生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公表特許公報(A)_ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ活性アッセイ |
| 出願番号： | 2007515346 |
| 年次： | 2008 |
| IPC分類： | C12Q 1/26 |
特許情報キャッシュ
ブレンナー，ミッチェル，シー． JP 2008500834 公表特許公報(A) 20080117 2007515346 20050526 ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ活性アッセイ ファイブローゲン、インコーポレーテッド 501093088 平木 祐輔 100091096 石井 貞次 100096183 藤田 節 100118773 ブレンナー，ミッチェル，シー． US 60/575,324 20040528 C12Q 1/26 20060101AFI20071214BHJP JPC12Q1/26 AP(BW,GH,GM,KE,LS,MW,MZ,NA,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),EP(AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,MC,NL,PL,PT,RO,SE,SI,SK,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KM,KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,MA,MD,MG,MK,MN,MW,MX,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PG,PH,PL,PT,RO,RU,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,SY,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC,VN,YU,ZA,ZM,ZW US2005018577 20050526 WO2005118836 20051215 34 20070122 4B063 4B063QA01 4B063QA20 4B063QQ22 4B063QQ61 4B063QQ89 4B063QQ95 4B063QR41 4B063QR48 4B063QR50 4B063QS20 4B063QS28 4B063QS36 4B063QS39 4B063QX01 本出願は、２００４年５月２８日出願の米国仮出願第６０／５７５，３２４号（その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする）に基づく利益を要求する。発明の分野 本発明は、ＥＧＬＮ活性を測定する方法、該方法で使用するための新規なペプチド基質、およびＥＧＬＮ活性をモジュレートする薬剤を特定する方法の使用を提供する。背景 ２−オキソグルタレートジオキシゲナーゼ酵素は、環境変化およびストレスに対する正常な細胞維持および細胞応答に関連する種々の生理学的過程に関与する。２−オキソグルタレートジオキシゲナーゼは、種々の基質をヒドロキシル化などにより修飾する非ヘムＦｅ（ＩＩ）依存性オキシゲナーゼである。鉄のほかに、２−オキソグルタレートジオキシゲナーゼは、その活性を得るために、酸素、２−オキソグルタレート、およびアスコルビン酸を必要とする。最もよく研究されたファミリーメンバーのいくつかの例としては、コラーゲン修飾酵素であるリジンヒドロキシラーゼ（ＥＣ１．１４．１１．４）、プロリル３−ヒドロキシラーゼ（ＥＣ１．１４．１１．７）、およびプロリル４−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ；ＥＣ１．１４．１１．２）のαサブユニットが挙げられる（例えば、Majamaaら (1985) Biochem J 229:127-133; Myllyharju and Kivirikko (1997) EMBO J 16:1173-1180を参照されたい）。 ２−オキソグルタレートジオキシゲナーゼ酵素はすべて、酵素結合鉄への２−オキソグルタレートおよび二酸素の配位を含む共通の触媒メカニズムを利用する。酸素は、後続的に切断され、１個の酸素原子が２−オキソグルタレートに転移されて二酸化炭素およびスクシネートを生成する。その際、残りのＦｅ結合酸素原子は、第２の基質を修飾し、Ｐ４Ｈの場合、コラーゲンの特定のアミノ酸配列骨格中に存在するプロリン残基をヒドロキシプロリンに酸化する。このように、このファミリーの酵素は鉄を必要とし、基質として２−オキソグルタレートおよび二酸素を使用し、産物としてスクシネートおよび二酸化炭素を生成する。それぞれの酵素により利用される追加の基質はファミリーメンバーごとに異なり、それによりファミリーの種々のメンバーが区別され、触媒されるそれぞれの反応に特有な状況がもたらされる。該酵素はまた、酵素の不活性化を防止するために補因子としてアスコルビン酸を必要とする。 Ｅｇｌ−９は、２−オキソグルタレートジオキシゲナーゼの新たに報告されたグループの創成メンバーである（Aravind and Koonin (2001) Genome Biol 2: RESEARCH0007; Taylor (Taylor (2001) Gene 275:125-132）。Ｅｇｌ−９は、もともとはCaenorhabditis elegans（線虫）において産卵に必要とされる遺伝子産物として同定されたが、さらに、線虫において緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）により引き起こされる筋肉麻痺にも必要とされることが明らかにされた。このほかに、筋肉（平滑筋、骨格筋、および心筋）ならびに神経に由来する組織および細胞で発現されるラットホモログであるＳＭ−２０が同定された（Darbyら (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96:15202-15207；さらに、Waxら (1994) J Biol Chem 269(17):13041-13047; Waxら (1996) Lab Invest 74(4):797-808も参照されたい）。興味深いことに、Ｅｇｌ−９ホモログはまた、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）やコレラ菌（Vibrio cholera）などの細菌において、さらにはショウジョウバエ（Drosophila）においても同定されていることから、Ｅｇｌ−９酵素グループの進化的保存が示唆される（例えば、Aravind and Koonin, 上掲を参照されたい）。Ｅｇｌ−９ファミリーは、ＥＧＬＮ１、ＥＧＬＮ２、およびＥＧＬＮ３として同定されたヒトおよびマウスのホモログを含めてさらに範囲が拡大されている（Taylor, 上掲）。 ＥＧＬＮファミリーの基質はわかっていなかったが、これらの酵素は、種々の要因に応答しての細胞の生存および増殖のレギュレーションに関連付けられてきた（例えば、Lipscombら (1999) J Neurochem 73:429-432; Moschellaら (1999) Gene Expr 8:59-66；およびLipscombら (2001) J Biol Chem 276:5085-5092を参照されたい）。ＥＧＬＮ基質が低酸素誘導性因子のαサブユニット（ＨＩＦα）であることが明らかになったことから、この酵素ファミリーは、酸素レベルに対する細胞応答に関連付けられている（Epsteinら (2001) Cell 107:43-54; Bruick and McKnight (2001) Science 294:1337-1340）。低酸素の条件下で遺伝子転写が活発になる転写因子ＨＩＦは、単一のβ（ＨＩＦβ／ＡＲＮＴ）サブユニットおよび一群のＨＩＦαサブユニットで構成されるヘテロダイマーである。すべての細胞は、ＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−βを構成的に発現するようであるが、常酸素条件下では、ＨＩＦαサブユニットはＥＧＬＮによりヒドロキシル化され、続いて、ユビキチンリガーゼ系により分解される。低酸素条件下では、ＨＩＦαサブユニットは安定であり、細胞内に蓄積可能であり、これが細胞内でＨＩＦβと二量体化し、核に移行し、そして遺伝子転写を開始させる。ＨＩＦ転写因子により転写される特定の遺伝子は、低酸素イベント時に細胞生存と代謝回復の両方を促進する代償的な局所性および全身性の応答をもたらす。 いくつかの出版物には、酸素感受性に不可欠であるＨＩＦα基質中のペプチド骨格に関する研究が報告されている。研究は、当初はｐＶＨＬとの相互作用に必要なＨＩＦα中のドメインに焦点をあてたものであった（例えば、Huangら (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95:7987-7992；Tanimotoら (2000) EMBO J 19:4298-4309；およびPoellingerら, 国際公開第ＷＯ ０２／１２３２６号を参照されたい）。これらの研究からｐＶＨＬによるＨＩＦαの認識に必要な基本モチーフが特定されたが、ＨＩＦαとＥＧＬＮとの相互作用のための、アミノ酸配列についての必要条件は決定されなかった。より最近では、研究は、ＥＧＬＮによるヒドロキシル化に必要なＨＩＦα中のドメインに焦点をあてたものになってきている（例えば、Hirsilaら (2003) J Biol Chem 278:30772-30780；およびHuangら (2002) J Biol Chem 277:39792-39800を参照されたい）。このドメインはｐＶＨＬ相互作用ドメインと重複するが、特異的なアミノ酸骨格は異なる構造的必要条件を示すようである。