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| タイトル： | 公開特許公報(A)_脱細胞処理液、脱細胞化組織の調製方法、移植片、及び培養部材 |
| 出願番号： | 2007217099 |
| 年次： | 2009 |
| IPC分類： | A61L 27/00,A61K 35/12,A61P 43/00,C12N 5/06 |
特許情報キャッシュ
岸田 晶夫 藤里 俊哉 木村 剛 舩本 誠一 JP 2009050297 公開特許公報(A) 20090312 2007217099 20070823 脱細胞処理液、脱細胞化組織の調製方法、移植片、及び培養部材 国立大学法人 東京医科歯科大学 504179255 学校法人常翔学園 503420833 正林 真之 100106002 岸田 晶夫 藤里 俊哉 木村 剛 舩本 誠一 A61L 27/00 20060101AFI20090213BHJP A61K 35/12 20060101ALI20090213BHJP A61P 43/00 20060101ALI20090213BHJP C12N 5/06 20060101ALI20090213BHJP JPA61L27/00 VA61K35/12A61P43/00 105C12N5/00 E 8 1 ＯＬ 11 4B065 4C081 4C087 4B065AA93X 4B065BA24 4B065BD42 4B065CA44 4C081AB11 4C081BA12 4C081CD34 4C081DA01 4C081EA11 4C087AA01 4C087AA02 4C087AA05 4C087BB63 4C087CA06 4C087NA06 4C087ZB21 本発明は、動物由来の原組織を脱細胞化する脱細胞処理液、この脱細胞処理液を用いた脱細胞化組織の調製方法、並びにこの脱細胞化組織を備える移植片及び培養部材に関する。 他人の生体組織由来の移植片を移植する場合、被移植者側組織による移植片の拒絶反応が問題である。そこで、このような問題の解決手段として、人工組織の開発が待望されている。 人工組織の素材としては、種々の合成高分子が試みられている。しかし、これら素材と生体組織との適合性が低いため、移植片と生体組織との接合部位における脱落や感染症が発生する場合がある。 そこで、生体組織との適合性を向上するべく、生体組織から細胞を除去して残存する支持組織である脱細胞化組織を、移植片として使用する技術が近年開発された。細胞成分の除去、つまり脱細胞化は、一般に、界面活性剤を含有する処理液を用いて原組織を洗浄することで行われる。 従来、界面活性剤としては、ＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（登録商標）、ＰＥＧ、ＰＥＯ等の人工化合物や、コール酸ナトリウム等の生体由来の化合物が使用されている（例えば、特許文献１、２参照）。特表２００５−５１４９７１号公報特表２００６−５０７８５１号公報 しかし、前述の人工化合物の多くは、容量依存的な細胞毒性を有することが示されているため、人体に用いる場合には除去することが望ましい。この結果、移植片の製造効率が低下する。また、生体組織を構成するコラーゲン等の生体内物質との適合性が不明であるため、移植後に予期せぬ症状が発生することも懸念される。 一方、生体由来の化合物は水等の溶媒への溶解度が低いため、処理液中の化合物含量が小さくなる。このため、処理液に接触した原組織への化合物の浸透が不充分になり、脱細胞化が不充分になる。あるいは、原組織への化合物の浸透に長時間が必要となり、移植片の製造効率が低下する。 本発明は、以上の実情に鑑みてなされたものであり、安全性及び製造効率を向上でき且つ充分に脱細胞化できる脱細胞処理液、この脱細胞処理液を用いた脱細胞化組織の調製方法、並びにこの脱細胞化組織を備える移植片及び培養部材を提供することを目的とする。 本発明者らは、血清又は血清誘導体が優れた浸透性及び脱細胞化能を有することを見出し、本発明を完成するに至った。具体的には、本発明は以下のようなものを提供する。 （１） 動物由来の原組織を脱細胞化する脱細胞処理液であって、 動物由来の血清又は血清誘導体を有効成分とする脱細胞処理液。 （１）の発明によれば、血清又は血清誘導体を有効成分としたので、原組織が迅速且つ充分に脱細胞化される。また、血清又は血清誘導体は動物由来であるため、人工化合物に比べ生体適合性が高い。このため、血清又は血清誘導体の洗浄が必要でなく、必要であっても短時間で済む。 従って、移植片の製造効率及び安全性を大幅に向上でき且つ充分に脱細胞化できる。 