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永瀬 光俊 杉中 克昭 會見 忠則 JP 5388049 特許公報(B2) 20131018 2008151908 20080610 トビウオ類の特異的検出法 島根県 591282205 特許業務法人三枝国際特許事務所 110000796 永瀬 光俊 杉中 克昭 會見 忠則 20140115 C12Q 1/68 20060101AFI20131219BHJP C12N 15/09 20060101ALI20131219BHJP JPC12Q1/68 AC12N15/00 A Ｃ１２Ｎ １５／０９ ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ） ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＣＡｐｌｕｓ（ＳＴＮ） ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ） 特許第３９５０５４６（ＪＰ，Ｂ２） 特開２００６−２８０２８１（ＪＰ，Ａ） J.Agric.Food.Chem.，１９９６年，Vol.44，p.2460-2467 日本食品科学工学会誌，２００４年，第51巻，第9号，p.471-476 Nippon Suisan Gakkaishi，２００１年，Vol.67，p.17-22 Fisheries Science，２００５年，Vol.71，p.914-923 GenBank [online]，２００５年 ６月１６日，Accession No.AB188717，ＵＲＬ，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB188717 5 2009296901 20091224 13 20110602 飯室 里美 この発明は、トビウオ類のミトコンドリア１６ＳリボソームＲＮＡをコードする遺伝子を含むＤＮＡを特異的かつ迅速に検出および同定するためのプライマーセット、トビウオ類の検出方法、並びにトビウオ類の検出用キットに関する。 食品は、その品質について、原材料名、原料原産地、賞味期限などの表示により、消費者に情報提供を行っている。表示内容は価格に反映されるが、表示内容の真偽については、基本的に生産者もしくは製造者と消費者との信頼関係に基づいていた。しかしながら、１９９０年代半ば頃より、食品表示に関する詐欺事件が増加したことから、表示内容について様々な角度から検証する手法の確立が望まれている。 従来において魚類もしくは加工食品等に含まれる魚類の鑑別は、原形がある場合は形態学的手法、原形が無い場合はたんぱく質およびアイソザイムの電気泳動法が用いられていたが、サンプルの形態が非常に似ていたり、加熱等によりたんぱく質の変性が著しいと鑑定が困難になる場合も多い。一方、近年の遺伝子工学の発達によって、感度の高いＤＮＡ解析技術が注目されており、様々なサンプルの鑑定に利用され始めている。ＤＮＡ解析技術によれば、形態の有無に関係なく、また、サンプルの状態が悪くても鑑定でき、今までマグロ（非特許文献１）、スズキ（非特許文献２）、ウナギ（特許文献１）、サバ（非特許文献３）などに応用例が見られる。しかしながら、今まで、トビウオ類に関してＤＮＡ解析による鑑定が試みられた文献等は見当たらない。また、トビウオの複数種をまとめて、類として検出できる技術もなかった。Ｊ．Ｌ．Ｒａｍ，Ｍ．Ｌ．Ｒａｍ，Ｆ．Ｆ．Ｂａｉｄｏｕｎ．Ｊ．Aｇｒｉｃ．Fｏｏｄ．Ｃｈｅｍ，４４，１９９６，２４６０−２４６７槙智之他、食工誌、５１、２００４、４７１−４７６特許第３９５０５４６号Ｋ．Ｓｅｚａｋｉ，Ｙ．Ｋｕｂｏｓｈｉｍａ，Ｉ．Ｍｉｔａｎｉ，Ａ．Ｆｕｋｕｉ，Ｓ．Ｗａｔａｂｅ．Ｎｉｐｐｏｎ Ｓｕｉｓａｎ Ｇａｋｋａｉｓｈｉ，６７，２００１，１７−２２Ｎａｇａｓｅ Ｍ，Ａｉｍｉ Ｔ，Ｓｕｇｉｎａｋａ Ｋ，Ｋｉｔａｍｏｔｏ Ｙ，Ｍｏｒｉｎａｇａ Ｔ．Ｆｉｓｈｅｒｉｅｒｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ、７１、２００５、９１４−９２３ 本発明は、トビウオ類のミトコンドリア１６ＳリボソームＲＮＡをコードする遺伝子を含むＤＮＡを特異的かつ迅速に検出および同定するためのプライマーセット、トビウオ類の検出方法、並びにトビウオ類の検出用キットを提供することを課題とする。 本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、トビウオ類のミトコンドリア１６ＳリボソームＲＮＡをコードする遺伝子を含むＤＮＡを単離し、さらに被検体に含まれるトビウオ類を迅速、高感度に検出し得るプライマーを作製することに成功し、本発明を完成するに至った。 本発明は、トビウオ類のミトコンドリア１６ＳリボソームＲＮＡをコードする遺伝子の塩基配列である配列番号１〜６で表されるいずれかの塩基配列の少なくとも一部とハイブリダイズすることができる５´側プライマーと、配列番号１〜６で表されるいずれかの塩基配列の少なくとも一部とハイブリダイズすることができる３´側プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットＡ、Ｂ、Ｃである。プライマーセットＡは、５´側プライマーとして配列番号７で表されるものが挙げられ、３´側プライマーとして配列番号８で表されるものが挙げられる。プライマーセットＢは、５´側プライマーとして配列番号９で表されるものが挙げられ、３´側プライマーとして配列番号１０で表されるものが挙げられる。プライマーセットＣは、５´側プライマーとして配列番号１１で表されるものが挙げられ、３´側プライマーとして配列番号１２で表されるものが挙げられる。 さらに、本発明は、トビウオ類を含むと思われる被検体について、上記のいずれかのプライマーセットを用いて、トビウオ類のミトコンドリア１６ＳリボソームＲＮＡをコードする遺伝子を含むＤＮＡを増幅することを特徴とする、トビウオ類の検出方法である。さらに、本発明は、上記のいずれかのプライマーセットを含む、トビウオ類の検出用キットである。 本発明により、トビウオ類の特異的かつ迅速な検出および同定するためのプライマー、及びトビウオ類を含むと思われる被検体についてトビウオ類を検出する方法が提供される。 以下、本発明を詳細に説明する。 本発明の遺伝子は、トビウオ類のミトコンドリア１６ＳリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡを含むものであり、以下のようにして得ることができる。１．ミトコンドリア１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子及びその隣接領域の単離（１）ゲノムＤＮＡの調製 ゲノムＤＮＡの供給源としては、ホソトビウオ（Ｃｙｐｓｅｌｕｒｕｓ ｈｉｒａｉｉ）、ツクシトビウオ（Ｃｙｐｓｅｌｕｒｕｓ ｈｅｔｅｒｕｒｕｓ）、トビウオ（Ｃｙｐｓｅｌｕｒｕｓ ａｇｏｏ）、ハマトビウオ（Ｃｙｐｓｅｌｕｒｕｓ ｐｉｎｎａｔｉｂａｒｂａｔｕｓ）、アヤトビウオ（Ｃｙｐｓｅｌｕｒｕｓ ｐｏｅｃｉｌｏｐｔｅｒｕｓ）、カラストビウオ（Ｃｙｐｓｅｌｕｒｕｓ ｃｙａｎｏｐｔｅｒｕｓ）、オオメナツトビ（Ｃｙｐｓｅｌｕｒｕｓ ａｎｔｏｎｃｉｃｈｉ）、その他のトビウオ類が挙げられる。 例えば、上記魚体筋肉を、界面活性剤を用いる方法や、熱処理を行う方法などの通常公知の方法でゲノムＤＮＡを抽出・精製することができる。また、市販のＤＮＡの抽出・精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社のＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ等）を用いることも可能である。ゲノムＤＮＡの採取対象は、特に限定されるものではなく、どのような生育段階のものや干物等の低次加工品、かまぼこ等の他原料と混合し調理した高次加工品からも抽出・調製することができる。