国際公開第ＷＯ ０２／１２３２６号Majamaaら (1985) Biochem J 229:127-133Myllyharju and Kivirikko (1997) EMBO J 16:1173-1180Aravind and Koonin (2001) Genome Biol 2: RESEARCH0007Taylor (2001) Gene 275:125-132Darbyら (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96:15202-15207Waxら (1994) J Biol Chem 269(17):13041-13047Waxら (1996) Lab Invest 74(4):797-808Lipscombら (1999) J Neurochem 73:429-432Moschellaら (1999) Gene Expr 8:59-66Lipscombら (2001) J Biol Chem 276:5085-5092Epsteinら (2001) Cell 107:43-54Bruick and McKnight (2001) Science 294:1337-1340Huangら (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95:7987-7992Tanimotoら (2000) EMBO J 19:4298-4309Hirsilaら (2003) J Biol Chem 278:30772-30780Huangら (2002) J Biol Chem 277:39792-39800 ＥＧＬＮ活性を測定する方法、特に、ハイスループット形式で測定する方法は、酵素反応速度論ならびに酵素インヒビターのスクリーニングおよび設計に関する研究に有利であろう。このほか、１つのＥＧＬＮファミリーメンバーに対して他のファミリーメンバーに対するよりも優先性を示す基質認識モチーフが特定されれば、個々のファミリーメンバーを標的とするインヒビター設計の見通しが得られるであろう。本発明は、そのような方法を提供し、種々のＥＧＬＮファミリーメンバーとの相互作用において選択性を示す基質を決定する。本発明はまた、ＥＧＬＮ酵素の活性をモジュレートする薬剤を特定する方法の使用を提供する。発明の概要 本発明は、ＥＧＬＮ酵素活性の測定方法を提供する。一態様において、本発明は、ＥＧＬＮ酵素活性の測定方法を提供し、該方法は、ＥＧＬＮ酵素を、２−オキソグルタレートおよび１種のペプチドと、ＥＧＬＮ酵素活性に適した条件下で混合するステップ、および該酵素の活性を測定するステップを含む。種々の実施形態では、前記方法での使用のためのペプチドは、配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｚ−Ｘ６を含み、該配列中、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３は独立に、任意のアミノ酸より選択され、Ｘ４は、イソロイシン、バリン、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、トレオニン、リジン、トリプトファン、システイン、アスパラギン、ヒスチジン、セリン、アラニン、グリシン、グルタミン酸、グルタミン、またはロイシンより選択され、Ｘ５は、トレオニン、セリン、リジン、グルタミン、メチオニン、イソロイシン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸、フェニルアラニン、システイン、ロイシン、またはアラニンより選択され、Ｘ６は、フェニルアラニンまたはチロシンより選択され、かつ、Ｚは、プロリン、アゼチジン−２−カルボキシレート、３，４−デヒドロプロリン、またはｂ−チオプロリンより選択され、ただし、Ｚがプロリンである場合、Ｘ１およびＸ４は、両方がロイシンであることはないか、またはＸ４はロイシンでなく、Ｘ５はアラニンでなく、かつＸ６はチロシンでない。種々の実施形態では、２−オキソグルタレートは、約０．１〜１００μＭ、例えば１０〜１００μＭの範囲内で提供され、塩などをはじめとする任意の好適な形態で供給可能である。 他の態様において、本発明は、ＥＧＬＮ酵素活性をモジュレートする薬剤の特定方法を提供し、該方法は、ＥＧＬＮ酵素を、試験薬剤、２−オキソグルタレート、および１種のペプチドと、薬剤の非存在下ではＥＧＬＮ酵素活性に適した条件下で混合するステップ、該酵素の活性を測定するステップ、および該薬剤の存在下での該酵素の活性を、該薬剤の非存在下での該酵素の活性と比較するステップを含み、ここで、該薬剤の非存在下での該酵素の活性と比較しての該薬剤の存在下での該酵素の活性の変化が、該薬剤がＥＧＬＮ活性をモジュレートする薬剤であることを示すものである。種々の実施形態では、前記方法での使用のためのペプチドは、配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｚ−Ｘ６を含み、該配列中、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３は独立に、任意のアミノ酸より選択され、Ｘ４は、イソロイシン、バリン、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、トレオニン、リジン、トリプトファン、システイン、アスパラギン、ヒスチジン、セリン、アラニン、グリシン、グルタミン酸、グルタミン、またはロイシンより選択され、Ｘ５は、トレオニン、セリン、リジン、グルタミン、メチオニン、イソロイシン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸、フェニルアラニン、システイン、ロイシン、またはアラニンより選択され、Ｘ６は、フェニルアラニンまたはチロシンより選択され、かつ、Ｚは、プロリン、アゼチジン−２−カルボキシレート、３，４−デヒドロプロリン、またはｂ−チオプロリンより選択され、ただし、Ｚがプロリンである場合、Ｘ１およびＸ４は、両方がロイシンであることはないか、またはＸ４はロイシンでなく、Ｘ５はアラニンでなく、かつＸ６はチロシンでない。種々の実施形態では、２−オキソグルタレートは、約０．１〜１００μＭ、例えば１０〜１００μＭの範囲内で提供され、塩などをはじめとする任意の好適な形態で供給可能である。 種々の実施形態では、本発明に係る方法で使用されるＥＧＬＮ酵素は、配列番号１の配列を含む。他の実施形態では、ＥＧＬＮ酵素は、配列番号３の配列を含む。特定の実施形態では、ＥＧＬＮ酵素は、配列番号２の配列をさらに含む。種々の態様において、ＥＧＬＮ酵素は、ＥＧＬＮ１、ＥＧＬＮ２、ＥＧＬＮ３、ならびにＥＧＬＮ１、ＥＧＬＮ２、およびＥＧＬＮ３の活性断片からなる群より選択される。これらの実施形態および態様にかかる酵素は、任意の生物種から取得可能であり、またはＥＧＬＮ酵素をコードする組換えポリヌクレオチドから発現されるＥＧＬＮ酵素もしくはその機能性断片を用いて作製可能である。 種々の態様において、本発明に係る方法で使用されるペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、とりわけ少なくとも約１５アミノ酸長、さらにとりわけ少なくとも約２０アミノ酸長である。種々の実施形態では、前記ペプチドは、配列番号８〜９２からなる群より選択される配列を含む。特定の実施形態では、該ペプチドは２０アミノ酸長であり、かつ配列番号８〜１０および１２〜９２からなる群より選択される。種々の態様において、ペプチドは、Ｌ−異性体とＤ−異性体の両方を含むアミノ酸で構成される。他の態様において、該ペプチドは、Ｌ−アミノ酸異性体で構成される。いくつかの実施形態では、Ｚはプロリンであり、Ｌ−異性体またはＤ−異性体より選択される。特定の実施形態では、ＺはＬ−プロリンである。他の実施形態では、Ｚは、アゼチジン−２−カルボキシレート、３，４−デヒドロプロリン、およびｂ−チオプロリンのＬ−異性体およびＤ−異性体からなる群より選択される。特定の実施形態では、Ｚは、Ｌ−異性体であるアゼチジン−２−カルボキシレート、３，４−デヒドロプロリン、およびｂ−チオプロリンより選択される。 一実施形態では、本発明に係る方法は、ＥＧＬＮ１、ＥＧＬＮ１の活性断片、ＥＧＬＮ２、およびＥＧＬＮ２の活性断片からなる群より選択される酵素を、２−オキソグルタレートおよびペプチドと、酵素活性に適した条件下で混合するステップ、および酵素の活性を測定するステップを含む。それに包含される種々の実施形態では、前記方法での使用のためのペプチドは、配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｚ−Ｘ６を含み、該配列中、Ｘ１は、チロシン、トリプトファン、メチオニン、イソロイシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アラニン、グルタミン酸、システイン、プロリン、グリシン、およびロイシンより選択され、Ｘ２およびＸ３は独立に、任意のアミノ酸より選択され、Ｘ４は、イソロイシン、バリン、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、トレオニン、リジン、トリプトファン、システイン、アスパラギン、ヒスチジン、セリン、アラニン、グリシン、グルタミン酸、グルタミン、またはロイシンより選択され、Ｘ５は、トレオニン、セリン、リジン、グルタミン、メチオニン、またはアラニンより選択され、Ｘ６は、フェニルアラニンまたはチロシンより選択され、かつ、Ｚは、プロリン、アゼチジン−２−カルボキシレート、３，４−デヒドロプロリン、またはｂ−チオプロリンより選択され、ただし、Ｚがプロリンである場合、Ｘ１およびＸ４は、両方がロイシンであることはないか、またはＸ４はロイシンでなく、Ｘ５はアラニンでなく、かつＸ６はチロシンでない。種々の実施形態では、２−オキソグルタレートは、約０．１〜１００μＭ、例えば１０〜１００μＭの範囲内で提供され、塩などをはじめとする任意の好適な形態で供給可能である。