリーニングは、ＦＴＯの選択的な阻害剤又は他の酵素の選択的な阻害剤（すなわち、他の酵素の活性に対してよりもＦＴＯ活性に対してより強力な阻害剤である阻害剤、又は他の酵素の活性に対してよりもＦＴＯ活性に対してより弱い阻害剤である阻害剤）を同定するために使用されてよい。阻害剤が、ＦＴＯ活性の選択的な阻害剤である場合、他の酵素の活性に対しては何の効果も有さなくてよいか、又は低い阻害レベルのみ（他の酵素の活性に対して約５０％未満の阻害）を示してよい。阻害剤が、ＦＴＯではない酵素の活性の選択的な阻害剤である場合、ＦＴＯ活性に対して何の効果も有さなくてよいか、又は低い阻害レベルのみ（ＦＴＯ活性に対して約５０％未満の阻害）を示してよい。 選択スクリーニングは、精製した酵素、部分的に精製した酵素（粗細胞溶解物など）又は細胞内にて行われてよい。 本発明は、変化（すなわち、増加又は減少）した２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼ活性（ＦＴＯオキシゲナーゼ活性など）に関連した状態の処置のための医薬の製造における選択的な阻害剤の使用を提供する。 試験されている１以上の酵素の第一基質が未知である場合に、選択的な阻害剤を同定するために、本発明の方法を使用することもまた可能である。この実施態様において、一般に、未知の基質を有する酵素を阻害することが望まれないような１以上の酵素であろう。オキシゲナーゼ活性に対する試験剤の効果は、基質非存在下にて、オキシゲナーゼによる２−ＯＧのターンオーバー速度に対して、試験剤が影響を及ぼす（例えば、阻害又は刺激する）か否かを決定することによって、決定されてよい。 本発明のアッセイは、ＦＴＯによってヒドロキシル化又はそうでなければ酸化される基質を使用してよい。特に、このような基質は、ＦＴＯ ２−ＯＧオキシゲナーゼ活性の調節剤の活性についてモニターするためのアッセイにおいて使用されてよい。基質は、ペプチド又は核酸基質であってよい。核酸基質は、ＤＮＡ又はＲＮＡであってよい。オリゴヌクレオチド基質が使用されてよい。ＤＮＡは好ましくは核ＤＮＡであるが、ミトコンドリアＤＮＡであってもよい。好ましくは、核酸基質は、１以上の残基がメチル化されている。 典型的には配列番号１のアミノ酸配列又はバリアントを有するＦＴＯとともに、ＦＴＯによって、ヒドロキシル化又はより一般的には酸化される任意の適切な基質が使用されてよい。２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼの基質のうちいくつかは、当該分野にて周知である。基質は、天然に生ずるタンパク質又はリコンビナントもしくは合成タンパク質又は核酸であってよい。ＦＴＯによる酸化部位を含む、天然に生ずる基質タンパク質又は核酸の断片及びバリアントが、本発明のアッセイにおける基質として使用されてよい。 ＦＴＯ又は別のオキシゲナーゼの選択的な阻害剤を同定するためのアッセイにおいて、異なる基質が、ＦＴＯ及び他のオキシゲナーゼ（単数又は複数）について使用されてよい。 本発明の方法は、ＦＴＯの２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼ活性の新規の基質を検出するために使用されてよい。このようなアッセイにおいて、試験基質が使用され、ヒドロキシラーゼ活性の検出は、試験基質のヒドロキシル化が生じたこと、したがって、試験基質がＦＴＯの基質であるということを示している。このようなアッセイは、単離された構成要素、半精製した抽出物又は全細胞にて行われてよい。 試験基質は、核酸、核酸誘導体もしくはアナログ（メチル化した核酸など）であってよく、又はタンパク質もしくはペプチド（メチル化タンパク質もしくはペプチドなど）であってよい。メチル化した核酸、タンパク質又はペプチドは、体重調節に関わる遺伝子、タンパク質又はペプチドと関連してよい。例えば、核酸は、遺伝子又は遺伝子から転写されたｍＲＮＡの一部であってよく、ペプチド又はタンパク質は、遺伝子によってコードされてよい。体重調節に関わる遺伝子及びペプチドの例としては、ａｇｏｕｔｉ遺伝子及びａｇｏｕｔｉ関連ペプチド並びにニューロペプチドＹ遺伝子及びニューロペプチドＹ関連ペプチド遺伝子並びに以下のペプチド及びペプチドをコードする遺伝子が挙げられる：レプチン、プロオピオメラノコルチン、オレキシン、ガラニン、ＰＹＹ、コレシストキニン、グルカゴン関連ペプチド−１及びインシュリン。 ２−ＯＧアナログ（Ｎ−オキサリルグリシン）及び遷移金属（亜鉛、マグネシウム、マンガン、コバルト及びニッケルなど）などを含むがこれに限定しないＦＴＯ活性の阻害剤は、ＦＴＯと基質との相互作用を安定化し、次いでＦＴＯに結合する基質又は結合パートナーを同定することによって、ＦＴＯ基質の同定を可能にするために使用されてよい。標準的な方法が、基質又は結合パートナーを同定するために使用されてよい。使用されてよい技術の例には、プロテオミクス分野において使用される質量分析又は抗体又は他の標準的な試薬及び方法論が含まれる。あるいは結合アッセイ又は細胞を基準としたアッセイが使用されてよい。調節物のモニター方法 本発明の任意のスクリーニング又はアッセイ方法の詳細なフォーマットは、日常的な技術及び知識を使用して、当業者によって改変されてよい。当業者は、適切なコントロール実験を付加的に用いる必要性について十分認識している。本発明のアッセイは、適切な基質のヒドロキシル化をモニターすること、基質及び共基質の利用をモニターすること、酵素とその基質との間の予期される産物の生成をモニターすることを含んでよい。本発明のアッセイ方法はまた、システム内の構成要素間の直接的な相互作用についてのスクリーニングを含んでもよい。あるいは、基質が介する下流効果をモニターするアッセイ（適切なレポーター構築物を使用する基質を介する転写など）が行われてよいし、又は基質によって直接的又は間接的に制御されるべきことが公知の遺伝子の上方制御もしくは遺伝子の発現パターンの変化についてモニターすることによってアッセイが行われてよい。 直接的又は間接的のいずれかで、オキシゲナーゼ活性を決定する様々な方法が、当該分野で公知である。ＦＴＯの２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼ活性を決定する任意の適切な方法（基質もしくは共基質の利用、ペプチド／核酸のヒドロキシル化／脱メチル化などの産物の出現又はヒドロキシル化／脱メチル化した産物もしくはヒドロキシル化していない産物によって介される下流効果によってなど）が、使用されてよい。 基質、酵素及び潜在的な阻害剤化合物は、阻害剤非存在下にて基質のヒドロキシル化／脱メチル化を提供する条件下にて一緒にインキュベートされてよく、阻害剤の効果は、基質のヒドロキシル化／脱メチル化を決定することによって決定されてよい。これは、任意の適切な手段によって遂行されてよい。小さなポリペプチド又はポリヌクレオチド基質が回収されて、物理的解析（質量分析器、ラジオグラフィーもしくはクロマトグラフィーなど）又は機能解析を行ってよい。このような方法は当該分野にて公知のものであり、日常的な技術及び知識を使用して行われてよい。例えば、実施例に説明するＬＣ−ＭＳアッセイが使用されてよい。決定は定量的又は定性的であってよい。どちらの場合でも、特に後者の場合には、定性的な決定は、適切なコントロール(例えば、潜在的な阻害剤なしでインキュベートした基質)と比較して行われてよい。 別の実施態様において、基質によって介されるプロモーターがレポーター遺伝子に機能的に連結して提供されるようなレポーター構築物が、提供されてよい。任意の適切なレポーター遺伝子（例えば、比色分析、蛍光定量、蛍光共鳴又は分光分析アッセイにおいて使用されてよい酵素など）が、使用され得る。 本明細書中にて説明するアッセイ方法において、典型的にはＦＴＯ及び基質は、共基質（酸素及び／又は２−オキソ酸（２−ＯＧ及び／又は二酸素など））の存在下にて接触される。ヒドロキシラーゼ／デメチラーゼ活性は、１以上の共基質（酸素、２−ＯＧ及び／又はアスコルビン酸塩など）のターンオーバーを決定することによって、決定されてよい。これは、反応産物（ヒドロキシル化した基質又はコハク酸など）の存在及び／又は量を決定することによって得られてよい。産物の量は、基質の量に対して相対的に決定されてよい。例えば、このような実施態様において、基質はポリペプチドであってよく、例えば、測定される産物は、ヒドロキシル化／脱メチル化したポリペプチド又は核酸であってよい。