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小崎 慎矢 新谷 晃司 JP 2011137692 公開特許公報(A) 20110714 2009297198 20091228 トロポニンＩの免疫測定方法 東ソー株式会社 000003300 小崎 慎矢 新谷 晃司 G01N 33/53 20060101AFI20110617BHJP JPG01N33/53 D 4 ＯＬ 8 本発明は、トロポニンＩの免疫測定方法に関するものである。更に詳しくは、血液等の生物学的試料中にモノマーの形態で、ＩＣダイマーの形態で、又は、ＩＴＣトリマーの形態で存在するトロポニンＩを、アルカリ金属イオンの存在下で免疫的に測定する方法に関するものである。 トロポニン（Ｔｎ）は、Ｉ（分子量約２３，５００）、Ｔ（分子量約３７，０００）及びＣ（分子量約１８，０００）の３つのサブユニットからなる複合体蛋白で、トロポミオシンやアクチンとともに横紋筋筋原繊維の細い繊維を構成し、骨格筋や心筋において筋肉の収縮を制御している（非特許文献１）。 トロポニンＩ（ＴｎＩ）は心筋、骨格筋でそのアミノ酸配列が異なり、心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）は高い心筋特異性を有しているため、アミノ酸配列の相違に基づいてｃＴｎＩを特異的に測定することは、心筋梗塞の診断等に有用である。ｃＴｎＩは他の心筋マーカーと異なり、通常は血中に殆ど存在せず、運動や筋疾患等による疑陽性も示さないことから、微小梗塞や軽度の心筋障害を鋭敏に検出するなどへの応用が進められている（非特許文献２）。急性心筋梗塞などで心筋が障害を受けると、トロポニンは血中に逸脱し、３〜４時間後には異常高値を示す。またこの場合、血中でのｃＴｎＩの異常高値は１週間程度持続することから、発症後時間が経過しても診断が可能である（非特許文献３）。 ｃＴｎＩの測定方法として免疫測定が知られている。免疫測定には通常、血清、血漿又は全血といった血液試料が使用されるが、ｃＴｎＩは心筋梗塞の初期診断のために試料採取から極めて短時間の内に免疫測定を実施することが求められることがある。このような場合、採血後、血液凝固時間を待たずに迅速に試料を調製可能という理由から、血漿を生物学的試料としてｃＴｎＩの免疫測定を実施することが多い。免疫測定に使用される血漿には、ＥＤＴＡ血漿、クエン酸血漿、ヘパリン血漿等のいくつかの種類が存在するが、トロポニン複合体の結合に関与する金属イオンをキレートしないという理由からヘパリン血漿が使用される頻度が高い。しかし、ｃＴｎＩを免疫測定する場合、トロポニンにヘパリン結合部位が存在することから、ヘパリンがその免疫測定に影響を与える可能性が示唆されている（非特許文献４）。Ｇａｎｏｎｇ，Ｗ．， Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， １６ｔｈ ｅｄ．， Ａｐｐｌｅｔｏｎ−Ｌａｎｇｅ， Ｅａｓｔ Ｎｏｒｗａｌｋ， ＣＴ； ５６−６０（１９９３）Ｆ． Ｓ． Ａｐｐｌｅ， Ｒ． Ｈ． Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｏｎ， Ａ． Ｓ． Ｊａｆｆｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｉｏｎａｌ ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ＩＦＣＣ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｃａｒｄｉａｃ ｄａｍａｇｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ： Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｉｓｓｕｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ， Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５３：４； ５４７−５５１（２００７）Ｌａｒｕｅ Ｃ， Ｃａｌｚｏｌａｒｉ Ｃ， Ｂｅｒｔｉｎｃｈａｒｄ ＪＰ， Ｌｅｃｌｅｒｑ Ｆ， Ｇｒｏｌｌｅａｕ Ｒ， Ｐａｕ Ｂ． Ｃａｒｄｉａｃ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ ｏｆ ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉ ｉｎ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｐｈａｓｅ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ３９：９７２−９７９（１９９３）Ｔ． Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ， Ｃ． Ｇｏｔｔｉｎｇ， Ｋ． Ｋｌｅｅｓｉｅｋ， Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｄｉａｃ ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｔｈｅ ＴＯＳＯＨ ＡＩＡ−ＰＡＣＫ ｃＴｎＩ ２Ｇ ａｓｓａｙ， ａ ｓｅｃｏｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉ， Ｌａｂ． Ｍｅｄ． ２８：１；９１-９６（２００４） ｃＴｎＩの免疫測定には、短時間内に測定が可能であることに加え、高感度で再現性が良いことも求められる。従って、上記したようなヘパリンの存在により測定結果が影響を受ける可能性は、例えその影響が微々たるものであっても、極力排除する必要がある。特に、血管形成術前又は心筋梗塞後等、特定の心臓血管症状の処置のために大量のヘパリンが投与された場合等、ヘパリンの存在がｃＴｎＩの免疫測定に与える影響は大きくなる可能性がある。 従来、上記のような影響の排除のために、ヘパリン採血管の使用を回避する、ヘパリンの干渉を回避するため、ヘパリンが結合してもｃＴｎＩの測定結果が影響を受けないような抗体等を使用する免疫測定が提案されている。また他の提案として、特許文献１が開示するように、ポリブレンの共存下でｃＴｎＩの免疫測定を実施する方法等が提案されている。しかし、いずれの方法も実施のために特別な抗体を必要とする、高価なポリブレンを必要とする、等の課題がある。 以上のような状況に鑑み、本発明者らは、ｃＴｎＩの免疫測定においてヘパリンの存在により生じ得る影響を排除可能な、簡便で効果の高い解決方法を検討した結果、ｃＴｎＩを含むトロポニンＩ全体に対して適用可能な本発明を完成するに至った。本発明は、アルカリ金属イオンの存在下で実施することを特徴とするトロポニンＩの免疫学的測定法及びそのための試薬である。以下、本発明を詳細に説明する。 本発明で免疫測定の対象とするのは、トロポニンＩである。トロポニンＩは、血液又は血漿等の生物学的試料中にトロポニンＩモノマーの形態、ＩＣダイマーの形態又はＩＴＣトリマーの形態で存在するもののいずれであっても良いが、中でも、心筋又は骨格のトロポニンＩを含むものを本発明の測定対象として例示することができる。本発明において免疫測定の際に共存させるアルカリ金属イオンは、ヘパリンの共存により生じ得る影響を排除するという効果を有するものの、上記のようなダイマー又はトリマーの形態で存在するトロポニンＩをモノマーの形態に変化するものではない。従って、例えばダイマーの形態又はトリマーの形態のトロポニンＩを測定しないような免疫測定、言い換えればモノマーのトロポニンＩのみを選択的に測定するための免疫測定への本発明の適用では、そのような特定の形態のトロポニンＩを測定するに際し、ヘパリンの共存により生じ得る影響を排除し得るという効果が達成される。 本発明において、トロポニンＩの免疫測定の際に共存させるアルカリ金属イオンは、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化ルビジウム又は塩化セシウム等であり、これらの中の一種類を単独で、又はこれらの中の一種類以上を混合して用いることができる。例示したアルカリ金属イオンの中でも、取り扱いの簡便さや価格等の面においては塩化ナトリウムが特に好ましい。一方、ヘパリンの影響の排除効果においては、塩化ルビジウムが最も強力であり、特に好ましい。 共存させるアルカリ金属イオンの量（濃度）は、測定対象となる生物学的試料中のヘパリンの量（濃度）に応じて決定すれば良く、例えば、「共存させるアルカリ金属イオンのモル濃度」と「分析しようとする試料中に存在が予想されるヘパリンのモル濃度」の比が１．０×１０５〜１．２×１０７、より好ましくは１．５×１０６〜１．２×１０７、特に好ましくは２．０×１０６〜８．