特定の実施形態では、前記ペプチドは、配列番号８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２９、３１、６２、６３、および７９からなる群より選択される配列を含む。特定の実施形態では、該ペプチドは、配列番号８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２９、３１、６２、６３、および７９からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、試験薬剤をアッセイに組み入れて、前記酵素の活性をモジュレートする試験薬剤の能力を測定する。 他の実施形態では、本発明に係る方法は、ＥＧＬＮ３またはＥＧＬＮ３の活性断片より選択される酵素を、２−オキソグルタレートおよびペプチドと、酵素活性に適した条件下で混合するステップ、および酵素の活性を測定するステップを含む。種々の実施形態では、２−オキソグルタレートは、約０．１〜１００μＭ、例えば１０〜１００μＭの範囲内で提供され、塩などをはじめとする任意の好適な形態で供給可能である。特定の実施形態では、前記ペプチドは、配列番号８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２９、３０、３１、３２、３６、４１、４４、４５、４７、５０、５６、６２、６３、６９、７２、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９１、および９２からなる群より選択される配列を含む。特定の実施形態では、該ペプチドは、配列番号８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２９、３０、３１、３２、３６、４１、４４、４５、４７、５０、５６、６２、６３、６９、７２、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９１、および９２からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、試験薬剤をアッセイに組み入れて、酵素の活性をモジュレートする試験薬剤の能力を測定する。 種々の実施形態では、本発明に係る方法は、還元剤をさらに含みうる。ここで、該還元剤は、限定されるものではないが、アスコルベートおよびフェロシアン化カリウムからなる群より選択可能である。これらの実施形態では、還元剤は、約０．１〜１０ｍＭ、例えば０．５〜５ｍＭの範囲内で提供可能であり、アスコルビン酸ナトリウム、フェロシアン化カリウムなどのような塩などをはじめとする任意の好適な形態で供給可能である。本方法はまた、塩化第一鉄、硫酸第一鉄などとして提供される第一鉄イオンなどの鉄をも含みうる。種々の実施形態では、第一鉄イオンは、約０〜５００μＭ、例えば２５〜２５０μＭ、特に５０〜２００μＭの範囲内で提供される。 いくつかの実施形態では、Ｚはアゼチジン−２−カルボキシレートである。それに包含される特定の実施形態では、前記ペプチドは、配列番号６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７３、７４、７５，７６、７７、および７８からなる群より選択される配列を含む。特定の実施形態では、該ペプチドは、配列番号６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７３、７４、７５、７６、７７、および７８からなる群より選択される。他の実施形態では、Ｚは３，４−デヒドロプロリンである。それに包含される特定の実施形態では、ペプチドは配列番号６２の配列を含む。特定の実施形態では、ペプチドは配列番号６２である。さらに他の実施形態では、Ｚはｂ−チオプロリンである。それに包含される特定の実施形態では、ペプチドは配列番号７２の配列を含む。特定の実施形態では、ペプチドは配列番号７２である。 本発明の種々の実施形態では、ＥＧＬＮ活性の測定ステップは、２−オキソグルタレート基質に対するＥＧＬＮ酵素の反応により生じた二酸化炭素を測定することを含み、生じた二酸化炭素の量は、ＥＧＬＮ酵素の活性に正比例する。他の実施形態では、ＥＧＬＮ活性の測定ステップは、反応の間での還元剤のその酸化形態への変換を測定することを含み、酸化された還元剤の量は、ＥＧＬＮ酵素の活性に正比例する。 本明細書中の開示内容に照らせば、本発明のこれらのおよび他の実施形態は、当業者には自明であろう。また、そのような実施形態はすべて、明確に意図される。図面の簡単な説明 図１（１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、および１Ｆ）は、種々の生物種に由来するＨＩＦαサブユニットのアライメントを示している。アライメントは、ＣＬＵＳＴＡＬＷプログラム（version 1.81; Thompsonら (1994) Nucleic Acids Res 22:4673-4680）を用いて作成されたものである。 図２は、種々のＥＧＬＮファミリーメンバーの活性ドメインのアライメントを示している。アライメントは、ＣＬＵＳＴＡＬＷプログラム（v.1.81; Thompsonら, 上掲）を用いて作成されたものである。図中、ＰＦ０３１７１は、ＰＦＡＭデータベース（version 13.0; Batemanら (2002) Nucleic Acids Research 30(1):276-280）により作成したときの多重配列アライメントおよび隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）分析により同定された２−オキソグルタレートＦｅ（ＩＩ）オキシゲナーゼスーパーファミリーモチーフを表し、ＣＤＤ１３０７１は、保存ドメインデータベース（ＣＤＤ, version 2.00; Marchler-Bauerら (2003) Nucleic Acids Res 31:383-387）により作成したときの多重配列アライメントにより同定されたＥｇｌ−９プロリンヒドロキシラーゼドメインを表している。 図３は、ＥＧＬＮ１に関して順序付けられた、対照ペプチドを基準にした基質ペプチドの活性のプロットを示している。図中の傾向線は、ＥＧＬＮ１（実線）およびＥＧＬＮ２（破線）に対する活性を示している。 図４は、ＥＧＬＮ３に関して順序付けられた、対照ペプチドを基準にした基質ペプチドの活性のプロットを示している。図中の傾向線は、ＥＧＬＮ３に対する活性を示している。 図５は、酵素活性を保持しつつ行いうる基本基質構造の種々の修飾を示している。上側のパネルは、ＥＧＬＮ１およびＥＧＬＮ２の好適な活性を保持するプロリン残基（１）および追加のアミノ酸（２〜１０）の修飾を示している。下側のパネルは、ＥＧＬＮ３の好適な活性を保持するプロリン残基（１）および追加のアミノ酸（２〜１０）の修飾を示している。それぞれのペプチド配列の一部分だけが図に示されている。 図６（６Ａおよび６Ｂ）は、種々の濃度のフェロシアン化カリウムに対する２−オキソグルタレートのターンオーバー（％）を示している。図６Ａは、改変型反応（ＩＩ）に基づくアゼチジン含有ペプチドの存在下におけるＥＧＬＮ１の活性を示している。各データ点は、３回の実験の平均を表している。図６Ｂは、ＤＬＤ１９ペプチドの存在下におけるＥＧＬＮ２の活性を示している。対照として、１ｍＭアスコルベートの存在下における反応を行った。各データ点は、３回の実験の平均を表している。 図７Ａは、２種類の異なる濃度のＥＧＬＮ１を用いたフェロシアン化カリウム濃度に対する２−オキソグルタレートのターンオーバー（％）を示している。図７Ｂは、改変型反応（ＩＩ）における当初のフェロシアン化物密度に対するフェリシアン化物産物の生成速度を示している。４０５ｎｍの波長におけるＦｅ３＋の光学密度をモニターすることにより、フェリシアン化物の生成をモニターした。産物の非酵素的生成を補正するために、酵素を用いた反応のＯＤから酵素を用いない反応の光学密度を差し引いた。発明の詳細な説明 本方法について説明する前に、本発明は記載の特定の試薬に限定されるものではないことを理解しなければならない。なぜなら、これらは変更可能であるからである。また、本明細書中で使用される用語は、本発明の特定の実施形態を説明することを意図したものであり、添付の請求の範囲に示される本発明の範囲を限定することをなんら意図したものではないことも理解しなければならない。 本明細書および添付の請求の範囲で使用する場合、文脈上明らかに異なる場合を除いて、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、複数の指示対象を包含することに留意しなければならない。従って、例えば、「ペプチド」（a peptide）の指示対象は、複数の該ペプチドおよび当業者に公知のその等価物などを包含しうる。 特に定義がない限り、本明細書中で使用される科学技術用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。本発明を実施または試験する際、本明細書中に記載のものと類似するかまたは等価な任意の方法および材料を使用しうるが、好ましい方法、装置、および材料を以下に記載する。本明細書中で引用される出版物はすべて、本発明に関連して使用しうる出版物中に報告された方法、試薬、および器具を説明し、かつ開示することを目的として、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。ここに記載の内容は、先行発明に基づいてそのような開示に先行する権利が本発明に与えられないことを容認するものと解釈すべきものではない。 本発明を実施する場合、特に指示がない限り、当該技術の範囲内にある化学、生化学、分子生物学、細胞生物学、遺伝学などの従来法を利用するものとする。そのような技術については、文献中に十分に説明されている。発明 本発明は、ＥＧＬＮアイソフォームに対して様々な特異性および多様性を示す、これまで知られていなかった基質と、新規な反応パラメーターとを利用して、種々のＥＧＬＮ酵素の活性を測定する方法を提供する。