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程 錦雁 袴塚 康治 二宮 郁純 安武 幹智 JP 2010268722 公開特許公報(A) 20101202 2009123220 20090521 骨芽細胞の製造方法、分化誘導材とその使用方法 オリンパス株式会社 000000376 旭化成クラレメディカル株式会社 000116806 上田 邦生 100118913 藤田 考晴 100112737 程 錦雁 袴塚 康治 二宮 郁純 安武 幹智 C12N 5/07 20100101AFI20101105BHJP A61L 27/00 20060101ALI20101105BHJP JPC12N5/00 EA61L27/00 VA61L27/00 J 6 1 ＯＬ 9 特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２１年２月５日 第８回日本再生医療学会総会事務局発行の「日本再生医療学会雑誌 再生医療（２００９ Ｖｏｌ．８ Ｓｕｐｐｌ 増刊号）−第８回 日本再生医療学会総会 プログラム・抄録−」に発表 4B065 4C081 4B065AA93X 4B065AC20 4B065BC42 4B065CA60 4C081AB02 4C081CD34 4C081CF022 4C081DA11 4C081DB05 4C081EA11 本発明は、骨芽細胞の製造方法、分化誘導材とその使用方法に関するものである。 従来、培養骨を製造する場合に、骨髄液から抽出した単核球細胞を培養する際に、分化誘導剤を添加して培養することにより骨芽細胞に分化させ、得られた骨芽細胞をブロック状のβリン酸三カルシウム多孔体に付着させることとしていた（例えば、特許文献１参照。）。一方、末梢血内にも単核球細胞が存在することが知られているが、末梢血から抽出される単核球細胞は分化誘導剤を添加して培養しても骨芽細胞に分化しない。特開２００３−３２０００９号公報 しかしながら、骨髄液内に含有される単核球細胞は微量であるため、十分な骨芽細胞を得るためには、多量の骨髄液を採取しなければならない。骨髄液は腸骨内等に多く存在するが、その採取には腸骨内まで穿刺する必要があり、患者にかかる負担が大きいという不都合がある。これに対して、末梢血内に含有される単核球細胞も微量ではあるが、末梢血の採取は骨髄液の採取と比較して容易であり、末梢血から骨芽細胞を得ることができれば患者にかかる負担を軽減することができる。 本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、末梢血から骨芽細胞を製造することができる骨芽細胞の製造方法、分化誘導材とその使用方法を提供することを目的としている。 上記目的を達成するために本発明は以下の手段を提供する。 本発明は、人体から採取された末梢血から単核球細胞を抽出する抽出ステップと、該抽出ステップにより抽出された単核球細胞と粒径２５〜７５μｍのβリン酸三カルシウム多孔体粉末とを混合して培養する培養ステップとを含む骨芽細胞の製造方法を提供する。 本発明によれば、末梢血から抽出された単核球細胞に、粒径２５〜７５μｍのβリン酸三カルシウム多孔体粉末を混合して培養するだけで骨芽細胞を製造することができる。 粒径２５μｍより小さいβリン酸三カルシウム多孔体粉末を使用する場合には、粒子どうしが凝集して、相対的に単核球細胞とβリン酸三カルシウム多孔体粉末の粒子との接触頻度が減少し、骨芽細胞への分化が行われず、粒径７５μｍより大きいβリン酸三カルシウム多孔体粉末を使用する場合には、βリン酸三カルシウム多孔体の気孔内に単核球細胞が入り込み、マクロファージ化され難く、骨芽細胞への分化が行われない。 上記発明においては、βリン酸三カルシウム多孔体が７５％以上の気孔率を有することが好ましい。 また、培養ステップにおいて、βリン酸三カルシウム多孔体粉末を培地に対して１〜３重量％の濃度で混合することが好ましい。 また、本発明は、粒径２５〜７５μｍのβリン酸三カルシウム多孔体粉末からなり、末梢血から抽出された単核球細胞の骨芽細胞への分化を誘導する分化誘導材を提供する。 本発明によれば、末梢血から抽出された単核球細胞に添加して培養することにより、単核球細胞を骨芽細胞に分化させることができる。 