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クウォン デュル ハン チョイ ワ ジョン リー チュン フワン キム ジン ヒー キム マン ベ JP 2009519324 公表特許公報(A) 20090514 2008545476 20061103 抗ウイルス活性を有するフラボノイド化合物 コリア リサーチ インスティテュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー 503312169 熊倉 禎男 100082005 小川 信夫 100084009 箱田 篤 100084663 浅井 賢治 100093300 平山 孝二 100114007 クウォン デュル ハン チョイ ワ ジョン リー チュン フワン キム ジン ヒー キム マン ベ KR 10-2005-0122246 20051213 A61K 31/7048 20060101AFI20090417BHJP A61P 31/12 20060101ALI20090417BHJP A61K 36/18 20060101ALI20090417BHJP A61K 36/00 20060101ALI20090417BHJP JPA61K31/7048A61P31/12A61K35/78 CA61K35/78 YA61K35/78 X AP(BW,GH,GM,KE,LS,MW,MZ,NA,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),EP(AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,NL,PL,PT,RO,SE,SI,SK,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KM,KN,KP,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,LY,MA,MD,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PG,PH,PL,PT,RO,RS,RU,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,SV,SY,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC,VN,ZA,ZM,ZW KR2006004566 20061103 WO2007069823 20070621 19 20080813 4C086 4C088 4C086AA01 4C086AA02 4C086EA11 4C086MA01 4C086MA04 4C086NA14 4C086ZB33 4C088AB47 4C088AC01 4C088BA10 4C088BA14 4C088BA32 4C088CA14 4C088MA44 4C088NA14 4C088ZB33 本発明は抗ウイルス活性を有するフラボノイド化合物に関し、ドクダミ（Ｈｏｕｔｔｕｙｎｉａ ｃｏｒｄａｔａ）をメタノールで抽出した後、クロマトグラフィを利用して分離／精製をして得たフラボノイド化合物と、これを効率的に抽出、精製する方法、そしてこの化合物を有効成分として含有する抗ウイルス剤組成物に関する。 ケルセチン−７−ラムノシドに対する薬理的、生物学的活性は現在まで全く報告されたところがない。しかし、これと類似した構造を有するフラボノイドや糖化フラボノイドの薬理活性については広く知られている［Journal of Antimicrobial Chemotherapy，L．C．Chiang，W．Chiang，M．C．Liu and C．C．Lin，Vol．52（pp194〜198，2003）］。フラボノイドがヘルペスウイルスやアデノウイルスなどに対して抗ウイルス活性を有することと、ロブスタフラボン（ｒｏｂｕｓｔａｆｌａｖｏｎｅ）などのようなバイフラボノイド系化合物がインフルエンザウイルスなどに対して阻害活性があることが報告されているが［Planta Medica，Yuh-Meei Lin，Vol．65（pp120〜125）］、抗ウイルス活性が卓越していない。 本発明の発明者は既にドクダミ抽出物の抗コロナウイルス活性を開示しており［大韓民国特許出願第２００４−９７５８７号］、ドクダミ抽出物から活性物質を分離するのに成功し、この活性物質がケルセチン−７−ラムノシドであることを確認した。