本明細書中に開示される基質はＨＩＦαポリペプチドといくぶんかの類似性を共有するが、それらは、基質構造の実質的かつ自明でない変更を含み、特有なアッセイ条件、酵素反応動態、およびアッセイ結果（readout）を提供する。該アッセイは、基質−酵素特異性のより十分な特性付けならびにそれぞれの基質と相互作用する特定のＥＧＬＮ酵素の能力を改変する薬剤のスクリーニングおよび特定に有用である。 一態様において、本発明は、ＥＧＬＮ酵素、該酵素に対して所望の特異性および選択性を有するペプチド、および２−オキソグルタレートなどの２−オキソ酸を、ＥＧＬＮ酵素活性に適した条件下で混合するステップ、および酵素の活性を測定するステップを含むアッセイを提供する。ＥＧＬＮ酵素活性に適した条件は、一般的には、酸素の存在を含み、場合により、還元剤および／または追加の鉄を含みうる。いくつかの実施形態では、還元剤はアスコルビン酸であるが、他の実施形態では、還元剤はフェロシアン化カリウムである。特定の態様において、ペプチド基質は、種々のＥＧＬＮ酵素に対して類似の特異性を示す。他の態様において、ペプチド基質は、１つのＥＧＬＮ酵素に対して他のＥＧＬＮファミリーメンバーに対するよりも高い特異性を示す。特定の実施形態では、ペプチド基質は、ＥＧＬＮ１およびＥＧＬＮ２に対してＥＧＬＮ３に対するよりも高い特異性を示す。あるいはまた、他の特定の実施形態では、ペプチド基質は、ＥＧＬＮ３に対してＥＧＬＮ１およびＥＧＬＮ２に対するよりも高い特異性を示す。さらに他の実施形態では、本発明は、ＥＧＬＮ１などに対してＥＧＬＮ２に対するよりも、またはＥＧＬＮ２に対してＥＧＬＮ１に対するよりも、高い親和性を示すペプチド基質を考慮する。 他の態様において、本発明は、ＥＧＬＮ酵素活性をモジュレートする薬剤の特定方法を提供し、該方法は、ＥＧＬＮ酵素を、試験薬剤、２−オキソグルタレート、および１種のペプチドと、薬剤の非存在下ではＥＧＬＮ酵素活性に適した条件下で混合するステップ、該酵素の活性を測定するステップ、および該薬剤の存在下での該酵素の活性を、該薬剤の非存在下での該酵素の活性と比較するステップを含み、ここで、該薬剤の非存在下での該酵素の活性と比較しての該薬剤の存在下での酵素の活性の変化が、該薬剤がＥＧＬＮ活性をモジュレートする薬剤であることを示すものである。ＥＧＬＮ ＥＧＬＮとは２−オキソグルタレートジオキシゲナーゼ酵素であり、他にも可能性のある基質はあるが、特に、ＨＩＦαタンパク質中の特定のプロリン残基をヒドロキシル化することが知られている。ＥＧＬＮによりヒドロキシル化されるプロリン残基としては、ヒトＨＩＦ−１α天然配列の残基４０２（Ｐ４０２）および５６４（Ｐ５６４）に存在するプロリン残基、ならびに例えば図１に示されたような他の生物種から取得されたＨＩＦαサブユニット中の対応するプロリン残基が挙げられる。好ましい実施形態では、アッセイで利用されるＥＧＬＮは、Ｔａｙｌｏｒ（上掲）により報告されて、ＡｒａｖｉｎｄおよびＫｏｏｎｉｎ（上掲）、Ｅｐｓｔｅｉｎら（上掲）、ならびにＢｒｕｉｃｋおよびＭｃＫｎｉｇｈｔ（上掲）により特性付けられたＥｇｌ−９酵素ファミリーのメンバーから選択される。本発明のいくつかの実施形態では、ＥＧＬＮ酵素は、ＥＧＬＮ１、ＥＧＬＮ２、および／またはＥＧＬＮ３のアイソフォームから選択可能である。ＥＧＬＮ１アイソフォームは、限定されるものではないが、ヒトＥＧＬＮ１（ｈＥＧＬＮ１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＧ３３９６５；Dupuyら (2000) Genomics 69:348-54）、マウスＥＧＬＮ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＣ４２５１５）、およびラットＥＧＬＮ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｐ５９７２２）を含む群から選択可能であり、ＥＧＬＮ２アイソフォームは、限定されるものではないが、ヒトＥＧＬＮ２アイソフォーム１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＣ４２５１０；Taylor, 上掲）、ヒトＥＧＬＮ２アイソフォーム３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿５４２７７０）、マウスＥＧＬＮ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＣ４２５１６）、およびラットＥＧＬＮ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＯ４６０３９）を含む群から選択可能であり、ＥＧＬＮ３アイソフォームは、限定されるものではないが、ヒトＥＧＬＮ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＣ４２５１１；Taylor, 上掲）、マウスＥＧＬＮ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＣ４２５１７）、およびラットＥＧＬＮ３（ＳＭ−２０）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＡ１９３２１）を含む群から選択可能である。本発明の他の実施形態では、ＥＧＬＮは、線虫（Caenorhabditis elegans）ＥＧＬ−９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＤ５６３６５）およびショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）ＣＧ１１１４遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＦ５２０５０）を包含しうる。 他の実施形態では、本発明のアッセイで利用されるＥＧＬＮは、上記の、または当業者に公知であるいずれかのＥＧＬＮ酵素ファミリーメンバーの活性断片を含みうる。活性断片は、好ましくは、配列 Ｈ−Ｘ−Ｄ−［Ｘ］ｎ−Ｈを含有するドメインを含むであろう。上記式中、Ｘは、任意のアミノ酸であり、ｎは、約４０〜８０、好ましくは約５０〜６５、最も好ましくは約５８である（例えば、図２を参照されたい）。例えば、アッセイで利用されるＨＩＦ ＰＨの活性断片は、タンパク質ファミリー（ＰＦＡＭ）データベース登録番号３１７１により定義されるコンセンサス配列（配列番号１）、Ｅｎｔｒｅｚ保存ドメインデータベース（ＣＤＤ）登録番号２１４８９により定義されるコンセンサス配列（配列番号２）、または図２に示されるコンセンサス配列（配列番号３）を含みうる（Batemanら (2004) Nucleic Acids Res 32(1):D138-141; Marchler-Bauerら (2003) Nucleic Acids Res 31:383-387）。 本発明で使用される酵素は、細胞により内因的に産生可能であり、ここでいう細胞とは、単細胞または多細胞の真核生物のような天然源から元々取得されるものである。例えば、酵素は、Caenorhabditis elegansなどの線虫もしくはDrosophila melanogaster（ショウジョウバエ）などの昆虫のような生体全体の消化により取得するか、マウスもしくはラットの腎臓、肺、肝臓、脳などから得られるものなどの単離された器官もしくは組織の消化により取得するか、または樹立細胞株のようなクローン細胞集団の溶解により、取得することが可能である。あるいはまた、組換えＤＮＡ技術を用いて酵素を産生させることが可能である。例えば、酵素をコードする遺伝子または転写産物のポリヌクレオチドを宿主細胞または生物に導入することが可能であり、該宿主は、構成的に、または特定の条件下で、外来性ポリヌクレオチド配列によりコードされたタンパク質を発現しうる。 酵素が内因性もしくは外来性のいずれのポリヌクレオチドから産生されるかにかかわらず、インタクトな宿主細胞内または細胞から生成された細胞溶解物内に含有された状態で酵素を本発明のアッセイで使用することが可能である。例えば、Ｈｅｐ３Ｂ細胞などの肝細胞、ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）のような内皮細胞、ヒト包皮繊維芽細胞のような繊維芽細胞などのような、内因的に酵素を産生する細胞を好適な密度まで培養下で増殖させることが可能であり、次に、当業者により知られる標準的技術を用いて細胞溶解物を調製することが可能である。特定のＥＧＬＮの内因的発現により細胞を選択することが可能である。例えば、ＥＧＬＮ１の特異的発現は、動脈内皮細胞において常酸素条件下で最近報告された（例えば、Takahashiら (2004) Biochem Biophys Res Comm 317:84-91を参照されたい）。あるいはまた、例えば、低酸素（hypoxic）、すなわち低い酸素の条件下で好適な時間をかけて細胞を増殖させることにより、ＥＧＬＮの発現を誘導することが可能である。そのような条件については、当業者に広く知られている。 場合により、例えば、酵素を含有する溶解物を分画することにより、酵素を部分的に精製または濃縮することが可能である。あるいはまた、当業者により知られる任意の方法を用いて、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）またはアフィニティークロマトグラフィーにより、酵素を溶解物中の他の成分から精製することが可能である。また、例えば、自動化４３２Ａペプチド合成機（Applied Biosystems, Inc., Foster City CA）などを用いて行われるＦＭＯＣ化学または当業者に公知の他の技術を利用して、酵素、特に酵素の活性断片を化学合成することが可能である。ペプチド 本発明は、ＥＧＬＮアイソフォームに対して様々な特異性および多様性を示す新規なペプチドを提供する。