例えば、ヒドロキシル化／脱メチル化の程度は、反応において生成したヒドロキシル化／脱メチル化したポリペプチド／核酸、コハク酸、二酸化炭素、もしくはホルムアルデヒドの量を測定することによって決定されてよく、又は２−ＯＧもしくは二酸素の減少量を測定することによって決定されてよい。これらの各々のモニター方法は、科学文献（例えば、Ｍｙｌｌｙｈａｒｊｕ ｅｔ ａｌ．（１９９１）ＥＭＢＯ Ｊ．１６（６）：１１７３−１１８０又はＣｕｎｌｉｆｆｅ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４０：６１７−６１９）において公知である。 未使用の２−ＯＧは、定量され試験ポリペプチドのヒドロキシル化の程度を示すために使用され得る指示的なクロモフォア又はフルオロフォアを与える化学試薬（例えば、ヒドラジン誘導体及びｏｒｔｈｏ−フェニレンジアミン誘導体が例として挙げられるが、これらに限定しない）によって誘導されてよい。溶解型の酸素電極（例えば、「クラーク（Ｃｌａｒｋｅ）型」電極又は蛍光クエンチを使用する電極が例として挙げられるが、これらに限定しない）は、アッセイ混合物中の酸素消費を追跡するために使用されてよく、これは、上記と類似の様式にて試験ポリペプチドのヒドロキシル化の程度を示すために使用され得る。 ｏｒｔｈｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）と２−ＯＧのα−ケト酸モチーフとの反応の蛍光産物は、３−（２−カルボキシエチル）−２（１Ｈ）−キノキサリノンである。この蛍光産物は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｔｅｃａｎ、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｊａｓｃｏ及びＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒによって製造されるような標準的な装置によって容易に検出され得、蛍光産物の生成が、ハイスループットスクリーニングにおいて使用され得ることを示す大きな前例である。 蛍光産物は一般に、約３００ｎｍから約４００ｎｍ、好ましくは約３３５から約３４５ｎｍ、最も好ましくは約３４０ｎｍの励起フィルターセットにて検出される。発光フィルターは一般に、約４００から約４５０ｎｍ、好ましくは約４１５から約４２５ｎｍ、最も好ましくは約４２０ｎｍである。 このアッセイ手順は、それ自身をハイスループットフォーマット（マルチウェルプレートフォーマット、例えば９６、３８４、又は１５３６ウェルプレートフォーマットなど）へと導く。 さらに、蛍光産物の性質は、使用する誘導体化試薬の性質を改変することによって調節され得る。例えば、方法の感度は、１，２−ジメトキシ−４，５−ジアミノベンゼン、又は１，２−メチレンジオキシ−４，５−ジアミノベンゼンのいずれかを使用して増大されてよい。 本発明の任意のスクリーニング又はアッセイ方法の詳細なフォーマットは、日常的な技術及び知識を使用して、当業者によって改変されてよい。当業者は、適切なコントロール実験を付加的に用いる必要性について十分認識している。活性は、ＯＰＤ又は他の芳香族ジアミン（１，２−ジメトキシ−４，５−ジアミノベンゼン又は１，２−メチレンジオキシ−４，５−ジアミノベンゼンなど）とともに、２−ＯＧの誘導体化によって測定され、このような誘導体は、ＯＰＤ（Ｍｕｈｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ（２００３）３８３−３９２，Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ．（１９８７）６８７−６９２）の使用と比較して増大した感度を与える。 アッセイは、オキシダーゼによる基質のヒドロキシル化／酸化に適切な条件下にて行われる。したがって、２−ＯＧがアッセイ中に存在する。アッセイ混合物はまた、鉄、好ましくは第一鉄も含んでよい。 他の構成要素が、アッセイ混合物に添加されてよい。例えば、還元剤（アスコルビン酸塩、チオール（ジチオスレイトール（ＤＤＴ）など）、β−メルカプトエタノール、Ｎ−アセチルシステイン又はフェノールなど）が、酵素の構造の維持を助けるためにアッセイに添加されてよく、及び／又はカタラーゼが、生成され得る任意のＨ２Ｏ２を破壊するために添加されてよい。しかし、アッセイは、還元剤又はカタラーゼ非存在下にて機能するであろう。 アッセイは、典型的には約２５℃から約４０℃の温度、例えば、約３０℃から約３９℃、又は約３５℃から約３８℃もしくは約３７℃の温度にて行われる。アッセイ混合物のｐＨは、典型的には約ｐＨ７から約ｐＨ９、例えば、約ｐＨ７．５から約ｐＨ８の間である。適切な緩衝液（トリス又はＨＥＰＥＳなど）が、アッセイ混合物のｐＨを維持するために使用されてよい。 典型的には、アッセイは、正常酸素圧条件下にて行われる。ヒドロキシル化／酸化を増強する薬剤によるオキシゲナーゼ活性の調節を検出するために、アッセイはまた、ヒドロキシル化又は酸化が減少しているか又は存在しない条件下にて（低酸素条件など）行われてもよい。 あるいは、終点の決定は、ポリペプチド又は核酸基質に由来した基質又は基質断片（合成及びリコンビナントペプチド又は核酸を含む）の、検出可能な産物への変換に基づかれてよい。基質は、アッセイを促進するために改変されてよく、改変された基質が、ハイスループットスクリーニングを迅速に行い得、ハイスループットスクリーニングに適切であってよい。 例えば、本明細書中に例示したような逆相ＨＰＬＣ（Ｃ−４オクタデシルシランカラム）は、出発時の合成ペプチド基質を産物から分離するために使用されてよい。このアッセイの改変又はオキシゲナーゼ活性のための変法アッセイは、当該分野にて周知の、例えば、質量分析、分光、及び／又は蛍光技術を用いてよい（Ｍａｓｉｍｉｒｅｍｂｗａ Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ（２００１）４（３）２４５−２６３，Ｏｗｉｃｋｉ Ｊ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．５（５）２９７−３０５，Ｇｅｒｓｈｋｏｖｉｃｈ Ａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｓ．３３（３）１３５−１６２，Ｋｒａａｆｔ Ｇ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｅｔｈｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４１ ７０−８６）。蛍光技術は、分光又は蛍光アッセイを行うか又は最適化するために、このような方法にて改変された基質バージョンを用いてよい。 ポリペプチド又は他の基質の、ヒドロキシル化及び非ヒドロキシル化又は脱メチル化された形態間を識別する分子の結合は、当業者が入手可能な任意の技術を使用して評価されてよく、これは適切な標識の存在の決定を含んでよい。 本発明のアッセイ方法はまた、インビボアッセイ又は動物（哺乳類（ヒトを含む）又は昆虫）由来の生体外の細胞にて行うアッセイの形態を取ってもよい。アッセイは、関連ポリペプチド又はペプチドが、細胞に導入された１以上のベクターから発現されている細胞株（酵母もしくは細菌株、又は昆虫もしくは哺乳類細胞株など）において行われてよい。あるいは、アッセイは、内在性のＦＴＯを発現しているか、又はＦＴＯが過剰発現している哺乳類細胞にて行われてよい。 本発明の細胞に基づくアッセイにおいて使用するＦＴＯポリペプチドは、好ましくは核局在シグナルを含む。試験化合物 本明細書中にて説明するアッセイ方法を使用してスクリーニングされてよい薬剤は、薬物スクリーニングプログラムにて使用する、天然又は合成化学化合物であってよい。いくつかの明らかにされた又は明らかにされていない構成要素を含む植物、微生物又は他の生命体の抽出物もまた、使用されてもよい。 組み合わせライブラリー技術（固相合成及び平行した合成方法論を含む）は、潜在的な膨大数の異なる物質を、相互作用を調節する能力について効率的に試験する方法を提供し得る。このようなライブラリー及びその使用は、天然産物、小分子及びペプチド、その他の全ての様式について、当該分野にて公知である。ペプチドライブラリーの使用は、ある状況において好ましくてよい。様々な市販の化合物ライブラリーもまた、入手可能である。