生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公開特許公報(A)_一般生菌数測定用培地 |
| 出願番号： | 2008249789 |
| 年次： | 2010 |
| IPC分類： | C12Q 1/04 |
特許情報キャッシュ
石垣 明美 鴻巣 正幸 JP 2010075145 公開特許公報(A) 20100408 2008249789 20080929 一般生菌数測定用培地 三愛石油株式会社 390019518 五十嵐 和壽 100080115 石垣 明美 鴻巣 正幸 C12Q 1/04 20060101AFI20100312BHJP JPC12Q1/04 2 ＯＬ 11 4B063 4B063QA01 4B063QQ06 4B063QR48 4B063QR49 4B063QR69 本発明は、牛由来成分を含有しない一般生菌数測定用培地に関するものであり、この培地は、細菌の選択性を示さず、一般生菌数を測定することができる。 従来、食品、化粧品、一般工業材料等の分野における一般生菌数の測定においては、ブレインハートインフュージョン寒天培地、ハートインフュージョン寒天培地、ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト寒天培地（ＣＡＳＯ寒天培地）、標準寒天培地、及び普通寒天培地が広く用いられている。 生菌数の測定において、例えば、食品衛生法で規定されている食品衛生検査指針においては、その測定対象となる菌種により、細かく検査方法が明記されている。その菌種の分類は、一般生菌数、大腸菌群・大腸菌、サルモネラ属薗、黄色ブドウ球薗、腸炎ビブリオ・カンピロバクター及び真菌となっている。 一般生菌数測定においては、通常、混釈法が用いられており、試験検体を滅菌希釈水で順次１０倍に希釈し、これを１ｍｌ又は１ｇシャーレに加えた検体液に、滅菌溶解して４５℃に保持されている標準寒天培地を注ぎ、寒天が固化した後、３６℃に維持されている恒温槽中で培養し、生育したコロニー（集落）数を計測して、検体１ｍｌ又は１ｇ中の生菌数としている。 また、化粧品において、一般生菌数測定は、第十四改正日本薬局法・微生物限度試験法に規定されており、メンブランフィルター法、寒天平板法、寒天平板表面塗抹法及び液体培地段階希釈法の４つの方法が明記されている。寒天平板法は、食品衛生検査指針に記載されている方法と試験方法は基本的に同様である。メンブランフィルター法、寒天平板法、寒天平板表面塗抹法で規定されている培地は、ＣＡＳＯ寒天培地が使用されている。 これらを含めた一般生菌数測定用培地は、表１に示す組成となっており、いずれも牛由来成分を多量に含有している。そして、牛由来成分を含有する培養培地は高品質のタンパク質を含み、細菌の選択性が無く、細菌の発育が良好な培地である。 ところが、現在のウシ海綿状脳症の問題から、牛肉をはじめとして牛由来部位の輸入が制限され、あるいは輸出制限が各国でなされており、供給が安定しておらず、入手できない成分が存在し、望ましい状態の培養培地を得ることが難しい状態にある。また、このような状況から全世界で共通の成分からなる培地を共用できないのが、現状である。 このような状況に鑑み、本発明は、牛由来成分を含有せずに、細菌の選択性が無く、細菌の発育が良好である一般生菌数測定用培養培地を提供することを目的とする。 本発明者らは、牛由来成分を含有せずに、各種の成分を組み合わせて培地を調製し、種々の細菌群での発育効果を評価した結果、細菌の選択性が無く、発育良好な組成を見出し、本発明に至った。 すなわち、第１の発明は、牛由来成分を含有せずに、大豆ペプトン及び酵母エキスを必須成分とし、ブドウ糖、リジン及び魚肉エキスのうち少なくとも１種類含有してなることを特徴とする一般生菌数測定用培地である。 また、第２の発明は、第１の発明において、精製水１，０００ｍｌ中に以下の成分を含有するものであることを特徴とする一般生菌数測定用培地である。 