これらのペプチドはＨＩＦαポリペプチドといくぶんかの類似性を共有するが、それらは、基質構造の実質的かつ自明でない変更を含有し、特有なアッセイ条件および酵素反応動態を提供する。 本明細書中で使用する場合、「ＨＩＦα」という用語は、低酸素誘導性因子タンパク質のαサブユニットを意味する。ＨＩＦαは、ＨＩＦ−１α、ＨＩＦ−２α、およびＨＩＦ−３αの３つの一般的形態で存在する。さらに、それぞれの一般的形態は、異なるアイソフォームで生物内に存在しうる。例えば、ＨＩＦ−１αとしては、ヒトＨＩＦ−１αアイソフォーム１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｑ１６６６５；ＨＩＦ１Ａ＿ＨＵＭＡＮ）およびアイソフォーム２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿８５１３９７；ＨＩＦ１ｖ＿ＨＵＭＡＮ）、ネズミＨＩＦ−１α（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｑ６１２２１；ＨＩＦ１Ａ＿ＭＯＵＳＥ）、ラットＨＩＦ−１α（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＡ７０７０１；ＨＩＦ１Ａ＿ＲＡＴ）、ならびにウシＨＩＦ−１α（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＡＡ７８６７５；ＨＩＦ１Ａ＿ＢＯＶＩＮＥ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。同様に、ＨＩＦ−２αとしては、ヒトＨＩＦ−２α（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＢ４１４９５；ＨＩＦ２Ａ＿ＨＵＭＡＮ）、マウスＨＩＦ−２α（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＡＡ２０１３０およびＡＡＢ４１４９６；ＨＩＦ２Ａ＿ＭＯＵＳＥ）、ラットＨＩＦ−２α（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＢ９６６１２；ＨＩＦ２Ａ＿ＲＡＴ）、およびウシＨＩＦ−２α（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＡＡ７８６７６；ＨＩＦ２Ａ＿ＢＯＶＩＮＥ）が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、ＨＩＦ−３αとしては、ヒトＨＩＦ−３α（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＤ２２６６８；ＨＩＦ３Ａ＿ＨＵＭＡＮ）、マウスＨＩＦ−３α（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＣ７２７３４）、およびラットＨＩＦ−３α（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＢ９６６１１；ＨＩＦ３Ａ＿ＲＡＴ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。種々の非哺乳動物ＨＩＦαタンパク質もまた報告されており、例としては、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）ＨＩＦ−１α（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＢ９６６２８；ＨＩＦ１Ａ＿ＸＥＮＬＡ）、ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）ＨＩＦ−１α（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＪＣ４８５１）、ニジマス（Oncorhynchus mykiss）ＨＩＦ−１α（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｑ９８ＳＷ２；ＨＩＦ１Ａ＿ＯＮＣＭＹ）、およびニワトリＨＩＦ−１α（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＡＡ３４２３４；ＨＩＦ１Ａ＿ＣＨＩＣＫ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。 ＨＩＦαサブユニットのアライメントは、図１に示されるように、種々のファミリーメンバー間で保存された領域を示す。該保存領域は、酸素により調節される分解に対するそれらの感受性のような、ＨＩＦαサブユニットにより共有される機能特性に関して最初に分析された。欠失研究から、ＨＩＦ−１αアミノ酸残基４０１〜６０３により規定されるＨＩＦαの一部分中の酸素分解ドメインが特定された（Huangら, 上掲）。その後、酸素感受性領域は、ＨＩＦ−１αのアミノ酸５５６〜５７５に、より具体的には、ＨＩＦ−１α（５５６〜５７５）中のＭ５６１ＬＡＰＹＩＰＭに対応する高度に保存された同一線上の配列に、位置が特定された（Jiangら (1997) J Biol Chem 272:19253-19260; Tanimotoら (2000) EMBO J 19:4298-4309; Srinivasら (1999) Biochem Biophys Res Commun 260:557-561；およびIvanら (2001) Science 292:464-468）。この配列中において、ＬＸＸＬＡＰモチーフに関連して起こるプロリン残基のヒドロキシル化（例えば、ＨＩＦ−１α天然配列のＬ３９７ＴＬＬＡＰおよびＬ５５９ＥＭＬＡＰならびにＨＩＦ−２αおよびＨＩＦ−３αの対応する部分で起こる）は、ＨＩＦ−１αの常酸素分解に必要であることが見いだされた（Ivan and Kaelin (2001) Science 292:464-468; Jaakkolaら (2001) Science 292:468-472を参照されたい）。例えば、ＨＩＦ−１α、ＨＩＦ−２α、およびＨＩＦ−３αのＣ末端酸素分解ドメイン（Ｃ−ＯＤＤ）に対応する領域を、以下に示す。 従って、これらの配列は、ＨＩＦ−ＰＨ酵素に対する内因性基質を代表する。さらに、太字で示されている残基は、種々のＨＩＦαアイソフォーム間で保存されているので、ＥＧＬＮヒドロキシル化に対するコンセンサス配列を規定しうる。 本発明は、ＥＧＬＮ酵素ファミリーの基質要件のさらなる特徴付けを提供する。一態様において、本発明は、配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｚ−Ｘ６を含むペプチドを提供する。該配列中、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３は独立に、任意のアミノ酸から選択され、Ｘ４は、イソロイシン、バリン、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、トレオニン、リジン、トリプトファン、システイン、アスパラギン、ヒスチジン、セリン、アラニン、グリシン、グルタミン酸、グルタミン、またはロイシンより選択され、Ｘ５は、トレオニン、セリン、リジン、グルタミン、メチオニン、イソロイシン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸、フェニルアラニン、システイン、ロイシン、またはアラニンより選択され、Ｘ６は、フェニルアラニンまたはチロシンより選択され、かつ、Ｚはプロリンであり、ただし、Ｘ１およびＸ４は、両方がロイシンであることはないか、またはＸ４−Ｘ５−Ｚ−Ｘ６は、ＬＡＰＹでない。任意の長さのペプチドを使用しうるが、ペプチドは、好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド長、特に少なくとも約１５、とりわけ少なくとも約２０ヌクレオチド長である。表１は、本発明に係る方法で使用するためのペプチドの種々の例を示している。それぞれのペプチド中の小文字のｐは、反応中にヒドロキシル化されうるプロリンを表す。 これらの配列の１つを含む任意のポリペプチドまたは表１に示される任意のペプチドを本明細書中に開示される方法で使用することが可能である。これらのペプチドは、以下に記載されるように、共基質（co-substrate）である２−オキソグルタレート、ＥＧＬＮ酵素、および酸素をさらに必要とする反応で使用される。該反応は、Ｆｅ２＋をさらに含みうる。該反応は、２−オキソグルタレート基質がスクシネートおよび二酸化炭素に変換されかつ非ヒドロキシル化ペプチド基質がヒドロキシル化される標準的反応（Ｉ）に従って進行する。 本発明はさらに、ペプチドが種々のＥＧＬＮ酵素に対して異なる特異性を示すことを実証する。従って、本発明は、特定の実施形態では、本明細書中で実証されるように種々のペプチドに対して類似の特異性を示すＥＧＬＮ１およびＥＧＬＮ２に対して最適化されたペプチドを提供する。酵素がＥＧＬＮ１もしくはＥＧＬＮ２であるかまたはペプチドがＥＧＬＮ１および／もしくはＥＧＬＮ２に対して少なくとも等しい特異性を示すことが望まれるアッセイで使用するために、図３に示されるペプチドを選択することが可能である。例えば、表１および図３からわかるように、ペプチドＤＴＤＬＤＬＥＡＲＡｐＹＩＰＡＤＤＤＦＱ（配列番号１５）は、ＥＧＬＮ１およびＥＧＬＮ２に対してＥＧＬＮ３に対するよりも高い特異性を示す。 さらにまた、本発明は、特定の実施形態では、ＥＧＬＮ３に対して最適化されたペプチドを提供する。酵素がＥＧＬＮ３であるかまたはペプチドがＥＧＬＮ３に対して少なくとも等しい特異性を示すことが望まれるアッセイで使用するために、図４に示されるペプチドを選択することが可能である。例えば、表１および図４からわかるように、ペプチドＤＴＤＬＤＭＥＡＬＡｐＹＩＰＡＤＤＤＦＱ（配列番号１３）、ＤＴＤＬＤＦＥＡＬＡｐＹＩＰＡＤＤＤＦＱ（配列番号１９）、およびＤＴＤＬＤＩＥＡＬＡｐＹＩＰＡＤＤＤＦＱ（配列番号２４）は、ＥＧＬＮ３に対してＥＧＬＮ１およびＥＧＬＮ２に対するよりも高い特異性を示す。 