阻害の主要な構造を同定し得る、これらのライブラリーをスクリーニングするためのコンピューターによる方法（プロセスは、バーチャルスクリーニングと呼ばれることもある）がある。 潜在的な阻害剤化合物（すなわち、アンタゴニスト）は、ポリペプチド、小分子（市販のライブラリー（組み合わせライブラリーなどを含む）由来の分子など）であってよい。使用されてよい小分子化合物は、２−ＯＧアナログ、又は基質アナログを含み、これは酵素の作用を阻害する。使用されてよい小分子化合物、及び他の化合物型は、全ての公知の２−ＯＧオキシゲナーゼ阻害剤（ＨＩＦヒドロキシラーゼ（例えば、ＷＯ０２／０７４９８１及びＷＯ０３／０８０５６６を参照）及びプロコラーゲンプロリルヒドロキシラーゼを阻害することがすでに公知のものなど）を含む。 潜在的な促進剤は、広く様々な源、特に市販の小化合物ライブラリーからスクリーニングされてよい。酸素を含む化合物は、スクリーニングされるべき候補化合物（例えば、２−ＯＧアナログ）に含まれてよい。肥満（Ｃｏｏｋｅ ａｎｄ Ｂｌｏｏｍ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２００６）及び２型糖尿病を処置するために現在使用される任意の薬剤は、ＦＴＯ活性に影響して、候補薬剤として使用されてよい。 ＴＣＡサイクル中間体（フマル酸など）を含む天然に生ずる化合物が、２−ＯＧオキシゲナーゼの公知の阻害剤であるから、可能であれば生理的に関連性のある様式（フマル酸はＷａｒｂｕｒｇ効果の結果、上方制御されることが公知の、ある種の癌を含む）にて、ＦＴＯを阻害してもよい。 基質のヒドロキシル化／酸化を増加させる、増強させる、刺激させる、破壊させる、減少させる、妨害させる又は完全にもしくは部分的に排除し、それによって活性を調節してもよい試験化合物は、本明細書中に説明するアッセイ方法を使用して同定されるか、及び／又は得られてよい。 ヒドロキシル化／酸化を増加させる又は増強させる薬剤（すなわちアゴニスト）（例えば、プロリル又はアスパラギニルヒドロキシル化）は、ポジティブに機能する試験剤非存在下にてヒドロキシル化／酸化を制限するか又は妨げる条件下にて、同定及び／又は得られてよい。このような薬剤は、ＦＴＯのオキシゲナーゼ活性を増強させる、増加させる、増進させる又は刺激させるために使用されてよい。 様々な局面において、本発明は、本発明のスクリーニング方法によって、ＦＴＯオキシゲナーゼ活性の調節剤であることが同定される薬剤又は化合物（例えば、ＦＴＯ活性を阻害する又は減少させる、増加させる又は増強させる物質）を提供する。 試験剤は、ＦＴＯ活性部位にて２−ＯＧ又はＦＴＯ基質と競合してよく、及び／又はＦＴＯ活性部位にて金属と結合してよい。試験剤は、マンガン、コバルト、亜鉛又はニッケルイオンなどの金属イオンを含んでよいが、これらに限定しない。あるいは阻害方法は、アロステリックな相互作用を介してよい。 試験剤は、還元剤であってよい。還元剤は典型的には２−ＯＧオキシゲナーゼ活性の活性化剤として、典型的にはインビトロにて機能する。オキシゲナーゼ活性の活性化剤は、インビトロ又はインビボのいずれかにて、ＦＴＯポリペプチドのオキシゲナーゼ活性を増加させる任意の種でよい。使用されてよい還元剤としては、アスコルビン酸塩及びアスコルビン酸塩アナログ並びにチオール化学ファミリーの還元剤（ジチオスレイトールなど）又はホスフィン（例えば、トリスカルボキシエチルホスフィン）の還元剤が挙げられる。 調節剤の同定に続いて、物質が精製され及び／又はさらに調査され（例えば、改変される）及び／又は製造されてよい。調節剤は、ペプチド的又は非ペプチド的な模倣体を得るために（例えば、当業者に周知及び本明細書中に記載した方法によって）使用されてよい。調節剤は、本明細書中に説明するように、例えば選択性を増大させるために、改変されてよい。以下に記載するように治療的な状況にて使用されてよい。 治療的な処置のために、調節剤は単独で、又は任意の他の治療的に活性のある物質又は処置と組み合わせて、使用されてよい。 酸性化合物は、塩（ナトリウム塩など）の形態にて存在し得る。化合物はまた、誘導体（ジメチルエステル、ジエチルエステル、モノエチルエステル又はジもしくはモノアミドなど）の形態にて存在してもよい。例えば、生命体の細胞内において酵素の阻害が必要である場合などの、ある例において、これらの誘導体が好ましくてもよい。 ２−ＯＧオキシゲナーゼを調節する化合物は、本発明の薬剤として、例えば、本明細書中に説明する体重疾患の処置において、有用であってよく、本発明のアッセイにおける試験物質として使用されてよい。試験化合物は、ＦＴＯ以外の２−ＯＧオキシゲナーゼの阻害剤として機能することが公知であってよい。例えば、試験剤は、プロコラーゲンプロリルヒドロキシラーゼ、低酸素症誘導因子、プロリル及びアスパラギニルヒドロキシラーゼ、コラーゲンプロリルヒドロキシラーゼ、ジベレリンＣ−２０オキシダーゼ、核酸デメチラーゼ（ＡｌｋＢ又はヒトＡｌｋＢホモログなど）、タンパク質デメチラーゼ（トリ、ジ、モノメチルリジン又はアルギニン残基デメチラーゼなど）、（代謝又は制御に含まれる）ヒト又は動物の他の２ＯＧオキシゲナーゼ、又は植物２−ＯＧヒドロキシラーゼの阻害剤であってよい。多くの２−ＯＧオキシゲナーゼ阻害剤は、ヒトプロリルヒドロキシラーゼとして特に公知である。Ｎ−オキサログリシン及びその誘導体が、適切な例である。グリシン又はアラニン誘導体及び２−オキソ酸アナログもまた使用されてよい。 ２−ＯＧオキシゲナーゼ、及びこのような化合物ファミリーを調節する化合物は当該分野にて公知であり、例えば、Ａｏｙａｇｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２３（１）：１−６，Ａｏｙａｇｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３５：４１０ Ｓｕｐｐｌ．１，Ｐｈｉｌｉｐｐ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０６（１９）：１３４４ Ｓｕｐｐｌ．Ｓ，Ｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９９（２１）：１３４５９−１３４６４，Ｎｗｏｇｕ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０４（１８）：２２１６−２２２１，Ｍｙｌｌｙｈａｒｊｕ ａｎｄ Ｋｉｖｉｒｉｋｋｏ（２００１）Ａｎｎ Ｍｅｄ ３３（１）：７−２１，Ｏｈｔａ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ３２（１１）：４３５０−４３５９，Ｆｒａｎｋｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３５３：３３３−３３８，Ｆｒａｎｋｌｉｎ（１９９７）Ｉｎｔ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２９（１）：７９−８９，Ｄｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｅｕｒ Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２８（６）：５１３−５１６，Ｂａａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３００：５２５−５３０，Ｂａａｄｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４）Ｅｕｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ａｎｄ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｌ ３２（７）：５１５−５２０，Ｂｉｃｋｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２８（２）：４０４−４１１，Ｂｉｃｋｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １３：Ｓ２６−Ｓ３４ Ｓｕｐｐｌ．