（２）ユニバーサルプライマーの合成 一般にトビウオ類を含む真核生物のミトコンドリアＤＮＡは、図１のような構造であることが知られている。発明者は、ホソトビウオ（Ｃｙｐｓｅｌｕｒｕｓ ｈｉｒａｉｉ，ＡＢ１８２６５３）についてミトコンドリアＤＮＡの全塩基配列を明らかにした（非特許文献４）。これを、同様に明らかにされているスケトウダラ（Ｔｈｅｒａｇｒａ ｃｈａｌｃｏｇｒａｍｍａ，ＡＢ１８２３００）、マアジ（Ｔｒａｃｈｕｒｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ，ＡＰ００３０９１）、イダテントビウオ（Ｅｘｏｃｏｅｔｕｓ ｖｏｌｉｔａｎｓ，ＡＰ００２９３３）の塩基配列と比較することにより、ミトコンドリア１６ＳリボソームＲＮＡをコードする領域の一部をユニバーサルに増幅することができ、特定の制限酵素反応部位を持つプライマーセットＢ、すなわち配列番号９及び配列番号１０を発明した。これを用いて、上記（１）で得られたゲノムＤＮＡを鋳型として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲともいう)を行う。（３）塩基配列の決定 得られたＰＣＲ断片を、適切なベクターにサブクローニング後、塩基配列の決定を行う。又は、ＰＣＲ断片を用いてダイレクトシークエンシングを行う。塩基配列の決定は、自動塩基配列決定機（例えばＡＢＩ社製３１００ＤＮＡシークエンサー等）を用いて行う。一旦本発明の遺伝子の塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又は本遺伝子のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、トビウオ類のミトコンドリア１６ＳリボソームＲＮＡする遺伝子を含むＤＮＡを得ることができる。（４）トビウオ類検出用プライマーの合成 配列番号１から配列番号６にトビウオ類のミトコンドリア１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を例示する。そしてこれらの塩基配列及び既に明らかにしたホソトビウオを比較し、トビウオ類に特徴的な配列を見出し、その配列を有する合成オリゴヌクレオチドをトビウオ類検出用プライマーとして用いることができる。また、これらの塩基配列とスケトウダラ（Ｔｈｅｒａｇｒａ ｃｈａｌｃｏｇｒａｍｍａ，ＡＢ１８２３００）、マアジ（Ｔｒａｃｈｕｒｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ，ＡＰ００３０９１）、イダテントビウオ（Ｅｘｏｃｏｅｔｕｓ ｖｏｌｉｔａｎｓ，ＡＰ００２９３３）などを比較し、魚類全般に特徴的な配列を見出し、その配列を有する合成オリゴヌクレオチドを検出反応確認用プライマーとして用いることができる。 例えば、トビウオ類検出に用いることができる５´側プライマー及び３´側プライマーとしては、配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列の領域から選択することができる。但し、ＧＣ含量の多い領域を含まず、プライマー同士でハイブリダイズしないような領域が好ましい。 例えば、５´側プライマーとしては、配列番号１又は配列番号２において、種間で違いが見られず、他魚種との違いが見られる第１７１〜１９７番目及び第１９８〜２３５番目などの、少なくとも１０〜５０塩基、より好ましくは１５〜２５塩基からなる領域が好ましい。また、３´プライマーとしては、同様に種間で違いが見られず、他魚種との違いが見られる第２７８〜３１９番目及び第３０８〜３５８番目などの、少なくとも１０〜５０塩基、より好ましくは１５〜２５塩基からなる領域が好ましい。またこれらのプライマーは、あらゆる任意の組み合わせで用いることができる。 