本発明の発明者により出願された特許文献１には、既にドクダミ抽出物の抗コロナウイルス活性が開示されている。しかし、ケルセチン−７−ラムノシドは、抗コロナウイルス活性がドクダミ・メタノール抽出物に比べて７００倍も優れており、更にインフルエンザウイルスに対する抗ウイルス活性が優れていることを確認することで、本発明を完成するに至った。大韓民国特許出願第２００４−９７５８７号大韓民国特許公開第２００４−１０１８６３号Journal of Antimicrobial Chemotherapy，L．C．Chiang，W．Chiang，M．C．Liu and C．C．Lin，Vol．52（pp194〜198，2003）Planta Medica，Yuh-Meei Lin，Vol．65（pp120〜125） 従って、本発明の目的は、ケルセチン−７−ラムノシド、その誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する抗ウイルス剤組成物を提供することにある。 更に、本発明の別の目的は、ドクダミ抽出物からケルセチン−７−ラムノシドを分離する方法を提供することにある。 本発明は下記式１に表されるフラボノイド化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する抗ウイルス剤組成物に関する。［式１］ 前記式１において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は各々Ｈ、ＯＨまたはアルキルの中から選択される。 更に、本発明は、 １）ドクダミをメタノールで抽出し、減圧濃縮した後、酢酸エチルで抽出して酢酸エチル抽出物を得る段階； ２）前記濃縮液をメタノールに溶解させた後、クロマトグラフィを行って活性分画を集める段階；及び ３）前記活性分画をクロマトグラフィで分離し、溶媒を減圧乾燥機で除去した後、冷凍乾燥して抗ウイルス活性を有する化合物を得る段階を含む、ドクダミから抗ウイルス活性を有する化合物を抽出して分離する方法に関する。 本発明を更に詳しく説明すると下記の通りである。 本発明はドクダミをメタノールで抽出した後、クロマトグラフィを利用して分離／精製して得たフラボノイド化合物と、これを効率的に抽出、精製する方法、そしてこの化合物を有効成分として含有する抗ウイルス剤組成物に関する。 本発明による化合物は有機合成方法で合成したり、本発明によってドクダミから抽出、分離することもできる。 ドクダミから抗ウイルス活性化合物を抽出する方法は下記の通りである。 ドクダミを採取してメタノールで２４〜７２時間還流抽出する。前記抽出物を減圧下で濾過した後、酢酸エチルで抽出する。 濃縮された酢酸エチル抽出物をクロロホルム／メタノール（１００／０→０／１００）を溶離液として使用してシリカゲルカラム吸着クロマトグラフィ（ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ｃｏｌｕｍｎ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を行い、活性分画を濃縮する。 前記濃縮された活性分画をメタノールに溶解させた後、セファデックスＬＨ−２０カラムと水−アセトニトリル（２５％アセトニトリル、１７分）溶離液を利用して高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を行い、ケルセチン−７−ラムノシドを得る。 ＥＳＩ−ＭＳ（ｅｌｅｃｔｒｉｎ ｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）、ＮＭＲ分析などの方法を通して、前記式１に表される化合物が下記ｌの理化学的特性を持つことが確認された。 ｉ）物質性状：粉末 ii）分子量：４４８ iii）分子式：Ｃ21Ｈ20Ｏ11 iv）質量分析値（Ｍ−Ｈ）-：４４８（ｍ／ｚ） 重水素化メタノール（ｄｅｕｔｅｒｏｍｅｔｈａｎｏｌ）溶媒を利用したＨ−ＮＭＲ及びＣ−ＮＭＲの分析結果、下記式１ａに表される構造を確認した。［式１ａ］ 本発明の抗ウイルス活性化合物は、薬学的に許容可能な塩の形態で使用することができる。薬学的に許容可能な遊離酸により形成された酸付加塩が好ましい。前記式１の化合物は、当該技術分野で通常的な方法によって薬学的に許容される酸付加塩を形成することができる。遊離酸としては、有機酸または無機酸を使用することができる。