３，ＵＳ ６，２００，９７４，ＵＳ ５，９１６，８９８，米国特許出願２００３−０１７６３１７，２００３−０１５３５０３及び２００４−００５３９７７，ＷＯ ０２／０７４９８１，ＷＯ ０３／０８０５６６，ＷＯ ０４／０３５８１２，Ｃｕｎｌｉｆｆｅ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：２６５２−２６５８，Ｈｉｇａｓｈｉｄｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ３８：２８５−２９５，Ｃｕｎｌｉｆｆｅ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３９（２）：３１１−３１５，Ｆｒａｎｋｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６１（ｌ）：１２７−１３０，Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９７（９）：４７３６−４７４１，Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１（３）：５８７−５８８，ＤＥ−Ａ−３８１８８５０，Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＵＳ：１５６７６−１５６８３並びにＬｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄｉｔ．４０：４０４０−４０４１である。 適切な試験化合物が、ＷＯ０３／０８０５６６及びＷＯ０２／０７４９８１に開示されている。他の適切な化合物は、Ｆｉｂｒｏｇｅｎ社のＨＩＦヒドロキシラーゼの阻害剤を含む。Ｆｉｂｒｏｇｅｎ社のＨＩＦヒドロキシラーゼの阻害剤は、米国特許出願公報に開示されている：２００７００４２９３７、２００６０２７６４７７、２００６０２７０６９９、２００６０２５８７０２、２００６０２５８６６０、２００６０２５１６３８、２００６０１８３６９５、２００６０１７８３１７及び２００６０１７８３１６。 他の適切な試験化合物は、式（Ｉ）の化合物を含み：ここで −Ｙ２は−ＯＲ’及び−ＮＲ’Ｒ’’から選択され、ここでＲ’は水素、又は非置換のＣ１−４アルキルであり、Ｒ’’は水素、ヒドロキシ又は非置換のＣ１−４アルキルであり； −Ｙ１は−Ｃ−、−Ｓ−及び−Ｓ（Ｏ）−から選択され； −Ｚ２は−Ｃ（Ｏ）−及び−ＮＲ’’から選択され、ここでＲ’’は水素、ヒドロキシ又は非置換のＣ１−４アルキルから選択され； −Ｚ１は水素及び非置換のＣ１−４アルキルから選択され；かつ −Ｒは、天然に生ずるアミノ酸の側鎖である。 好ましくは、Ｙ１は−Ｃ−であり、Ｙ２は−ＯＨ又は−ＮＨ２である。最も好ましくは、Ｙ１は−Ｃ−であり、Ｙ２は−ＯＨである。 好ましくは、Ｚ２は−Ｃ（Ｏ）−又は−ＮＲ’’−であり、ここでＲ’’は水素、メチル又はエチルである。より好ましくは、Ｚ２は−Ｃ（Ｏ）−又は−ＮＨ−である。好ましくは、Ｚ１は水素、メチル又はエチルであり、より好ましくは、水素である。最も好ましくは、Ｚ２は−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｚ１は水素、メチル又はエチルである。 好ましくは、Ｒは、アラニン、バリン、ロイシン又はフェニルアラニンの側鎖である。好ましくは、Ｒは、バリン、ロイシン又はフェニルアラニンの側鎖である。より好ましくはＲはフェニルアラニン、すなわち−ＣＨ２Ｐｈの側鎖である。 これらの化合物のＬ−立体異性体又はＤ−立体異性体が使用されてよい。 式（Ｉ）の試験化合物を得るために使用する例示的な合成スキームを以下のスキーム１に示す。ここで、式（Ｉ）の化合物を生成するために、アミノ酸をオキサリルクロリドと反応させる。同様の一般的な反応が他のアミノ酸でも起こることは明らかであるが、このスキームにおいて、使用するアミノ酸はフェニルアラニンである。第１反応により、本発明の保護された化合物（ジメチルエステル形態）が生じる。二酸形態は、水酸化ナトリウム水との反応により、容易に生成する。 Ｘが−Ｏ−もしくは−Ｓ−であるか、又はＺが−ＣＯ−ＣＯ−ＯＨ以外である化合物は、Ｍｏｌｅ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１３，２６７７−２６８０及びＣｕｎｌｉｆｆｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９２）３５ ２６５２−２６５８に説明されるように合成されてよい。 クレブスサイクルの中間体（コハク酸及びフマル酸など）は、ＦＴＯデメチラーゼ活性の阻害剤として機能する。それゆえ、コハク酸及びフマル酸アナログは、ＦＴＯ活性を阻害するために使用されてよい。治療的適用 ＦＴＯのオキシゲナーゼ活性に影響を与える能力を有することが見出されている化合物、物質又は薬剤は、記載するように多くの状況において、治療性及び他の潜在性を有している。特に、ＦＴＯ活性の調節剤は、体重増加又は体重減少に関連する病気の処置又は予防において使用されてよい。調節剤は、過体重の患者における体重増加を防ぎ又は逆行させてよい。調節剤は、低体重の患者において、体重減少を防ぐか又は体重増加を促進してよい。調節剤はまた、体重増加を防ぐために、正常な健康的な範囲（典型的に、肥満指数が約１９から約２５）内に体重を有する個体（例えば、ＦＴＯ遺伝子のアリルバリアント（アリルバリアントは肥満に関連する）を有する個体）に対して投与されてもよい。この実施態様において、調節剤は、体重増加及び関連した病気又は疾患を防ぐために使用される。 ＦＴＯ活性の調節剤を投与することによって処置し又は防ぎ得る体重増加に関連する病気及び疾患としては、肥満（肥満指数が３０以上）、癌（特に結腸癌、前立腺癌、直腸の癌、乳癌及び子宮内膜癌）、心臓病（心臓発作及びうっ血性心不全を含む）、高血圧、高コレステロールレベル、インシュリン耐性、２型糖尿病、胆石、睡眠時無呼吸、変形性関節症、痛風、脂質異常症、ピックウィック症候群及び不妊症が挙げられる。 ＦＴＯ活性の調節剤を投与することによって処置し又は防ぎ得る体重減少に関連する疾患としては、拒食症、過食症、低栄養、骨粗しょう症、不妊症、低下した免疫能力、ＡＩＤＳ又は抗癌剤投与中の患者における体重減少が挙げられる。 ＦＴＯ活性の調節剤はまた、癌の処置又は予防において使用されてもよい。これは、ＦＴＯのＤＮＡ修復能力のためである。 治療的な処置のために、ＦＴＯ調節剤は、任意の他の活性のある物質（例えば、体重コントロール、糖尿病、及び心臓病における処置）と組み合わせて使用されてよい。 オキシゲナーゼ活性を調節する能力を有するとして、１以上の１次スクリーニング（例えば、無細胞システムにて）を使用して同定される薬剤は、１以上の２次スクリーニングを使用してさらに評価されてよい。 一般に、本発明にしたがう調節剤である、薬剤、化合物又は物質は、単離した及び／又は精製した形態（すなわち、実質的に純粋）にて提供される。少なくとも活性成分が約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％で組成物中に存在することを含んでよい。しかし、任意のこのような組成物は、不活性担体物質又は他の薬学的及び生理的に受容可能な賦形剤（活性のある薬剤の正しい送達、放出及び／又は安定化に必要なものなど）を含んでよい。以下に示すように、本発明にしたがう組成物は、開示した調節剤化合物に加えて、治療に使用する１以上の他の分子（体重コントロール、糖尿病、及び心臓病における処置など）を含んでよい。本発明のアッセイによって得られる産物 本発明は、本発明のアッセイ方法によって得られる化合物、及び該化合物を含む組成物（化合物が薬学的に受容可能な担体又は希釈剤と混合している薬学組成物など）をさらに提供する。適切な担体又は希釈剤の例としては、例えば、「Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」が挙げられる。担体は液体（例えば、食塩水、エタノール、グリセロール及びそれらの混合物）、又は固体(例えば、錠剤又は半固体形態（デポー製剤としてゲル製剤化したなど）又は経皮投与可能なビヒクル（経皮パッチなど）の形態にて)であってよい。 本発明は、ＦＴＯオキシゲナーゼ活性を妨害する薬剤を患者に投与することを含む処置方法をさらに提供する。このような薬剤は、ＦＴＯオキシゲナーゼ活性の阻害剤又は活性化剤を含んでよい。 治療的な／予防的な目的は、減少もしくは準最適なもしくは増加したＦＴＯレベルもしくは活性に関連した状態の処置、又は正常なＦＴＯレベルを有するが、ＦＴＯオキシゲナーゼ活性の増加又は減少などの活性調節が望ましいような状態の処置に関連してよい。例えば、ＦＴＯ活性は、望ましくない体重減少又は増加に関連する疾患の処置において調節されてよい。 