生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公開特許公報(A)_グリセリドの加水分解方法 |
| 出願番号： | 2008278056 |
| 年次： | 2010 |
| IPC分類： | C11C 3/10,C10L 1/08,C10L 1/02,C12P 7/64,C12P 7/62 |
特許情報キャッシュ
島田 裕司 永尾 寿浩 西村 嘉 野上 誠 出田 善裕 JP 2010106107 公開特許公報(A) 20100513 2008278056 20081029 グリセリドの加水分解方法 地方独立行政法人 大阪市立工業研究所 508114454 関西電力株式会社 000156938 南條 博道 100104673 島田 裕司 永尾 寿浩 西村 嘉 野上 誠 出田 善裕 C11C 3/10 20060101AFI20100416BHJP C10L 1/08 20060101ALI20100416BHJP C10L 1/02 20060101ALI20100416BHJP C12P 7/64 20060101ALI20100416BHJP C12P 7/62 20060101ALI20100416BHJP JPC11C3/10C10L1/08C10L1/02C12P7/64C12P7/62 13 ＯＬ 22 4B064 4H013 4H059 4B064AD61 4B064AD85 4B064CA21 4B064CB03 4B064CB24 4B064CD06 4B064CD21 4B064DA16 4H013BA02 4H059BA30 4H059BC06 4H059BC13 4H059BC48 4H059CA36 4H059CA38 4H059CA97 本発明は、酵素を用いてグリセリドを加水分解する方法に関する。本発明はまた、酵素を用いて遊離脂肪酸または脂肪酸エステルを製造する方法、および該方法を用いてバイオディーゼル燃料を製造する方法に関する。本発明はさらに、酵素を用いて遊離脂肪酸または脂肪酸エステル、あるいはこれらの混合物を製造する方法に関する。 昨今の地球環境問題を背景として、地球環境への負荷が少なくエネルギー消費が少ない酵素反応を用いる製造技術が注目されている。しかし、一般に、化学触媒反応では、９９％以上の高い反応率が得られることが多いのに対して、酵素反応では、化学触媒反応と比較して反応率が低いという問題がある。 例えば、リパーゼを用いる酵素反応では、基質であるグリセリド（トリグリセリドおよび部分グリセリド）を完全に加水分解することが望ましいが、逆反応の存在によりグリセリドを完全に加水分解することは困難である。 リパーゼは、脂肪酸エステルからなるバイオディーゼル燃料を製造する技術においても利用され、原料油脂に含まれるグリセリドとアルコールとのエステル交換反応、原料油脂に含まれるグリセリドを加水分解する反応、および加水分解産物である遊離脂肪酸とアルコールとから脂肪酸エステルを合成する反応を触媒する。そのため、グリセリドの分解率を高めることは、脂肪酸エステルの含量が高くかつグリセリド含量が低い高品質のバイオディーゼル燃料の製造にとって重要である。 リパーゼを用いて、グリセリドと遊離脂肪酸とを含む油分を脂肪酸エステルへ変換する方法においては、該油分に酵素とアルコールとを作用させると、遊離脂肪酸のエステル化に伴って生成する水がグリセリドのアルコリシスを妨害するという問題がある。非特許文献１には、この問題を解決するため、遊離脂肪酸とアルコールとのエステル化により得られた油分を脱水した後に、グリセリドとアルコールとを反応させる方法が開示され、この方法によって、大豆油製造過程で排出される脱酸廃棄物に由来する油分から脂肪酸エステルの含量を９１質量％以上、かつグリセリドを３質量％以下の割合で含有するバイオディーゼル燃料を製造できることが記載されている。 リパーゼを用いて、廃食用油に含まれるトリグリセリドをアルコリシスして、トリグリセリドを構成する脂肪酸をエステル化し、脂肪酸エステルを得る方法においては、メタノールを添加すると酵素が不可逆的に失活するという問題がある。特許文献１には、この問題を解決するため、メタノールを廃食用油に逐次添加する方法が開示され、この方法によって、脂肪酸メチルエステルを９６質量％以上、かつグリセリドを４質量％以下の割合で含有するバイオディーゼル燃料を製造できることが記載されている。 このように、リパーゼを用いる酵素反応によって、グリセリドからバイオディーゼル燃料を製造する技術において、非特許文献１および特許文献１に記載の方法によれば、脂肪酸エステルへの変換率を９６％以上にできる。しかし、非特許文献１の方法は、反応後にグリセリドが約３質量％残存するという問題がある。また、２種の酵素反応の他に反応液から水を除去する工程が必要であるなど工程数が多く、２ポット以上の反応系を要するため、環境負荷や製造コストの点でも問題が多い。 これに対して、特許文献１の方法は、メタノールを反応液に逐次添加する工程を伴うが、１ポットの反応系のみからなり得るため、非特許文献１の方法と比較して簡便であり、環境負荷や製造コストの点でも有利である。しかし、特許文献１の方法は、遊離脂肪酸を５質量％以上含む油脂には適用できず、反応後にグリセリドが約３質量％残存するという問題がある。また、リパーゼ阻害濃度以下にアルコール濃度を調節しつつ反応させる方法であるため、アルコールを反応液に添加する時期や量の制御が複雑であるという問題がある。さらに、グリセリドを含む油脂を原料として脂肪酸エステルを製造するには適しているが、高収率で遊離脂肪酸を得るには適さないという問題がある。 ところで、特許文献２には、酵素反応によってステロール脂肪酸エステルを遊離ステロールへ変換する方法において、反応液にアルコールを添加することによって、ステロール脂肪酸エステルのアルコリシス反応を促進し、遊離ステロールへの変換率を高めることが記載されている。しかし、特許文献２には、アルコールを反応開始前に添加しても反応中に逐次的に添加してもよいとの記載があるにもかかわらず、アルコールを反応開始前に添加した実施例しか記載されていない。この実施例では、ステロール脂肪酸エステルの濃度が０．７ｗｔ％になるまでに３日も要している（特許文献２の表４参照）。これは、上述のように、アルコールを反応開始前に添加する場合は、アルコールが酵素活性を阻害するため、遊離ステロールへの効率的な変換が期待できないということと一致する。一方、特許文献２は、アルコールを反応中に逐次的に添加する場合については、アルコールを反応液に添加する時期や量を特定していない。