無機酸としては塩酸、臭素酸、硫酸、リン酸などであり、有機酸としてはクエン酸、酢酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、蟻酸、プロピオン酸、シュウ酸、トリフルオロ酢酸、安息香酸、グルコン酸、メタンスルホン酸、グリコール酸、コハク酸、４−トルエンスルホン酸、ガラクツロン酸、エンボン酸（ｅｍｂｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、グルタミン酸、アスパラギン酸などである。 更に、本発明は式１に表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する抗ウイルス剤組成物に関する。 前記薬剤組成物は、前記式１に表される化合物または薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有するため、コロナウイルスの増殖を阻害し、コロナウイルス感染による下痢、脱水などの症状を治療したり予防するのに有用に使用することができる。更に、インフルエンザウイルスの増殖を阻害するため、インフルエンザや風邪、または他のＲＮＡウイルスによる感染を治療したり予防するのに有用に使用することができる。 本発明の薬剤組成物は臨床目的のため、経口または非経口投与、例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に投与することができる。また、医薬品または健康食品の形態で使用することができる。 本発明の薬剤組成物の経口投与用剤形の例として、錠剤、トローチ（ｔｒｏｃｈｅｓ）、ドロップ（ｌｏｚｅｎｇｅ）、水溶性または油性懸濁剤、粗製粉末または顆粒、エモルジョン、ハードまたはソフトカプセル、シロップまたはエリキシル剤が含まれる。錠剤、カプセルなどの剤形に製剤するために、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アミロペクチン、セルロースまたはゼラチンのような結合剤；第２リン酸カルシウムのような賦形剤；コーンスターチまたはサツマイモデンプンのような崩壊剤；及びステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリルフマル酸ナトリウムまたはポリエチレングリコールワックスのような潤滑油が含まれる。カルシウム剤形の場合は、脂肪油のような液体担体もまた含まれる。 更に、本発明の薬剤組成物は、皮下注射、静脈注射、筋肉注射または胸腔内注射により非経口で投与することができる。非経口投与用剤形に製剤化するために、前記式１の化合物を安定剤または緩衝剤と共に水に混合して、溶液または懸濁剤を得て、これをアンプル剤またはバイアル剤に製剤する。 一般的に、成人患者への前記式１に表される化合物の有効容量は、１日１〜１００ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは１日５〜２０ｍｇ／ｋｇである。医師または薬剤師の判断によって一定間隔で１日数回、好ましくは１日２〜３回投与することができる。 健康食品とは、前記式１に表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を飲料、茶類、香辛料、ガム、菓子類などの食品素材に添加したり、カプセル、粉末、懸濁液などの形態に製造した食品である。これを摂取する場合、健康上特定な効果をもたらすが、一般薬品とは異なり、長期間服用しても副作用がないという長所がある。 以下、本発明は下記実施例に依拠して更に詳しく説明するが、本発明がこれに限定されるわけではない。実施例１：コロナウイルス活性を有する化合物の分離及び精製 コロナウイルスを阻害し得る化合物を得るために、本発明の発明者は抽出及びクロマトグラフィを利用してドクダミから化合物を分離、精製した。 先ず、キョンナム（Ｋｙｅｕｎｇｎａｍ）農業技術センターで得たドクダミ１ｋｇを１００％メタノールで４８時間抽出した。前記抽出物を減圧下で濃縮した後、酢酸エチルで抽出した。前記酢酸エチル層を濃縮し、前記濃縮物を２ｍＬのメタノールに溶解させた後、クロロホルム／メタノール（１００／０→０／１００）を溶離液として使用してシリカゲルカラム吸着クロマトグラフィを行い、活性分画を濃縮した。前記濃縮された活性分画をメタノールに溶解させた後、セファデックスＬＨ−２０カラムと水−アセトニトリル（２５％アセトニトリル）溶離液（カラム：Ｃ１８、流速：１．５ｍＬ／分、２２０ｎｍ検出）を使用してＨＰＬＣを行った。維持時間１７分台の活性分画を分離し（図１）、減圧乾燥機で溶媒を除去した後、残渣を冷凍乾燥して下記式１に表される化合物３．７ｍｇを得た。