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| タイトル： | 公開特許公報(A)_カーボンナノチューブとコラーゲンからなる培養用担体並びにその製造方法 |
| 出願番号： | 2007272027 |
| 年次： | 2008 |
| IPC分類： | C12N 5/06,A61L 27/00 |
特許情報キャッシュ
宇尾 基弘 亘理 文夫 久保木 芳徳 JP 2008237209 公開特許公報(A) 20081009 2007272027 20071019 カーボンナノチューブとコラーゲンからなる培養用担体並びにその製造方法 株式会社高研 591071104 田中 宏 100089406 樋口 榮四郎 100096563 宇尾 基弘 亘理 文夫 久保木 芳徳 JP 2007051840 20070301 C12N 5/06 20060101AFI20080912BHJP A61L 27/00 20060101ALI20080912BHJP JPC12N5/00 EA61L27/00 V 9 1 ＯＬ 10 4B065 4C081 4B065AA90X 4B065AA91X 4B065AC20 4B065BC41 4B065BC50 4B065CA44 4C081CD121 4C081CD34 4C081CF162 4C081DA01 4C081DA02 4C081DA03 4C081DA04 4C081DA05 4C081DB06 4C081DC03 4C081DC13 4C081EA06 本発明はカーボンナノチューブとコラーゲンからなる培養用担体並びにその製造方法に関し、特に生体内に埋植可能な培養用担体及びその製造方法に関する。 近年カーボンナノチューブ（Carbon Nanotube）に関する研究が盛んに行われている。カーボンナノチューブの特徴としては鋼鉄の数十倍の強さを持ち、かつしなやかで、薬品や高熱に耐性を持ち銀よりも電気を、ダイヤモンドよりも熱をよく伝える等の特性を有している。 カーボンナノチューブは炭素の普通の形態で蜂の巣状の平面的なシートが積み重なったものであるグラファイトのシートがチューブ状に丸まった構造をしている。発見当初のナノチューブは大小のチューブが入れ子のように数層重なったもの（多層カーボンナノチューブ）であったが、1層のもの（単層カーボンナノチューブ）も合成できるようになった。 カーボンナノチューブの利用分野としては伝導性を応用した半導体、強度を応用した自動車の車体、ラケット等の高強度材料、チューブに荷電した際に電子を放出する性質を応用したディスプレイ用電子源、チューブ内に薬剤等を封じ込めＤＤＳ担体、燃料電池への応用が考えられている。 一方カーボンナノチューブは炭素だけで出来ているために、細胞培養担体、埋植材料として優れていると予想され、その応用も検討されている。 特許文献1にはフラーレン、カーボンナノチューブ、及びフラーレンとカーボンナノチューブの複合体であるピーポット（Peapod）からなる群より選択される少なくとも一種類の炭素ナノ材料を含有する三次元細胞培養担体が開示されている。 特許文献2にはある種の界面活性剤あるいは水溶性高分子を用いて、カーボンナノチューブを含むナノカーボンの水可溶化剤が開示されている。 特許文献3にはカーボンナノチューブを含む無機物に疎水結合性吸着ポリマーをコーティングした細胞培養基質が開示されている。 特許文献4にはコラーゲンのみからなる培養担体の一例が示されている。特開2005−130759号公報JPWO 2004−06798号公報JPWO 2004−085606号公報特開平6−22744号公報 しかし特許文献1にあるようなカーボンナノチューブは炭素だけで出来ているために十分な細胞接着性を持たず、細胞培養担体として使用することはできなかった。