国際公開第００／１２７４３号パンフレット特開２００３−０７９３９０号公報Y. Watanabeら、「Conversion of acid oil by-produced in vegetable oil refining to biodiesel fuel by immobilized Candida antarctica lipase」、J. Mol. Catal. B: Enzymatic、2007年、第44巻、p. 99-105 本発明は、酵素を用いてグリセリドを簡便かつ効率的に加水分解する方法、酵素を用いて遊離脂肪酸または脂肪酸エステルを簡便かつ効率的に製造する方法、および該方法を用いてバイオディーゼル燃料を製造する方法、ならびに酵素を用いて遊離脂肪酸または脂肪酸エステル、あるいはこれらの混合物を簡便かつ効率的に製造する方法を提供することを目的とする。 本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、酵素を用いてグリセリドを加水分解する際に、グリセリドの加水分解反応が３０％以上の分解率に達するまで酵素反応を行った後、反応液にアルコールを添加することによって、グリセリドの加水分解率を、反応液にアルコールを添加しない場合と比較して上昇させることができることを見出し、本発明を完成した。 本発明は、酵素を用いてグリセリドを加水分解する方法を提供し、該方法は、 グリセリドを含む油脂と、水と、グリセリドの加水分解反応を触媒し得る酵素とを混合して、該グリセリドの加水分解反応が３０％以上の分解率に達するまで反応させる第１反応工程、および 該第１反応工程で得られる反応液にアルコールを添加して、さらに該加水分解反応を続行させる第２反応工程、を含む。 １つの実施態様では、上記アルコールは、第１級または第２級アルコールである。 １つの実施態様では、上記第２反応工程において、上記アルコールは、上記グリセリドを含む油脂中の全脂肪酸量に対して０．１〜５モル当量の割合で添加される。 １つの実施態様では、上記油脂は、植物油脂、動物油脂、魚油または微生物油脂である。 １つの実施態様では、上記酵素は、リパーゼである。 また、本発明は、酵素を用いて遊離脂肪酸または脂肪酸エステルを製造する方法を提供し、該方法は、 グリセリドを含む油脂と、水と、グリセリドの加水分解反応を触媒し得る酵素とを混合して、該グリセリドの加水分解反応が３０％以上の分解率に達するまで反応させる第１反応工程、および 該第１反応工程で得られる反応液にアルコールを添加して、さらに該加水分解反応を続行させる第２反応工程、を含む。 １つの実施態様では、上記アルコールは、第１級または第２級アルコールである。 １つの実施態様では、上記第２反応工程において、上記アルコールは、上記グリセリドを含む油脂中の全脂肪酸量に対して０．１〜５モル当量の割合で添加される。 １つの実施態様では、上記油脂は、植物油脂、動物油脂、魚油または微生物油脂である。 １つの実施態様では、上記酵素は、リパーゼである。 本発明は、酵素を用いてバイオディーゼル燃料を製造する方法を提供し、該方法は、 グリセリドを含む油脂と、水と、グリセリドの加水分解反応を触媒し得る酵素とを混合して、該グリセリドの加水分解反応が３０％以上の分解率に達するまで反応させる第１反応工程、および 該第１反応工程で得られる反応液にアルコールを添加して、さらに該加水分解反応を続行させる第２反応工程であって、該第２反応工程が、該第２反応工程で得られる反応液中の該遊離脂肪酸または脂肪酸エステルを含む水溶性画分または非水溶性画分中のグリセリド含量が該画分の１質量％以下に達するまで継続される、工程、を含む。 さらに、本発明は、酵素を用いて遊離脂肪酸または脂肪酸エステル、あるいはこれらの混合物を製造する方法を提供し、該方法は、 グリセリドを含む油脂と、水と、グリセリドの加水分解反応を触媒し得る酵素とを混合して、該グリセリドの加水分解反応が３０％以上の分解率に達するまで反応させる第１反応工程、 該第１反応工程で得られる反応液にアルコールを添加して、さらに該加水分解反応を続行させる第２反応工程、および 該第２反応工程で得られる反応液中の水溶性画分または非水溶性画分から該グリセリド、該遊離脂肪酸または脂肪酸エステル、あるいはこれらの混合物を回収する工程、を含む。 １つの実施態様では、上記油脂は、魚油または微生物油脂であり、前記遊離脂肪酸または遊離脂肪酸エステルは、高度不飽和脂肪酸またはそのエステルである。 本発明によれば、酵素を用いてグリセリドを加水分解する方法、酵素を用いて遊離脂肪酸または脂肪酸エステルを製造する方法、および該方法を用いてバイオディーゼル燃料（ＢＤＦ）を製造する方法、ならびに酵素を用いて遊離脂肪酸または脂肪酸エステル、あるいはこれらの混合物を製造する方法において、１ポットでの反応系においても、グリセリドの加水分解率を、反応液にアルコールを添加しない場合と比較して上昇させることができる。本発明によれば、例えば、魚油から高度不飽和脂肪酸含量の高い油脂を、効率よく得ることができ、グリセリドを含む廃油からグリセリド含量が１質量％以下の高品質のＢＤＦを、効率よく得ることができる。 （油脂） 本発明において、油脂とは、グリセリドを主成分として含み、遊離脂肪酸または脂肪酸エステルを含むものをいう。本発明において用いられる油脂としては、植物、動物、魚類または微生物のいずれに由来するものでもよい。一般に、グリセリドを５質量％以上含む油脂が、好ましく用いられる。より好ましくは、グリセリドを７０質量％以上含む油脂である。植物由来油脂としては、例えば、オリーブ油、サラダ油、パーム油、ヤトロファ（Ｊａｔｒｏｐｈａ）油などが挙げられる。動物由来油脂としては、例えば、牛脂、豚脂などが挙げられる。魚類由来油脂（魚油）としては、例えば、マグロ油、イワシ油、カツオ油などが挙げられる。微生物由来油脂としては、モルティエレラ属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）やシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）の微生物が生産するものなどが挙げられる。 （グリセリド） 本発明において、グリセリドとは、グリセロール（グリセリン）と脂肪酸とがエステル結合したものを総称し、アシルグリセロール（ＡＧ：トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、およびモノアシルグリセロールの混合物）、好ましくはトリグリセリド（トリアシルグリセロール：ＴＡＧ）、ジグリセリド（ジアシルグリセロール：ＤＡＧ）、またはモノグリセリド（モノアシルグリセロール：ＭＡＧ）を含み、より好ましくはＴＡＧである。 （遊離脂肪酸） 本発明において、遊離脂肪酸とは、遊離のカルボキシル基を有する脂肪酸をいい、その種類を問わない。また、直鎖の脂肪酸であってもよく、分岐の脂肪酸であってもよい。さらに、飽和脂肪酸であってもよく、不飽和脂肪酸であってもよい。 （脂肪酸エステル） 本発明において、脂肪酸エステルとは、アルコールと脂肪酸とから脱水縮合によって生成される化合物をいい、その種類を問わない。 （アルコール） 本発明において用いられるアルコールとしては、特に制限はない。第１級アルコール、第２級アルコールなどが用いられるが、第１級アルコールが好ましく用いられる。第１級アルコールとしては、炭素数１〜１２の直鎖または分岐のアルコールが用いられる。例えば、メタノール、エタノール、ブタノール、ドデカノールなどが挙げられるが、特に限定されない。より好ましくはメタノールおよびエタノールである。第２級アルコールとしては、例えば、イソプロパノール、２−ブタノール、２−ヘキサノールなどが挙げられる。 （酵素） 本発明において用いられるグリセリドの加水分解反応を触媒し得る酵素としては、上記グリセリドを基質として認識するものであれば限定されない。例えば、リパーゼ（トリグリセリドリパーゼ、モノグリセリドリパーゼ、モノおよびジグリセリドリパーゼ）、クチナーゼ、エステラーゼなどが挙げられる。これらの中でもリパーゼが好ましく、特にトリグリセリドリパーゼが好ましい。トリグリセリドリパーゼは、トリグリセリドの１，３−位に特異的であってもよく、非特異的（トリグリセリドの任意の位置のエステル結合を加水分解する）であってもよい。本発明において、加水分解反応とは、グリセリドなどの脂肪酸エステルと水とから遊離脂肪酸とアルコールとを生成する反応をいう。加水分解反応は可逆反応であるため、上記酵素は、遊離脂肪酸とアルコールとから水と脂肪酸エステルとを生成する反応（逆反応）をも触媒し得る。 上記酵素は、微生物、動物、または植物のいずれに由来するものでもよい。例えば、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ゲオトリカム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、リゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、アルペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、サーモミセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）属（以前の名称はフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属）、シュードチマ（Ｐｓｅｏｄｏｚｙｍａ）属などの微生物が生産する酵素、豚膵臓由来の酵素などが挙げられる。これらの酵素を単独で、または複数を混合して用いることができる。これらの酵素は一般に市販されているものを用いてもよく、容易に入手可能である。 上記酵素は、粗精製物、部分精製物、または完全精製物のいずれでもよい。また、遊離型のままでもよく、あるいはイオン交換樹脂、多孔性樹脂、セラミックス、炭酸カルシウムなどの担体に固定されたものでもよい。遊離型の酵素を用いる場合は、一旦酵素を水に溶解してから反応液に添加してもよく、酵素と水とを別々に反応液に添加してもよい。 （高度不飽和脂肪酸） 本発明において、高度不飽和脂肪酸とは、多価不飽和脂肪酸（ポリエン脂肪酸）のうち、炭素鎖長２０以上で二重結合を３個以上含むものをいう。例えば、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などが挙げられる。 （バイオディーゼル燃料） 本発明において、バイオディーゼル燃料とは、生物由来のグリセリドから作られるディーゼルエンジン用燃料であって、脂肪酸エステルを主成分とするものをいう。 （グリセリドの加水分解方法） 本発明の、グリセリドを加水分解する方法は、 グリセリドを含む油脂と、水と、グリセリドの加水分解反応を触媒し得る酵素とを混合して、該グリセリドの加水分解反応が３０％以上の分解率に達するまで反応させる第１反応工程、および 該第１反応工程で得られる反応液にアルコールを添加して、さらに該加水分解反応を続行させる第２反応工程、を含む。 上記加水分解方法において、第１反応工程では、グリセリドを含む油脂と、水と、グリセリドの加水分解反応を触媒し得る酵素とを混合して反応液を調製し、グリセリドの加水分解反応が３０％以上の分解率に達するまで反応させる。この第１反応工程においては、加水分解反応によってグリセリドから遊離脂肪酸とグリセロールとが生成して反応液中の遊離脂肪酸の濃度が上昇する結果、反応の進行に伴って酵素の逆反応が誘引され、グリセリドの加水分解反応は、その速度が徐々に遅くなり、やがて平衡状態に達する。 本発明において、反応液中のグリセリド含量は、反応液を適宜サンプリングし、ガスクロマトグラフィーや薄層クロマトグラフィー／水素炎イオン化検出器（ＴＬＣ−ＦＩＤ）などを用いて分析することにより適宜定量することができる。本発明において、グリセリドの加水分解反応の分解率または加水分解率とは、反応液中のグリセリド含量が加水分解反応によって反応開始時から低下した割合（％）をいう。分解率または加水分解率は、反応液中のグリセリド含量をモニターすることにより適宜決定することができる。 次いで、第２反応工程では、第１反応工程で得られる反応液にアルコールを添加して、さらに該加水分解反応を続行させる。すなわち、アルコールの添加は、グリセリドの分解率が３０％以上に達してから行い、加水分解反応が平衡状態になってから行ってもよい。この第２反応工程においては、反応液にアルコールを添加することによって、酵素反応により遊離脂肪酸と添加したアルコールとから脂肪酸エステルが生成して反応液中の遊離脂肪酸の濃度が減少する結果、上記酵素の逆反応を緩和してグリセリドの加水分解が促進されるものと考えられる。グリセリドの最終加水分解率は、好ましくは９９％以上である。 上記加水分解方法において、酵素反応は、静置反応でもよいし、各種の攪拌法、振盪法、超音波法、窒素などの吹き込み法、ポンプなどによる循環混合法、弁またはピストンを用いる混合法などにより、あるいはこれらの方法の組合せにより、反応液をよく混合しながら行ってもよい。 上記酵素反応は、加水分解反応を効率よく行うために適した温度で行えばよく、好ましくは０〜９０℃、より好ましくは２０〜７０℃である。また、酵素反応の途中で変更してもよい。 