［式１ａ］実施例２：活性化合物の理化学的特性 活性化合物の理化学的特性を分析するために、ＥＳＩ−ＭＳ（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｆｉｓｏｎｓ ＶＧ Ｑｕａｔｔｒｏ ４００ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ，ＵＳＡ）、Ｈ−及びＣ−ＮＭＲ分光法を利用した。ＮＭＲ分光法は各試料を重水素化メタノール溶媒に溶かした後、５ｍｍ ＮＭＲチューブで行い、各溶媒のピークを内部標準物質またはＴＭＳ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｓｉｌａｎｅ）のピークを基準として化学移動を測定した。前記化合物に対して物質性状、分子量、分子式及び質量を分析した。 活性化合物の性状は粉末であり、分子量は４４８であり、分子式はＣ21Ｈ20Ｏ11であることを確認し、質量分析値（Ｍ−Ｈ）-は４４８（ｍ／ｚ）であった。重水素化メタノールを使用したＨ−ＮＭＲ及びＣ−ＮＭＲ分光法の結果、活性化合物は抗ウイルス活性を持つ化合物であることが確認された（図２）。＜ＮＭＲデータ＞１）前記式１の化合物13Ｃ ＮＭＲ（ＭｅＯＨ−ｄ6）δ１７．２，２３．１，２９．５，３０．３，３６．５，３９．２，４０．５，７９．７，１１６．８，１２１．０，１２５，１３７．８，１４１．８，１４９．１，１６５．０実施例３：ケルセチン−７−ラムノシドの抗コロナウイルス活性 ケルセチン−７−ラムノシドのコロナウイルス活性を測定するために、本発明の発明者はアフリカミドリザルの腎臓細胞由来のＶｅｒｏ細胞株のＶｅｒｏ細胞を利用して下記のような生体外実験を行った。 ケルセチン−７−ラムノシドのウイルス増殖抑制活性は、大韓民国特許公開第２００４−１０１８６３号で提案された方法にて測定した。コロナウイルスの一種であるブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）に対する阻害活性を測定した。Ｖｅｒｏ細胞を９６−ウェルマイクロプレート上で、各ウェルの底が細胞で完全に覆われるまで培養した。残存する培養地を完全に除去し、リン酸緩衝液で各ウェルを２回洗浄した。ＴＣＩＤ５０の濃度に調整されたＰＥＤＶ溶液を各ウェルに入れ、ケルセチン−７−ラムノシド；シグマ社から購入した既存抗ウイルス剤であるリバビリン、アシクロビル、アマンタジン、アジドチミジン；ロシェ社から購入したオセルタミビル（商品名：タミフル）；グラクソ・ウエルカム社から購入したザナミビル（商品名：リレンザ）を各々ジメチルスルホキシドに溶解させ、各溶液を０．０１〜１００μｇ／ｍＬの濃度で各ウェルに添加した後、４８時間培養し、顕微鏡でＶｅｒｏ細胞を観察した。各ウェルに７０％アセトンを１００μＬずつ添加した後、−２０℃で１時間放置し、乾燥機で乾燥させた後、１％（ｖ／ｖ）酢酸に溶かした０．４％（ｗ／ｖ）ＳＲＢ（スルホローダミンＢ）溶液１００μＬを添加した。３０分間染色させた後、細胞と結合しなかったＳＲＢ染色液を１％（ｖ／ｖ）酢酸で４回洗浄した。乾燥させた後、１０ｍＭトリス溶液（ｐＨ１０．５）１００μＬを各ウェルに加えてウェルの底に染色剤を溶かした後、５６２ｎｍで吸光度を測定して抗ウイルス阻害活性を評価した。 ＤＭＳＯのみで処理した細胞とＤＭＳＯ及びＰＥＤＶで処置した細胞を対照群として使用し、比較した本発明の化合物のＰＥＤＶに対する抗ウイルス活性を下記表１に表した。 前記表１に表されるように、ケルセチン−７−ラムノシドの抗ウイルス阻害活性指数（ＴＩ＝ＣＣ50／ＩＣ50；ＣＣ50＝５０％の細胞毒性を示すのに要求される濃度、ＩＣ50＝５０％のウイルス阻害効果を示すのに要求される濃度）は７，１４３以上を示し、ケルセチン−７−ラムノシドは標準対照物質であるリバビリン（ＴＩ値：２４４）よりウイルス阻害効果が優れていた。別の抗ウイルス剤であるラミブジン、アジドチミジン及びアシクログアニンを最大投与量（１００μg／ｍＬ）でもＩＣ50に及ばなかった。従って、本発明のケルセチン−７−ラムノシドは生体外でブタ流行性下痢ウイルスを効果的に阻害することのできる化合物であることを確認した。 ケルセチン−７−ラムノシドの阻害活性指数（＞７，１４３）は特許文献１のドクダミのメタノール抽出物（１０．１）の阻害活性指数より７００倍以上高いことを確認した。 ケルセチン−７−ラムノシドとそれと類似した構造を有する他のフラボノイドのＰＥＤＶに対するＰＥＤＶに対する阻害活性を比較した。