そのために細胞接着物質をカーボンナノチューブにコーティングする（特許文献3）ことも行われているが、培養担体の基本骨格がカーボンナノチューブであるために、希望の形状をした担体を製造することは困難であった。 一方代表的な細胞外マトリックスであるコラーゲンの細胞培養担体は知られている（例えば特許文献4）が、場合によっては埋植材料として強度が不足するあるいは通電条件下で培養することができない等の問題が残っていた。そこでコラーゲンを希望の形状とした後に、表面にカーボンナノチューブをコーティングすることが望ましいと考えられるが、例えば特許文献2にあるカーボンナノチューブを含むナノカーボンの水可溶化剤が開示されているが、コラーゲン成型物にカーボンナノチューブをコーティングすることについては検討されていなかった。 そこで発明者らはカーボンナノチューブの特徴である強度を有し耐薬品性を有すると共に細胞接着性の良好な培養用担体、特に埋植可能な培養用担体について鋭意検討を行った結果、本発明を完成したもので、本発明の目的は強度を有し薬品に対して安定性を有する細胞接着性の良好な培養用担体、特に埋植可能な培養用担体を提供することを目的とする。 本発明の要旨は、カーボンナノチューブとコラーゲンとを構成原料として含む培養用担体であり、更に所望の形状のコラーゲン構造物の表面にカーボンナノチューブをコーティングさせることを特徴とする培養用担体の製造方法である。 本発明においては構成原料の一つであるコラーゲンが用いられる。また、製造方法においては、所望の形状のコラーゲン構造物としてはコラーゲンコーティング成型品、コラーゲンフイルム、コラーゲンスポンジ、コラーゲンチューブ、コラーゲン棒、コラーゲン綿、コラーゲン糸状及びコラーゲンコーティング容器等の何れでも良く、その表面にカーボンナノチューブをコーティングさせるのである。コーティングに際しては、カーボンナノチューブ分散液を使用することが好ましく、分散液を得るには界面活性剤を使用する。界面活性剤としては陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性イオン界面活性剤又は非イオン界面活性剤の何れでもよいが、特に陰イオン性界面活性剤であることが好ましい。 本発明に係る細胞培養用担体は細胞培養に最適な材料であるコラーゲンを用い、カーボンナノチューブを含むことにより担体の強度を高め通電性を付加することができ、細胞付着性の良好な細胞培養用担体であって、この細胞培養用担体は埋植材料としても使用が可能である。 また高い細胞付着性を持つ培養用担体を製造することができ、培養用担体の他に選択性細胞採取等の特徴を持った、培養用担体としての利用も可能である。 以下に本発明を詳細に説明する。 本発明は希望の形状に成型したコラーゲン構造物をまず準備した後に、カーボンナノチューブを表面にコーティングするが、コラーゲン構造物は特に制限はない。コラーゲンは大きく不溶性コラーゲンと可溶性コラーゲンの二つに分けることができる。不溶性コラーゲンは水溶液を調製できないために、可溶性コラーゲンに比べ成型性に劣り、できる形状が限定されるが、いずれのコラーゲンを原料とした構造物であっても本発明に用いることができる。具体的には凍結乾燥により調製されるコラーゲンスポンジ、又はコラーゲン溶液若しくは分散液を風乾し調製されるコラーゲンフイルム、或いはコラーゲン溶液若しくは分散液を凝固浴に押し出し調製されるコラーゲンからなる糸、棒、更にその糸を絡めた綿、または高濃度のコラーゲン溶液若しくは分散液を空気中に押し出しそのまま乾燥し調製される棒（ペレット）、コラーゲン分散液を漉くことで調製される紙、コラーゲンのパーティクルを凝固させ調製されるミクロスフェア等を用いることができる。