生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公開特許公報(A)_新規ＣｈｅｍｅｒｉｎＲアゴニスト |
| 出願番号： | 2009079044 |
| 年次： | 2010 |
| IPC分類： | C07K 7/06,A61K 38/00,A61P 37/00,A61P 29/00,A61P 3/10 |
特許情報キャッシュ
松田 匡雄 宮本 靖久 嶋村 健 鴇田 滋 善本 亮 JP 2010229093 公開特許公報(A) 20101014 2009079044 20090327 新規ＣｈｅｍｅｒｉｎＲアゴニスト 萬有製薬株式会社 000005072 松田 匡雄 宮本 靖久 嶋村 健 鴇田 滋 善本 亮 C07K 7/06 20060101AFI20100917BHJP A61K 38/00 20060101ALI20100917BHJP A61P 37/00 20060101ALI20100917BHJP A61P 29/00 20060101ALI20100917BHJP A61P 3/10 20060101ALI20100917BHJP JPC07K7/06A61K37/02A61P37/00A61P29/00A61P3/10 9 ＯＬ 11 4C084 4H045 4C084AA02 4C084AA07 4C084BA01 4C084BA09 4C084BA17 4C084CA59 4C084DA01 4C084NA14 4C084ZB07 4C084ZB11 4C084ZC35 4H045AA10 4H045AA20 4H045AA30 4H045BA15 4H045EA20 4H045FA20 4H045FA33 本発明は、新規なＣｈｅｍＲ２３アゴニスト及びその用途に関する。 Ｇタンパク質共役型レセプターであるＣｈｅｍＲ２３は、内在性タンパク質であるＣｈｅｍｅｒｉｎとの結合を介して、細胞内にシグナルを伝達し、種々の生体内反応を惹起する。ＣｈｅｍＲ２３及びそのリガンドの作用により脂質生成、免疫作用へ作用することが報告されている（非特許文献１及び２）。ＣｈｅｍＲ２３は抗原提示細胞、マクロファージなど免疫関連細胞に発現し、Ｃｈｅｍｅｒｉｎにより細胞レベルで細胞走化性を調整することが知られている（非特許文献３）。またＣｈｅｍＲ２３のアゴニストとして知られるＲｅｓｏｌｖｉｎ Ｅ１はマウスに投与することにより、炎症部位から炎症性細胞の除去、炎症性サイトカインの低下を誘起し、炎症病態からの回復を促進することが報告されており、自然免疫、応答免疫に関与していることが示唆されている（非特許文献４）。また、ＣｈｅｍＲ２３は脂肪組織、株化脂肪細胞に発現することが知られており（非特許文献２）、細胞レベルで脂肪細胞の分化に伴いＣｈｅｍＲ２３の発現が誘導されることが認められている。さらに、Ｃｈｅｍｅｒｉｎは株化脂肪細胞において脂肪酸分解作用を抑制、遊離脂肪酸を低下させることが報告されている（非特許文献５）。インスリン抵抗性の原因の一つとして血中脂肪値が高いことが知られている。したがって、ＣｈｅｍＲ２３アゴニストの脂肪分解抑制によって、血中遊離脂肪酸量を減少させ、血中脂肪値を正常化することでインスリン抵抗性が改善されることが期待できる。ＣｈｅｍＲ２３の生理的意義、創薬可能性を明らかにするために生体へ投与可能なＣｈｅｍＲ２３アゴニストが必要だが、これまでの生体内で安定、且つＣｈｅｍＲ２３に対する結合活性を有するアゴニストは同定されていない。内在性リガンドであるＣｈｅｍｅｒｉｎは生体内で前駆体として合成後、様々なタンパク分解酵素の作用により活性化、さらに容易に不活性化されることが知られている（非特許文献６，７及び８）。近年、ヒト活性型ＣｈｅｍｅｒｉｎのＣ末端のアミノ酸９残基（１４８〜１５６残基目）が活性型Ｃｈｅｍｅｒｉｎとほぼ同様のＣｈｅｍＲ２３に対する結合活性を有することが見出され、Ｃｈｅｍｅｒｉｎ−９として報告された（非特許文献９）。しかし、Ｃｈｅｍｅｒｉｎ−９は生体内においてタンパク分解酵素による分解を受け、非常に不安定であるため、生体におけるＣｈｅｍＲ２３アゴニストとしては不適当である。上記の記載から、ＣｈｅｍＲ２３アゴニスト活性を有し、生体内で安定な化合物は、免疫疾患、炎症性疾患、糖尿病の治療及び／又は予防剤としてきわめて有用であると考えられる。Ｓａｍｓｏｎ Ｍ．