生命科学関連特許情報
| タイトル： | 特許公報(B2)_γ−アミノ酪酸の定量方法 |
| 出願番号： | 2010508221 |
| 年次： | 2014 |
| IPC分類： | C12Q 1/32,C12Q 1/52 |
特許情報キャッシュ
吉橋 忠 ワルニー バラニャノン パチャリ タントラクン ビパ スロジャナメタクン JP 5413781 特許公報(B2) 20131122 2010508221 20090414 γ−アミノ酪酸の定量方法 独立行政法人国際農林水産業研究センター 501174550 平山 一幸 100082876 吉橋 忠 ワルニー バラニャノン パチャリ タントラクン ビパ スロジャナメタクン JP 2008106488 20080416 20140212 C12Q 1/32 20060101AFI20140123BHJP C12Q 1/52 20060101ALI20140123BHJP JPC12Q1/32C12Q1/52 Ｃ１２Ｑ １／３２ Ｃ１２Ｑ １／５２ ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ） ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ） 特開２００５−３０４４８３（ＪＰ，Ａ） 特開２００２−３５５０９５（ＪＰ，Ａ） 特開昭５８−１２９９９４（ＪＰ，Ａ） 生化学辞典，株式会社 東京化学同人，１９９８年，第３版，p.1010 Anal Chim Acta., 328 (1996) p.41-46 臨床検査, 41[9] (1997) p.995-1000 Food Res Int, 34 (2001) p.393-399 BioTechniques, 19[4] (1995) p.640-649 7 JP2009057537 20090414 WO2009128461 20091022 8 20101012 馬場 亮人 本発明は、γ−アミノ酪酸（以下、ＧＡＢＡということもある。）を、試料中に含まれる各種アミノ酸の影響を受けずに、比色分析によって簡易・迅速に定量する方法に関する。 ＧＡＢＡは天然界に広く存在するアミノ酸の一種であり、血圧降下作用や、精神安定作用などの生理機能性が知られている。この作用を期待し、ＧＡＢＡを添加、あるいは強化した食品が多く製造されている（特許文献１参照）。また、穀類種子にはＧＡＢＡは少量しか含まれていないが、種子を発芽させることによりＧＡＢＡ含有量が増加することが知られている（特許文献２参照）。 穀類種子のＧＡＢＡの増加は、収穫後処理や品質により異なり、また、発芽処理等がされＧＡＢＡ含量を強化した食品においては、その発芽処理によって確実にＧＡＢＡが増加していることを消費者に対して保証することが求められている。 特許文献３には、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフェート又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフェートをアルカリフォスターゼによって脱リン酸化反応させて、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドへ変換し、そして、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを電子伝達体の存在下でテトラゾリウム塩と反応させて生成したホルマザン色素を測定するアルカリフォスターゼ活性の測定法が開示されている。特開２００７−１５９０１７号公報特開２００３−２５０５１２号公報特開２００５−３０４４８３号公報 しかし、飲食品のように各種アミノ酸を含有する試料中のＧＡＢＡを定量するに際し、特許文献３の方法を適用した場合、混在するアミノ酸の影響でホルマザン色素が沈殿し、正確な測定を行うことができない。このため、飲食物中のように各種アミノ酸が混在するＧＡＢＡの定量分析では、混合する種々のアミノ酸の影響を排除するため、アミノ酸分析計やＨＰＬＣ等の高額機器を用いた分離分析法が用いられている。しかし、このような分離分析法では、高額機器を必要とするうえに、多検体を同時に分析することはできない。そのため、製品に表示されるＧＡＢＡ含量は、製品中に実際に含まれているＧＡＢＡ含量を必ずしも保証するには至っていないという問題が指摘されている。 