６×１０６となるように使用することが例示できる。 アルカリ金属イオンは、トロポニンＩを免疫測定するために使用する抗トロポニンＩ抗体とトロポニンＩが免疫反応する際に共存させれば良く、共存させる方法としては、免疫測定前に生物学的試料にアルカリ金属イオンを添加し、後に免疫測定が実施される際にはアルカリ金属イオンが共存するようにする、緩衝液や免疫反応試薬液（抗トロポニンＩ抗体の溶液等）等の免疫測定用の試薬に添加しておき、後に免疫測定が実施される際にアルカリ金属イオンが共存するようにする、等を例示できる。抗トロポニンI抗体を含有する免疫測定用の試薬の一部としてアルカリ金属イオンを添加する好ましい理由は、アルカリ金属イオンが抗トロポニンI抗体の反応に深く関与していること、また長期安定性の観点で有効であるからである。トロポニンＩを測定するための免疫測定は、トロポニンＩと抗体又は抗原間の免疫反応を利用するものであれば特に制限はなく、従来知られている種々の手法を採用することができる。例えば、サンドイッチ法や競合法を例示することができる。従って、本発明の試薬は、抗トロポニンＩ抗体（モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であっても良い）、トロポニンＩ抗原又はトロポニンＩ抗原類似体（免疫学的にトロポニンＩと同等の抗体反応性を有するもの）等（そのいずれかはアルカリホスファターゼ等の酵素、蛍光物質、ラジオアイソトープ又は化学発光基質等で直接標識されていても、アビジンやビオチン等によって間接的にこれらで標識されていても良い）を含み、かつ、そのいずれかにアルカリ金属イオンを含有するものであれば良い。 本発明によれば、後述する実施例からも明らかなように、免疫測定をアルカリ金属の共存下で実施するという極めて簡便な構成によってヘパリンにより生じ得る影響を排除することが可能となる。本発明で使用するアルカリ金属は安価であり、それを共存させる手法も生物学的試料に添加する、免疫測定用試薬に添加する、等というように、特に熟練を要するものでもない。従って本発明によれば、安価かつ簡便に、トロポニンＩの免疫測定においてヘパリンによって生じ得る影響を排除することが可能となる。 以下、実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお以下の実施例では、免疫測定装置として市販の装置ＡＩＡ−１８００自動免疫測定装置（東ソー（株）製）を用い、１ステップサンドイッチ法によりｃＴｎＩの測定を行った。具体的には、抗ｃＴｎＩマウスモノクロナール抗体を固定化した水不溶性の担体及びアルカリ性フォスファターゼで標識した抗ｃＴｎＩマウスモノクロナール抗体（前記固定化された抗体とは異なる部位でｃＴｎＩと結合する抗体）を含む溶液及びｃＴｎＩ溶液を反応カップに投入後、血清又はヘパリン血漿を添加し３７℃にて攪拌保温した。その後、未反応物をＢ／Ｆ分離により除去し、ｃＴｎＩを介して水不溶性担体に結合したアルカリ性フォスファターゼ標識抗ｃＴｎＩマウスモノクロナール抗体を、４−メチルウンベリフェリルりん酸塩を添加し、単位時間当たりの４−メチルウンベリフェロンの生成（ｎＭ／秒）を蛍光測定することで定量した。その生成度はアルカリ性フォスファターゼ量、即ち水不溶性担体上に免疫複合体を形成したｃＴｎＩ量に比例するからである。なお、上記のようなサンドイッチ免疫測定において、予め既知濃度のｃＴｎＩを含む標準品を用いてその蛍光強度とｃＴｎＩ濃度による標準曲線を作成しておけば、ｃＴｎＩ未知の試料の蛍光強度を測定することにより、そのｃＴｎＩ濃度を標準曲線より算出することができる。 抗ｃＴｎＩマウスモノクロナール抗体を結合させた水不溶性担体にアルカリ性フォスファターゼ標識された抗ｃＴｎＩマウスモノクロナール抗体（前記固定化された抗体とは異なる部位でｃＴｎＩと結合する抗体）を含む溶液を添加し、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化ルビジウム又は塩化セシウムを２５〜１５０ｍＭ添加し凍結乾燥し、ｃＴｎＩ測定試薬を作製した。また対照のため、アルカリ金属を添加することなく凍結乾燥させた対照試薬を作製した。 上記のようにして作製した試薬を用い、種々のアルカリ金属塩の共存による効果を以下の要領で評価した。 表１および図１は、健常人血清（陰性検体）に一定量（２．５６×１０−５ｍＭ）のヘパリンナトリウムを添加してヘパリン添加血清を調整し、調整したヘパリン添加血清に心筋トロポニンＩモノマーを添加して測定した結果である。