また培養担体として、コラーゲンのみから成る構造物以外にコラーゲンコーティング成型品、具体的にはコラーゲンコートディッシュ、コラーゲンコーティングミクロスフェア等、プラスティク、多糖類等を骨格としたディッシュ等の容器、ミクロスフェア等の構造物表面にコラーゲンコーティングされたものを用いることができる。 コラーゲン構造物は形状を調製後にコラーゲンに架橋処理を行い、埋植後等の安定性を高めたものであっても使用することはできる。具体的には紫外線、γ線、乾熱の物理的処理、アルデヒド化合物、イソシアナート化合物、エポキシ化合物等の化学架橋剤、あるいはカルボジイミド化合物等の縮合剤による化学的処理法のいずれの処理構造物であっても用いることはできる。 またコーティングは基材に化学的結合を含まない吸着によるコーティングであっても、化学的結合を含むコーティングのいずれも用いることはできる。 このコラーゲン構造物表面にカーボンナノチューブを均一に接触させることによってコーティングすることが行われる。カーボンナノチューブは直径数ｎｍ〜数十ｎｍ、長さ数μｍ程度の、炭素６員環が連なったグラフェンシートを筒状に丸めた構造を有し、筒が１つの単層カーボンナノチューブと複数の筒が入れ子状に重なった多層カーボンナノチューブがある。このカーボンナノチューブを,界面活性剤を含む水溶液に加え、カーボンナノチューブの均一水分散液を調製する。このカーボンナノチューブ均一分散液にコラーゲン構造物を含浸、放置、あるいはコラーゲンコーティング容器の中に分散液を入れることでコラーゲン構造物表面あるいはコーティングされたコラーゲン表面にカーボンナノチューブをコーティングすることができる。用いられるカーボンナノチューブに制限はない。具体的には多層や単層のカーボンナノチューブ等を用いることができる。カーボンナノチューブの均一水分散液中のカーボンナノチューブの濃度は0．1ppm〜1％（10000ppm）が望ましく、これより濃度が低い場合には均一にコーティングすることが難しく、反対にこの濃度より高い場合には均一の水分散液を調製することが難しく均一にコーティングすることが難しくなる。 カーボンナノチューブの均一水分散液を調製するためには界面括性剤を添加する必要がある。用いられる界面活性剤としてはイオン系界面活性剤並びに非イオン性界面活性剤のいずれでも用いることができる。イオン系界面活性剤はさらに、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤および両性界面活性剤に分頬され、いずれのイオン系界面活性剤も用いることができる。陰イオン界面活性剤としては脂肪酸系、直鎖アルキルベンゼン系、コール酸塩系、高級アルコール系、アルファオレフィン系、ノルマルパラフィン系等を用いることができる。陽イオン界面活性剤としては第四級アンモニウム塩系、両性界面活性剤としてはアミノ酸系、ベタイン系、アミンオキシド系等を用いることができる。 非イオン系界面活性剤は大きくはエステル型、エーテル型、エステル・エーテル型及びその他に分類され、いずれの非イオン系界面活性剤を用いることができる。更に具体的にはショ糖の脂肪酸エステルからなるアクリル酸・メタアクリル酸アルキル共重合体、水溶性高分子鎖に親油基を有する化合物、オクテルフェノールに酸化エチレンを付加重合した化合物、ヒマシ油の二重結合に水素還元物、酸化エチレン付加重合物、ステアリルアルコールに酸化エチレンを付加した化合物、セタノールに酸化エチレンを付加重合した化合物、酸化プロピレンの重合物に酸化エチレンを付加重合した化合物、ポリグリセリンと脂肪酸とのエステル化またはポリグリセリンと油脂とのエステル交換反応生成物、モノオレイン酸ソルビタンに酸化エチレンを付加重合化合物、エチレングリコールのモノステアリン酸エステル化合物、モノステアリン酸グリセリンに酸化エチレンを付加重合した化合物、モノステアリン酸ソルビタンに酸化エチレンを付加重合物、モノパルミチン酸ソルピタンに酸化エチレンを付加重合物、モノラウリン酸ソルビタンに酸化エチレンを付加重合した化合物、ポリオキシエチレンソルビットのラウリン酸モノエステル化合物、ラウリン酸とジエタノールアミンとの縮合物等を用いることができる。 