例えば、ポジティブコントロールとして検出反応確認に用いることができる５´側プライマー及び３´側プライマーとしては、配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列の領域から選択することができる。但し、ＧＣ含量の多い領域を含まず、プライマー同士でハイブリダイズしないような領域が好ましい。 例えば、５´側プライマーとしては、配列番号１又は配列番号２において、他魚種との違いが全く見られない第９番目〜２５番目、第１３７番目〜１５６番目及び第３７４〜４０２番目などの、少なくとも１０〜５０塩基、より好ましくは１５〜２５塩基からなる領域が好ましい。また、３´プライマーとしては、同様に他魚種との違いが全く見られない第４２７〜４８０番目の、少なくとも１０〜５０塩基、より好ましくは１５〜２５塩基からなる領域が好ましい。またこれらのプライマーは、あらゆる任意の組み合わせで用いることができる。 本発明のトビウオ類検出用プライマーの塩基配列を、配列番号７及び配列番号８（プライマーセットＡ）、及び配列番号９及び配列番号１０（プライマーセットＢ）に例示する。また本発明の検出反応確認用プライマーの塩基配列を、配列番号１１及び配列番号１２（プライマーセットＣ）に例示する。但し、配列番号１〜６で表されるいずれかの塩基配列からなるＤＮＡを含む遺伝子の少なくとも一部とハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドも本発明のプライマーに含まれる。また、本発明において用いられるプライマーは、これらに限定されるものではない。２．本発明のプライマーを用いたトビウオ類の検出（１）被検体サンプル溶液の調製 トビウオ類を含むと思われる被検体サンプル溶液の調製は、魚肉、血液、内臓、鱗、鰭、刺身、干物、燻製、煮干、だし、魚卵、だし入り醤油、かまぼこなどから、界面活性剤を用いる方法や、熱処理を行う方法などの通常公知の方法でゲノムＤＮＡを抽出・精製して被検体サンプル溶液とする。（２）ＰＣＲによるトビウオ類の検出 トビウオ類の検出は、上記１．に記載のトビウオ類に特異的な配列を有するトビウオ類検出用プライマーを用いてミトコンドリア１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を増幅させ、増幅断片をアガロースゲル電気泳動法やポリアクリミドゲル電気泳動法などにより分画後、ゲルをエチジウムブロマイドなどを用いて染色し、ＵＶランプ下で増幅断片の有無を確認することにより行うことができる。 増幅は、標準的なプロトコルに従ったＰＣＲによって行うことができ、少量のサンプルから目的のＤＮＡ断片を特異的に増幅させることができる。すなわち、ＤＮＡサンプルを変性して一本鎖にする。次いで、目的のＤＮＡ配列の一方の鎖の５´側に相補的な５´側プライマー、及び他方の鎖の３´側に相補的な３´側プライマー、鋳型として用いるＤＮＡ配列、４種のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，およびｄＴＴＰもしくはｄＵＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼを含有する反応系を用い、鋳型ＤＮＡと上記２種のプライマーをアニーリングさせる。次いでＤＮＡポリメラーゼと４種のデオキシヌクレオシド三リン酸とから各鋳型上に相補鎖を合成させる。そして生成した二本鎖を熱変性によって一本鎖にした後、それぞれの鎖を鋳型として上記と同じアニーリング、相補鎖の合成の手順を繰り返すことにより、プライマーに挟まれた部分のみを指数関数的に増やすことができる。なお、ＰＣＲ法等に用いるＤＮＡポリメラーゼとしてはＤＮＡの開裂温度において耐熱性であるポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑポリメラーゼなどを用いることが好ましい。 本発明において、増幅されるＤＮＡ断片は、トビウオ類が保有するミトコンドリア１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片である。