上記加水分解方法において、酵素の量は、反応温度、反応時間、油脂の種類などにより適宜設定でき、特に限定されないが、好ましくは反応液１ｇ当たり１単位（Ｕ）〜１００００Ｕ、より好ましくは５Ｕ〜１０００Ｕである。１Ｕとは、リパーゼの場合、オリーブ油の加水分解において１分間に１μｍｏｌの脂肪酸を遊離する酵素の量である。 上記加水分解方法において、水の量は、特に限定されないが、好ましくは反応液に対して１〜１００質量％、より好ましくは１０〜５０質量％である。 上記加水分解方法において、アルコールの量は、特に限定されないが、好ましくは通常グリセリドを含む油脂中の全脂肪酸量に対して０．１〜３０モル当量、より好ましくは０．１〜５モル当量である。 上記加水分解方法において、酵素反応の方法、および酵素の量、水の量などの酵素反応の条件（アルコールの量を除く）は、第１反応工程と第２反応工程とで同じであってもよいし、異なっていてもよい。 （遊離脂肪酸または脂肪酸エステルの製造方法） 本発明の、遊離脂肪酸または脂肪酸エステルを製造する方法は、 グリセリドを含む油脂と、水と、グリセリドの加水分解反応を触媒し得る酵素とを混合して、該グリセリドの加水分解反応が３０％以上の分解率に達するまで反応させる第１反応工程、および 該第１反応工程で得られる反応液にアルコールを添加して、さらに該加水分解反応を続行させる第２反応工程、を含む。 上記製造方法において、第１反応工程では、グリセリドを含む油脂と、水と、グリセリドの加水分解反応を触媒し得る酵素とを混合して反応液を調製し、グリセリドの加水分解反応が３０％以上の分解率に達するまで反応させる。この第１反応工程においては、加水分解反応によってグリセリドから遊離脂肪酸とグリセロールとが生成して反応液中の遊離脂肪酸の濃度が上昇する結果、反応の進行に伴って酵素の逆反応が誘引され、グリセリドの加水分解反応は、その速度が徐々に遅くなり、やがて平衡状態に達する。 次いで、第２反応工程では、第１反応工程で得られる反応液にアルコールを添加して、さらに該加水分解反応を続行させる。すなわち、アルコールの添加は、グリセリドの分解率が３０％以上に達してから行い、加水分解反応が平衡状態になってから行ってもよい。この第２反応工程においては、反応液にアルコールを添加することによって、酵素反応により遊離脂肪酸と添加したアルコールとから脂肪酸エステルが生成して反応液中の遊離脂肪酸の濃度が減少する結果、上記酵素の逆反応を緩和してグリセリドの加水分解が促進されるものと考えられる。 上記製造方法において、酵素反応の方法、および酵素の量、水の量、アルコールの量などの酵素反応の条件は、上記加水分解方法と同様である。 上記製造方法においては、第２反応工程で得られる反応液からの脂肪酸エステルを酵素的または化学的に分解する工程をさらに加えることによって、得られる遊離脂肪酸の収率を上昇させることができる。これとは反対に、第２反応工程で得られる反応液からの遊離脂肪酸を酵素的または化学的に脂肪酸エステルへ変換する工程をさらに加えることによって、得られる脂肪酸エステルの収率を上昇させることもできる。 （バイオディーゼル燃料の製造方法） 本発明の、バイオディーゼル燃料を製造する方法は、 グリセリドを含む油脂と、水と、グリセリドの加水分解反応を触媒し得る酵素とを混合して、該グリセリドの加水分解反応が３０％以上の分解率に達するまで反応させる第１反応工程、および 該第１反応工程で得られる反応液にアルコールを添加して、さらに該加水分解反応を続行させる第２反応工程であって、該第２反応工程が、該第２反応工程で得られる反応液中の該遊離脂肪酸または脂肪酸エステルを含む水溶性画分または非水溶性画分中のグリセリド含量が該画分の１質量％以下に達するまで継続される、工程、を含む。 上記製造方法において、第１反応工程では、グリセリドを含む油脂と、水と、グリセリドの加水分解反応を触媒し得る酵素とを混合して反応液を調製し、グリセリドの加水分解反応が３０％以上の分解率に達するまで反応させる。この第１反応工程においては、加水分解反応によってグリセリドから遊離脂肪酸とグリセロールとが生成して反応液中の遊離脂肪酸の濃度が上昇する結果、反応の進行に伴って酵素の逆反応が誘引され、グリセリドの加水分解反応は、その速度が徐々に遅くなり、やがて平衡状態に達する。 次いで、第２反応工程では、第１反応工程で得られる反応液にアルコールを添加して、さらに該加水分解反応を続行させる。すなわち、アルコールの添加は、グリセリドの分解率が３０％以上に達してから行い、加水分解反応が平衡状態になってから行ってもよい。この第２反応工程においては、反応液にアルコールを添加することによって、酵素反応により遊離脂肪酸と添加したアルコールとから脂肪酸エステルが生成して反応液中の遊離脂肪酸の濃度が減少する結果、上記酵素の逆反応を緩和してグリセリドの加水分解が促進されるものと考えられる。第２反応工程は、第２反応工程で得られる反応液中の該遊離脂肪酸または脂肪酸エステルを含む水溶性画分または非水溶性画分中のグリセリド含量が該画分の１質量％以下に達するまで継続される。したがって、遊離脂肪酸または脂肪酸エステル（バイオディーゼル燃料）を９９質量％以上含む画分を得ることができる。 上記製造方法において、酵素反応の方法、および酵素の量、水の量、アルコールの量などの酵素反応の条件は、上記加水分解方法と同様である。 上記製造方法においては、遊離脂肪酸または脂肪酸エステルの回収工程では、第２反応工程で得られる反応液を水溶性画分と非水溶性画分とに分画し、そして分画された水溶性画分または非水溶性画分から遊離脂肪酸または脂肪酸エステルを分離精製する。これは、溶媒による抽出、蒸留による精製などの常法によって行うことができる。 上記製造方法においては、遊離脂肪酸または脂肪酸エステルは、炭素鎖長が４以下の場合には、第２反応工程で得られる反応液中の水溶性画分から回収される。水溶性画分には、加水分解反応の副産物であるグリセロールや未反応のアルコールなども共存するため、目的とする遊離脂肪酸または脂肪酸エステルをこれらの夾雑物から分離する必要がある。一方、遊離脂肪酸または脂肪酸エステルは、炭素鎖長が５以上の場合には、第２反応工程で得られる反応液中の非水溶性画分から回収される。非水溶性画分には、原料であるグリセリドが含まれるが、残存するグリセリドの量が少ないため、目的とする遊離脂肪酸または脂肪酸エステルの分離精製は比較的容易である。グリセリドを完全に分解することにより、目的物の分離精製はさらに容易となる。 本発明において、水溶性画分または非水溶性画分とは、反応液を水溶性画分と非水溶性画分とに分画した場合の水溶性画分または非水溶性画分をいう。