上記発明においては、βリン酸三カルシウム多孔体が７５％以上の気孔率を有することが好ましい。 また、本発明は、末梢血から抽出した単核球細胞を培養する際に培地に混合する分化誘導材の使用方法を提供する。 本発明によれば、末梢血から抽出された単核球細胞に分化誘導材を培地に混合して培養することにより、単核球細胞を骨芽細胞に分化させることができる。 本発明によれば、末梢血から骨芽細胞を製造することができるという効果を奏する。本発明の一実施形態に係る骨芽細胞の製造方法を示すフローチャートである。図１の製造方法の比較例であって、７５μｍより大きな粒径のβリン酸三カルシウム多孔体粉末を添加した場合の実験結果を示す顕微鏡写真である。図１の製造方法であって、２５〜７５μｍの粒径のβリン酸三カルシウム多孔体粉末を添加した場合の実験結果を示す顕微鏡写真である。 以下、本発明の一実施形態に係る骨芽細胞の製造方法について、図面を参照して以下に説明する。 本実施形態に係る骨芽細胞の製造方法は、図１に示されるように、人体から採取された末梢血から単核球細胞を抽出する抽出ステップＳ１と、該抽出ステップＳ１により抽出された単核球細胞と粒径２５〜７５μｍのβリン酸三カルシウム多孔体粉末とを混合して培養する培養ステップＳ２とを含んでいる。 抽出ステップＳ１は、例えば、フィコール法によって末梢血から単核球細胞を分離する。 フィコール法は、人体から採取した末梢血を生理食塩水で希釈した希釈液を、フィコールパック（Ficoll-paque，Pharmacia）上に重層し、密度勾配遠心分離を行うことで分離された単核球細胞を単離する。そして、単離した単核球細胞層を洗浄するために食塩水あるいは血液なし培地を添加して、単核球細胞と混合する。それを遠心処理した後に、上澄み液を除去する。これにより、末梢血から単核球細胞が分離される。 培養ステップＳ２は、細胞を培養するための培地、例えば、血清入りのＤＭＥＭ培地に、粒径２５〜７５μｍのβリン酸三カルシウム多孔体粉末を混合した培地内に単核球細胞を播種することにより行われる。 本実施形態に係る骨芽細胞の製造方法によれば、培地内に添加された粒径２５〜７５μｍのβリン酸三カルシウム多孔体粉末が分化誘導材として機能し、末梢血から採取された単核球細胞を骨芽細胞に分化させることができる。 すなわち、本実施形態に係る骨芽細胞の製造方法によれば、骨髄液のように採取に際して侵襲が高い細胞ソースを使用することなく、末梢血という低侵襲で採取可能な細胞ソースを利用することができる。したがって、患者にかかる負担を大幅に軽減することができる。 ここで、使用するβリン酸三カルシウム多孔体粉末の適正粒径を決定するために以下の実験を行った。 まず、βリン酸三カルシウム多孔体を含む溶液および培地を、以下の条件で調製した。（１）オリンパステルモバイオマテリアル社製βリン酸三カルシウム多孔体で気孔率７５％、粒径を２５μｍ以下、２５〜７５μｍ、７５〜１０５μｍの３種類を準備し、それぞれの粒径のβリン酸三カルシウム多孔体１ｇに対してリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１０ｍＬを混合して溶液を調製し、４℃で保存した。（２）培地には、Ｆ−１２培地： ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium ：ＧＩＢＣＯ社製）を使用し、ペニシリン１００Ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン１００ｎｇ／ｍＬ、アンフォテリシン２５０ｎｇ／ｍＬを添加した。（３）血清として、１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）を使用した。（４）末梢血液の細胞分離はフィコール（Ficoll）法を用いた。 ヘパリンを入れたシリンジで成人健常ドナーから静脈血を採血し、得られた血液を生理食塩水で１：１に希釈した。希釈血液にフィコールパック（Ficoll-Paque）を１：１（２０ｍＬ：２０ｍＬ）で重層した。そして、密度勾配遠心分離（３０Ｇ，１４００ｒｐｍ、３０分）を室温で行い、遠心後、単核球細胞層を単離した。単離された単核球細胞層を洗浄するために食塩水あるいは血液なし培地を、食塩水あるいは培地：単核球細胞層＝３５ｍＬ：１５ｍＬの割合で混合し、よく攪拌した。