ら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２８巻、１６８９−１７００頁（１９９８年）Ｒｏｈ ＳＧ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、３６２巻、１０１３−１０１８頁（２００７年）Ｚａｂｅｌ ＢＡ．ら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７４巻、２４４−２５１頁（２００５年）Ｍａｋｏｔｏ Ａ．ら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１巻、７１３−７２２頁（２００５年）Ｇｏｒａｌｓｋｉ ＫＢ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８２巻、２８１７５−２８１８８頁（２００７年）Ｄｕ ＸＹ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８４巻、７５１−７５８頁（２００９年）Ｇｕｉｌｌａｂｅｒｔ Ａ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ、８４巻、１５３０−１５３８頁（２００８年）Ｚａｂｅｌ ＢＡ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８０巻、３４６６１−３４６６６頁（２００５年）Ｗｉｔｔａｍｅｒ Ｖ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７９巻、９９５６−９９６２頁（２００４年） 天然のＣｈｅｍＲ２３リガンドは、生体内での安定性が極めて低く、ＣｈｅｍＲ２３アゴニストとしては不適当である。 したがって、本発明の目的は、ＣｈｅｍＲ２３アゴニスト活性を有し、かつ、生体内で安定なペプチドを提供することにある。 上記目的を達成するために、本発明者らはＣｈｅｍＲ２３リガンドのアナログを種々合成したところ、ＣｈｅｍＲ２３アゴニスト活性を有し、かつ、生体内での安定性、特に、代謝安定性に優れたペプチドを見出し、本発明を完成するに至った。 すなわち、本発明は、ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｘ１−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｘ２−Ｘ３−Ｓｅｒで表されるペプチド（ここで、ｔｙｒはＤ−Ｔｙｒであり、Ｘ１はＤ−Ａｌａ又はＤ−Ｓｅｒであり、Ｘ２はＡｌａ又はＤ−Ａｌａであり、Ｘ３はＤ−Ｐｈｅ又はＴｉｃである）に関する。ここで、Ｔｉｃとは、で表される構造を有する。 本発明は、また、ＣｈｅｍＲ２３に選択的なリガンド、好ましくはＣｈｅｍＲ２３アゴニストを提供する。 本発明は、また、上記ペプチドを有効成分とする医薬を提供する。より具体的には、本発明は、免疫疾患、炎症性疾患、糖尿病の治療及び／又は予防剤を提供する。 本発明は、また、ＣｈｅｍＲ２３に結合する化合物をスクリーニングする方法であって、（ａ）候補化合物が存在する条件及び存在しない条件の下で、ＣｈｅｍＲ２３と請求項１乃至５のいずれか一項に記載のペプチドとを接触させ、ＣｈｅｍＲ２３と本発明のペプチドとの結合量を測定する工程と、（ｂ）ＣｈｅｍＲ２３と本発明のペプチドとの結合量を変化させる候補化合物を選択する工程と、を備える方法を提供する。 本発明のペプチドは、代謝安定性が極めて高いため、ＣｈｅｍＲ２３の機能を解明する上で有用なツールとなる。また、本発明のペプチドは糖尿病をはじめとする様々な疾患の予防・治療剤となり、さらに、様々な疾患に対する予防・治療剤となる医薬品候補化合物のスクリーニングに応用することも可能である。 （ペプチド） 以下、本発明に係るペプチドについて説明する。 本発明のペプチドは、ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｘ１−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｘ２−Ｘ３−Ｓｅｒ（ここで、Ｘ１はＤ−Ａｌａ又はＤ−Ｓｅｒであり、Ｘ２はＡｌａ又はＤ−Ａｌａであり、Ｘ３はＤ−Ｐｈｅ又はＴｉｃである。）で表されるペプチド。