反応液の分画は、通常、反応液を静置または遠心分離することによって行うが、他の方法によってもよい。 （遊離脂肪酸または脂肪酸エステル、あるいはこれらの混合物の製造方法） 本発明の、遊離脂肪酸または脂肪酸エステル、あるいはこれらの混合物を製造する方法は、 グリセリドを含む油脂と、水と、グリセリドの加水分解反応を触媒し得る酵素とを混合して、該グリセリドの加水分解反応が３０％以上の分解率に達するまで反応させる第１反応工程、 該第１反応工程で得られる反応液にアルコールを添加して、さらに該加水分解反応を続行させる第２反応工程、および 上記第２反応工程で得られる反応液中の水溶性画分または非水溶性画分から該遊離脂肪酸または脂肪酸エステル、あるいはこれらの混合物を回収する工程、を含む。 上記製造方法において、第１反応工程では、グリセリドを含む油脂と、水と、グリセリドの加水分解反応を触媒し得る酵素とを混合して反応液を調製し、グリセリドの加水分解反応が３０％以上の分解率に達するまで反応させる。この第１反応工程においては、加水分解反応によってグリセリドから遊離脂肪酸とグリセロールとが生成して反応液中の遊離脂肪酸の濃度が上昇する結果、反応の進行に伴って酵素の逆反応が誘引され、グリセリドの加水分解反応は、その速度が徐々に遅くなり、やがて平衡状態に達する。 次いで、第２反応工程では、第１反応工程で得られる反応液にアルコールを添加して、さらに該加水分解反応を続行させる。すなわち、アルコールの添加は、グリセリドの分解率が３０％以上に達してから行い、加水分解反応が平衡状態になってから行ってもよい。この第２反応工程においては、反応液にアルコールを添加することによって、酵素反応により遊離脂肪酸と添加したアルコールとから脂肪酸エステルが生成して反応液中の遊離脂肪酸の濃度が減少する結果、上記酵素の逆反応を緩和してグリセリドの加水分解が促進されるものと考えられる。 次いで、遊離脂肪酸または脂肪酸エステル、あるいはこれらの混合物の回収工程では、第２反応工程で得られる反応液を水溶性画分と非水溶性画分とに分画し、そして分画された水溶性画分または非水溶性画分から遊離脂肪酸または脂肪酸エステル、あるいはこれらの混合物を分離精製する。これは、溶媒による抽出、蒸留による精製などの常法によって行うことができる。 上記製造方法において、酵素反応の方法、および酵素の量、水の量、アルコールの量などの酵素反応の条件は、上記加水分解方法と同様である。 上記製造方法においては、遊離脂肪酸または脂肪酸エステルは、炭素鎖長が４以下の場合には、第２反応工程で得られる反応液中の水溶性画分から回収される。水溶性画分には、加水分解反応の副産物であるグリセロールや未反応のアルコールなども共存するため、目的とする遊離脂肪酸または脂肪酸エステルをこれらの夾雑物から分離する必要がある。一方、遊離脂肪酸または脂肪酸エステルは、炭素鎖長が５以上の場合には、第２反応工程で得られる反応液中の非水溶性画分から回収される。非水溶性画分には、原料であるグリセリドが含まれるが、残存するグリセリドの量が少ないため、目的とする遊離脂肪酸または脂肪酸エステルの分離精製は比較的容易である。グリセリドを完全に分解することにより、目的物の分離精製はさらに容易となる。したがって、魚油や微生物由来のグリセリドを原料とする場合のように、グリセリドの加水分解によって得られる遊離脂肪酸が高度不飽和脂肪酸である場合には、遊離脂肪酸または脂肪酸エステルは、第２反応工程で得られる反応液中の非水溶性画分から効率よく回収することができる。 本発明によれば、グリセリドを含む油脂と、水と、グリセリドの加水分解反応を触媒し得る酵素とを混合して反応液を調製し、グリセリドの加水分解反応が３０％以上の分解率に達する時点（第１反応工程終了時）で、反応液にアルコールを添加すると、加水分解反応によって生じる遊離脂肪酸のエステル化反応が開始され、同時にグリセリドの分解率も飛躍的に上昇する（第２反応工程）。特に酵素が作用しやすい脂肪酸で構成されているグリセリドの加水分解においては、グリセリドをほぼ完全に分解することができる。また、本発明によれば、上記加水分解反応に伴い、グリセリドを含む油脂から遊離脂肪酸または脂肪酸エステルを効率よく製造することができる。例えば、グリセリドを含む廃油からグリセリド含量が１質量％以下の高品質のバイオディーゼル燃料（ＢＤＦ）を、効率よく得ることができる。さらに、本発明によれば、上記加水分解反応に伴い、グリセリドを含む油脂から遊離脂肪酸または脂肪酸エステル、あるいはこれらの混合物を効率よく製造することができる。例えば、魚油から高度不飽和脂肪酸含量の高い油脂を、効率よく得ることができる。 一方、本発明とは異なり、グリセリドを含む油脂と、水と、グリセリドの加水分解反応を触媒し得る酵素とを混合して反応液を調製し、反応開始時に、反応液にアルコールを添加すると、グリセリドの加水分解率は、反応液にアルコールを添加しない場合と比較して著しく低下する。これは、アルコールのリパーゼ阻害作用によるものと考えられる。 以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明がこの実施例に制限されないことはいうまでもない。 （材料および方法） １．グリセリドを含む油脂 以下の実施例に用いた油脂のケン化価、酸価、および主な構成脂肪酸組成を表１に示す。ここで、ケン化価とは、油脂１ｇをケン化するのに必要なＫＯＨのｍｇ数をいい、酸価とは、油脂１ｇを中和するのに必要なＫＯＨのｍｇ数をいう。 ２．酵素 酵素として、酵母キャンディダ・ルゴーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）由来のリパーゼ（商品名：リパーゼＯＦ、名糖産業株式会社製）、糸状菌リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）由来のリパーゼ（商品名：リポザイムＲＭ、ノボザイムズ社製）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属の細菌由来のリパーゼ（商品名：リパーゼＱＬＭ、名糖産業株式会社製）、および細菌バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）由来のリパーゼ（商品名：リパーゼＰＳ、天野エンザイム社製）を使用した。リパーゼの場合、オリーブ油の加水分解において１分間に１μｍｏｌの脂肪酸を遊離する酵素の量を１Ｕと定義した。リパーゼが粉末のときは、一旦リパーゼを水に溶解してから、所定の量になるように反応液に添加した。なお、リゾムコール・ミエヘイ・リパーゼ（リポザイムＲＭ）は、ＴＡＧを１，３−位特異的に加水分解する。 ３．酵素反応 グリセリドを含む油脂、水、およびリパーゼを含む反応液を５０ｍＬ容のサンプル瓶に入れ、このサンプル瓶を３０℃に設定した水槽に入れ、反応液を５００ｒｐｍで攪拌しながら反応を行った。 ４．グリセリド、遊離脂肪酸、および脂肪酸エステルの分析 反応液のうち約０．８ｇを取り出し、遠心分離により油層と水層とに分離し、油層画分のグリセリド（ＡＧ）、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、および脂肪酸エステルの含量を分析した。グリセリドとしてマグロ油を用いた反応では、反応液の油層画分中の各成分の含量をガスクロマトグラフィーにより分析した。カラムはＤＢ−１ｈｔ（５ｍ、０．２５μｍ、アジレントテクノロジー社製）を用い、１２０℃で０．５分間保持後、１５℃／分で２８０℃へ、そして１０℃／分で３７０℃へ昇温し、３７０℃で３分間保持した。注入口、検出器とも３７０℃に設定した。グリセリドとしてヤトロファ油およびサラダ油を用いた反応では、反応液の油層画分中の各成分の含量をＴＬＣ−ＦＩＤ（イアトロスキャンＭＫ−５、ヤトロン社製）を用いて分析した。ＴＬＣ−ＦＩＤ分析では、一次展開溶媒としてトルエン：クロロホルム：酢酸＝５０：２０：１（容量比）を、二次展開溶媒としてヘキサン：ジエチルエーテル＝６５：５（容量比）を用いて行った。 （参考例：メタノールを添加しない場合の加水分解率） グリセリドを含む油脂として１４ｇのヤトロファ油（インドネシア、バンドン工科大学化学工学部、Ｔ．Ｐｒｏｋｏｓｏ博士提供）を用いた。グリセリドを含む油脂および３０質量％の水を含む反応液（ヤトロファ油１４ｇおよび水６ｇからなる反応液）に、反応液１ｇ当たり３０Ｕのキャンディダ・ルゴーサ・リパーゼ（リパーゼＯＦ）を添加して、グリセリドの加水分解を行った。結果を以下の表２に示す。得られた反応液の油層画分中のＡＧ含量は、反応開始から２０時間後には５．８質量％まで低下した。しかし、その後は、４４時間後までほとんど低下しなかった。したがって、加水分解反応は反応開始から２０時間後にほぼ平衡状態に達した。この場合のグリセリドの分解率（すなわち、最終分解率）は９４％であった。 （比較例１：反応開始時にメタノールを添加した場合の加水分解率） 反応開始時に、グリセリドを含む油脂中の全脂肪酸量に対して１．５モル当量のメタノールを添加したこと以外は、参考例と同様に反応を行った。結果を以下の表２に示す。得られた反応液の油層画分中のＡＧ含量は、反応開始から２０時間後に５５．５質量％まで低下し、４４時間後に２７．７質量％まで低下した。グリセリドの最終分解率は７２％であった。したがって、メタノールの添加により、グリセリドの分解速度は遅くなる（すなわち、酵素反応が阻害される）ことがわかった。 （比較例２：反応開始から１０分後にメタノールを添加した場合の加水分解率） 反応開始から１０分後に、メタノールを添加してさらに４４時間反応を行ったこと以外は、参考例と同様に反応を行った。結果を以下の表２に示す。得られた反応液の油層画分中のＡＧ含量は、反応開始から１０分後にメタノールを添加した時点で、７８．４質量％（グリセリドの分解率は２２％）であり、反応開始から２０時間後に５０．５質量％（グリセリドの分解率は４９％）まで低下し、４４時間後に３３．９質量％まで低下した。すなわち、グリセリドの最終分解率は６６％であった。したがって、グリセリドの加水分解率が３０％以上に達する前のメタノールの添加は、ＦＦＡのメチルエステル化反応を誘導せず、その結果、グリセリドの最終分解率は上昇しないことがわかった。 （実施例１：反応開始から２０時間後にメタノールを添加した場合の加水分解率） 反応開始から２０時間後に、グリセリドを含む油脂中の全脂肪酸量に対して１．５モル当量のメタノールを添加してさらに２４時間反応を行ったこと以外は、参考例と同様に反応を行った。結果を表２に示す。得られた反応液の油層画分中のＡＧ含量は、反応開始から２０時間後にメタノールを添加した時点で、５．４質量％（グリセリドの分解率は９５％）であり、反応開始から４４時間後には検出限界（１質量％）以下まで低下した。すなわち、グリセリドの最終分解率はほぼ１００％であり、グリセリドがほぼ完全分解した。したがって、グリセリドの加水分解率が３０％以上に達した後のメタノールの添加は、ＦＦＡのメチルエステル化反応を誘導し、その結果、グリセリドの最終分解率は上昇し得ることがわかった。 （実施例２：各種リパーゼを用いた検討） グリセリドを含む油脂として１２ｇのヤトロファ油を用いた。グリセリドを含む油脂および３０質量％の水を含む反応液に、反応液１ｇ当たり３０Ｕの以下の表３に記載の各種リパーゼをそれぞれ添加して、グリセリドの加水分解を行った。反応開始から２０時間後に、グリセリドを含む油脂中の全脂肪酸量に対して１．５モル当量のメタノールを添加してさらに２４時間反応を行った。結果を表３に示す。 キャンディダ・ルゴーサ・リパーゼ（リパーゼＯＦ）を用いた場合、反応開始から４４時間後（反応終了後）の反応液の油層画分中のＡＧ含量は、メタノールを添加しないときは５質量％であった。これに対して、メタノールを添加したときは、検出限界以下であった。リゾムコール・ミエヘイ・リパーゼ（リポザイムＲＭ）を用いた場合、反応終了後の反応液の油層画分中のＡＧ含量は、メタノール添加により５３質量％から３８質量％まで低下した。アルカリゲネス属リパーゼ（リパーゼＱＬＭ）を用いた場合、反応終了後の反応液の油層画分中のＡＧ含量は、メタノール添加により３４質量％から７質量％まで低下した。バークホルデリア・セパシア・リパーゼ（リパーゼＰＳ）を用いた場合、反応終了後の反応液の油層画分中のＡＧ含量は、メタノール添加により４３質量％から９質量％まで低下した。したがって、いずれのリパーゼを用いた場合も、酵素反応の途中でのメタノールの添加により、グリセリドの最終分解率は上昇し得ることがわかった。 ヤトロファ油の最終分解率、および分解産物であるＦＦＡのメチルエステル化率（すなわち、（脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）の含量）／（ＦＦＡの含量＋ＦＡＭＥの含量）×１００（％））については、次のことがわかった：キャンディダ・ルゴーサ・リパーゼを用いた場合は、メタノール添加により、グリセリドの最終分解率がほぼ１００％、およびＦＦＡのメチルエステル化率が約７０％に達した。リゾムコール・ミエヘイ・リパーゼでは、メタノール添加により、グリセリドの最終分解率が約６０％、およびＦＦＡのメチルエステル化率が約９５％に達した。