その後、混合した細胞を計数し、それを遠心操作（２８Ｇ，１２００ｒｐｍ、５分）後、上澄み液を除去した。食塩水あるいは培地を添加し、細胞密度を２×１０６／ｍＬとなるように調製した。（５）血清入りの培地を入れ３７℃のインキュベータ内で約１５分静置した。（６）（１）で調整したβリン酸三カルシウム多孔体溶液を、添加濃度５μＬ／ウェルで添加した。（７）播種密度は細胞密度２×１０６／ｍＬの溶液を１００μＬ／ウェル／２４マイクロプレートとなるように蒔いた。（８）さらに培地を１ｍＬ／ウェル／２４マイクロプレートとなるように添加した。（９）添加後、マイクロプレートを振動させる。（１０）０〜２時間経過後の状態を顕微鏡で観察し、下記の結果を得た。 βリン酸三カルシウム多孔体粉末の粒径が７５μｍ以上の粒子になると、そのβリン酸三カルシウム多孔体の気孔内に細胞が入り込み、マクロファージ化して貪食する働きが行われ難い（図２参照。）。 一方、βリン酸三カルシウム多孔体粉末の粒径が２５μｍ以下の粒子になると粒子どうしが凝集し、相対的に細胞とβリン酸三カルシウム多孔体の接触頻度が減少した。 これに対して、βリン酸三カルシウム多孔体粉末の粒径が２５〜７５μｍの範囲である場合には、そのような不都合がなく骨芽細胞への分化が確認された（図３参照。）。 次に、上記の実験により有効であることが確認された２５〜７５μｍの粒径範囲のβリン酸三カルシウム多孔体粉末を使用した培養試験の実施例について説明する。＜細胞処理〜培養＞ まず、濃度１０００Ｕ／ｍＬのヘパリンナトリウム（ニプロファーマ（株））を最終濃度が５０００Ｕ／Ｌとなるよう健常人新鮮血液１００ｍＬに添加した。 次いで、リンパ球分離溶液（ナカライテスク（株））１５ｍＬ上に上記血液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））（ナカライテスク（株））で約２倍希釈した血液３０ｍＬを重層し、室温で４００Ｇにて３０分間遠心後（遠心機：ＬＣ−１００，（株）TOMY精工）、中間の単核球層を採取した。 採取した単核球層をＰＢＳ（−）で約２倍に希釈後、室温で２５０Ｇにて５分間遠心し上清を吸引除去した。 次に、１０％仔牛血清を含むＤＭＥＭ培地（ＨＩ ＦＢＳ：１６１４０, ＧＩＢＣＯ社、ＤＭＥＭ：１１８８５，ＧＩＢＣＯ社）を約２ｍＬ添加後細胞をほぐし、室温で２５０Ｇにて１０分間遠心後、上清を吸引除去した。 そして、１０％仔牛血清を含むＤＭＥＭ培地を約１ｍＬ添加後、血球計数装置（ＳＦ−３０００, Ｓｙｓｍｅｘ（株）社）にて細胞数を測定し、単核球数が２×１０７／ｍＬになるよう１０％仔牛血清を含むＤＭＥＭ培地を加えて単核球浮遊液を調製した。 上記単核球浮遊液をHuman Fibronectin Cellware ２４−Well Plate（BD Biosciences社）に０．５ｍＬ／ウェル添加後、粒径２５〜７５μｍのβリン酸三カルシウム多孔体粉末（オリンパステルモバイオマテリアル（株）社）をＰＢＳ（−）で２００ミリグラム／ｍＬに調製した懸濁液を５０μＬ／ウェル添加後、ＣＯ２インキュベータ（型式：Ｆ３７０，サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）社）にて５週間培養した。培地交換は２〜３回／週行った。＜培養後の細胞処理＞ まず、５週間培養後、培養上清を吸引除去し、室温のＰＢＳ（−）０．５ｍＬ／ウェルで２回洗浄した。 そして、２０％ギ酸（和光純薬(株)）を０．５ｍＬ／ウェル加え、CELL SCRAPER（IWAKI社）で細胞を剥離させてマイクロチューブに回収した。 この後に、氷上で超音波発生機（Handy Sonic：UR-２０P，（株）ＴＯＭＹ精工社）のプローブを回収液に浸漬し、６０秒間超音波にて細胞破砕を行った。 ４℃にて２００００Ｇで１０分間遠心後、上清０．４５ｍＬを採取した。 ＮＡＰ−５ columns（GE Healthcare社）にＴＥバッファー（１０ｍＭ Tris-HCl, １mM EDTA、invitrogen社）９ｍＬ／columnを用いて平衡化し、上記上清０．４５ｍＬを添加した。 さらに、Gla-Type Osteocalcin（Gla-OC）EIA Kit（Precoated）（タカラバイオ（株）社）添付のSample Diluent ０．