界面活性剤の濃度は使用する界面活性剤の種類によって異なるが、例えばコール酸ナトリウム水溶液の場合、約1wt％程度が望ましく、これより濃度が低い場合には均一に分散することが難しく、反対にこの濃度より高い場合には溶液の粘度が増加して、その後の処理に支障が生じる。 使用できるカーボンナノチューブに特に制限はなく、例えば先端が開いた、あるいは閉じたいずれのチューブも使用でき、巻き方としてアームチェア型、ジグザグ型、カイライ型等いずれも使用でき、また単層、多層、カーボンナノホーン、フラーレンと組み合わさったピーポットのいずれも使用することができる。 コラーゲン構造物を含浸する際にはコラーゲン構造物が熱変性を起こさず、また凍結しない温度であれば問題はない。含浸する時間は1時間以上であれば良い。 コラーゲン構造物に付着するカーボンナノチューブの量は、カーボンナノチューブ分散液中のカーボンナノチューブ濃度、時間により変わるが、当然カーボンナノチューブの濃度が高く、時間が長いほど付着量は増加する。 コーティングを終了したコラーゲン構造物は取り出され、乾燥し培養用担体として用いることができる。なお、使用に先立ち界面活性剤を生理的食塩水、培地等によりリンスし使用することが望まし。 以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお本発明は、下記実施例により限定されるものではない。実施例１ 1．0％アテロコラーゲン（pH3．0）溶液をトレーに分注後、密閉容器に先のトレーを入れる。その容器の中に更に3．0％のアンモニア水を入れ12時間室温で放置する。放置後流水にて形成したゲルを1晩洗浄後、凍結乾燥を行うことによりポアサイズ300〜500μｍのコラーゲンスポンジを得ることが出来る。得られたコラーゲンスポンジを、100ppmの多層ナノチューブ分散液（コール酸ナトリウム(東京化成製)1wt％水溶液に分散）に6時間浸漬後、水洗・乾燥し、コート体を得た。実施例２ コラーゲンコート培養ディッシュに、先と同様の100ppmの多層ナノチューブ分散液（コール酸ナトリウム1wt％水溶液に分散）を加え、6時間浸漬後、水洗・乾燥し、コラーゲンコートに更にカーボンナノチューブがコートされたディッシュを得た。 得られたカーボンナノチューブがコートされたディッシュに細胞分散液を播種、接着後細胞の接着率、及びその強度を測定した。なおこの場合、コラーゲン重量はコートされたカーボンナノチューブ重量の1／20であった。実施例３ 1％の酸性アテロコラーゲン溶液をトレーに、溶液の高さが5mmになるように分注する。その溶液を風乾させコラーゲンフイルムを得る。このフイルムを実施例1と同じ多層ナノチューブ分散液（コール酸ナトリウム1wt％水溶液に分散）に浸し、カーボンナノチューブがコートされたフイルムを得た。実施例４ 実施例3で作成したフイルムを24穴プレートに入れ、α−MEM（10％FBS，Antibiotics含む）にラット線椎芽細胞様細胞（MC3T3−El）を104個／mL密度の細胞分散液を播種。24時間培養してフイルムに細胞を接着後、常法により固定・乾燥しSEM（日立S−4000）にて観察した。写真を図1として示す。 また、細胞の接着率はコントロール（プレートそのもの）に比べて20％強であった。実施例５ 実施例1で作成したカーボンナノチューブをコーティングする前のコラーゲンスポンジとカーボンナノチューブをコーティングしたコラーゲンスポンジの圧縮強度の比較を行った。結果を以下の表1に示す。 試験方法は、縦横が約8mm、厚さ3mmの立方体サンプルを平板に置き、¢20mmのプローブで押し込み速度10mm／minでサンプルを圧縮し、圧縮弾性率を測定した。 