アルカリゲネス属リパーゼでは、メタノール添加により、グリセリドの最終分解率が９０％以上、およびＦＦＡのメチルエステル化率が９５％以上に達した。バークホルデリア・セパシア・リパーゼでは、メタノール添加により、グリセリドの最終分解率が９０％以上、およびＦＦＡのメチルエステル化率が９７％に達した。 （実施例３：メタノール量の影響） グリセリドを含む油脂として１２ｇのヤトロファ油を用いた。グリセリドを含む油脂および３０質量％の水を含む反応液に、反応液１ｇ当たり３０Ｕのキャンディダ・ルゴーサ・リパーゼ（リパーゼＯＦ）を添加して、グリセリドの加水分解を行った。反応開始から２０時間後に、グリセリドを含む油脂中の全脂肪酸量に対して０、１、１．５、または３モル当量のメタノールを添加してさらに２４時間反応を行った。結果を表４に示す。 メタノールを添加しなかった場合（すなわち、添加したメタノール量がグリセリドを含む油脂中の全脂肪酸量に対して０モル当量の場合）、反応開始から２０時間後に加水分解はほぼ平衡状態に達し、グリセリドの最終分解率は９５％であった。添加したメタノール量がグリセリドを含む油脂中の全脂肪酸量に対して１モル当量の場合、反応開始から４４時間後（反応終了後）の反応液の油層画分中のＡＧ含量は、検出限界以下まで低下した。しかし、添加したメタノール量がグリセリドを含む油脂中の全脂肪酸量に対して３モル当量の場合、反応終了後にも、未分解のグリセリドが残存していた。したがって、メタノールの添加により、ＦＦＡのメチルエステル化反応が誘導され、その結果、グリセリドの最終分解率は上昇し得るが、添加するメタノール量が多すぎると、酵素反応が阻害され、グリセリドの分解速度およびＦＦＡのメチルエステル化速度は遅くなることがわかった。 （実施例４：水分量の影響） グリセリドを含む油脂として１２ｇのヤトロファ油を用いた。グリセリドを含む油脂および１０〜７０質量％の水を含む反応液に、反応液１ｇ当たり３０Ｕのキャンディダ・ルゴーサ・リパーゼ（リパーゼＯＦ）を添加して、グリセリドの加水分解を行った。反応開始から２０時間後に、グリセリドを含む油脂中の全脂肪酸量に対して１．５モル当量のメタノールを添加してさらに反応を行った。結果を表５に示す。 反応開始から２０時間後のメタノールの添加直前のグリセリドの分解率は、反応液の水分量が１０質量％の場合は約８０％であり、水分量が３０質量％以上の場合は約９５％であった。メタノールの添加後は、水分量が１０質量％の場合と比較して、水分量が３０質量％以上の場合は、ＦＦＡのメチルエステル化速度が速くなり、グリセリドの分解率が上昇した（２７時間および４４時間）。これは、反応液への水の添加により、メタノールが希釈され、メタノールによる酵素反応の阻害が緩和されたためであると考えられる。水分量を３０質量％から７０質量％に上げることによるグリセリドの分解率の大きな変化は観察されなかった。 （実施例５：各種油脂およびアルコールの影響） グリセリドを含む油脂として１２．６ｇのヤトロファ油を用いた。グリセリドを含む油脂および３０質量％の水を含む反応液に、反応液１ｇ当たり３０Ｕのキャンディダ・ルゴーサ・リパーゼ（リパーゼＯＦ）を添加して、グリセリドの加水分解を行った。反応開始から２０時間後に、グリセリドを含む油脂中の全脂肪酸量に対して１モル当量のメタノールを添加してさらに２４時間反応を行った。また、グリセリドを含む油脂として１２．６ｇのサラダ油（日清オイリオグループ株式会社製）を用い、ヤトロファ油と同様にキャンディダ・ルゴーサ・リパーゼを用いてグリセリドの加水分解を行った。反応開始から２０時間後に、グリセリドを含む油脂中の全脂肪酸量に対して１モル当量のメタノールまたはドデカノールを添加してさらに２４時間反応を行った。結果を以下の表６に示す。いずれの場合も、アルコールの添加により、グリセリドの最終分解率は上昇した。 グリセリドを含む油脂として１３ｇのマグロ油（株式会社マルハニチロ水産製）を用いた。グリセリドを含む油脂および３０質量％の水を含む反応液に、反応液１ｇ当たり２００Ｕのキャンディダ・ルゴーサ・リパーゼ（リパーゼＯＦ）を添加して、グリセリドの加水分解を行った。結果を表６に示す。反応開始から２０時間および４４時間後のグリセリドの分解率はそれぞれ６３％および６５％であった。分解率が低いのは、リパーゼＯＦが、他の脂肪酸と比較して、高度不飽和脂肪酸を加水分解し難いためであると考えられる。反応開始から２０時間後に、グリセリドを含む油脂中の全脂肪酸量に対して０．５モル当量のエタノールを添加してさらに２４時間反応を行った。グリセリドの分解率は７０％まで上昇した。したがって、マグロ油の加水分解においても、アルコールの添加により、グリセリドの最終分解率は上昇し得ることがわかった。 （実施例６：バイオディーゼル燃料（ＢＤＦ）の製造） グリセリドを含む油脂として１２．６ｇのヤトロファ油を用いた。グリセリドを含む油脂および３０質量％の水を含む反応液に、反応液１ｇ当たり３０Ｕのキャンディダ・ルゴーサ・リパーゼ（リパーゼＯＦ）を添加して、グリセリドの加水分解を行った。反応開始から２０時間後に、グリセリドを含む油脂中の全脂肪酸量に対して１モル当量のメタノールを添加してさらに２４時間反応を行った。反応終了後、反応液から水層を除去し、さらに残存するメタノールおよび水を減圧下で除去し、反応生成物１を得た。さらに、反応生成物１に含まれるＦＦＡを、固定化キャンディダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼ（商品名：Ｎｏｖｏｚｙｍ４３５、ノボザイムズ社製）を触媒としたメチルエステル化反応により、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）へ変換した。すなわち、９ｇの反応生成物１と１ｇのメタノール（ＦＦＡに対して２モル当量）とを含む反応液に０．１ｇの固定化キャンディダ・アンタークティカ・リパーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍ４３５）を添加して３０℃で２４時間反応を行った。反応終了後、固定化酵素を回収して新たな反応液に添加して３０℃で２４時間（１日間）反応を行い、これを繰り返した（反応２）。結果を表７に示す。 グリセリドを含む油脂の加水分解で得られた油層にはＦＦＡが４６質量％、ＦＡＭＥが５４質量％含まれていた（表７、反応生成物１）。固定化リパーゼを繰り返し用いることにより、ＦＡＭＥの含量が９７質量％以上の油脂を５０日間連続生産できた。さらに、反応終了後の反応液１００ｇを４０ｍＬの０．５Ｍ ＮａＯＨ水溶液で洗浄した後、４０ｍＬの０．０５Ｍ ＨＣｌ水溶液、次いで４０ｍＬの０．