シグマ社から購入したアピゲニン、ルテオリン、ケルセチン、カテキン、クエルシトリン、ゲニスチン、ヘスペリジン及びルチンを各々ジメチルスルホキシドに溶解させた後、０．０１〜１００μg／ｍＬの濃度で抗ウイルス阻害活性を測定し、その結果を下記表２に示した。 アピゲニン、ルテオリン及びケルセチンはフラボノイドに糖が結合されていない化合物であり、カテキンもフラボノイドと非常に類似した構造をしているが、糖が結合されていない化合物である。ゲニスチンはフラボノイドの７番目の炭素にグルコースが結合されている化合物であり（式１参照）、ヘスペリジンとルチンはフラボノイドの７番目の炭素に２個の糖が結合されている化合物であり（式１参照）、ケルセチンはフラボノイドの３番目の炭素にラムノースが結合されている化合物である（式１参照）。前記表２によると、アピゲニンの抗ウイルス阻害活性指数（ＴＩ＝ＣＣ50／ＩＣ50）は３７０であり、ルテオリンとケルセチンの抗ウイルス阻害活性指数は各々３２．７、３４．２であり、カテキンの抗ウイルス阻害活性指数は９．０であり、ケルセチン、ゲニスチン、ヘスペリジン及びルチンは最大投与量（１００μg／ｍＬ）でもＩＣ50に及ばなかった。従って、本発明のケルセチン−７−ラムノシドは、類似するフラボノイドと異なり、特異的であり、生体外でウイルスを阻害することが優れた化合物であることを確認した。 ケルセチン−７−ラムノシドの別種のコロナウイルスであるブタ流行性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）とブタ呼吸器コロナウイルス（ＰＲＣＶ）に対する抗ウイルス活性を評価した。ＳＴ細胞を９６ウェルマイクロプレート上で、各ウェルの底が細胞で完全に覆われるまで培養した。残存する培養地を完全に除去し、リン酸緩衝液で各ウェルを２度洗浄した後、ＴＣＩＤ５０の濃度に調整されたＴＧＥＶ溶液またはＰＲＣＶ溶液を各ウェルに入れた。ケルセチン−７−ラムノシドと、シグマ社から購入した既存の抗ウイルス剤であるリバビリン、ラムブジン、アジドブジン（ａｚｉｄｏｖｕｄｉｎｅ）、アシクログアニン（ａｃｙｃｌｏｇｕａｎｉｎｅ）及びグリシリジン（ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｈｉｎ）を各々ジメチルスルホキシドに溶解させた後、０．０１〜１００μｇ／ｍＬの濃度で各ウェルに添加し、４８時間培養した後、顕微鏡でＳＴ細胞を観察した。前述したＰＥＤＶに対する抗ウイルス阻害評価のように、ＤＭＳＯのみで処理した細胞とＤＭＳＯ及びＴＧＥＶまたはＤＭＳＯ及びＰＲＣＶで処理した細胞を対照群として使用した。本発明の化合物のＰＥＤＶに対する抗ウイルス活性を前記表１に表した。 ラミブジン、アジドブジン、アシクログアニン及びグリシリジンはＴＧＥＶとＰＲＣＶに対して全く阻害活性を示さず、ケルセチン−７−ラムノシドとリバビリンの抗ウイルス阻害活性を下記表３に表した。 前記表３に表されるように、ケルセチン−７−ラムノシドはリバビリンと比べて、ＴＧＥＶ及びＰＲＣＶに対する抗ウイルス活性が優れていることが分かった。従って、ケルセチン−７−ラムノシドは生体外で、ブタ流行性下痢ウイルス、ブタ流行性下痢ウイルス及びブタ流行性胃腸炎ウイルスのコロナウイルスに属する３種のコロナウイルスを効果的に阻害することを確認することができた。実施例４：ケルセチン−７−ラムノシドのインフルエンザウイルスに対する阻害活性 ケルセチン−７−ラムノシドのインフルエンザウイルスに対する阻害活性を評価するために、イヌ腎臓由来のＭＤＣＫ細胞を利用して下記のような生体外実験を行った。 ケルセチン−７−ラムノシドのウイルス増殖抑制活性を特許文献２に方法で測定した。Ａ型インフルエンザウイルス （Ｈ１Ｎ１；ＷＳ／３３株）に対する阻害活性を測定した。ＭＤＣＫ細胞を９６−ウェルマイクロプレート上で各ウェルの底が細胞で完全に覆われるまで培養した。残存する培養地を完全に除去し、リン酸緩衝液で各ウェルを２度洗浄した。ケルセチン−７−ラムノシド；シグマ社から購入した既存の抗ウイルス剤であるリバビリン、アマンタジン；ロシェ社から購入したオセルタミビル（商品名：タミフル）；グラクソ・ウエルカム社から購入したザナミビル（商品名：リレンザ）を各々ジメチルスルホキシドに溶解させた後、１０μｇ／ｍＬの濃度となるように各ウェルに添加し、４８時間培養した後、ＭＤＣＫ細胞を顕微鏡で観察した。７０％アセトンを１００μＬずつ添加した後、各ウェルを−２０℃で１時間放置し、乾燥機で乾燥させた後、１％（ｖ／ｖ）酢酸に溶かした０．