上記したように、飲食品のような各種アミノ酸を含有する試料中のＧＡＢＡを定量する方法は、幾つかの課題を有する。すなわち、ホルマザン色素を測定する方法では、混在するアミノ酸の影響をうけ、正確な測定がほとんど不可能であり、また分離分析法では、高額機器を必要とするうえに、多検体を同時に分析することはできないため効率が悪い。 本発明は、これらの課題を解決しようとするものであって、アミノ酸分析計やＨＰＬＣ等の高額機器を用いることなく、しかも、検体に含まれる各種アミノ酸等の影響を受けることなく、少量多検体の試料に含まれるＧＡＢＡを同時に且つ簡易・迅速に定量する方法を提供することを目的としている。 ＧＡＢＡｓｅは、微生物やトマトなど様々な生物に存在する酵素複合体であり、ＧＡＢＡアミノ基転移酵素活性及びコハク酸脱水素酵素活性を併せ持つ。発明者等は、本酵素によるＧＡＢＡからのコハク酸セミアルデヒド生成と、生成したコハク酸セミアルデヒドが酸化される際、補酵素の酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸が、還元型へ定量的に変換されることに着目し、生成した還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸から、電子供与体を介した水溶性ヒドラゾンの生成をカップリングさせた。この結果、ＧＡＢＡからのコハク酸への変換と水溶性ヒドラゾンの生成がカップリングして行われ、比色法によってＧＡＢＡの定量を行うことが可能となった。さらに、比色法を利用することで、比較的安価なマイクロプレートリーダーを使用することが可能となるとともに、反応系を縮小することに成功し、本発明の完成に至った。 すなわち、本発明は、飲食品のように各種アミノ酸を含有する試料中のγ−アミノ酪酸を定量する方法であって、（１）試料と、γ−アミノ酪酸アミノ基転移酵素と、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素とを反応させて還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフェートを生成させた後、反応溶液のｐＨを２以下にするする工程と、（２）水溶性ホルマザン色素を生成させるテトラゾリウム塩の存在下、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフェートと電子伝達体とを反応させて水溶性ホルマザン色素を生成させる工程と、（３）水溶性ホルマザン色素を測定する工程と、を含むことを特徴とする。 本発明は、ＧＡＢＡに特異的なアミノ基転移酵素及びその生成物に特異的な補酵素としてＮＡＤＰを要求する脱水素酵素を作用させ、ＮＡＤＰＨを生成し、ついで、ＮＡＤＰＨに水溶性テトラゾリウム塩の存在下、電子伝達体を作用させ、生成する水溶性ホルマザン色素を測定することによりＧＡＢＡを簡易に定量できるので以下の効果を有する。 本発明方法によれば、アミノ酸分析計やＨＰＬＣ等の高額機器を必要としないので経済的であると共に、検体に含まれる各種アミノ酸等の影響を受けることなく、少量多検体の試料に含まれるＧＡＢＡを同時に且つ簡易・迅速に定量することができる。 本発明方法によれば、コメなどの食品に含まれるＧＡＢＡを同時に且つ迅速に定量することができるので、生理機能が注目されて様々な食品に添加されているＧＡＢＡの食品中の含量を測定することが可能となり、これらの製品中に含まれるＧＡＢＡ含量を保証することができる。 さらに、コメ内在の代謝酵素群を利用したＧＡＢＡの生成を利用してＧＡＢＡを強化した発芽玄米製品においても、ＧＡＢＡ含量の表示をより正確に行うことが可能になり、玄米の発芽処理の失敗により生じるＧＡＢＡ含量の少ない製品の検査に利用することが可能である。また、本発明によって発芽処理によるＧＡＢＡ含量の品種間差を容易に検定することが可能となるため、発芽玄米に向く品種の選抜等に貢献する。ＧＡＢＡ定量の原理説明図である。ＧＡＢＡ標準試料を用いた検量線図である。Ｄａｂｓｙｌ誘導化ＨＰＬＣ法での定量と本発明による定量の比較線図である。タイ国における各種品種でのＧＡＢＡ生成能の検討図である。 以下、本発明を実施するための最良の形態を実施例により説明する。なお、本発明は、これら実施例に限定されるものでないことは勿論である。 