薬剤の治療上有効量が、典型的には、それを必要とする被験体に投与される。治療上有効量は、状態の症状を改善するか、又は状態によって被験体に生じている苦痛を減じるような量である。体重増加又は体重増加（肥満など）に関連する疾患を処置又は予防するための治療上有効量は、典型的には、体重増加を減少させる量、例えば、患者の体重を維持する又は体重減少を誘導する量である。あるいは、治療上有効量は、体重減少を誘導する量であってよい。体重減少又は体重減少に関連する疾患（拒食症など）を処置又は予防するための治療上有効量は、典型的には、体重減少を減少させる量、例えば、患者の体重を維持する又は体重増加を誘導する量である。薬学組成物 したがって、様々なさらなる局面において、本発明は、このような目的のための薬学組成物、医薬、薬物又は他の組成物、（２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼ活性の阻害剤又は活性化剤を含む）本明細書中に説明した１以上の薬剤、化合物又は物質を含む該組成物、医学的処置方法におけるこのような組成物の使用、このような組成物を患者に投与することを含む方法（例えば、上に説明した医学的状態の処置（予防的処置を含んでよい））、任意のこのような目的のために投与する組成物、医薬又は薬物の製造におけるこのような薬剤化合物又は物質の使用（例えば、本明細書中に説明する状態の処置）、及び、このような薬剤、化合物又は物質を、薬学的に受容可能な賦形剤、ビヒクル又は担体、及び任意の他の原料と混合することを含む薬学組成物の作製方法を提供する。 １つの実施態様において、薬学組成物を提供する方法は、典型的には以下を含んでよい： （ａ）本発明のアッセイ方法による薬剤の同定；及び （ｂ）このように同定した薬剤と薬学的に受容可能な賦形剤との製剤化。 本発明の薬学組成物は、本発明にしたがう薬剤、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター又は抗体及び薬学的に受容可能な賦形剤を含んでよい。 本発明の医学的処置方法において使用する薬剤が何であれ、投与は好ましくは、「予防的に効果的な量」又は「治療上有効量」（場合によっては、予防は治療と考えられてもよい）であり、個体に利益を示すにはこれで十分である。実際の投与量並びに投与の速度及び時間的経過は、処置されるものの性質及び重症度に依存するであろう。処置の処方（例えば、用量の決定など）は、一般開業医及び他の医学的な医師の責任の範囲内である。 薬剤又は組成物は、単独で又は他の処置と組み合わせて投与されてよく、同時又は連続であるかのいずれかについては、処置されるべき状態(例えば、上に説明するとおり)に依存する。 本発明にしたがう薬学組成物及び本発明にしたがう使用のための薬学組成物は、活性成分に加えて、薬学的に受容可能な賦形剤、担体、緩衝液、安定剤又は当業者に周知の他の物質を含んでよい。特に、薬学的に受容可能な賦形剤を含んでよい。このような物質は、非毒性であるべきであり、活性成分の有効性を妨害すべきではない。担体又は他の物質の詳細な性質は、投与経路に依存し、投与経路は、経口、又は注射（例えば、皮膚注射、皮下注射又は静脈注射）によるものであってよい。 経口投与のための薬学組成物は、錠剤、カプセル剤、粉末剤又は液体の形態であってよい。錠剤は、ゼラチン又はアジュバントなどの固体担体を含んでよい。液体の薬学組成物は一般に、水、石油、動物もしくは植物油、ミネラルオイル又は合成油などの液体担体を含む。生理的食塩水溶液、デキストロースもしくは他の糖溶液又はグリコール（エチレングリコール、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなど）が含まれてよい。 静脈、皮膚もしくは皮下注射、又は疼痛部位への注射のためには、活性成分は、ピロゲンを含まずに、適切なｐＨ、等張性及び安定性を有する、非経口にて受容可能な水溶液の形態であろう。関連する当業者は、例えば、等張ビヒクル（ナトリウムクロリド注射、リンゲル液注射、乳酸リンゲル液注射など）を使用する適切な溶液を十分調製可能である。保存剤、安定剤、緩衝液、抗酸化剤及び／又は他の添加剤が、必要に応じて含まれてよい。 リポソーム、特にカチオン性リポソームが、担体製剤化において使用されてよい。上に述べる技術及びプロトコールの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．（ｅｄ），１９８０に見出し得る。 物質又は組成物は、特定の部位に局在する様式にて投与されるか、又は特定の細胞又は組織を標的する様式にて（例えば、動脈内ステントに基づく送達を使用して）送達されてよい。 標的療法は、抗体又は細胞特異的リガンドなどの標的システムの使用によって、活性のある物質をより特異的にある細胞型に送達するために使用されてよい。様々な理由（例えば、薬剤が受け入れがたいほど毒性である場合、又はそうでなければ高すぎる用量が必要である場合、又はそうでなければ標的細胞に進入することができない場合）のために、標的が望まれてよい。 さらなる実施態様において、本発明は、増加又は減少したＦＴＯオキシゲナーゼレベル又は活性と関連する状態の処置のための医薬の製造における、本発明の薬剤の使用を提供する。状態は、例えば、体重減少又は増加に関連する病気を含んでよい。 本明細書中に挙げた全ての文献は、引用によって本明細書中に取り込まれている。 以下の実施例は、発明を例示する。実施例１：２−ＯＧオキシゲナーゼとしての解析のためのＦＴＯの選択 既報のＡＢＨ３結晶構造（Ｓｕｎｄｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００６）ＥＭＢＯ Ｊ．２５（１４）３３８９−３３９７）に基づいて、ＭＯＤＥＬＬＥＲ８Ｖ２にてＦＴＯのホモロジーモデルを構築するために、２次構造予測（ＪＰＲＥＤ）と保存配列との組み合わせを使用して、ＦａｔｓｏとＡＢＨ３の配列アライメントを、作製した。次いで、比較のために、ＦＴＯモデルをＡＢＨ３及びＥ．ｃｏｌｉ由来のＡｌｋＢ ＤＮＡデメチラーゼ（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ，４３９，８７９−８８４）と重ね合わせた。配列アライメント、２次構造予測及び構造モデルは、これら３つのタンパク質間の強い類似性を示している。ＤＳＢＨの足場はＦＴＯ中に明らかに存在し、個々の活性部位Ｆｅ（ＩＩ）及び２ＯＧ結合残基が厳密に保存されている（例えば、Ｈｉｓ２３１ ＦＴＯ、Ｈｉｓ１９１ ＡＢＨ３、Ｈｉｓ１３１ ＡｌｋＢ；Ａｓｐ２３３ ＦＴＯ、Ａｓｐ１９３ ＡＢＨ３、Ａｓｐ１３３ ＡｌｋＢ；Ｈｉｓ３０７ ＦＴＯ、Ｈｉｓ２５７ ＡＢＨ３、Ｈｉｓ１８７ ＡｌｋＢ；Ａｒｇ３１６ ＦＴＯ、Ａｒｇ２６９ ＡＢＨ３、Ａｒｇ２０４ ＡｌｋＢ）。さらに、触媒機構に含まれる残基（すなわち、Ａｒｇ３２２ ＦＴＯ、Ａｒｇ２７５ ＡＢＨ３及びＡｒｇ２１０ ＡｌｋＢ；Ｌｅｕ２１３ ＦＴＯ及びヒドロキシル化したＬｅｕ１７７ ＡＢＨ３）及びＤＮＡ塩基認識に含まれることが予測される芳香族残基（Ｔｙｒ１０８ ＦＴＯ及びＴｙｒ１４３ ＡＢＨ３）が存在している。 したがって、ＦＴＯ配列を、ＡｌｋＢホモログ（ＡＢＨ）及び他の公知の２−オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼ（これらのうちいくつかは、メチル化した核酸配列の脱メチル化を触媒し、２本鎖ベータへリックス（ＤＳＢＨ）モチーフ及び少なくとも１つのＣ末端へリックスドメインを有することが見出されている）のホモログとして検出した。 ＤＳＢＨモチーフは、２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼに特徴的であるが、２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼではない多くのタンパク質もまた、ＤＳＢＨモチーフを含む。このようなタンパク質は、ＪｍｊＣファミリー（全てが２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼであるわけではない）（Ｃｌｉｓｓｏｌｄ＆Ｐｏｎｔｉｎｇ（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６：７−９）を含むが、これに限定しない。ＤＳＢＨモチーフはまた、機能的に多様性のあるｃｕｐｉｎスーパーファミリー（Ｄｕｎｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６５：７−１７）にも、特徴的である。