大豆ペプトン １０ｇ 酵母エキス １ｇ ブドウ糖 １〜１０ｇ リジン １〜３ｇ 魚肉エキス ３〜１０ｇ 寒天 １５〜１８ｇ 本発明の牛由来成分を含有しない一般生菌数測定用培地は、従来使用されている牛由来成分を含有するブレインハートインフュージョン寒天培地、ハートインフュージョン寒天培地、ＣＡＳＯ寒天培地、標準寒天培地、及び普通寒天培地における各菌種の発育特性及び検出感度に比べて遜色ない培地であり、その成分も輸出入の問題もなく、安定して供給されているもので、どこでも入手可能となり、望ましい状態の培地を得ることができて非常に有用である。また、全世界で共用することができる。 本発明における一般生菌数測定用培地は、従来使用していた牛由来成分を含有せずに、大豆ペプトン及び酵母エキスを必須成分とし、ブドウ糖、リジン及び魚肉エキスのうち少なくとも１種類含有してなる。そして、その成分としては下記成分組成からなる培地が好ましいもとして挙げられる。 大豆ペプトン １０ｇ 酵母エキス １ｇ ブドウ糖 １〜１０ｇ リジン １〜３ｇ 魚肉エキス ３〜１０ｇ 寒天 １５〜１８ｇ 精製水 １，０００ｍｌ 本発明における一般生菌数測定用培地は、前記成分からなる溶液を調製し、ｐＨを７．０〜７．２となるように調整し、溶液を滅菌し、容器に分注し、室温で固化させて、調製される。前記溶液のｐＨが７．０〜７．２であれば調整しなくてもよいが、そうでない場合は水酸化ナトリウム水溶液もしくは塩酸水溶液を用いて調整する。例えば、１Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液を０．１〜１ｍｌ、もしくは１Ｎ−塩酸水溶液を０．１〜１ｍｌ添加して調整することが好ましい。また、滅菌は、例えば、オートクレーブ等で、日本薬局法で決められている１２１℃、１．３ｋｐａで１５〜２０分間滅菌する。さらにシャーレ等の容器に分注し、室温で固化させて培地を調製する。 培地への試験検体である菌の接種は、菌を、固化する前の培地に、加えて固化させるか、培地が固化した後、滅菌コンラージ棒などで均一に伸ばして接種する。菌の接種は、例えば１０3［ｃｆｕ／ｍｌ］及び１０5［ｃｆｕ／ｍｌ］に調整した菌含有液を、培地に１ｍｌ接種するのが好ましい。 その後、２５〜３５℃に調整した恒温槽で２４〜１２０時間培養し、菌の発育状態を観察し、生育したコロニー（集落）数を計測して、接種した検体１ｍｌ又は１ｇ中の生菌数に対する数値を求めて、評価する。本発明ではコロニー数の計測は目視で行い、その評価は、本発明の一般生菌数測定用培地での一般細菌の生育状態と、従来の牛由来成分を含有する培地での一般生菌の生育状態とを比較して評価した。 そして、本発明の一般生菌数測定用培地での一般細菌の生育状態は、従来の牛由来成分を含有する培地での一般生菌の生育状態と比較して遜色のないものであり、また、一般に発育が良くないヨーグルト菌を本発明の培地で培養した生育状態も良好である。 大豆ペプトン、酵母エキス及び寒天を、大豆ペプトン：１０ｇ、酵母エキス：１ｇ、寒天：１８ｇを蒸留水１，０００ｍｌに添加し、この液に、ブドウ糖、リジン及び魚肉エキスの各成分０ｇ、１ｇ、３ｇをそれぞれ添加し、表２に示す成分組成からなる各種培地用の溶液を調製した。溶液のｐＨは、７．０〜7．２となるように、１Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液を０．１ｍｌ添加して調整した。調製した培地を、オートクレーブを用いて、１２１℃、１．３ｋｐａで２０分間かけて滅菌し、シャーレに２０ｍｌずつ分注し、室温（２５℃）で固化させた。これに試験菌培養液を滅菌生理食塩水で希釈して、１０3［ｃｆｕ／ｍｌ］又は１０5［ｃｆｕ／ｍｌ］にそれぞれなるように調整したものを、先に調製した培地に１ｍｌ加え、滅菌コンラージ棒で均一に伸ばして接種した。その後、３０±２℃に調整した恒温槽で２日間培養し、菌の発育状態を観察した。試験結果を表２に示す。 