本発明のＧＡＢＡの定量方法は、各種アミノ酸、特に、ＧＡＢＡと構造の類似するグルタミン酸等のアミノ酸を排除するために、特異的なアミノ基転移酵素、及び補酵素として酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフェート（以下、ＮＡＤＰという。）を要求する脱水素酵素（以下、ＮＡＤＰ要求性脱水素酵素ともいう。）であるコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素を用い、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフェート（以下、ＮＡＤＰＨという。）を生成させた後に反応溶液のｐＨを２以下にする工程と、生成したＮＡＤＰＨに水溶性ホルマザン色素を生成させるテトラゾリウム塩の存在下、電子伝達体を作用させ、生成した水溶性ホルマザン色素を測定する工程とからなる。 ここで、各種アミノ酸とは、前述したグルタミン酸の他、ＧＡＢＡと類似する構造を有するアミノ酸、たとえば、グルタミン酸、セリン、グリシン、ヒスチジンである。 アミノ基転移酵素は、ＧＡＢＡアミノ基転移酵素（以下、ＧＡＢＡ−Ｔという。）、ＮＡＤＰ要求性脱水素酵素は、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素（以下、ＳＳＡＤＨという。）を例示することができる。 電子伝達体は、人工電子伝達体、たとえばフェナジンメント硫酸塩（以下、ＰＭＳという。）、１−メトキシフェナジンメント硫酸塩（以下、１−ＭｅＯ−ＰＭＳという。）、フェナジンエト硫酸塩（以下、ＰＥＳという。）を例示することができる。 水溶性ホルマザン色素を生成させるテトラゾリウム塩は、例えば２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムナトリウム塩（以下、ＷＳＴ−８という。）を例示することができる。 本発明の原理を図１に示す。本発明は、飲食品のように各種アミノ酸を含有する試料中のγ−アミノ酪酸を定量する方法であって、γ−アミノ酪酸アミノ基転移酵素とＮＡＤＰ要求性脱水素酵素の二酵素系で、γ−アミノ酪酸アミノ基転移酵素に特異的なＮＡＤＰＨを生成したのち反応溶液のｐＨを２以下にする第一工程と、テトラゾリウム塩を第一工程で生成したＮＡＤＰＨで還元して水溶性ホルマザン色素を生成し、水溶性ホルマザン色素の色を測定する第二工程からなる。すなわち、ＧＡＢＡ−Ｔ及びＳＳＡＤＨでＮＡＤＰからＮＡＤＰＨへの変換を行った後、反応溶液のｐＨを２以下にする第一工程と、水溶性ホルマザン色素を生成させるテトラゾリウム塩の存在下、ＮＡＤＰＨから電子伝達体を介して生成する水溶性ホルマザン色素により生じる色（黄色）を測定する第二工程とからなる。 第一工程において、反応溶液を酸性にせず、水溶性ホルマザン色素を生成させるテトラゾリウム塩と電子伝達体を添加すると、酵素反応非特異的なテトラゾリウム塩の還元反応が同時に進行し、ＧＡＢＡの正確な測定ができない。 また、水不溶性のホルマザン色素を生成させるテトラゾリウム塩を用いた場合には、還元されて生成したホルマザン色素が沈殿するため、正確な測定が困難となる。 反応溶液のｐＨを２以下にする操作は、塩酸や硫酸等の酸を添加すればよい。また、反応溶液を酸性にすることにより酵素が失活する。以下に、幾つかの実施例を示して本発明をさらに具体的に説明する。 本発明のＧＡＢＡの定量に及ぼすアミノ酸の影響を調べた例を以下に示す。 ＧＡＢＡｓｅ、ＮＡＤＰを含有する以下のような試薬１、反応停止液である試薬２及び１−ＭｅＯ−ＰＭＳ、ＷＳＴ−８を含有する試薬３を調整した。 試薬１ １００ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．９） １０ｍＭ α−ケトグルタル酸 ２ｍＭ ２−メルカプトエタノール ０．５ｍＭ ＮＡＤＰ ０．２５Ｕ／ｍＬ ＧＡＢＡｓｅ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来） 試薬２ １Ｍ 硫酸 試薬３ １−ＭｅＯ−ＰＭＳ、ＷＳＴ−８混合試薬（和光純製薬Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８） これらの試薬を使用し、以下の手順によりＧＡＢＡ濃度を測定した。