Ｘ２−Ｇｌｎは、Ｘ２のカルボキシル基とＧｌｎのアミノ基とが結合してアミド結合を形成していることを意味し、Ｐｈｅ−Ｘ２は、Ｐｈｅのカルボキシル基とＸ２のアミノ基とが結合してアミド結合を形成していることを意味し、Ｘ２−Ｘ３は、Ｘ２のカルボキシル基とＸ３のアミノ基とが結合してアミド結合を形成していることを意味し、Ｘ３−Ｓｅｒは、Ｘ３のカルボキシル基とＳｅｒのアミノ基とが結合してアミド結合を形成していることを意味する。 本発明のペプチドは、例えば、公知のペプチド合成法を応用して合成することが可能である。公知のペプチド合成法としては、Ｆｍｏｃ法又はＢｏｃ法による固相合成法又は液相合成法などがある。特に、Ｆｍｏｃ法による固相合成法が収率等の観点から優れている。Ｆｍｏｃ法による固相合成法で使用するＦｍｏｃ基で保護されたアミノ酸又はＸは、市販されているものを利用することができ、また、必要に応じて公知の方法で合成することもできる。Ｎ末端（トリプトファン）まで伸長した後、トリフルオロ酢酸などで処理することにより脱保護を行い、本発明の化合物を固相（樹脂）から切断し、必要に応じて精製（例えば、ＯＤＳカラムなどを用いた逆相ＨＰＬＣ等）を行う。 本発明のペプチドは、Ｘ１がＤ−Ｓｅｒである場合が好ましい。 また、本発明のペプチドは、Ｘ１がＤ−Ｓｅｒであり、かつ、Ｘ２がＤ−Ａｌａである場合がより好ましい。 また、本発明のペプチドは、Ｘ１がＤ−Ｓｅｒであり、Ｘ２がＤ−Ａｌａであり、かつ、Ｘ３がである場合が特に好ましい。 （医薬） 本発明の医薬は、本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する。ＣｈｅｍＲ２３７及びＣｈｅｍＲ２３リガンドが関与する疾患や症状に対して本発明の医薬は適用可能であるが、具体的な医薬としては、免疫疾患、炎症性疾患、糖尿病の治療及び／又は予防剤である。 本発明の医薬は、その投与形態に合わせ、本発明の化合物に薬剤学的に許容される添加剤を加えて各種製剤化することができる。添加剤としては、製剤分野において通常用いられる各種の添加剤が使用可能であり、例えばゼラチン、乳糖、白糖、酸化チタン、デンプン、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、トウモロコシデンプン、マイクロクリスタリンワックス、白色ワセリン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、無水リン酸カルシウム、クエン酸、クエン酸三ナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ソルビトール、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリソルベート、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン、硬化ヒマシ油、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸マグネシウム、軽質無水ケイ酸、タルク、植物油、ベンジルアルコール、アラビアゴム、プロピレングリコール、ポリアルキレングリコール、シクロデキストリン及びヒドロキシプロピルシクロデキストリン等が挙げられる。 これらの添加剤との混合物として製剤化される剤形としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくは坐剤等の固形製剤；シロップ剤、エリキシル剤若しくは注射剤等の液体製剤等が挙げられる。これらは、製剤分野における通常の方法に従って調製することができる。なお、液体製剤にあっては、用時に水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁させる様式であってもよい。また、特に注射剤の場合、必要に応じて生理食塩水又はブドウ糖液に溶解又は懸濁させてもよく、更に緩衝剤や保存剤を添加してもよい。 本発明のペプチドを例えば臨床の場で使用する場合、その投与量及び投与回数は、患者の性別、年齢、体重、症状の程度及び目的とする処置効果の種類と範囲等により異なるが、一般に経口投与の場合、成人１日あたり、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０３〜１ｍｇ／ｋｇを１〜数回に分けて、また非経口投与の場合は、０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．