ＰＣＲ法等においてはプライマーに挟まれる部分のＤＮＡ配列が増幅されるため、そのＤＮＡ断片の大きさは、用いるプライマーの種類に依存する。本発明の１例では、上記プライマーセットＡおよびＣを用いるとそれぞれ約１００ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される。次に、増幅されたＤＮＡ断片は、アガロースゲルやアクリルアミドゲルを用いて電気泳動に供し、その後エチジウムブロマイドなどを用いて染色し、ＵＶランプ下で増幅断片の有無を確認することができる。 また、本発明の方法を使用することにより、フィレーや刺身など原型が無く、形態学的に判別不能なトビウオ類や、干物、燻製などの加工されたトビウオ類、さらに、かまぼこなどトビウオ類の他に他魚種や複数の食品添加物が含まれた高次加工品も正確に同定することができる。さらに、本発明のプライマーは、全部あるいは組み合わせにより、トビウオ類を含むと思われる被検体中のトビウオ類を検出するためのキットとして使用することができる。 以下に、本発明の実施例を示して具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。トビウオ類ミトコンドリアＤＮＡの鑑定 各種魚類からのＤＮＡの調製ホソトビウオ、ツクシトビウオ、トビウオ、ハマトビウオ、アヤトビウオ、カラストビウオ、オオメナツトビ、スケトウダラ、ミナミダラ、マアジ、クラカケトラギスのそれぞれ１個体の筋肉組織から、Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｐｒｅｐ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて全ＤＮＡの抽出を行った。全ＤＮＡは、分光光度計で２６０ｎｍの吸光度を測定することにより、ＤＮＡ濃度を決定した。 調製した全ＤＮＡ１０ｎｇを鋳型とし、サーマルサイクラーパーソナル（タカラバイオ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、配列番号７及び配列番号８（プライマーセットＡ）と配列番号１１及び配列番号１２（プライマーセットＣ）をそれぞれ使用し、反応液の総量は１００μＬとし、９４℃２分の前加熱後、９４℃３０秒の変性工程、５５℃３０秒のアニーリング工程、及び７２℃３０秒の伸長工程を３０サイクルの条件で行われた。ＰＣＲ終了後、ＰＣＲ産物を１０μＬとり、３％アガロースゲル電気泳動にかけた。 結果を図２および３に示す。トビウオ類検出用プライマーであるプライマーセットＡにより、７種類のトビウオは全て約１００ｂｐのＰＣＲ産物が確認されたが、その他４魚種のスケトウダラ、ミナミダラ、マアジ、クラカケトラギスは確認されなかった。一方、検出反応確認用プライマーであるプライマーセットＣにより、１１種類のサンプル全てについて約１００ｂｐのＰＣＲ産物が確認された。このことから、トビウオ類とその他の魚を識別することが可能であることが明らかとなった。ＲＦＬＰ解析によるトビウオ類ミトコンドリアＤＮＡの鑑定 トビウオ類の鑑定について、ＲＦＬＰに応用可能かどうかを検討するため、各種トビウオの塩基配列情報（配列番号１〜６）と既に公知の塩基配列情報であるホソトビウオ（Ｃｙｐｓｅｌｕｒｕｓ ｈｉｒａｉｉ，ＡＢ１８２６５３）、スケトウダラ（Ｔｈｅｒａｇｒａ ｃｈａｌｃｏｇｒａｍｍａ，ＡＢ１８２３００）、マアジ（Ｔｒａｃｈｕｒｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ，ＡＰ００３０９１）を用いてＲＦＬＰの検討を行った。 ９種類のそれぞれの塩基配列において、制限酵素認識部位を市販の解析ソフトウェアであるＧＥＮＥＴＹＸ（ゼネティックス社）を用いて探索したところ、トビウオ類のみに共通するＡｆａＩ認識部位およびＭｆｅＩ認識部位が確認された。 