４％（ｗ／ｖ）ＳＲＢ（スルホローダミンＢ）溶液１００μＬを添加し、３０分間染色させた後、細胞とＳＲＢ染色液を１％（ｖ／ｖ）酢酸で４回洗浄した。乾燥させた後、１０ｍＭトリス溶液（ｐＨ１０．５）１００μＬを各ウェルに加え、ウェルの底に染色剤を溶かした後、５６２ｎｍで吸光度を測定して抗ウイルス活性を評価した。ＤＭＳＯのみで処理した細胞と、ＤＭＳＯ及びウイルスで処理した細胞を対照群として使用して比較し、各実験を３度反復した。与えられた濃度（１０μｇ／ｍＬ）で各化合物の抗ウイルス活性を下記表４に示した。 前記表４に表されるように、ケルセチン−７−ラムノシドのＡ型インフルエンザウイルスにより感染されたＭＤＣＫ細胞の阻害活性は６６．０３％であり、現在インフルエンザウイルス感染治療剤として使用されるタミフル（−９．７８％）より著しく優れていることを示す。副作用発生率が高いため、吸入用としてのみ使用されるリレンザ（５２．６８％）と、２０００年までインフルエンザの治療に使用されていたが、副作用があるため、現在使用されていないアマンタジン（１４．６０％）も優れた阻害活性を示す。リバビリン（７４．１５％）はケルセチン−７−ラムノシドより阻害活性が優れているが、貧血などの副作用発生率が高いため、インフルエンザ治療剤として使用されていない。従って、本発明のケルセチン−７−ラムノシドは生体外でインフルエンザウイルスを効果的に阻害することができる天然物由来の化合物であることを確認することができた。実施例５：ケルセチン−７−ラムノシドのＢ型インフルエンザウイルスに対する阻害活性 ケルセチン−７−ラムノシドのインフルエンザウイルスに対する阻害活性を評価するために、イヌ腎臓由来のＭＤＣＫ細胞を利用して下記のような生体外実験を行った。 ケルセチン−７−ラムノシドのウイルス増殖抑制活性を特許文献２に方法で測定した。Ｂ型インフルエンザウイルス （Ｂ／Ｌｅｅ／４０）に対する阻害活性を測定した。ＭＤＣＫ細胞を９６−ウェルマイクロプレート上で各ウェルの底が細胞で完全に覆われるまで培養した。残存する培養地を完全に除去し、リン酸緩衝液で各ウェルを２度洗浄した後、ＴＣＩＤ５０の濃度に調整したインフルエンザウイルス溶液を各ウェルに加えた。その後、本発明の化合物と、シグマ社から購入した既存の抗ウイルス剤であるリバビリン及びアマンタジン、ロシェ社から購入したオセルタミビル（商品名：タミフル）、及びグラクソ・ウエルカム社から購入したザナミビル（商品名：リレンザ）を各々ジメチルスルホキシドに溶解させた後、１０μｇ／ｍＬの濃度となるように各ウェルに添加し、４８時間後、前記ＭＤＣＫ細胞を顕微鏡で観察した。７０％アセトンを１００μＬずつ添加した後、各ウェルを−２０℃で１時間放置し、乾燥機で乾燥させた後、１％（ｖ／ｖ）酢酸に溶かした０．４％（ｗ／ｖ）ＳＲＢ（スルホローダミンＢ）溶液１００μＬを添加し、３０分間染色させた後、細胞と結合されていないＳＲＢ溶液を１％（ｖ／ｖ）酢酸で４回洗浄した。乾燥させた後、１０ｍＭトリス溶液（ｐＨ１０．５）１００μＬを各ウェルに加え、ウェルの底に染色剤を溶かした後、５６２ｎｍで吸光度を測定して抗ウイルス活性を評価した。ＤＭＳＯのみで処理した細胞と、ＤＭＳＯ及びウイルスで処理した細胞を対照群として使用して比較し、各実験を３度反復した。与えられた濃度（１０μｇ／ｍＬ）で各化合物の抗ウイルス活性を下記表５に示した。 前記表５に表されるように、ケルセチン−７−ラムノシドのＢ型インフルエンザウイルスにより感染されたＭＤＣＫ細胞の阻害活性は９２．６６％であり、現在インフルエンザウイルス感染治療剤として使用されるタミフル（−１．４３％）より著しく優れていることを示す。副作用発生率が高いため、吸入用としてのみ使用されるリレンザ（３．４０％）と、２０００年までインフルエンザの治療に使用されていたが、副作用があるため、現在使用されていないアマンタジン（−１．８５％）も優れた阻害活性を示す。リバビリン（９５．７７％）はケルセチン−７−ラムノシドより阻害活性が優れているが、貧血などの副作用発生率が高いため、インフルエンザ治療剤として使用されていない。従って、本発明のケルセチン−７−ラムノシドは生体外でインフルエンザウイルスを効果的に阻害することができる天然物由来の化合物であることを確認することができた。実施例６：ケルセチン−７−ラムノシドのロタウイルスに対する阻害活性 ケルセチン−７−ラムノシドのロタウイルスに対する阻害活性を評価するために、ブタ腎臓由来のＭＡ０１４細胞を利用して下記のような生体外実験を行った。 ケルセチン−７−ラムノシドのウイルス増殖抑制活性を特許文献２に方法で測定した。ロタウイルス（ＯＳＵ株）に対する阻害活性を測定した。