００１〜０．１ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．０１〜０．１ｍｇ／ｋｇを１〜数回に分けて投与するのが好ましい。通常の内科医、獣医又は臨床医は病状進行を阻止し、抑制し又は停止させるに必要な効果的薬物量を容易に決定し処理することができる。 本発明の医薬は、本発明のペプチドを全薬剤１．０〜１００重量％、好ましくは１．０〜６０重量％の割合で含有することができる。これらの製剤は、また、治療上有効な他の化合物を含んでいてもよい。 （スクリーニング方法） ＣｈｅｍＲ２３に結合する化合物をスクリーニングする本発明の方法は以下の工程を備える：（ａ）候補化合物が存在する条件及び存在しない条件の下で、ＣｈｅｍＲ２３と本発明のペプチドとを接触させ、ＣｈｅｍＲ２３と本発明のペプチドとの結合量を測定する工程、及び（ｂ）ＣｈｅｍＲ２３と本発明のペプチドとの結合量を変化させる候補化合物を選択する工程。 ＣｈｅｍＲ２３は様々な疾患や症状に関連することから、ＣｈｅｍＲ２３に結合する化合物（アゴニスト及びアンタゴニスト）は、ＣｈｅｍＲ２３が関与する疾患等の予防・治療薬となり得る。具体的には、免疫疾患、炎症性疾患、糖尿病の予防・治療剤などである。本発明のスクリーニング方法によれば、これらの医薬の候補化合物を選別することが可能である。 本発明のスクリーニング方法に用いる本発明のペプチドは、ＣｈｅｍＲ２３との結合量を測定するために、標識されていることが好ましい。標識及び標識方法は特に制限されず、当業者にとって公知の標識及び標識方法を利用することができる。具体的には、［３Ｈ］、［１２５Ｉ］、［１４Ｃ］及び［３５Ｓ］などで放射標識を利用することができ、特に［１２５Ｉ］による放射標識が好ましい。 工程（ａ）は、候補化合物が存在する条件及び存在しない条件の下で、ＣｈｅｍＲ２３と本発明のペプチドとを接触させ、その結合量を測定する工程である。ここで、ＣｈｅｍＲ２３と本発明のペプチドとの接触は、適切なバッファー中で行う。好ましくはｐＨ６〜８のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどを使用するが、ＣｈｅｍＲ２３、本発明のペプチド及び候補化合物の結合を阻害しない限りバッファーの種類は特に限定されない。必要に応じて、ＣｈｅｍＲ２３、本発明のペプチド及び候補化合物間の非特異的結合を低減させる目的のために、界面活性剤などをバッファーに加えてもよい。また、必要に応じて、ＣｈｅｍＲ２３、本発明のペプチド及び候補化合物の分解を抑制する目的のために、プロテアーゼ阻害剤をバッファーに加えてもよい。候補化合物が存在しない条件下又は存在する条件下（例えば、１０−１０Ｍ〜１０−７Ｍの濃度範囲で）、一定量の標識された本発明の化合物（例えば、５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍの範囲内で設定する）とＣｈｅｍＲ２３とを含んだバッファーをインキュベートする。インキュベーション温度は４℃〜３７℃が好ましく、インキュベーション時間は３０分〜３時間が好ましい。インキュベーション後、グラスフィルター等で濾過し、適量のバッファーで洗浄し、グラスフィルター上の標識の量を測定して（液体シンチレーションカウンターやγ−カウンターで放射活性を測定する）、ＣｈｅｍＲ２３と本発明のペプチドとの結合量を測定する。 工程（ｂ）は、ＣｈｅｍＲ２３と本発明のペプチドとの結合量を変化させる候補化合物を選択する工程である。工程（ａ）で測定した結合量が、候補化合物の存在下及び非存在下で結合量に変化がないかどうかを調べる。例えば、候補化合物の非存在下の結合量（Ｂ０）から非特異的な結合量（ＮＳＢ）を引いた数値（Ｂ０−ＮＳＢ）を１００％としたとき、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が５０％以下になる候補化合物をＣｈｅｍＲ２３に結合する化合物として選択することができる。あるいは、ＩＣ５０が所定値（例えば、１〜１００ｎＭ）以下の候補化合物をＣｈｅｍＲ２３に結合する化合物として選択してもよい。 以下、実施例を挙げて本発明について更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 以下の実施例においては、用いるアミノ酸は３文字表記で記載した。 