このほかに、本発明は、特定の実施形態では、ＥＧＬＮ１、ＥＧＬＮ２、およびＥＧＬＮ３による活性が本質的に等価であるペプチドを提供する。ＥＧＬＮ１、ＥＧＬＮ２、およびＥＧＬＮ３の直接的な比較が望まれるかまたはペプチドがＥＧＬＮ１、ＥＧＬＮ２、およびＥＧＬＮ３に対して実質的に等しい特異性を示すことが望まれるアッセイで使用するために、表１に示されるペプチドを選択することが可能である。例えば、表１からわかるように、ペプチドＤＴＤＬＤＬＥＡＦＡｐＹＩＰＡＤＤＤＦＱ（配列番号１４）は、ＥＧＬＮ１、ＥＧＬＮ２、およびＥＧＬＮ３に対して似通った特異性を示す。 本発明はまた、表２に示されるアミノ酸アナログを含有するペプチドを提供する。これらのアナログは、プロリン、具体的には、標準的反応（Ｉ）においてヒドロキシル化により修飾されるプロリン残基の代わりに使用される。一態様において、本発明は、配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｚ−Ｘ６を含むペプチドを提供する。該配列中、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３は独立に、任意のアミノ酸より選択される。 Ｘ４は、イソロイシン、バリン、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、トレオニン、リジン、トリプトファン、システイン、アスパラギン、ヒスチジン、セリン、アラニン、グリシン、グルタミン酸、グルタミン、またはロイシンより選択され、Ｘ５は、トレオニン、セリン、リジン、グルタミン、メチオニン、イソロイシン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸、フェニルアラニン、システイン、ロイシン、またはアラニンより選択され、Ｘ６は、フェニルアラニンまたはチロシンより選択され、Ｚは、アゼチジン−２−カルボキシレート、３，４−デヒドロプロリン、ｂ−チオプロリン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、またはアゼチジン−３−カルボン酸より選択される。任意の長さのペプチドを使用しうるが、ペプチドは、好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド長、特に少なくとも約１５ヌクレオチド長、とりわけ少なくとも約２０ヌクレオチド長である。本発明は、ＨＩＦ−ＰＨによるヒドロキシル化を受けにくいこれらのアナログが継続してスクシネートおよび二酸化炭素への共基質２−オキソグルタレートのターンオーバーを可能にすることを実証する。 さらに、異なるＥＧＬＮ酵素は、プロリンアナログを含有するペプチドに対して異なる親和性を示す。従って、本発明は、特定の実施形態では、表３に示されるように、ＥＧＬＮ１およびＥＧＬＮ２に対して最適化されたプロリンアナログ含有ペプチドを提供する。 本アッセイにおいて測定可能な活性を保持する表３に示されるペプチドは、本明細書中に開示されるアッセイで使用することが特に意図される。これらのペプチドは、以下に記載されるように、共基質２−オキソグルタレートおよび還元剤（例えばアスコルベート）、ＥＧＬＮ酵素、ならびに酸素をさらに必要とする反応で使用される。該反応は、Ｆｅ２＋をも含みうる。該反応は、２−オキソグルタレートがスクシネートおよび二酸化炭素に変換されかつ還元剤が続いて酸化される（例えば、アスコルベートがデヒドロアスコルベートに酸化される）改変型反応（ＩＩ）に従って進行する。該反応は前記ペプチドの存在を必要とするが、該ペプチドは、該反応中に修飾されず、酵素補因子として作用する。 酵素がＥＧＬＮ１もしくはＥＧＬＮ２であるかまたはペプチドがＥＧＬＮ１および／もしくはＥＧＬＮ２に対して特異的な親和性を示すことが望まれるアッセイで使用するためのペプチドとして、表３に示されるペプチドを選択することが可能である（図３も参照されたい）。例えば、表３および図３からわかるように、ヒドロキシル化されるプロリンがプロリンアナログである３，４−デヒドロプロリンで置き換えられているペプチドＤＴＤＬＤＬＥＡＬＡ４ＹＩＰＡＤＤＤＦＱ（配列番号６２）は、ＥＧＬＮ１およびＥＧＬＮ２に対してＥＧＬＮ３に対するよりも高い特異性を示す。 本発明はさらに、特定の実施形態では、表４に示されるように、ＥＧＬＮ３に対して最適化されたプロリンアナログ含有ペプチドを提供する。 本アッセイにおいて測定可能な活性を保持する表４に示されるペプチドは、本明細書中に開示されるアッセイで使用することが特に意図される。これらのペプチドは、以下に記載されるように、２−オキソグルタレートおよび還元剤（例えばアスコルベート）、ＥＧＬＮ酵素、ならびに酸素をさらに必要とする反応で使用される。該反応は、Ｆｅ２＋をも含みうる。該反応は、２−オキソグルタレートがスクシネートおよび二酸化炭素に変換されかつ還元剤が続いて酸化される（例えば、アスコルベートがデヒドロアスコルベートに酸化される）改変型反応（ＩＩ）に従って進行する。該反応は前記ペプチド基質の存在を必要とするが、該ペプチドは、該反応中に修飾されず、酵素補因子として作用する。 酵素がＥＧＬＮ３であるかまたはペプチドがＥＧＬＮ３に対してより大きい特異性を示すことが望まれるアッセイで使用するために、図４に示されるペプチドを選択することが可能である（図４も参照されたい）。例えば、表４および図４からわかるように、ヒドロキシル化されるプロリンがプロリンアナログであるＬ−アゼチジン−２−カルボキシレートで置き換えられているペプチドＤＴＤＬＤＬＥＡＬＡ８ＹＩＰＡＤＤＤＦＱ（配列番号６３）は、ＥＧＬＮ３に対してＥＧＬＮ１およびＥＧＬＮ２に対するよりも高い特異性を示す。 従って、以下のアッセイで使用するためのペプチドとしては、以上のペプチド基質のいずれも、特に表１〜４に示されているものが挙げられる。本アッセイで使用されることが意図されるペプチドはまた、表１〜４に示されているペプチド中に例示された置換の種々の組合せを含みうる。例えば、図５に示される置換の組合せは、改変型反応（ＩＩ）で使用するためのＥＧＬＮに対して特異性を有する一連の考えられるペプチドを示している。図５の上側のパネルは、ＥＧＬＮ１および／またはＥＧＬＮ２に対する特異性を保持または増強するように行いうる種々の修飾を示し、一方、図５の下側のパネルは、ＥＧＬＮ３に対する特異性を保持または増強するように行いうる種々の修飾を示している。当業者であれば、以上および図５に提供される情報から、本明細書中に具体的に開示されていないが本質的に本発明の範囲内に包含される広範にわたる新規なペプチドを即座に思い描くことが可能である。例えば、ペプチドＤＴＤＬＤＹＥＭＩＡｐＹＩＰＡＤＤＤＦＱ（配列番号８９）、ＤＴＤＬＤＷＥＭＶＳｐＹＩＰＡＤＤＤＦＱ（配列番号９０）、ＤＴＤＬＤＷＥＡＶＳｐＹＩＰＡＤＤＤＦＱ（配列番号９１）、およびＤＴＤＬＤＷＥＭＶＡｐＹＩＰＡＤＤＤＦＱ（配列番号９２）は、ＥＧＬＮ１およびＥＧＬＮ３の両者により容易にヒドロキシル化されるので、特に本発明により考慮される。 標準的反応（Ｉ）または改変型反応（ＩＩ）におけるペプチドの使用は、主に、ＨＩＦ−ＰＨによりヒドロキシル化されるプロリン残基に代わるプロリンアナログの非存在または存在によりそれぞれ決定される。 自動化４３２Ａペプチド合成機（Applied Biosystems）などを用いて行われるＦＭＯＣ化学または当業者に公知の他の技術を利用して、上述のペプチドのいずれを化学合成することも可能である。アッセイ 本発明は、ＥＧＬＮ酵素の活性を測定する方法を提供する。一態様において、前記方法は、上記で提供されたようなＥＧＬＮ酵素、２−オキソ酸基質、およびペプチド基質を、ＥＧＬＮ酵素活性に適した条件下で混合するステップ、および該酵素の活性を測定するステップを含むアッセイである。特定の実施形態では、２−オキソグルタレートをスクシネートおよび二酸化炭素に変換し、併行して非ヒドロキシル化ペプチドをヒドロキシル化ペプチドに変換する標準的反応（Ｉ）で、酵素活性を測定する。標準的アッセイは、反応（Ｉ）：を含む。ここで、−Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ｐ−Ａ４−Ａ５−Ａ６−は、基質ペプチドを表し、−Ａ１−Ａ２−Ａ３−ＰＯＨ−Ａ４−Ａ５−Ａ６は、ヒドロキシル化ペプチドを表す。非ヒドロキシル化プロリン残基はＰとして表され、ヒドロキシル化プロリンは、ＰＯＨとして表されている。基質中の使用される特定のプロリンは、好ましくは、天然に存在するＬ−プロリン（ｐ）であるが、一部の場合には、Ｄ−プロリン異性体（ｄ）を使用することも可能である。本アッセイで特に使用される基質としては、前掲の表１に提供される基質ならびに本明細書内で明確に想定されるこれらの基質の組合せ、例えば、配列番号１１および８４〜８６が挙げられる。種々の実施形態では、酵素活性を維持するのに好適な条件下で共基質を酵素と混合し、次に、酵素の活性を測定する。該アッセイは、追加の成分の非存在下または存在下で使用しうる。例えば、酵素活性を増大または減少させる可能性があると推測される薬剤を該反応に追加することが可能であり、標準的アッセイのそのような使用は、明らかに本発明に包含される。 他の実施形態では、２−オキソグルタレートをスクシネートおよび二酸化炭素に変換し、併行してアスコルベートなどの還元剤（ＲＡ）をデヒドロアスコルベートなどのその酸化形態に変換する改変型反応（ＩＩ）で、酵素活性を測定する。改変型アッセイは、反応（ＩＩ）：を含む。ここで、−Ａ１−Ａ２−Ａ３−ｐ−Ａ４−Ａ５−Ａ６−は、ペプチドを表し、プロリンアナログはｐとして表されている。この反応では、該ペプチドは、実際の基質としてではなく酵素補因子として作用する。好ましいペプチドアナログとしては、アゼチジン−２−カルボキシレート、３，４−デヒドロプロリン、およびｂ−チオプロリンのＬ異性体およびＤ異性体の両方、好ましくはＬ異性体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。