ＭＡ０１４細胞を９６−ウェルマイクロプレート上で各ウェルの底が細胞で完全に覆われるまで培養した。残存する培養地を完全に除去し、リン酸緩衝液で各ウェルを２度洗浄した後、ＴＣＩＤ５０の濃度に調整されたロタウイルス溶液を各ウェルに添加した。その後、本発明の化合物と、シグマ社から購入した既存の抗ウイルス剤であるリバビリン、アジドチミジン、アシクロビル、ラミブジン及びグリシリジン、グラクソ・ウエルカム社から購入したザナミビル（商品名：リレンザ）を各々ジメチルスルホキシドに溶解させた後、１０μｇ／ｍＬの濃度となるように各ウェルに添加し、４８時間後、ＭＡ１０４細胞を顕微鏡で観察した。７０％アセトンを１００μＬずつ添加した後、各ウェルを−２０℃で１時間放置し、乾燥機で乾燥させた後、１％（ｖ／ｖ）酢酸に溶かした０．４％（ｗ／ｖ）ＳＲＢ（スルホローダミンＢ）溶液１００μＬを添加し、３０分間染色させた後、細胞と結合していないＳＲＢ溶液を１％（ｖ／ｖ）酢酸で４回洗浄した。乾燥させた後、１０ｍＭトリス溶液（ｐＨ１０．５）１００μＬを各ウェルに加え、ウェルの底に染色剤を溶かした後、５６２ｎｍで吸光度を測定して抗ウイルス活性を評価した。ＤＭＳＯのみで処理した細胞と、ＤＭＳＯ及びウイルスで処理した細胞を対照群として使用して比較し、各実験を２度反復した。与えられた濃度（１０μｇ／ｍＬ）で各化合物の抗ウイルス活性を下記表６に示した。 前記表６に表されるように、ケルセチン−７−ラムノシドのロタウイルスにより感染されたＭＡ１０４細胞の阻害活性は７７．３７％であり、現在抗ウイルス剤として使用されるアジドチミジン（０．６９％）、アシクロビル（０．７８％）、ラミブジン（０．０２％）及びリレンザ（０．５０％）より著しく優れている。抗ウイルス活性の天然物であるグリシリジンの阻害活性は０．４９％しかない一方、ケルセチン−７−ラムノシドは７７．３７％の優れた阻害活性を示す。リバビリン（８２．３４％）はケルセチン−７−ラムノシドより阻害活性が優れているが、貧血などの副作用発生率が高いため、インフルエンザ治療剤として使用されていない。従って、本発明のケルセチン−７−ラムノシドは生体外でロタウイルスを効果的に阻害することができる天然物由来の化合物であることを確認することができた。実施例７：ケルセチン−７−ラムノシドのライノウイルスに対する阻害効果 ケルセチン−７−ラムノシドのライノウイルスに対する阻害活性を評価するために、ヒト子宮頸癌細胞株の一つであるＨｅＬａ細胞を利用して下記のような生体外実験を行った。 ケルセチン−７−ラムノシドのウイルス増殖抑制活性を特許文献２に方法で測定した。ライノウイルス（ライノウイルス２株）に対する阻害活性を測定した。ＨｅＬａ細胞を９６−ウェルマイクロプレート上で各ウェルの底が細胞で完全に覆われるまで培養した。残存する培養地を完全に除去し、リン酸緩衝液で各ウェルを２度洗浄した後、ＴＣＩＤ５０の濃度に調整されたライノウイルス溶液を各ウェルに添加した。その後、本発明の化合物と、ケルセチン−７−ラムノシドと類似したフラボノイド化合物であるケルセチン、ルテオリン、アピゲニン、クエルシトリン、ゲニスチン、ヘスペリジン、カテキン及びルチン、そしてシグマ社から購入した既存の抗ウイルス剤であるリバビリンを各々ジメチルスルホキシドに溶解させた後、１０μｇ／ｍＬの濃度となるように各ウェルに添加し、４８時間後、ＨｅＬａ細胞を顕微鏡で観察した。７０％アセトンを１００μＬずつ添加した後、各ウェルを−２０℃で１時間放置し、乾燥機で乾燥させた後、１％（ｖ／ｖ）酢酸に溶かした０．４％（ｗ／ｖ）ＳＲＢ（スルホローダミンＢ）溶液１００μＬを添加し、３０分間染色させた後、細胞と結合していないＳＲＢ溶液を１％（ｖ／ｖ）酢酸で４回洗浄した。乾燥させた後、１０ｍＭトリス溶液（ｐＨ１０．５）１００μＬを各ウェルに加え、ウェルの底に染色剤を溶かした後、５６２ｎｍで吸光度を測定して抗ウイルス活性を評価した。ＤＭＳＯのみで処理した細胞と、ＤＭＳＯ及びウイルスで処理した細胞を対照群として使用して比較し、各実験を３度反復した。与えられた濃度（１０μｇ／ｍＬ）で各化合物の抗ウイルス活性を下記表７に示した。 前記表７に表されるように、ケルセチン−７−ラムノシドと類似した構造を有するフラボノイド化合物であるケルセチン（１３．４３％）、ゲニスチン（１２．９７％）、ヘスペリジン（３．１２％）、ルチン（２５．６８％）及びカテキン（１１．２１％）はロタウイルスに対する阻害活性が優れていなかったが、ケルセチン−７−ラムノシドは７７．８９％の優れた阻害活性を示した。強力な抗ウイルス剤の一つであるリバビリン（４２．