また、本発明のペプチドを合成する際に用いたアミノ酸の保護基は、Ｆｍｏｃ法において通常用いられる保護基である。 さらに、本発明のペプチドを合成する際に用いた特殊アミノ酸を３文字で表記した。用いた特殊アミノ酸は、以下の通りである。Ｔｉｃ：１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸ａｌａ：Ｄ−アラニンｓｅｒ：Ｄ−セリンｔｙｒ：Ｄ−チロシン（実施例１）Ｃｈｅｍｅｒｉｎ９：Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒの合成 ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社より販売されている、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＮｏｖａＳｙｎ（登録商標）ＴＧＡ ｒｅｓｉｎを出発原料とし、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機を用いてＨＢＴＵを縮合試薬としたＦｍｏｃ法でＦｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，の順で縮合を行いＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）− ＮｏｖａＳｙｎ（登録商標） ＴＧＡ ｒｅｓｉｎを得た。このｒｅｓｉｎにＴＦＡ／ｗａｔｅｒ／ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌａｎｅ（９４／３／３）を加え室温で２時間振盪した後、樹脂をろ去した。このろ液に冷却したエーテルを加え、粗Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒを沈殿として得た。この粗ペプチドをＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＱ，Ｓ−５，１２０Ａカラム（２０Ｘ２５０ｍｍ）を用いた逆相分取ＨＰＬＣ（Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．１％ＴＦＡアセトニトリル、Ａ／Ｂ：９５／５−２ｍｉｎ，８０／２０〜５０／５０−１５ｍｉｎ 直線型濃度勾配溶出、流速１０ｍｌ／ｍｉｎ）で精製し目的物を含む分画を回収、凍結乾燥することにより目的物を得た。（実施例２）ペプチド１：ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−ａｌａ−Ｔｉｃ−Ｓｅｒの合成 ｎｏｖａｂｕｏｃｈｅｍ社より販売されている、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＮｏｖａＳｙｎ（登録商標）ＴＧＡ ｒｅｓｉｎを出発原料とし、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機を用いてＨＢＴＵを縮合試薬としたＦｍｏｃ法でＦｍｏｃ−Ｔｉｃ，Ｆｍｏｃ−ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−ｔｙｒの順で縮合を行いｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｐｈｅ−ａｌａ−Ｔｉｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＮｏｖａＳｙｎ（登録商標）ＴＧＡ ｒｅｓｉｎを得た。このｒｅｓｉｎにＴＦＡ／ｗａｔｅｒ／ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌａｎｅ（９４／３／３）を加え室温で２時間振盪した後、樹脂をろ去した。このろ液に冷却したエーテルを加え、粗ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−ａｌａ−Ｔｉｃ−Ｓｅｒを沈殿として得た。この粗ペプチドをＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＱ，Ｓ−５，１２０Ａカラム（２０Ｘ２５０ｍｍ）を用いた逆相分取ＨＰＬＣ（Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．