このほかに、基質中の使用されるプロリンアナログとしては、例えば、２，３−デヒドロプロリンのＬ異性体およびＤ異性体の両方、好ましくはＬ異性体が挙げられうる。本アッセイで特に使用されるペプチドとしては、前掲の表３および４に提供されるペプチドならびに本明細書内で明確に想定されるこれらの基質の組合せが挙げられる（例えば、図５を参照されたい）。種々の実施形態では、酵素活性を維持するのに好適な条件下で共基質と補因子とを混合し、次に、酵素の活性を測定する。該アッセイは、追加の成分の非存在下または存在下で使用しうる。例えば、酵素活性を増大または減少させる可能性があると推測される薬剤を該反応に追加することが可能であり、改変型アッセイのそのような使用は、明らかに本発明に包含される。 アッセイは、鉄を含むこともできる。一般的には、第一鉄イオンは、約０〜５００μＭ、例えば２５〜２５０μＭ、特に５０〜２００μＭの範囲内で提供される。第一鉄イオンは、塩化第一鉄、硫酸第一鉄などのような任意の好適な形態で供給可能である。２−オキソグルタレートは、約０．１〜１００μＭ、例えば１０〜１００μＭの範囲内で提供され、塩などをはじめとする任意の好適な形態で供給可能である。一般的には、および特に標準的反応（Ｉ）では、アスコルベートは、約０．１〜１０ｍＭ、例えば０．５〜５ｍＭのの範囲内で提供され、アスコルビン酸ナトリウムなどの塩などをはじめとする任意の好適な形態で供給可能である。アスコルベートは、標準的反応（Ｉ）において、またはより好ましくは改変型反応（ＩＩ）において、フェロシアン化カリウムなどの他の還元剤で置き換えることが可能である。 酵素活性は、１種以上の反応基質の消費または１種以上の反応産物の蓄積をモニターすることにより測定可能である。例えば、標準的反応（Ｉ）または改変型反応（ＩＩ）のいずれにおいても、酵素活性は、２−オキソ［１−１４Ｃ］グルタル酸の脱カルボキシル化に基づくＫｉｖｉｒｉｋｋｏおよびＭｙｌｌｙｌａにより報告された方法（1982, Methods Enzymol 82:245-304）の改変型を用いて測定可能である。この方法では、反応中に生成された放射性１４ＣＯ２を塩基含浸濾紙上に捕捉し、捕捉された放射活性を液体シンチレーション計数により測定する。特定の実施形態では、実施例２（後掲）に記載されているように標準的反応（Ｉ）における酵素活性を測定した。 他の実施形態では、標準的反応（Ｉ）内の酵素活性は、ヒドロキシル化ペプチドの生成により測定可能である。そのような測定では、ヒドロキシプロリンに特異的に結合する抗体を利用することが可能であり、修飾アミノ酸を特異的に認識するが未修飾アミノ酸を認識しない抗体は、当技術分野で公知である（例えば、trans-ヒドロキシプロリンポリクローナル抗体, QED Bioscience Inc., San Diego CAを参照されたい）。このほか、抗体は、ヒドロキシプロリンに関連するペプチドの領域を認識してそれに結合するが未修飾プロリンに関連するペプチドの同一領域に対してはそのような作用を示さないものであってもよい（例えば、Chanら (2002) J Biol Chem 277:40112-40117を参照されたい）。あるいはまた、ヒドロキシル化ペプチドに付随し非ヒドロキシル化ペプチドに付随しない活性を用いて、ペプチドヒドロキシル化を測定することが可能である。例えば、ヒドロキシル化ペプチドは、ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ Ｌｉｎｄａｕタンパク質（ｐＶＨＬ）には結合するが未修飾ペプチドには結合しないことが知られている（例えば、Ivan and Kaelin, 上掲; Jaakkolaら, 上掲を参照されたい）。従って、ペプチドヒドロキシル化のアッセイでは、ｐＶＨＬとペプチドとの相互作用を比較することが可能である（例えば、国際公開第ＷＯ／６９９０８号を参照されたい）。 さらに他の実施形態では、改変型反応（ＩＩ）内の酵素活性は、還元剤の還元形の消失または還元剤の酸化形の出現により測定可能である。任意の好適な還元剤を改変型反応（ＩＩ）で使用することが可能であり、本発明により使用されることが特に意図される還元剤は、アスコルベートおよびフェロシアン化物から選択可能である。例えば、改変型反応（ＩＩ）でアスコルベートを使用する場合、ＨＰＬＣなどを用いてアスコルベートの消失および／またはデヒドロアスコルベートの出現を測定することが可能である。特定の実施形態では、アスコルベートを限定した量で改変型反応（ＩＩ）に追加することが可能であり、ＤｉｌｉｂｅｒｔｏおよびＡｌｌｅｎ（1981, J Biol Chem 256:3385-3393）により報告された方法に変更を加えてＮＡＤＨからＮＡＤ＋への併行する酸化によりアスコルベートを反応中に再生する。このほか、該反応は、例えば、セミデヒドロ−アスコルベートからアスコルベートへのＮＡＤＨ依存性還元を触媒するセミデヒドロアスコルベートレダクターゼを含む。ＨＩＦ−ＰＨ活性は、３４０ｎｍの波長における吸光度の減少を引き起こすＮＡＤＨの消費により、間接的に測定される。フェロシアン化カリウムを用いて改変型反応（ＩＩ）を行う場合、分光測光法を用いて還元剤の酸化形（フェリシアン化カリウム）への変換を直接測定することが可能である。特定の実施形態では、実施例３（後掲）に記載されるように改変型反応（ＩＩ）における酵素活性を測定した。試験薬剤 ＥＧＬＮ酵素活性のモジュレーターを特定する方法で使用するための薬剤としては、天然もしくは合成の化学化合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。そのような化合物または薬剤は、植物、微生物、もしくは他の生物から得られるいくつかの特性付けられたかまたは特性付けされていない成分を含有する抽出物として取得可能であり、またはポリペプチドもしくは小分子（例えば、市販のコンビナトリアルライブラリーに由来する分子）の複合ライブラリーでありうる。化合物または薬剤はまた、候補分子のフォーカスト（focused）化学ライブラリーとして取得することも可能であり、例えば、キナーゼインヒビターに特異的なフォーカストライブラリーが報告されている（例えば、Grayら (1998) Science 281:533-538; およびChangら (1999) Chem Biol 6:361-375を参照されたい）。 本明細書中の開示内容に照らせば、本発明のこれらのおよび他の実施形態は、当業者には自明であろう。実施例 単に本発明の代表例であることが意図されたものであるが、以下の実施例を参照すれば、本発明についてさらなる理解が得られるであろう。これらの実施例は、単に、特許請求された本発明を説明するために提供されているにすぎない。本発明は、例示された実施形態によりその範囲が限定されるものではなく、これらは、単に本発明の個別の態様の具体例であることが意図されるにすぎない。機能的に等価な方法はいずれも、本発明の範囲内にある。本明細書中に記載されている態様以外の本発明の種々の変更態様は、以上の説明および添付の図面から当業者に自明なものとなろう。そのような変更態様は、添付の特許請求の範囲内に包含されるものとみなされる。実施例１：ペプチド 本発明で使用されるペプチドは、Mimotopes (San Diego CA)およびSynPep Corporation (Dublin CA)により合成されたものである。活性は、対照ペプチドＤＴＤ２０： ＤＴＤＬＤＬＥＭＬＡＰＹＩＰＭＤＤＤＦＱ （ＤＴＤ２０）を基準にして測定されたものである。 ＤＴＤ２０は、ＨＩＦ−１α Ｃ−ＯＤＤドメインに最も類似しているが、この領域内には、すべてのＨＩＦαファミリーメンバー間でかなりの相同性が存在する。本明細書中に提供されるいくつかのアッセイでは、ペプチドＤＬＤ１９： ＤＬＤＬＥＡＬＡＰＹＩＰＡＤＤＤＦＱＬ （ＤＬＤ１９）の存在下で活性を測定した。 ＤＬＤ１９では、アッセイ反応中にメチオニンが酸化される可能性があるため、メチオニン（Ｍ）残基をアラニン（Ａ）残基に変更した。アッセイで使用されるペプチドは、Ｎ末端アセチル基、Ｃ末端アミド基などのようなＮ末端および／またはＣ末端ブロック基をさらに含有しうる。基質ペプチドの存在下における酵素活性は、対照ペプチドＤＴＤ２０の存在下における酵素活性を基準にした酵素活性パーセントとして上記に提供されている。実施例２：標準的反応（Ｉ） すべての実験において、基質ターンオーバーなどにより測定された酵素活性パーセントは３０％未満であり、得られたデータがすべて直線範囲内にあることが保証された。ＥＧＬＮ酵素調製物（１０〜４００μＬ）、０．０５μモルのヒドロキシル化可能なペプチド基質、０．１μモルの２−オキソ［１−１４Ｃ］グルタル酸（１６０，０００ｄｐｍ）、１μモルのアスコルビン酸、６０μｇのカタラーゼ、および５０μモルのＨＥＰＥＳ緩衝剤を含有する１ｍＬの反応体積中（２５℃でｐＨ７．４に調整されている）で、標準的反応（Ｉ）における酵素活性を測定した。場合により、０．０４μモルのＦｅＳＯ４も反応混合物に添加した。反応を３７℃で２０分間行った。種々の反応において、アスコルベートを０．１〜１５ｍＭのフェロシアン化カリウムにより置き換えた。結果を表１（前掲）ならびに図３および４に提供する。実施例３：改変型反応（ＩＩ） ヒドロキシル化不可能なペプチドを使用したことおよび還元剤を反応に追加したこと以外は実施例２（前掲）に記載されるように、改変型反応（ＩＩ）における酵素活性を測定した。種々の改変型反応（ＩＩ）において、０．１〜５．０ｍＭのフェロシアン化カリウムを還元剤として使用し、反応混合物をインキュベートした後、反応溶液の１０５μＬアリコートを透明なプレートに移し、４０５ｎｍの波長で光学密度を測定した（図６参照）。アスコルベートを還元剤として使用する場合、ＨＰＬＣを用いてアスコルベートの消失および／またはデヒドロアスコルベートの出現を測定する。 本明細書に提示および説明されている態様以外の本発明の種々の変更態様は、以上の説明から当業者に自明なものとなろう。そのような変更態様は、添付の特許請求の範囲内に包含されるものとみなされる。 