試験菌としては、Escherichia Coli（NBRC3972）、pseudomonas aeruginosa（NBRC12689）、グラム陽性薗としてStaphylococcus aureus（NBRC12732）、Bacillus subtilis（NBRC13719）、市販ヨーグルトダノンBio（ダノン製）、ソフィール（ヤクルト製）から単離した細菌を用いた。これら試験菌は、滅菌した普通ブイヨン培養液（栄研化学製）にて前培養したものである。 培地成分としては次のものを用いた。 大豆ペプトン：ポリペプトンＳ、日本製薬（株）製 酵母エキス：オリエンタル酵母工業（株）製 ブドウ糖：関粛化学（株）製試薬特級 リジン：和光純薬工業（株）製 魚肉エキス：エルリッヒカツオエキス（極東製薬エ簑（株）製） 寒天：和光純薬工轟（株）製試薬特級 表２及び以下に示す表３及び表４において、Soy-pepton は大豆ペプトンを示し、YeastExtractは酵母エキスを示し、Agarは寒天を示す。また、E.ColiはEscherichia Coliを示し、P.aeruginosaはpseudomonas aeruginosaを示し、S.aureusはStaphylococcus aureusを示し、B.subtilisはBacillus subtilisを示す。 表２から、ブドウ糖、リジン、魚肉エキスの含有量がそれぞれ高い組成の培地において、発育が良いことが確認され、大豆ペプトン、酵母エキスの他に少なくともブドウ糖、リジン、魚肉エキスが１種以上添加された組成の培地では、発育性能が高いことが明らかとなった。 表３に示すように培地成分の添加量をブドウ糖：２、３、４、５、１０ｇ、リジン：１、２、３ｇ、魚肉エキス：３、４、５、１０ｇとする以外は実施例１と同様にして培地を調製し、調製した培地に、試験菌を接種し、菌の発育状態を観察した。その結果を表３に示す。 表３から、ブドウ糖、魚肉エキスが多い組成の培地は、菌の発育が良好なことが確認でき、発育性能が高いことが明らかとなった。（比較例） 前述した一般的に使用される培地を用いて、試験菌の発育特性の確認を行った。 実施例１及び実施例２と同じ試験菌を用いて、同様な操作で実施した。 培地として、ブレインハートインフュージョン寒天培地、ハートインフュージョン寒天培地、ＣＡＳＯ寒天培地、標準寒天培地、及び普通寒天培地の５種類を用いた。これらのその成分組成は表１に示されている。 結果を表４に示す。ここで用いた使用培地について次に示す。すなわち ブレインハートインフュージョン寒天培地は極東製薬工業（株）製 ハートインフュージョン寒天培地は極東製薬工業（株）製、 ＣＡＳＯ寒天培地はトリプトソーヤ寒天培地（極東製薬工業（株）製） 標準寒天培地は栄研化学（株）製 普通寒天培地は栄研化学（株）製をそれぞれ用いた。 表４から、一般に使用される一般生菌数測定用培地は、菌の発育性が高いことが確認された。 また、表２〜４から、本発明の一般生菌数測定用培地は、従来使用されている牛由来成分を含有する培地と比べて各菌種の発育特性に遜色ない発育特性及び検出感度を示すものであった。 牛由来成分を含有せずに、大豆ペプトン及び酵母エキスを必須成分とし、ブドウ糖、リジン及び魚肉エキスのうち少なくとも１種類含有してなることを特徴とする一般生菌数測定用培地。 精製水１，０００ｍｌ中に以下の成分を含有するものであることを特徴とする請求項１記載の一般生菌数測定用培地。 大豆ペプトン １０ｇ 酵母エキス １ｇ ブドウ糖 １〜１０ｇ リジン １〜３ｇ 魚肉エキス ３〜１０ｇ 寒天 １５〜１８ｇ 【課題】ウシ海綿状脳症の問題から安定供給の難しい、牛由来成分を含有せずに、細菌の選択性が無く、細菌の発育が良好である一般生菌数測定用培養培地を提供する。【解決手段】牛由来成分を含有せずに、大豆ペプトン及び酵母エキスを必須成分とし、ブドウ糖、リジン及び魚肉エキスのうち少なくとも１種類含有してなる一般生菌数測定用培地。【選択図】なし