１％ＴＦＡアセトニトリル、Ａ／Ｂ：９５／５−２ｍｉｎ，８０／２０〜５０／５０−１５ｍｉｎ 直線型濃度勾配溶出、流速１０ｍｌ／ｍｉｎ）で精製し目的物を含む分画を回収、凍結乾燥することにより目的物を得た。上記ペプチドを用いた、ビトロ、ビボでの薬理試験方法、及びその結果（１）ビトロ薬理試験（細胞内カルシウム変化測定試験） マウスＣｈｅｍＲ２３をコードするｃＤＮＡ配列を、発現ベクターｐＥＦ１（インビトロジェン社製）にクローニングした。得られた発現ベクターをカチオン性脂質法［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎａｔｉｏｎａｌ ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｕｎｉｔｅｄ ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）、８４巻、７４１３頁（１９８７年）参照］を用いて宿主細胞 ＣＨＯ−Ｋ１ Ｇα１５ ＮＦＡＴ β−Ｌａｃｔａｍａｓｅ Ｃｅｌｌ（Ａｕｒｏｒａ社製）にトランスフェクトし、マウスＣｈｅｍＲ２３発現細胞を得た。細胞内カルシウム変化測定試験を行うために、マウスＣｈｅｍＲ２３発現細胞は９６ウェルブラックプレート（ボトムクリアー）（パッカード社製）へ１ウェル当たり５０，０００細胞になるように培養し、ＣＯ２（５％）インキュベーター内で３７℃に保ち、一晩培養した。培養後、培養培地をカルシウム反応性蛍光物質Ｆｌｕｏ−４（インビトロジェン社製）を含む培地Ａ（Ｈａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，２．５ｍＭｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ，１％牛胎児血清）ｘ５０μＬに交換し、ＣＯ２（５％）インキュベーター内で３７℃に保ち、１時間培養した。培養後、１．６ｍＭ ＴＲ４０（インビトロジェン社製）を含む培地Ａを５０μＬ加え、試験用細胞プレートとした。また、各試験薬剤を終濃度の３倍になるように培地Ａを用いて希釈し、試験薬剤プレートとした。試験用細胞プレートと試験薬剤プレートをＦＬＩＰＲ ＴＥＴＲＡ （モレキュラーデバイス社製）にセットし、装置内で試験薬剤ｘ５０μＬを細胞へ添加、細胞を刺激した。励起波長４７０−４９５ｎｍ、蛍光波長 ６２６−５７５ｎｍによって細胞内カルシウム濃度を測定し、その変化によって受容体に対する活性を測定した。活性は被験化合物の５０％刺激濃度（ＥＣ５０値）を求めた。その結果、本発明に係るペプチド１のＥＣ５０値は２３ｎＭであった。（２）ビボ薬理試験（絶食による亢進するマウス脂肪分解作用に対する抑制試験） マウスにおける脂肪分解抑制作用を評価するために、雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（７−１０週齢）を一晩絶食させ脂肪分解作用を亢進させた。１０％エタノール水溶液に溶解した被験化合物を絶食処置マウスの腹腔内に投与し、各時間においてイソフルラン麻酔下眼窩より採血を行った。血液における遊離脂肪酸量はＮＥＦＡ−ＨＡテスト（和光社製）を用いて測定を行った。その結果、被験化合物投与後３０分では本発明に係るペプチド１を３０ミリグラム／ｋｇ投与したマウスでは非投与に比べて血中の遊離脂肪酸の量が有意に減少した（図１）。 次に、Ｃｈｅｍｅｒｉｎ９と本発明に係るペプチド１とで生体内での安定性を比較した。（３）マウス血漿を用いた代謝安定性試験マウス全血から遠心分離により血漿を調製した。各被験化合物を最終濃度５μＭになるようにマウス血漿に加え、３７℃でインキュベーションした。被験化合物添加後、０、１０、３０、６０、１２０、２４０（本発明に係るペプチド１のみ）分後に３倍量のアセトニトリル（０．２％リン酸を含む）を加え、遠心分離後の上清をＬＣ／ＭＳ／ＭＳのサンプルとした。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳはＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣとＴＱＤ ｔｒｉｐｌｅ ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ウォーターズ社製）を用いた。