ヘパリンの影響が回避されたかどうかについては、心筋トロポニンＩをヘパリン添加血清に添加した量を理論値とした上で、測定値÷理論値＝回収率（％）を算出し、その回収率から判断した。なお、アルカリ金属イオン濃度が１５０ｍＭ（アルカリ金属イオンのモル濃度／試料中に存在するヘパリンのモル濃度の比＝５．９×１０６）以上の場合については、回収率（Ｙ軸）と［アルカリ金属イオンのモル濃度／試料中に存在するヘパリンのモル濃度の比］（Ｘ軸）の図から回帰直線を近似することでヘパリンの影響が回避されたかどうかを評価した。 表１および図１に示されたとおり、アルカリ金属イオンを添加していない試薬で測定すると回収率は５３％であったが、アルカリ金属イオンを添加することで回収率は向上する。その効果は「アルカリ金属イオンのモル濃度」と「試料中に存在するヘパリンのモル濃度」の比が１．５×１０６〜１．２×１０７の範囲で認められ、特に２．０×１０６〜９．９×１０６範囲で顕著である。 表２及び図２は、上記と同様にしてｃＴｎＩＣダイマーについて測定した結果である。ＩＣダイマーの測定においてもアルカリ金属イオンを添加していない試薬で測定すると回収率は７９％であったが、アルカリ金属イオンを添加することで回収率は向上する。その効果は「アルカリ金属イオンのモル濃度」と「試料中に存在するヘパリンのモル濃度」の比が１．０×１０５〜１．２×１０７の範囲認められ、特に１．２×１０６〜８．６×１０６の範囲で顕著である。 表３及び図３は、上記と同様にしてｃＴｎＩＴＣトリマーについて測定した結果である。ＩＣダイマーの測定においてもアルカリ金属イオンを添加していない試薬で測定すると回収率は９８％であったが、アルカリ金属イオン、特に塩化ルビジウム又は塩化セシウムを添加することで回収率はほぼ１００％に向上する。その効果は「アルカリ金属イオンのモル濃度」と「試料中に存在するヘパリンのモル濃度」の比８．８×１０６以下にすることで達成される。 以上の結果から、モノマー、ＩＣダイマー又はＩＴＣトリマーの形態で存在するトロポニンＩの免疫測定において、全形態のトロポニンＩを共存するヘパリンの影響を排除しつつ測定するには、「アルカリ金属イオンのモル濃度」と「試料中に存在するヘパリンのモル濃度」の比が１．５×１０６〜１．２×１０７、好ましくは２．０×１０６〜８．６×１０６の範囲となるようにアルカリ金属イオンを共存させることが好ましいことが分かる。ｃＴｎＩモノマーの免疫測定におけるアルカリ金属イオンの影響を示す図である。図中、白丸は塩化リチウム、白四角は塩化ナトリウム、白三角は塩化カリウム、黒丸は塩化ルビジウム、そして、黒四角は塩化セシウムを共存させた時の結果を示す。ｃＴｎＩＣダイマーの免疫測定におけるアルカリ金属イオンの影響を示す図である。図中、白丸は塩化リチウム、白四角は塩化ナトリウム、白三角は塩化カリウム、黒丸は塩化ルビジウム、そして、黒四角は塩化セシウムを共存させた時の結果を示す。ｃＴｎＩＴＣトリマーの免疫測定におけるアルカリ金属イオンの影響を示す図である。図中、白丸は塩化リチウム、白四角は塩化ナトリウム、白三角は塩化カリウム、黒丸は塩化ルビジウム、そして、黒四角は塩化セシウムを共存させた時の結果を示す。アルカリ金属イオンの存在下で実施することを特徴とする、トロポニンＩの免疫学的測定法。アルカリ金属イオンが塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化ルビジウム又は塩化セシウムからなる群から選ばれる一種以上であることを特徴とする請求項１記載の方法。アルカリ金属イオンを含む、トロポニンＩの免疫学的測定用試薬。アルカリ金属イオンが塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化ルビジウム又は塩化セシウムからなる群から選ばれる一種以上であることを特徴とする請求項３記載の試薬。 【課題】心筋梗塞の診断等に有用なトロポニンＩの免疫測定に影響を与える可能性があるヘパリンの当該影響を排除するための、簡便かつ効果的な方法等を提供すること。【解決手段】塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化ルビジウム又は塩化セシウムからなる群から選ばれる一種以上のアルカリ金属イオンの存在下でトロポニンＩの免疫学的測定を実施することにより、前記課題を解決する。【選択図】なし

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