各種魚類からのＤＮＡの調製ホソトビウオ、ツクシトビウオ、トビウオ、ハマトビウオ、アヤトビウオ、カラストビウオ、オオメナツトビ、スケトウダラ、ミナミダラ、マアジ、クラカケトラギスのそれぞれ1個体の筋肉組織から、Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｐｒｅｐ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて全ＤＮＡの抽出を行った。全ＤＮＡは、分光光度計で２６０ｎｍの吸光度を測定することにより、ＤＮＡ濃度を決定した。 調製した全ＤＮＡ１０ｎｇを鋳型とし、サーマルサイクラーパーソナル（タカラバイオ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、配列番号９及び配列番号１０（プライマーセットＢ）を使用し、反応液の総量は１００μＬとし、９４℃２分の前加熱後、９４℃３０秒の変性工程、６０℃３０秒のアニーリング工程、及び７２℃３０秒の伸長工程を３０サイクルの条件で行われた。ＰＣＲ終了後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ(キアゲン社)を用いてＰＣＲ産物を精製し、分光光度計で２６０ｎｍの吸光度を測定することにより、ＤＮＡ濃度を決定した。 ＰＣＲ産物５０ｎｇに対して、制限酵素ＡｆａＩおよびＭｆｅＩをそれぞれ用いて３７℃、１時間インキュベートすることにより消化を行った。次いで、各消化物を４％アガロースゲル電気泳動にかけた。 結果を図４および５に示す。２種類の制限酵素とも、７種類のトビウオは全て約３００ｂｐ及び約２００ｂｐのバンドが確認され、ＰＣＲ産物は消化されていた。それに対し、その他４魚種のスケトウダラ、ミナミダラ、マアジ、クラカケトラギスは５００ｂｐのバンドが確認され、ＰＣＲ産物は消化されていなかった。このことから、トビウオ類とその他の魚を識別することが可能であることが明らかとなった。トビウオ類を使用した加工食品の鑑定 島根県内で市販され、トビウオ使用の表示がある、かまぼこの一種であるあご野焼１７種類から、Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｐｒｅｐ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて全ＤＮＡの抽出を行った。全ＤＮＡは、分光光度計で２６０ｎｍの吸光度を測定することにより、ＤＮＡ濃度を決定した。 調製した全ＤＮＡ１０ｎｇを鋳型とし、サーマルサイクラーパーソナル（タカラバイオ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、配列番号７及び配列番号８（プライマーセットＡ）と配列番号１１及び配列番号１２（プライマーセットＣ）を使用し、反応液の総量は１００μＬとし、９４℃２分の前加熱後、９４℃３０秒の変性工程、５５℃３０秒のアニーリング工程、及び７２℃３０秒の伸長工程を３０サイクルの条件で行われた。ＰＣＲ終了後、ＰＣＲ産物を１０μＬとり、３％アガロースゲル電気泳動にかけた。 結果を図６および７に示す。トビウオ類検出用プライマーであるプライマーセットＡ及び反応確認用プライマーであるプライマーセットＣにより、１７種類のサンプル全てについて約１００ｂｐのＰＣＲ産物が確認された。焼きかまぼこであるあご野焼は、水晒し、塩ずり、本ずり、成型、加熱、冷却など様々な製造工程を経るため、ＤＮＡが分解、消失するリスクが大きい。本発明は、かまぼこのような高次加工品に対しても、感度よくトビウオ類を検出できることが明らかとなった。 スケトウダラ冷凍すり身（日水製２級）とトビウオすり身（島根県産）を別々に塩ずりし、あらかじめ決めた割合で合わせ、あご野焼を作成した。そこから、Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｐｒｅｐ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて全ＤＮＡの抽出を行った。