すなわち、試料としてＧＡＢＡの濃度を０．１ｐｐｍ、０．５ｐｐｍ、１ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、２０ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍとなるよう調製した水溶液を用い、試料１００μＬに９０μＬの試薬１を加え、その後これを３０℃にて１５分間加温し、ついで、１０μＬの試薬２を混合し、さらに５μＬの試薬３を加え、マイクロプレートリーダー（Ｔｅｋａｎ社製 Ｓａｐｐｈｉｒｅ）にて波長４７０ｎｍにおける吸光度をエンド法に基づき測定した。また、試料にグルタミン酸、セリン、グリシン、ヒスチジンを１００ｐｐｍ加えたものも測定した。図２に示すように、ＧＡＢＡは５０ｐｐｍまでの間で相関係数は０．９９９であり、高い直線性を示し、定量的に測定可能であった。また、グルタミン酸、セリン、グリシン、ヒスチジン等他のアミノ酸の影響も受けないことが明らかになった。 食品中のＧＡＢＡを定量した。 各種精白米・玄米・発芽玄米の水抽出物中のＧＡＢＡ含量を、Ｄａｂｓｙｌ誘導体化−ＨＰＬＣ法によって測定し比較したところ、図３のように、０．９９９の非常に高い相関が得られた。このことからＨＰＬＣ法と同等の精度での比色分析による定量が可能であることが分かった。 発芽玄米中のＧＡＢＡを定量した。 精白米・玄米を水に浸漬し、発芽させた場合におけるＧＡＢＡの定量を行った。タイ国産の各種玄米試料を水浸漬処理し、処理前後のＧＡＢＡ含量を実施例１に示す方法により測定したところ、低温乾燥米と天日乾燥米ではＧＡＢＡ含量の増加が確認された。一方、タイ国において雨期に広く適用されている高温乾燥処理されたコメでは、ＧＡＢＡ生成酵素が失活しているが、図４のようにＧＡＢＡの増加は認められず、本法の信頼性が確認された。 チョコレート中のＧＡＢＡを定量した。 市販チョコレート中に含まれるＧＡＢＡの定量を本法及びＨＰＬＣ法で行った。ＧＡＢＡ添加チョコレート及び通常のチョコレートを熱水抽出し、ＧＡＢＡ含量を実施例１に示す方法により測定した。ＧＡＢＡ添加チョコレートでは２８９５±８４ｐｐｍのＧＡＢＡが定量され、同一条件下では、通常のチョコレートからはＧＡＢＡが検出されなかった。ＨＰＬＣ法においては、ＧＡＢＡ添加チョコレートでは２９６５±５４ｐｐｍ、通常のチョコレートでは検出されなかった。これらの結果から、ＧＡＢＡ添加食品におけるＧＡＢＡ含量の保証にも、本発明の方法が有効であることが確認された。 清涼飲料中のＧＡＢＡを定量した。 実施例１と同様にして、市販清涼飲料水に含まれるＧＡＢＡの定量を行った。ＧＡＢＡを添加した清涼飲料及びアミノ酸を添加した清涼飲料におけるＧＡＢＡ含量を測定したところ、ＧＡＢＡ添加清涼飲料では９８４２±９５ｐｐｍのＧＡＢＡが定量され、同一条件では、ＧＡＢＡの含まれないアミノ酸添加清涼飲料ではＧＡＢＡが検出されなかった。これらの結果から、ＧＡＢＡ添加清涼飲料におけるＧＡＢＡ含量の保証に、本発明の方法が有効であることが確認された。 これらの結果から、本発明の方法により広範な食品におけるＧＡＢＡ含量を保証することが可能であることが確認された。 比較例 水溶性ホルマザンＷＳＴ−８の代わりに非水溶性ホルマザンであるＭＴＴを使用した手法の比較を行った。 各種精白米・玄米・発芽玄米の水抽出物では、ＭＴＴ（３−（４, ５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２,５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）を使用した場合には、低濃度においても反応生成物が沈殿し、マイクロプレート表面に沈着したため、分析を行うことは不可能であった。これは食品の水抽出物に含まれる蛋白質等とＭＴＴホルマザンが共沈することによるものと考えられる。さらに，ＧＡＢＡ含有チェコレート水抽出物中のＧＡＢＡを分析した場合、抽出物に含まれる有色物質による可視部吸収が分析を妨害した。 一方、水溶性ホルマザンを適用した場合では、溶解性の問題が無く、ホルマザン濃度を増加させることにより、問題を解決することができた。 