ヒトタンパク質ｐｉｒｉｎ（Ｐａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１４９１−１４９８）もまたＤＳＢＨモチーフを含むが、これは２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼではない。ＤＳＢＨモチーフを含む２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼの１つが、ＦＩＨである。ＦＴＯのアリルバリアントは、以前から体重増加に関係しているが、ＦＴＯは、２−ＯＧ依存性オキシゲナーゼとして見なされていなかったし、ＤＳＢＨ構造モチーフも含むとも見なされていなかった。 ＦＴＯのＣ末端へリックスドメインは、２ＯＧオキシゲナーゼと関連することは公知でない。 ＡｌｋＢに代表される２−ＯＧオキシゲナーゼのサブファミリー内に存在する他の特徴と同様に、ＦＴＯが２−ＯＧ鉄依存性オキシゲナーゼに特徴的なＦｅ（ＩＩ）及び塩基性残基（ここではアルギニン）と結合するために使用する保存された２−Ｈｉｓ−１−カルボン酸の表面トリアドを提示していることも、配列解析で示した。実施例２：ＦＴＯのクローニング マウスｆｔｏの全長をコードするｃＤＮＡ配列を、以下のＰＣＲ反応にて、制限酵素部位の突出部を有する、市販の合成オリゴヌクレオチドプライマー（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ）ｍｆｔｏ１ｆ（配列：５’−ＧＣＴＡＧＣＡＴＧＡＡＧＣＧＣＧＴＣＣＡＧＡＣＣ−３’）及びｍｆｔｏ１ｒ（配列：５’−ＧＡＡＴＴＣＣＴＡＧＧＡＴＣＴＴＧＣＴＴＣＣＡＧＣＡＧ−３’）を使用して、Ｉｍａｇｅクローン ＩＭＧＣＬＯ４２３７２６１から増幅した：条件：鋳型ＤＮＡ １５０ｎｇ ｍｆｔｏ１ｆ（１０μＭ） １μｌ ｍｆｔｏ１ｒ（１０μＭ） １μｌＭｇＣｌ２（５０ｍＭ） １μｌ ｄＮＴＰ（各１０ｍＭ） １μｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）１０ｘ ポリメラーゼ緩衝液 ５μｌＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ １μｌ （ポリメラーゼ緩衝液はＳｔｒａｔａｇｅｎｅから） Ｈ２Ｏ 全量が５０μｌになるまで添加 完了したＰＣＲ反応液をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）にて精製し、サンプルをＴＡＥ緩衝液とともに１％アガロースゲル上にて泳動した。ＰＣＲ産物を、ＮｈｅＩ及びＥｃｏＲＩ（どちらもＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で、３７℃にて一晩反応して消化した： ＤＮＡ １μｇＮｈｅＩ（１００００ユニット／ｍｌ） ２μｌＥｃｏＲＩ（２００００ユニット／ｍｌ）２μｌ１０ｘＥｃｏＲＩ緩衝液 ５μｌ１００ｘＢＳＡ ０．５μｌＨ２Ｏ 全量が５０μｌになるまで添加 次いで、反応混合物を、ＴＡＥ緩衝液中で１％アガロースゲル上にて泳動し、消化したＰＣＲ産物に相当するバンドを切り出して、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）にてゲルからＤＮＡを抽出した。 抽出したＤＮＡを、同様に制限処理して精製したｐＥＴ−２８ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）中に、一晩氷上にてＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してライゲーションした：ベクター ５０ｎｇ ＰＣＲ産物 ４２ｎｇ１０ｘＴ４緩衝液 ２μｌＴ４ ＤＮＡリガーゼ（４０００００ユニット／ｍｌ） ０．５μｌＨ２Ｏ 全量が２０μｌになるまで添加 製造業者の指示書にしたがって、５０μｌのＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１０ Ｇｏｌｄ（登録商標）細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、この反応混合物４μｌで形質転換した。細胞を、２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢプレート上にて３７℃で一晩増殖させた。 次の日、８コロニーをプレートからピックアップし、それぞれ２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含む５ｍｌの２ＹＴ培地に再懸濁し、環境条件の振とう器にて３７℃で一晩インキュベートした。 次の日、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、これらの液体培養からプラスミドを単離し、サンプルをＥｃｏＲＩ及びＮｈｅＩにて、３７℃で３時間、コントロールの制限消化した：少量調製したＤＮＡ ３μｌＮｈｅＩ（１００００ユニット／ｍｌ） １μｌＥｃｏＲＩ（２００００ユニット／ｍｌ） １μｌ１０ｘＥｃｏＲＩ緩衝液 ２μｌ １００ｘＢＳＡ ０．２μｌＨ２Ｏ 全量が２０μｌになるまで添加 サンプルを１％アガロースゲルで解析し、ｍｆｔｏ挿入物を含むことが分かった。１つのサンプルについて、外注のシーケンス配列決定を行い（Ｇｅｎｅｓｅｒｖｉｃｅ）、所望の挿入物を含むことが分かった。このプラスミドを、ｍｆｔｏ−ｐＥＴ−２８ａと呼ぶ。実施例３：ＦＴＯの発現及び精製 製造業者の指示書にしたがって、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をＭｆｔｏ−ｐＥＴ−２８ａで形質転換し、上記のようにカナマイシンを含むＬＢプレート上で増殖させた。発現試行により、３７℃、２８℃及び２１℃にて中程度の可溶性発現が見られ、温度が下がると不溶性物質の量が減少した。 発現させるために、形質転換プレートからシングルコロニーをピックアップし、１００ｍｌの２ＹＴ＋カナマイシン培地に再懸濁し、環境条件の振とう器にて３７℃にて一晩増殖させた。翌日、６ｍｌの各一晩培養液を、１２倍量の６００ｍｌの２ＹＴ＋カナマイシンに接種して、培養物がＯＤ６００が１．０に到達するまで環境条件の振とう器にて３７℃で増殖させた。この段階にて、培養物を２１℃に１時間シフトした後に、ＩＰＴＧを最終濃度０．２５ｍＭになるようにそれぞれに添加した。２１℃にて９時間インキュベーションを続けた後、細胞を遠心分離によって回収し（全部で６０ｇ）、−８０℃にて保存した。 細胞ペレットを、細胞１グラムあたりスパチュラ先端量のＤＮＡｓｅＩを含む、５ｍｌの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール、１ｍＭ ＭｇＣｌ２中に再懸濁した。３０ｍｇフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ、プロテアーゼ阻害剤）を添加して、細胞を氷上にて超音波処理によって溶解させた。破片を除去するために遠心分離した後（Ｂｅｃｋｍａｎ ＡｖａｎｔｉＴＭ Ｊ−２５遠心分離機、ＪＡ２５．５０ローター、２２０００ｒｐｍ、２０分、４℃）、上清をデカンテーションし、０．４５μｍ Ｏｍｎｉｐｏｒｅフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ過して、１０ｍｌのＨｉｓ−Ｂｉｎｄ（登録商標）カラム（Ｎｏｖａｇｅｎ）に流速０．５ｍｌ／分にて載せた。カラムを、２ｍｌ／分にて、２５０ｍｌの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、０．５Ｍ ＮａＣｌ、４０ｍＭ イミダゾールで洗浄し、次に２．５ｍｌ／分にて、１００ｍｌの２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、０．５Ｍ ＮａＣｌ、４０ｍＭ イミダゾール、５ｍＭ ＡＴＰ二カリウム塩で洗浄した：この工程で、ＨｉｓタグとＦＴＯタンパク質間のペプチドリンカーに結合しているＥ．ｃｏｌｉのシャペロンを除去しなければならない。最初の洗浄緩衝液１００ｍｌにてもう一度洗浄した後、結合したタンパク質を、２．５ｍｌ／分にて、３５ｍｌの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５００ｍＭ イミダゾールを使用して、等張溶出にて溶出した。 