全ＤＮＡは、分光光度計で２６０ｎｍの吸光度を測定することにより、ＤＮＡ濃度を決定した。 調製した全ＤＮＡ２０ｎｇを鋳型とし、リアルタイムＰＣＲ装置（ＰＲＩＳＭ７０００、アプライドバイオサイエンス社）を用いてＰＣＲを行った。ＤＮＡ結合色素は、ＳＹＢＲグリーンを用いた。ＰＣＲは、配列番号７及び配列番号８（プライマーセットＡ）と配列番号１１及び配列番号１２（プライマーセットＣ）を使用し、反応液の総量は５０μＬとし、９４℃１０秒の前加熱後、９５℃５秒の変性工程、５７℃１０秒のアニーリング工程、及び７２℃３１秒の伸長工程を３０サイクルの条件で行われた。ＰＣＲ終了後、専用ソフトで定量を試みた。 結果を図８に示す。トビウオすり身含量を０％、３０％、７０％、１００％としたときのプライマーセットＡによるＰＣＲ産物の増加曲線を表しており、図９の検量線を引くことができた。また、プライマーセットＣによるＰＣＲ産物の増加曲線は、どのサンプルとも大差なく、反応が正常に行われていることを確認した。本発明は、かまぼこに含まれるトビウオ類の定量に応用できることを明らかにした。真核生物がもつ一般的なミトコンドリアＤＮＡの模式図である。上記１１種類の魚種の全ＤＮＡから、プライマーセットＡで増幅したＰＣＲ産物を示した写真である。上記１１種類の魚種の全ＤＮＡから、プライマーセットＣで増幅したＰＣＲ産物を示した写真である。ホソトビウオ、ツクシトビウオ、トビウオ、ハマトビウオ、アヤトビウオ、カラストビウオ、オオメナツトビ、スケトウダラ、ミナミダラ、マアジ及びクラカケトラギスの全ＤＮＡから、プライマーセットＢで増幅したＰＣＲ産物をＡｆａＩで消化した場合のＲＦＬＰの結果を示した写真である。上記１１種類の魚種の全ＤＮＡから、プライマーセットＢで増幅したＰＣＲ産物をＭｆｅＩで消化した場合のＲＦＬＰの結果を示した写真である。商品の原材料表示欄にトビウオの表示があるあご野焼の全ＤＮＡから、プライマーセットＡで増幅したＰＣＲ産物を示した写真である。商品の原材料表示欄にトビウオの表示があるあご野焼の全ＤＮＡから、プライマーセットＣで増幅したＰＣＲ産物を示した写真である。異なるトビウオ含量のあご野焼の全ＤＮＡから、プライマーセットＡで増幅したＰＣＲ産物の増幅曲線を示した図面である。図８より、トビウオ含量とサイクル数の関係から求めた検量線を示した図面である。 配列番号７で表わされる５´側プライマーと配列番号８で表わされる３´側プライマーとのプライマーセットＡ、または配列番号９で表わされる５´側プライマーと配列番号１０で表わされる３´側プライマーとのプライマーセットＢである、トビウオ類検出用プライマーセット。 トビウオ類を含むと思われる被検体を対象として、請求項１に示すプライマーセットＡまたはＢを用いて、トビウオ類のミトコンドリア１６ＳリボソームＲＮＡをコードする遺伝子を含むＤＮＡを増幅することを特徴とする、上記被検体におけるトビウオ類の検出方法。 トビウオ類を含むと思われる被検体を対象として、更に配列番号１１で表わされる５´側プライマーと配列番号１２で表わされる３´側プライマーを含むプライマーセットＣを用いて、トビウオ類のミトコンドリア１６ＳリボソームＲＮＡをコードする遺伝子を含むＤＮＡを増幅することを特徴とする、請求項２に記載するトビウオ類の検出方法。 トビウオ類を含むと思われる被検体がトビウオ使用の表示のある加工食品である請求項２または３に記載するトビウオ類の検出方法。配列番号７で表わされる５´側プライマーと配列番号８で表わされる３´側プライマーを含むプライマーセットＡ、及び配列番号１１で表わされる５´側プライマーと配列番号１２で表わされる３´側プライマーを含むプライマーセットＣを含むか、または配列番号９で表わされる５´側プライマーと配列番号１０で表わされる３´側プライマーを含むプライマーセットＢ、及び制限酵素ＡｆａＩまたはＭｆｅＩを含むトビウオ類の検出キット。配列表

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