被験化合物の分離には、４０℃に保ったＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＢＥＨ Ｃ１８ （２．１ｍｍ ｉ．ｄ．×５０ｍｍ，粒子径１．７μｍ）を用いた。移動相として精製水（０．１％ギ酸含む）（Ａ）およびアセトニトリル（０．１％ギ酸含む）（Ｂ）を用い、９０％Ａ＋１０％Ｂから３０％Ａ＋７０％Ｂまで５分間で直線的に組成を変化させながら流速０．２ｍＬ／分によって行った。定量分析にはＥＳＩ ポジティブモードでのｍｕｌｔｉ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇにて測定した。 その結果、本発明に係るペプチド１は、マウスＣｈｅｍｅｒｉｎ９に比べて、代謝安定性が著しく向上した（図２及び図３）。（４）マウスＣｈｅｍｅｒｉｎ９の薬理試験（細胞内カルシウム変化測定試験及びビボ薬理試験（絶食による亢進するマウス脂肪分解作用に対する抑制試験） 細胞内カルシウム変化測定試験によりマウスｃｈｅｍｅｒｉｎ９はＥＣ５０値４２ｎＭの濃度で受容体であるマウスＣｈｅｍＲ２３を刺激した。 また、絶食による亢進するマウス脂肪分解作用に対する抑制試験において、未修飾のマウスＣｈｅｍｅｒｉｎ９を３０ミリグラム／ｋｇ投与し血中遊離脂肪酸量を測定した。投与後３０，６０分後いずれも血中遊離脂肪酸の減少が観察されず、脂肪酸分解作用は抑制されなかった（図４）。 以上の結果より、本発明に係るペプチドは、ＣｈｅｍＲ２３アゴニスト活性を有し、かつ、天然のＣｈｅｍＲ２３アゴニストに比べて、生体内での安定性、特に、代謝安定性が著しく向上した。 本発明のペプチドは、ＣｈｅｍＲ２３アゴニストであり、かつ、代謝安定性に優れており、免疫疾患、炎症性疾患、糖尿病の治療・予防に有効である。本発明のペプチド１をマウスに投与した場合及び非投与の場合の血中の遊離脂肪酸量を示す図である。マウス血漿中における本発明のペプチド１の代謝安定性を示す図である。マウス血漿中におけるＣｈｅｍｅｒｉｎ９の代謝安定性を示す図である。Ｃｈｅｍｅｒｉｎ９をマウスに投与した場合及び非投与の場合の血中の遊離脂肪酸量を示す図である。 ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｘ１−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｘ２−Ｘ３−Ｓｅｒ（ここで、ｔｙｒはＤ−Ｔｙｒであり、Ｘ１はＤ−Ａｌａ又はＤ−Ｓｅｒであり、Ｘ２はＡｌａ又はＤ−Ａｌａであり、Ｘ３はＤ−Ｐｈｅ又はＴｉｃであり、Ｔｉｃは、で表される基を示す）で表されるペプチド。 Ｘ１がＤ−Ｓｅｒである請求項１記載のペプチド。 Ｘ２がＤ−Ａｌａである請求項２記載のペプチド。 Ｘ３が、Ｔｉｃである請求項３記載のペプチド。 請求項１乃至４のいずれか一項に記載のペプチドからなるＣｈｅｍＲ２３リガンド。 請求項１乃至４のいずれか一項に記載のペプチドからなるＣｈｅｍＲ２３アゴニスト。 請求項１乃至４のいずれか一項に記載のペプチドを有効成分とする医薬。 請求項１乃至４のいずれか一項に記載のペプチドを有効成分とする免疫疾患、炎症性疾患、糖尿病の治療及び／又は予防剤。 ＣｈｅｍＲ２３に結合する化合物をスクリーニングする方法であって、（ａ）候補化合物が存在する条件及び存在しない条件の下で、ＣｈｅｍＲ２３と請求項１乃至４のいずれか一項に記載のペプチドとを接触させ、ＣｈｅｍＲ２３と請求項１乃至５のいずれか一項に記載のペプチドとの結合量を測定する工程と、（ｂ）ＣｈｅｍＲ２３と請求項１乃至４のいずれか一項に記載のペプチドとの結合量を変化させる候補化合物を選択する工程と、を備える方法。 【課題】新規なＣｈｅｍＲ２３アゴニスト及びその用途を提供する。【解決手段】ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｘ１−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｘ２−Ｘ３−Ｓｅｒで表されるペプチドは、生体内で安定なＣｈｅｍＲ２３アゴニストである。［式中、ｔｙｒはＤ−Ｔｙｒであり、Ｘ１はＤ−Ａｌａ又はＤ−Ｓｅｒであり、Ｘ２はＡｌａ又はＤ−Ａｌａであり、Ｘ３はＤ−Ｐｈｅ又はＴｉｃである］【選択図】なし