０１Ｍ ＨＣｌ水溶液で洗浄することにより、ＦＡＭＥの含量が９９質量％以上の油脂を９５％の回収率で得た。得られた油脂は、ＦＡＭＥ含量が高いため、そのままＢＤＦとして用いられ得る。 （実施例７：リパーゼ併用の影響１） グリセリドを含む油脂として１２．６ｇのヤトロファ油を用いた。グリセリドを含む油脂および３０質量％の水を含む反応液に、反応液１ｇ当たり３０Ｕのキャンディダ・ルゴーサ・リパーゼ（リパーゼＯＦ）を添加して、グリセリドの加水分解を行った。反応開始から２０時間後に、グリセリドを含む油脂中の全脂肪酸量に対して１モル当量のメタノールを添加してさらに２４時間反応を行った。この結果、４６質量％のＦＦＡと５４質量％のＦＡＭＥとの混合物が得られた。一方、反応開始から２０時間後に、反応液１ｇ当たり２０Ｕのバークホルデリア・セパシア・リパーゼ（リパーゼＰＳ）、およびグリセリドを含む油脂中の全脂肪酸量に対して３モル当量のメタノールを添加してさらに２４時間反応を行ったこと以外は、同様に反応を行った。結果を表８に示す。この結果、２．５質量％のＦＦＡと９７．５質量％のＦＡＭＥとの混合物が得られ、この混合物はグリセリドを全く含んでいなかった。したがって、２種のリパーゼを併用することにより、ＦＡＭＥ生成量を向上させることができた。 （実施例８：リパーゼ併用の影響２） グリセリドを含む油脂として１０．５ｇのヤトロファ油を用いた。グリセリドを含む油脂および３０質量％の水を含む反応液に、反応液１ｇ当たり１０Ｕのキャンディダ・ルゴーサ・リパーゼ（リパーゼＯＦ）を添加して、グリセリドの加水分解を行った。反応開始から２０時間後に、グリセリドを含む油脂中の全脂肪酸量に対して３モル当量のメタノールと、反応液１ｇ当たり２０Ｕのバークホルデリア・セパシア・リパーゼ（リパーゼＰＳ）とを添加してさらに２４時間反応を行った。結果を表９に示す。この結果、リパーゼＰＳを併用することにより、実施例７のリパーゼを併用しない場合と同じリパーゼ活性量で、ＦＡＭＥ生成量を向上させることができた。 本発明によれば、酵素を用いてグリセリドを加水分解する方法、酵素を用いて遊離脂肪酸または脂肪酸エステルを製造する方法、および該方法を用いてバイオディーゼル燃料（ＢＤＦ）を製造する方法、ならびに酵素を用いて遊離脂肪酸または脂肪酸エステル、あるいはこれらの混合物を製造する方法において、１ポットでの反応系においても、グリセリドの加水分解率を、反応液にアルコールを添加しない場合と比較して上昇させることができる。本発明の方法は、例えば、魚油から高度不飽和脂肪酸含量の高い油脂の製造、グリセリドを含む廃油からグリセリド含量が１質量％以下の高品質のＢＤＦの製造などに好適である。 グリセリドを加水分解する方法であって、 グリセリドを含む油脂と、水と、グリセリドの加水分解反応を触媒し得る酵素とを混合して、該グリセリドの加水分解反応が３０％以上の分解率に達するまで反応させる第１反応工程、および 該第１反応工程で得られる反応液にアルコールを添加して、さらに該加水分解反応を続行させる第２反応工程、を含む、方法。 前記アルコールが、第１級または第２級アルコールである、請求項１に記載の方法。 前記第２反応工程において、前記アルコールが、前記グリセリドを含む油脂中の全脂肪酸量に対して０．１〜５モル当量の割合で添加される、請求項１または２に記載の方法。 前記油脂が、植物油脂、動物油脂、魚油または微生物油脂である、請求項１から３のいずれかの項に記載の方法。 前記酵素が、リパーゼである、請求項１から４のいずれかの項に記載の方法。 遊離脂肪酸または脂肪酸エステルを製造する方法であって、 グリセリドを含む油脂と、水と、グリセリドの加水分解反応を触媒し得る酵素とを混合して、該グリセリドの加水分解反応が３０％以上の分解率に達するまで反応させる第１反応工程、および 該第１反応工程で得られる反応液にアルコールを添加して、さらに該加水分解反応を続行させる第２反応工程、を含む、方法。 前記アルコールが、第１級または第２級アルコールである、請求項６に記載の方法。 前記第２反応工程において、前記アルコールが、前記グリセリドを含む油脂中の全脂肪酸量に対して０．１〜５モル当量の割合で添加される、請求項６または７に記載の方法。 前記油脂が、植物油脂、動物油脂、魚油または微生物油脂である、請求項６から８のいずれかの項に記載の方法。 前記酵素が、リパーゼである、請求項６から９のいずれかの項に記載の方法。 バイオディーゼル燃料を製造する方法であって、 グリセリドを含む油脂と、水と、グリセリドの加水分解反応を触媒し得る酵素とを混合して、該グリセリドの加水分解反応が３０％以上の分解率に達するまで反応させる第１反応工程、および 該第１反応工程で得られる反応液にアルコールを添加して、さらに該加水分解反応を続行させる第２反応工程であって、該第２反応工程が、該第２反応工程で得られる反応液中の該遊離脂肪酸または脂肪酸エステルを含む水溶性画分または非水溶性画分中のグリセリド含量が該画分の１質量％以下に達するまで継続される、工程、を含む、方法。 遊離脂肪酸または脂肪酸エステル、あるいはこれらの混合物を製造する方法であって、 グリセリドを含む油脂と、水と、グリセリドの加水分解反応を触媒し得る酵素とを混合して、該グリセリドの加水分解反応が３０％以上の分解率に達するまで反応させる第１反応工程、 該第１反応工程で得られる反応液にアルコールを添加して、さらに該加水分解反応を続行させる第２反応工程、および 該第２反応工程で得られる反応液中の水溶性画分または非水溶性画分から該グリセリド、該遊離脂肪酸または脂肪酸エステル、あるいはこれらの混合物を回収する工程、を含む、方法。 前記油脂が、魚油または微生物油脂であり、前記遊離脂肪酸または遊離脂肪酸エステルが、高度不飽和脂肪酸またはそのエステルである、請求項１２に記載の方法。 【課題】酵素を用いてグリセリドを簡便かつ効率的に加水分解する方法、および酵素を用いてグリセリドから遊離脂肪酸または脂肪酸エステルを簡便かつ効率的に製造する方法を提供すること。【解決手段】本発明の、グリセリドの加水分解方法、遊離脂肪酸または脂肪酸エステルの製造方法、およびバイオディーゼル燃料の製造方法、ならびに遊離脂肪酸または脂肪酸エステル、あるいはこれらの混合物の製造方法は、グリセリドを含む油脂と、水と、グリセリドの加水分解反応を触媒し得る酵素とを混合して、該グリセリドの加水分解反応が３０％以上の分解率に達するまで反応させる第１反応工程、および該第１反応工程で得られる反応液にアルコールを添加して、さらに該加水分解反応を続行させる第２反応工程を含む。本発明によれば、グリセリドの加水分解率は、好ましくは９９％以上である。【選択図】なし