３４２％）はケルセチン−７−ラムノシドより阻害活性が悪かった。従って、本発明のケルセチン−７−ラムノシドは生体外でライノウイルスを効果的に阻害することができる天然物由来の化合物であることを確認することができた。実施例８：毒性試験 本発明のケルセチン−７−ラムノシドに対して毒性実験を下記のように行った。 ケルセチン−７−ラムノシドをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、水で希釈した後、これをマウス（群当り１０匹）に各々１０ｇ／ｋｇを投与した。マウスを７日間観察したが、死亡したネズミは見つからなかった。製造例１：粉末剤 有効成分 １０ｇ コーンスターチ ５０ｇ カルボキシセルロース ４０ｇ 総量 １００ｇ 前記成分を細かく砕き、混合して粉末を製造した。５番硬質カプセルに前記粉末１００ｍｇを詰めた。製造例２：錠剤 有効成分 １０ｇ ラクトース ７０ｇ 結晶性セルロース １５ｇ ステアリン酸マグネシウム ５ｇ 総量 １００ｇ 前記成分を細かく砕き、混合した後、直接打錠法により錠剤を製造した。各錠剤の総量は１００ｍｇであり、そのうち有効成分の含量は１０ｍｇである。製造例３：注射剤 有効成分 １０ｍｇ 塩化ナトリウム ６００ｍｇ アスコルビン酸 １００ｍｇ 注射用水 適量 総量 １００ｍＬ 前記のような組成で注射剤を製造した。この溶液をアンプルに詰め、１２０℃で３０分間加熱滅菌した。 以上説明した通り、本発明によるフラボノイド化合物またはその薬学的に許容可能な塩はウイルス感染による疾患を治療したり予防するのに有用に利用される。ドクダミ・メタノール抽出物から分離された活性分画をＨＰＬＣ分析した結果を表すものである。ケルセチン−７−ラムノシドの13Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。ケルセチン−７−ラムノシドの1Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。Ａ型インフルエンザ（Ｈ１Ｎ１／ＷＳ／３３）ウイルスに対するケルセチン−７−ラムノシドの抗ウイルス活性を表すグラフである。Ｂ型インフルエンザ（Ｂ／Ｌｅｅ／４０）ウイルスに対するケルセチン−７−ラムノシドの抗ウイルス活性を表すグラフである。ロタウイルス（ＯＳＵ）に対するケルセチン−７−ラムノシドの抗ウイルス活性を表すグラフである。ライノウイルス２に対するケルセチン−７−ラムノシドの抗ウイルス活性を表すグラフである。 下記式１に表されるフラボノイド化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有することを特徴とする抗ウイルス剤組成物。［式１］ 前記式１において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は各々Ｈ、ＯＨまたはアルキルの中から選択される。 前記化合物は下記式１ａに表される化合物であることを特徴とする、請求項１記載の抗ウイルス剤組成物。［式１ａ］ 前記化合物はドクダミ抽出物から分離されたものであることを特徴とする、請求項１または２記載の抗ウイルス剤組成物。 １）ドクダミをメタノールで抽出した後、減圧下で前記抽出物を濃縮し、酢酸エチルで抽出して酢酸エチル抽出物を得る段階； ２）前記酢酸エチル抽出物を濃縮し、前記濃縮物をメタノールに溶解させた後、シリカゲルカラム吸収クロマトグラフィとセファデックスＬＨ−２０カラムクロマトグラフィを行って活性分画を集める段階；及び ３）前記活性分画を高速液体クロマトグラフィで分離し、溶媒を減圧乾燥機で除去した後、冷凍乾燥して抗ウイルス活性を有する化合物を得る段階を含むことを特徴とする、ドクダミから抗ウイルス活性を有する有効成分を抽出して分離する方法。 前記抗ウイルス活性を有する化合物は下記式１に表される化合物であることを特徴とする、請求項４記載の方法。［式１］ 前記式１において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は各々Ｈ、ＯＨまたはアルキルの中から選択される。 本発明は抗ウイルス活性を有するフラボノイド化合物に関し、更に詳しくは、ドクダミをメタノールで抽出した後、クロマトグラフィを利用して分離／精製をして得た化合物と、これを効率的に抽出、精製する方法、そしてこの化合物を有効成分として含有する抗ウイルス剤組成物に関する。

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