まず基本的には、ＧＡＢＡと構造の類似するグルタミン酸等のアミノ酸を排除するために、特異的なアミノ基転移酵素、及びコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素を用い、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフェート（以下ＮＡＤＰＨという。）を生成させた後に反応溶液のｐＨを２以下にする第一工程と生成したＮＡＤＰＨにテトラゾリウム塩の存在下、電子伝達体を作用させ、生成する水溶性ホルマザン色素を測定する第二工程とからなることを特徴とするＧＡＢＡを簡易に定量する方法を提供する。 詳しくは、ＧＡＢＡと構造の類似するグルタミン酸等のアミノ酸を排除するために、特異的なアミノ基転移酵素、及びコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素を用い、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフェート（以下ＮＡＤＰＨという。）を生成させた後、反応溶液のｐＨを２以下にする第一工程と生成したＮＡＤＰＨにテトラゾリウム塩の存在下、電子伝達体を作用させ、生成する水溶性ホルマザン色素を測定する第二工程とからなることを特徴とするＧＡＢＡを簡易に定量する方法である。 さらに詳しくは、飲食品中のγ−アミノ酪酸を定量する方法であって、 （１）食品の水抽出液又は飲料と、γ−アミノ酪酸アミノ基転移酵素と、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素とを反応させて還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフェートを生成させた後、反応溶液のｐＨを２以下にする工程と、 （２）水溶性ホルマザン色素を生成させるテトラゾリウム塩の存在下、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフェートと電子伝達体とを反応させて水溶性ホルマザン色素を生成させる工程と、 （３）水溶性ホルマザン色素を測定する工程と、を含むことを特徴とする、飲食品中のγ−アミノ酪酸の定量方法である。ここで、テトラゾリウム塩は２−(２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムナトリウム塩である。 なお、本発明のγ−アミノ酪酸を定量する方法は、実施例に示された飲食物中のγ−アミノ酪酸の定量に限定されるものではなく、ＧＡＢＡと構造の類似するグルタミン酸等のアミノ酸を含む測定試料、例えば生体検体試料にも適用されるものであることは、前述した本発明の原理から明らかである。 アミノ酸を含む試料中のγ−アミノ酪酸を定量する方法であって、 （１）試料と、γ−アミノ酪酸アミノ基転移酵素と、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素とを反応させて還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフェートを生成させた後、反応溶液のｐＨを２以下にする工程と、 （２）水溶性ホルマザン色素を生成させるテトラゾリウム塩の存在下、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフェートと電子伝達体とを反応させて水溶性ホルマザン色素を生成させる工程と、 （３）生成した水溶性ホルマザン色素を測定する工程と、を含むことを特徴とする、γ−アミノ酪酸の定量方法。 前記テトラゾリウム塩が２−(２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムナトリウム塩である、請求項１記載のγ−アミノ酪酸の定量方法。 前記電子伝達体が、フェナジンメント硫酸塩、１−メトキシフェナジンメント硫酸塩及びフェナジンエト硫酸塩から選ばれるものである、請求項２記載のγ−アミノ酪酸の定量方法。 前記水溶性ホルマザン色素の測定が、波長４７０ｎｍの吸光度の測定である、請求項１記載のγ−アミノ酪酸の定量方法。 前記反応溶液のｐＨを２以下にする工程が、硫酸を添加する工程である、請求項１記載のγ―アミノ酪酸の定量方法。 前記試料が、グルタミン酸、セリン、グリシン又はヒスチジンを含む、請求項1〜５のいずれかに記載のγ―アミノ酪酸の定量方法。 前記試料が飲食物である、請求項６に記載のγ―アミノ酪酸の定量方法。