ＦＴＯを含む画分（ＳＤＳ＿ＰＡＧＥ解析によると、＞９０％純粋）を、Ａｍｉｃｏｎ−１５ ５０００分画分子量限外ろ過装置を使用して、最終量３ｍｌまで濃縮し、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、０．０５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴにて平衡化した３００ｍｌのＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２００ゲルろ過カラム上に載せた。ゲルろ過工程は、溶出量が７０ｍｌにて回収を開始して、１０ｍｌ画分にて、３ｍｌ／分で行った。実施例４：精製したＦＴＯでの２−オキソグルタル酸脱カルボキシル化アッセイ ２−ＯＧターンオーバーアッセイを使用して酵素活性について、ＦＴＯを試験した（Ｋｉｖｉｒｉｋｋｏ ａｎｄ Ｍｙｌｌｙｌａ（１９８２）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ８２：４４１２−４４２１）。特定の試薬（Ｆｅ２＋、アスコルビン酸塩又はＤＴＴ）が入っておらず、０．５ｍＭの濃度のＮ−オキサリル−グリシン（ＮＯＧ）、一般的なＦｅ２＋−２ＯＧ−ジオキシゲナーゼ阻害剤が存在する様々な緩衝液にて、全ての必要な共因子とともにＦＴＯをインキュベートした。Ｆｅ２＋（（ＮＨ４）２Ｆｅ（ＩＩ）（ＳＯ４）２の形態にて添加）及び２ＯＧに加えて、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及びアスコルビン酸ナトリウム塩を反応混合物に添加した：ＤＴＴは、Ｆｅ２＋の維持を補助する還元剤である。アッセイの構成要素：１１．５μＭ ＦＴＯ１４４μＭ ２ＯＧ１６μＭ １４Ｃ−２ＯＧ８０μＭ （ＮＨ４）２Ｆｅ（ＩＩ）（ＳＯ４）２１ｍＭ ＤＴＴ４ｍＭ アスコルビン酸塩 これを、５０ｍＭ トリス、ｐＨ７．５にて、全量が１００μｌになるまで希釈した。全ての試薬を混合して、５ｍｌのプラスチックのスクリューキャップ付チューブにピペットで入れ、ＦＴＯは別にチューブに添加した。２００μｌのハイアミンヒドロキシド（Ｈｙａｍｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＣＯ２捕獲剤）を含む５００μｌのエッペンドルフチューブを各チューブに添加して、チューブをゴムのセプタムにて閉めた。環境条件の振とう器にて３７℃で３０分インキュベーションした後、２００μｌのメタノールを内容物に添加し、チューブを３０分間氷上において反応をクエンチさせた。ハイアミンヒドロキシドを含むエッペンドルフチューブを、シンチレーションバイアルに移し、５ｍｌのＯｐｔｉＰｈａｓｅ液体シンチレーションカクテル（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と混合して、Ｂｅｃｋｍａｎ ＬＳ６５００多目的シンチレーションカウンターを使用して１４Ｃの全カウントを定量した。 最初のアッセイの結果を、以下の表１に示す（総カウント−出発時の２−ＯＧの全カウント及び図４にて）。結果から、ＦＴＯの２−ＯＧターンオーバー活性は、共因子Ｆｅ（ＩＩ）により刺激されて、Ｎ−オキサリルグリシン（多くの２−ＯＧオキシゲナーゼの阻害剤）により阻害されることが明らかとなった。活性はまた、アスコルビン酸塩(他の２−ＯＧオキシゲナーゼに関しては、天然基質の代替として機能し得る)の添加によってもまた刺激される。 ［１−１４Ｃ］−２ＯＧから［１４Ｃ］−二酸化炭素への変換をモニターする、ＦＴＯでの２ＯＧ非共役ターンオーバーアッセイから、ＦＴＯが２ＯＧの脱カルボキシル化を触媒すること、反応は、アスコルビン酸塩及びＦｅＳＯ４により刺激されることが明らかとなった（図８ａ）。２ＯＧターンオーバーは、公知の２ＯＧオキシゲナーゼ阻害剤（図８ｂ）及びＦｅ（ＩＩ）及びアスコルビン酸塩の非存在により阻害された。実施例５：ＦＴＯ阻害剤を検出するための２−ＯＧオキシゲナーゼアッセイの使用 実施例４に説明した方法を使用して、様々な２−ＯＧオキシゲナーゼ阻害剤を、ＦＴＯオキシゲナーゼ活性の活性を阻害する能力について、スクリーニングした。試験した阻害剤は以下の通りである：ＮＯＧ＝Ｎ−オキサリルグリシン ＮＯＦＤ＝Ｎ−オキサリル Ｄ−フェニルアラニン Ｐ−２−４−ＣＤ−ピリジン−２，４−ジカルボン酸 Ｐ−２−４−ＣＤ−ピリジン−２，５−ジカルボン酸 化合物４１及び化合物１６は、以下に説明する構造を有する。実施例６：脱メチル化アッセイ 実施例２に説明する方法を使用するが、未標識の２ＯＧのみを使用して、様々な潜在的な基質を、ＦＴＯによる脱メチル化についてスクリーニングした。結果を図５及び６に示す。結果は、使用したアッセイ条件下にて、ＦＴＯが３−メチルチミン及び３−メチルシトシン残基の脱メチル化（３メチルチミン残基を好む）を触媒することを示している。 合成１本鎖１−メチルアデニン（１−ｍｅＡ）がメチル化したオリゴヌクレオチド、Ｌｙｓ−９がメチル化したヒストンＨ３、低酸素症誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）サブユニット断片、ＩκＢα及び補酵素Ａ誘導体を含む、潜在的なＦＴＯ基質をスクリーニングした。１−ｍｅＡがメチル化したオリゴヌクレオチドのみが、有意に２ＯＧのターンオーバーを刺激した（図６ａ）。この活性は、Ｎ−オキサリルグリシン、フマル酸及びコハク酸（これらは２ＯＧ非共役ターンオーバーアッセイにおける阻害剤でもある）によって阻害した（図６ｃ）。 ＤＮＡ脱メチル化を直接モニターするＬＣ−ＭＳアッセイを使用して（放射性標識した（共）基質又は共役アッセイの必要はない）、我々は、ＦＴＯがＦｅ（ＩＩ）及び２ＯＧ依存的なＤＮＡの脱メチル化を触媒することを示した。この活性を、他の２ＯＧオキシゲナーゼについて観察したように、アスコルビン酸塩が刺激した（図６ｂ）。反応を低酸素条件下にて行った場合、ターンオーバーの有意な減少を観察した。コハク酸の生成について、１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）解析により証明し、ホルムアルデヒドの生成についてはペンタフルオロフェニルヒドラジンでの誘導化により確認した。 付与されているＦｅ（ＩＩ）結合及び２ＯＧ ５−カルボン酸結合残基の予測された役割を試験するために、Ｈｉｓ−３０４及びＡｒｇ−３１３のアラニン置換変異体を構築した。Ｈｉｓ−３０４変異体は、２ＯＧターンオーバーの有意な減少を示し、一方でＡｒｇ−３１３変異体は活性がなくなった（図６ｂ）。 １箇所がメチル化された１本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓ−ＤＮＡ）を使用して、ＦＴＯ活性についてさらに調査した：１−メチルアデニン（１−ｍｅＡ）、１−メチルグアニン（１−ｍｅＧ）、３−メチルシトシン（３−ｍｅＣ）及び３−メチルチミン（３−ｍｅＴ）（図７ｂ）。ｐＨ７．５でのアッセイ条件下にて、ｓｓ−ＤＮＡでは、ＦＴＯは、１−ｍｅＡ又は３−ｍｅＣよりも３−ｍｅＴに対する好みを示し；１−ｍｅＧはＦＴＯ基質ではないことが分かった（図７ａ）。先行する報告と一致して、我々は、ＡＢＨ２及びＡＢＨ３のリコンビナント形態は、ｓｓ−ＤＮＡ基質では、３−ｍｅＣ及び１−ｍｅＡ及び３−ｍｅＴに対する好みを示し、我々の条件下では３−ｍｅＴの脱メチル化は非常に低いレベルしか見られないことを見出した。３−ｍｅＴ基質をＦＴＯが好むことは、メチル化したポリ（ｄＡ）及びポリ（ｄＴ）からのホルムアルデヒドの放出を測定するアッセイにおいても観察した（図７ｃ）。実施例７：ＦＴＯの局在 ＦＴＯはＤＮＡ脱メチル化を触媒するので、核に局在するであろうと予測された。実際に、共焦点像により、ＹＦＰそのものは細胞質のみに存在する一方で、黄色蛍光タンパク質を付加したＦＴＯ（ＹＦＰ−ＦＴＯ）は、核に濃縮することが分かった。興味深いことに、ＦＴＯは、ＡＢＨ３よりもさらにずっと効果的に核に局在した。 ２ＯＧオキシゲナーゼが触媒する翻訳後のヒドロキシル化は、低酸素反応における転写制御の中心であり、２ＯＧオキシゲナーゼはヒストン脱メチル化を触媒する。ＦＴＯの触媒活性は、核酸の脱メチル化による代謝に含まれる遺伝子の転写を、同様に制御してよい。あるいは、ＦＴＯ（ＡＢＨ２を提案する）は、核酸修復酵素として機能し得る可能性がある：遺伝的修復プロセスの崩壊が肥満及びメタボリック症候群を導くという証拠がある。