なお測定値はサンプルの断面積で補正した。 実施例６ コラーゲンコート培養ディッシュに、多層ナノチューブ分散液（コール酸ナトリウム1wt％水溶液に分散）として多層カーボンナノチューブ(CNT Co. Ltd.製)の濃度が1ppm、10ppm、100ppm、1000ppmに調製した。この4種類の分散液をコラーゲンコート培養ディッシュに加え、３時間浸漬後、水洗・乾燥し、コラーゲンコートに更にカーボンナノチューブがコートされたディッシュを得た。 カーボンナノチューブがコートされた４種類のディッシュをSEMにて観察した。写真を図2に示す。 分散液の濃度が高くなるほど、付着物並びに凝集体が多くなり、付着量が十分で、凝集体の影響を受けない濃度は100ppmであった。 実施例７ コラーゲンコート培養ディッシュに、多層ナノチューブ分散液（コール酸ナトリウム1wt％水溶液に分散）として多層カーボンナノチューブ(CNT Co. Ltd.製)の濃度を100ppmに調製した。この分散液をコラーゲンコート培養ディッシュに加え、1時間、３時間、6時間と時間を変え浸漬後、水洗・乾燥し、コラーゲンコートに更にカーボンナノチューブがコートされたディッシュを得た。 カーボンナノチューブがコートされた３種類のディッシュをSEMにて観察した。写真を図３に示す。 分散液の浸漬時間が長くなるほど、付着物並びに凝集体が多くなり、付着量が十分で、凝集体の影響を受けない浸漬時間は3時間であった。 実施例８実施例７の浸漬時間3時間で得られたコラーゲンコート培養ディッシュと対象として、多層ナノチューブをコートしていないコラーゲンコートディッシュを用いて培養を行った。 ラット線維芽細胞（MC3T3-E1細胞）を用いて、通常の方法により1から3日間培養した。 細胞増殖率を図4に示すが、コラーゲンコートディッシュに比べ、多層ナノチューブコートディッシュはやや低い結果であった。培養3日後、トリプシンを用いて細胞の剥離（トリプシン、0.02%EDTAにより6分間の処理を行う）を行ったところ(図５)、コラーゲンコートディッシュに比べ、多層ナノチューブコートディッシュでは細胞がより強く付着していた。細胞の接着していた面の、光学顕微鏡写真像を図5に示す。実施例４のSEM写真実施例６のSEM写真実施例７のSEM写真実施例８の細胞増殖率を示した図実施例８の培養３日目の細胞を剥離した際の様子を示した光学顕微鏡写真 カーボンナノチューブとコラーゲンとを構成原料として含む培養用担体。 カーボンナノチューブが多層カーボンナノチューブであることを特徴とする請求項１に記載の培養用担体。 コラーゲンがアテロコラーゲンであることを特徴とする請求項1または２に記載の培養用担体。 培養用担体が生体内に埋植可能であることを特徴とする請求項１〜３の何れかの項に記載の培養用担体。 コラーゲンを構成原料として含む成型物のコラーゲン表面に、カーボンナノチューブをコーティングさせたことを特徴とする請求項１〜４の何れかの項に記載の培養用担体。 カーボンナノチューブは界面活性剤水溶液を用いてカーボンナノチューブの濃度が0.1ppm〜10000ppmになるように分散させた分散液を用いることを特徴とする請求項1〜５の何れかの項に記載の培養用担体。 界面活性剤が陰イオン性界面活性剤であることを特徴とする請求項６に記載の培養用担体。 陰イオン性界面活性剤がコール酸ナトリウムであることを特徴とする請求項６または７に記載の培養用担体。 コラーゲンよりなるフイルム、スポンジ、チューブ、棒、綿、糸状またはコラーゲンコーティング容器の何れかの表面にカーボンナノチューブ分散液をコーティングさせたことを特徴とする特許請求項１〜８の何れかの項に記載の培養用担体の製造方法。 【課題】、担体の強度を高め通電性を付加し生体内に埋植可能な細胞担体の提供【解決手段】カーボンナノチューブとコラーゲンとを構成原料として含む埋植可能な培養用担体である。【選択図】図１