５ｍＬを添加後、カラムからの溶出液を採取した。 採取した溶出液を−８０℃ディープフリーザにて一晩凍結させた後に、真空凍結乾燥機（FZ-Compact，LABCONCO社）で約８時間完全に乾燥させた。＜オステオカルシンの測定＞ 乾燥後の検体にGla-Type Osteocalcin（Gla-OC）EIA Kit（Precoated）（タカラバイオ（株）社）添付のSample diluentを０．２５ｍＬ添加後溶解させた。 そして、Gla-Type Osteocalcin“Gla-OC”EIA Kit“Precoated”（タカラバイオ（株）社）にてオステオカルシンの定量を行った。 比較例１として、単核球浮遊液にβリン酸三カルシウム多孔体粉末を添加しない以外は上記実施例と同じ方法で行った。 比較例２として、上記培養試験で用いた１０％仔牛血清を含むＤＭＥＭ培地に最終濃度が１００ｎＭ Dexamethasone（SIGMA社）、１０ｍＭ Glycerol ２−phosphate disodium salt hydrate（SIGMA社）、５０ｍＭ L-Ascorbic acid ２−phosphate sesquimagnesium salt hydrate（SIGMA社）となるように調製した培地を用いた以外は比較例１と同じ方法で行った。 実施例の結果、ヒト末梢血から分離した単核球細胞をβリン酸三カルシウム多孔体粉末と共培養した結果、０．４６ｎｇ／ｃｍ２のオステオカルシンが産生されたことが確認された。 一方、βリン酸三カルシウム多孔体粉末を添加しない比較例１およびβリン酸三カルシウム多孔体粉末および分化誘導剤を添加した培地で培養した比較例２のいずれにおいても、オステオカルシンの産生は確認されなかった。 このことから、ヒト末梢血から分離した単核球細胞は、粒径２５〜７５μｍのβリン酸三カルシウム多孔体粉末を混合した培地内で培養することにより、骨芽細胞に分化誘導することができ、骨芽細胞を製造することができることがわかった。 すなわち、粒径２５〜７５μｍのβリン酸三カルシウム多孔体粉末は、ヒト末梢血から分離した単核球細胞の骨芽細胞への分化誘導材として使用することができることがわかった。 なお、本実施形態においては、気孔率７５％のβリン酸三カルシウム多孔体粉末を使用したが、これに代えて、７５％より大きい気孔率を有するものを使用してもよい。このようにすることで、βリン酸三カルシウム多孔体粉末の培地への溶出を容易にし、単核球細胞の骨芽細胞への分化をさらに効果的に誘導することができるという利点がある。 Ｓ１ 抽出ステップ Ｓ２ 培養ステップ 人体から採取された末梢血から単核球細胞を抽出する抽出ステップと、 該抽出ステップにより抽出された単核球細胞と粒径２５〜７５μｍのβリン酸三カルシウム多孔体粉末とを混合して培養する培養ステップとを含む骨芽細胞の製造方法。 βリン酸三カルシウム多孔体が７５％以上の気孔率を有する請求項１に記載の骨芽細胞の製造方法。 培養ステップにおいて、βリン酸三カルシウム多孔体粉末を培地に対して１〜３重量％の濃度で混合する請求項１または請求項２に記載の骨芽細胞の製造方法。 粒径２５〜７５μｍのβリン酸三カルシウム多孔体粉末からなり、末梢血から抽出された単核球細胞の骨芽細胞への分化を誘導する分化誘導材。 βリン酸三カルシウム多孔体が７５％以上の気孔率を有する請求項４に記載の分化誘導材。 末梢血から抽出した単核球細胞を培養する際に培地に混合する請求項４または請求項５に記載の分化誘導材の使用方法。 【課題】末梢血から骨芽細胞を製造する。【解決手段】人体から採取された末梢血から単核球細胞を抽出する抽出ステップＳ１と、該抽出ステップＳ１により抽出された単核球細胞と粒径２５〜７５μｍのβリン酸三カルシウム多孔体粉末とを混合して培養する培養ステップＳ２とを含む骨芽細胞の製造方法を提供する。粒子どうしの凝集を抑制して、単核球細胞とβリン酸三カルシウム多孔体粉末の粒子との接触頻度を増大させるとともに、βリン酸三カルシウム多孔体の気孔内への球細胞の入り込みを防止して、マクロファージ化を抑え、骨芽細胞への分化を促すことができる。【選択図】図１

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