生理的ｐＨにおける上記で使用したアッセイ条件下にて、同定したＦＴＯの好ましい基質は、ＤＮＡの３−メチルチミン（メチル化試薬にＤＮＡをさらすと生成する、マイナーであるが安定な損傷である）であった。 ＦＴＯ活性のアッセイ方法であって、該方法がＦＴＯポリペプチドのオキシゲナーゼ活性をモニターすることを含む、方法。 酸素が共基質として使用される、請求項１に記載の方法。 鉄が共因子として使用される、請求項１又は２に記載の方法。 ２−オキソ酸が共基質として使用される、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。 ２−オキソグルタル酸が共基質として使用される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。 オキシゲナーゼ活性が還元剤存在下にてモニターされる、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。 前記還元剤がアスコルビン酸塩もしくはそのアナログ、チオール又はホスフィンである、請求項６に記載の方法。 オキシゲナーゼ活性が基質存在下にて測定される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。 前記基質がペプチド又は核酸基質である、請求項８に記載の方法。 前記ＦＴＯポリペプチドがリコンビナントポリペプチドである、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。 前記ＦＴＯポリペプチドが、以下を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法：（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；及び（ｂ）全長にわたって、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも４０％の同一性を有するアミノ酸配列。 全長にわたって、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも４０％の同一性を有する前記アミノ酸配列が、ヒトＦＴＯ又はヒト以外の種由来のＦＴＯホモログの、天然に生じるバリアントである、請求項１１に記載の方法。 全長にわたって、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも４０％の同一性を有する前記アミノ酸が、配列番号２から１１のうちいずれか１つに示されるアミノ酸配列である、請求項１１又は１２に記載の方法。 さらに以下の工程を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法： （ｉ）ＦＴＯポリペプチドを試験剤と接触させる工程； （ｉｉ）該試験剤存在下にてオキシゲナーゼ活性をモニターする工程；かつ （ｉｉｉ）該試験剤がＦＴＯ活性の阻害剤又は活性化剤であるかどうかを決定する工程。 前記試験剤が、ＦＴＯ以外の２−ＯＧオキシゲナーゼの既報の阻害剤であるか、又はこのような阻害剤のアナログもしくはバリアントである、請求項１４に記載の方法。 前記２−ＯＧオキシゲナーゼが、プロコラーゲンプロリルもしくはリシルヒドロキシラーゼ、低酸素症誘導因子プロリルヒドロキシラーゼ、メチル化したリシルデメチラーゼ（ヒストンデメチラーゼを含む）、アスパラギニルヒドロキシラーゼ、ホスファチジルセリン受容体（Ｊｍｊｄ６）、ＡｌｋＢもしくはヒトＡｌｋＢホモログ及び／又はジベレリンＣ−２０オキシダーゼである、請求項１５に記載の方法。 前記阻害剤が、Ｎ−オキサリルグリシンもしくはそれらの誘導体などのＮ−オキサリルアミノ酸、グリシンもしくはアラニン誘導体、２−オキソ酸アナログ、フラボノイド又はゲニステインなどのフラボノイド誘導体である、請求項１５又は１６に記載の方法。 前記試験剤が、２−ＯＧもしくはＦＴＯ基質とＦＴＯ活性部位において競合し、及び／又はＦＴＯ活性部位において金属と結合する、請求項１４から１７のいずれか１項に記載の方法。 前記試験剤が金属イオンを含む、請求項１４から１８のいずれか１項に記載の方法。 前記試験剤が還元剤である、請求項１４に記載の方法。 前記還元剤が、ＦＴＯ以外の２−ＯＧオキシゲナーゼの既報の活性化剤である、請求項２０に記載の方法。 前記還元剤が、アスコルビン酸塩もしくはアスコルビン酸塩アナログ又はジチオスレイトールなどのチオール還元剤又はホスフィン化学ファミリーの還元剤である、請求項２０又は２１に記載の方法。 ＦＴＯ以外の酵素を使用して前記方法工程を繰り返す工程、かつ前記試験剤がＦＴＯ又は他の酵素を選択的に阻害又は活性化するかどうかを決定する工程をさらに含む、請求項１４から２２のいずれか１項に記載の方法。 前記ＦＴＯ以外の酵素が、２−ＯＧオキシゲナーゼである、請求項２３に記載の方法。 前記２−ＯＧオキシゲナーゼが、プロリルもしくはアスパラギニルヒドロキシラーゼなどの低酸素症誘導因子ヒドロキシラーゼ、コラーゲンもしくはプロコラーゲンプロリルヒドロキシラーゼ、ＡｌｋＢホモログなどの核酸デメチラーゼ、又はトリ、ジもしくはモノメチルリシンもしくはアルギニン残基デメチラーゼなどのタンパク質デメチラーゼである、請求項２４に記載の方法。 前記タンパク質デメチラーゼが、メチル化したヒストン又はそれらの断片をヒドロキシル化する、請求項２５に記載の方法。 前記基質が、核酸、核酸誘導体又はアナログである、請求項８から２６のいずれか１項に記載の方法。 前記基質が、メチル化した核酸、誘導体又はアナログである、請求項２７に記載の方法。 前記メチル化した核酸配列が、ａｇｏｕｔｉ遺伝子又はニューロペプチドＹ遺伝子などの、体重調節に関する遺伝子と関連している、請求項２８に記載の方法。 以下の工程をさらに含む、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法： （ｉ）ＦＴＯポリペプチドを試験基質と接触させる工程； （ｉｉ）オキシゲナーゼ活性をモニターする工程；かつ （ｉｉｉ）該試験基質がＦＴＯの基質であるかどうかを決定する工程。 前記試験基質が、ヒト核酸配列である、請求項３０に記載の方法。 前記核酸配列が、３−メチルチミン塩基、１−メチルアデニン塩基又は３−メチルシトシン塩基を含む、請求項３１に記載の方法。 前記基質が、メチル化したタンパク質又はペプチドである、請求項３２に記載の方法。 ＦＴＯ阻害剤が、基質の同定に先だって、ＦＴＯと基質との間の相互作用を安定化させることによって、前記ＦＴＯ基質の同定を可能にするために使用される、請求項３０から３３のいずれか１項に記載の方法。 ＦＴＯ活性を調節するための、２−ＯＧオキシゲナーゼ活性の阻害剤又は活性化剤の使用。 体重増加もしくは体重減少を処置もしくは予防する方法、又は体重増加もしくは体重減少に関連する疾患を処置もしくは予防する方法における使用のための、ＦＴＯオキシゲナーゼ活性の調節剤。 前記調節剤が、請求項１５から２２のいずれか１項に定義する阻害剤又は活性化剤である、請求項３６に記載の調節剤。 前記調節剤が、請求項２３から２６のいずれか１項にしたがう方法によって同定可能な、選択的なＦＴＯオキシゲナーゼ活性である、請求項３６に記載の調節剤。 体重増加又は体重減少を処置又は予防することを必要とする個体における体重増加又は体重減少を処置又は予防する方法であって、該方法が、ＦＴＯオキシゲナーゼ活性の阻害剤又は活性化剤の治療上有効量を個体に投与することを含む、方法。 体重増加又は体重減少に関連する疾患を処置又は予防することを必要とする個体における体重増加又は体重減少に関連する疾患を処置又は予防する方法であって、該方法が、ＦＴＯオキシゲナーゼ活性の阻害剤又は活性化剤の治療上有効量を個体に投与することを含む、方法。 体重増加に関連する前記疾患が、肥満、癌、心臓病、高血圧、高コレステロールレベル、インシュリン耐性、糖尿病、胆石、睡眠時無呼吸、変形性関節症、痛風、脂質異常症、ピックウィック症候群及び／又は不妊症であり、体重減少に関連する前記疾患が、拒食症、過食症、低栄養、骨粗しょう症、不妊症及び／又は低下した免疫能力である、請求項４０に記載の方法、又は請求項３６から３８のいずれか１項に記載の調節剤。 体重増加に関連する前記疾患が、肥満又は糖尿病である、請求項４１に記載の方法又は調節剤。 本発明は、オキシゲナーゼ活性のアッセイ方法を提供し、該方法は、ＦＴＯのオキシゲナーゼ活性をモニターすることを含む。【選択図】なし 配列表