本明細書に引用されている参考文献はすべて、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。種々の生物種に由来するＨＩＦαサブユニットのアライメントを示す。種々の生物種に由来するＨＩＦαサブユニットのアライメントを示す。種々の生物種に由来するＨＩＦαサブユニットのアライメントを示す。種々の生物種に由来するＨＩＦαサブユニットのアライメントを示す。種々の生物種に由来するＨＩＦαサブユニットのアライメントを示す。種々の生物種に由来するＨＩＦαサブユニットのアライメントを示す。種々のＥＧＬＮファミリーメンバーの活性ドメインのアライメントを示す。ＥＧＬＮ１に関して順序付けられた、対照ペプチドを基準にした基質ペプチドの活性のプロットを示す。ＥＧＬＮ３に関して順序付けられた、対照ペプチドを基準にした基質ペプチドの活性のプロットを示す。酵素活性を保持しつつ行いうる基本基質構造の種々の修飾を示す。種々の濃度のフェロシアン化カリウムに対する２−オキソグルタレートのターンオーバー（％）を示す。２種類の異なる濃度のＥＧＬＮ１を用いたフェロシアン化カリウム濃度に対する２−オキソグルタレートのターンオーバー（％）、および改変型反応（ＩＩ）における当初のフェロシアン化物濃度に対するフェリシアン化物産物の生成速度を示す。 ＥＧＬＮ酵素活性の測定方法であって、以下のステップ： （ａ） ＥＧＬＮ酵素を、２−オキソグルタレートおよび１種のペプチドと、ＥＧＬＮ酵素活性に適した条件下で混合するステップ、および （ｂ） 該酵素の活性を測定するステップを含み、ここで該ペプチドは、配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｚ−Ｘ６を含み、該配列中、 Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は独立に、任意のアミノ酸より選択され、 Ｘ４は、イソロイシン、バリン、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、トレオニン、リジン、トリプトファン、システイン、アルパラギン、ヒスチジン、セリン、アラニン、グリシン、グルタミン酸、グルタミン、またはロイシンより選択され、 Ｘ５は、トレオニン、セリン、リジン、グルタミン、メチオニン、イソロイシン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸、フェニルアラニン、システイン、ロイシン、またはアラニンより選択され、 Ｘ６は、フェニルアラニンまたはチロシンより選択され、かつ Ｚは、プロリン、アゼチジン−２−カルボキシレート、３，４−デヒドロプロリン、またはｂ−チオプロリンより選択されるが、ただし、Ｚがプロリンである場合、Ｘ１およびＸ４のいずれもがロイシンであることはない、上記方法。 ＥＧＬＮ酵素活性をモジュレートする薬剤の特定方法であって、以下のステップ： （ａ） ＥＧＬＮ酵素を、試験薬剤、２−オキソグルタレートおよび１種のペプチドと、薬剤の非存在下ではＥＧＬＮ酵素活性に適した条件下で混合するステップ、 ここで該ペプチドは、配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｚ−Ｘ６を含み、該配列中、 Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は独立に、任意のアミノ酸より選択され、 Ｘ４は、イソロイシン、バリン、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、トレオニン、リジン、トリプトファン、システイン、アルパラギン、ヒスチジン、セリン、アラニン、グリシン、グルタミン酸、グルタミン、またはロイシンより選択され、 Ｘ５は、トレオニン、セリン、リジン、グルタミン、メチオニン、イソロイシン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸、フェニルアラニン、システイン、ロイシン、またはアラニンより選択され、 Ｘ６は、フェニルアラニンまたはチロシンより選択され、かつ Ｚは、プロリン、アゼチジン−２−カルボキシレート、３，４−デヒドロプロリン、またはｂ−チオプロリンより選択されるが、 ただし、Ｚがプロリンである場合、Ｘ１およびＸ４のいずれもがロイシンであることはない、 （ｂ） 該酵素の活性を測定するステップ、および （ｃ） 該薬剤の存在下での該酵素の活性を、該薬剤の非存在下での該酵素の活性と比較するステップを含み、ここで、該薬物の非存在下での該酵素の活性と比較しての該薬剤の存在下での該酵素の活性の変化が、ＥＧＬＮ活性をモジュレートする薬剤であることを示すものである、上記方法。 前記混合ステップで、アスコルベートおよびフェロシアン化カリウムからなる群より選択される還元剤がさらに含まれる、請求項１または２に記載の方法。 前記混合ステップで、鉄がさらに含まれる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。 ＥＧＬＮ酵素が配列番号３の配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。 ＥＧＬＮ酵素が配列番号２の配列を含む、請求項５に記載の方法。 ＥＧＬＮ酵素が、ＥＧＬＮ１、ＥＧＬＮ２、ＥＧＬＮ３、ならびにＥＧＬＮ１、ＥＧＬＩＮ２およびＥＧＬＮ３の活性断片からなる群より選択される、請求項６に記載の方法。 前記ペプチドが、配列番号８〜１０および１２〜９２からなる群より選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。 ＥＧＬＮ酵素が、ＥＧＬＮ１、ＥＧＬＮ１の活性断片、ＥＧＬＮ２、およびＥＧＬＮ２の活性断片からなる群より選択され、かつ前記ペプチドが配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｚ−Ｘ６を含み、該配列中、 Ｘ１は、チロシン、トリプトファン、メチオニン、イソロイシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アラニン、グルタミン酸、システイン、プロリン、グリシン、およびロイシンより選択され、 Ｘ２およびＸ３は独立に、任意のアミノ酸より選択され、 Ｘ４は、イソロイシン、バリン、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、トレオニン、リジン、トリプトファン、システイン、アルパラギン、ヒスチジン、セリン、アラニン、グリシン、グルタミン酸、グルタミン、またはロイシンより選択され、 Ｘ５は、トレオニン、セリン、リジン、グルタミン、メチオニン、またはアラニンより選択され、 Ｘ６は、フェニルアラニンまたはチロシンより選択され、かつ Ｚは、プロリン、アゼチジン−２−カルボキシレート、３，４−デヒドロプロリン、またはｂ−チオプロリンより選択されるが、ただし、Ｚがプロリンである場合、Ｘ１およびＸ４のいずれもがロイシンであることはない、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。 前記ペプチドが、配列番号８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２９、３１、６２、６３および７９からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。 ＥＧＬＮ酵素が、ＥＧＬＮ３またはＥＧＬＮ３の活性断片である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。 前記ペプチドが、配列番号８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２９、３０、３１、３２、３６、４１、４４、４５、４７、５０、５６、６２、６３、６９、７２、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９１および９２からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。 Ｚがアゼチジン−２−カルボキシレートである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。 前記ペプチドが、配列番号６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７３、７４、７５、７６，７７、および７８からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。 Ｚが３，４−デヒドロプロリンである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。 前記ペプチドが配列番号６２である、請求項１５に記載の方法。 Ｚがｂ−チオプロリンである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。 前記ペプチドが配列番号７２である、請求項１７に記載の方法。 ＥＧＬＮ活性の測定ステップが、反応により生じた二酸化炭素を測定することを含み、ここで、生じた二酸化炭素の量がＥＧＬＮ酵素の活性に正比例するものである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。 ＥＧＬＮ活性の測定ステップが、反応の間での前記還元剤のその酸化形態への変換を測定することを含み、ここで、酸化される還元剤の量がＥＧＬＮ酵素の活性に正比例するものである、請求項１〜７および１３〜１８のいずれか１項に記載の方法。 前記ペプチドが、少なくとも約２０アミノ酸長である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。 本発明は、ＥＧＬＮ活性を測定する方法を提供する。本発明はまた、前記方法での使用、およびＥＧＬＮ活性をモジュレートする薬剤を特定する方法の使用のための、新規ペプチドを提供する。【選択図】なし 配列表