なお、「血清又は血清誘導体を有効成分とする」とは、安全性、製造効率、及び脱細胞化能が許容範囲を超えて阻害されない限りにおいて、血清又は血清誘導体以外の任意成分を含有してもよいことを指す。また、「血清誘導体」とは、安全性、製造効率、及び脱細胞化能が許容範囲を超えて阻害しない処理を血清に施したものを指す。 （２） 前記血清誘導体は、血清が非働化処理されたものである（１）記載の脱細胞処理液。 血清中には、液性免疫を担う主要成分である補体が存在する。処理液中の補体量が過剰であると、脱細胞化組織内に相当量の補体が残存し、移植後に炎症が生じること等が懸念される。 そこで（２）の発明によれば、血清を非働化処理したので、血清中の補体が不活化される。よって、移植後の炎症等が抑制されるので、安全性をより向上できる。 （３） 前記血清誘導体は、血清が液体中で超高静水圧を印加されたものである（１）又は（２）記載の脱細胞処理液。 血清中には様々な異物が存在すると考えられる。処理液中の異物量が過剰であると、脱細胞化組織内に相当量の異物が残存し、移植後に何らかの不具合が生じることが懸念される。一方、異物を除去するために人工的化合物等を用いて処理すると、血清誘導体自体の安全性が損なわれるので、脱細胞化組織の安全性の低下が懸念される。 そこで（３）の発明によれば、血清に液体中で超高静水圧を印加したので、安全性をより向上できる。 （４） 前記超高静水圧は、１０００気圧以上である（３）記載の脱細胞処理液。 原組織に印加される圧力が不足すると、原組織内に存在する常在菌の破壊が不充分となり、調製された脱細胞化軟組織に常在菌が残存するおそれがある。 そこで（４）の発明によれば、超高静水圧を１０００気圧以上としたので、常在菌が充分に破壊され、脱細胞化組織への常在菌の残存が抑制される。よって、安全性をより向上できる。 （５） 動物由来の原組織が脱細胞化された脱細胞化組織の調製方法であって、 前記原組織を、（１）から（４）いずれか記載の脱細胞処理液中に含浸する手順を有する調製方法。 （６） 動物に移植される移植片であって、 （５）記載の調製方法で調製された脱細胞化組織を備える移植片。 （７） 前記脱細胞化組織上に位置し、前記動物において前記原組織に隣接する隣接組織を更に備える（６）記載の移植片。 （８） （５）記載の調製方法で調製された脱細胞化組織を備え、前記動物において前記原組織に隣接する隣接組織の細胞を培養するために用いられる培養部材。 本発明によれば、血清又は血清誘導体を有効成分としたので、原組織が迅速且つ充分に脱細胞化される。また、血清又は血清誘導体は動物由来であるため、人工化合物に比べ生体適合性が高い。このため、血清又は血清誘導体の洗浄が必要でなく、必要であっても短時間で済む。従って、移植片の製造効率及び安全性を大幅に向上でき且つ充分に脱細胞化できる。 以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明を限定することを意図するものではない。 ＜脱細胞処理液＞ 脱細胞処理液は、動物由来の血清又は血清誘導体を有効成分として含有する。 ［血清］血清が由来する動物としては、特に限定されず、ヒト、ウシ、ブタ等が挙げられる。ヒトへの移植片を作製するためには、補体等による炎症反応を抑制できる点で、ヒト由来の血清が好ましい。 ［血清誘導体］ 血清誘導体は、前述の通り、安全性、製造効率、及び脱細胞化能が許容範囲を超えて阻害しない処理を血清に施したものを指す。このような処理としては、特に限定されないが、非働化、超高静水圧の印加、希釈等が挙げられる。なお、オートクレーブ等の高温高圧滅菌やγ線照射を長時間に亘って行うことは、上記処理には該当しない。 （非働化） 非働化は、加熱によって補体を不活化する処理をいい、通常、約５６℃で約３０分間加熱すればよい。非働化によれば、移植後の炎症等が抑制されるので、安全性をより向上できる。 （超高静水圧の印加） 超高静水圧の印加は、血清に液体中で超高静水圧を印加することで、原組織内の細胞、常在菌、ウイルスを破壊する処理である。かかる処理によれば、安全性が極めて高レベルに確保されるので、輸血用途には不適切な期間経過後の血清も使用できる。かかる血清は安価に入手できるため、安全性を維持できつつ移植片の製造コストを低減できる。 超高静水圧は、血清に存在する常在菌を破壊できるとされる静水圧を指し、具体的には１０００気圧以上であることが好ましい。また、超高静水圧は、血清に存在する細菌を充分に破壊できる点で４０００気圧以上であることがより好ましく、ウイルスを充分に破壊できる点で６０００気圧以上、例えば１００００気圧であることが更に好ましい。 具体的な手順としては、例えば、まず、水不透過性フィルムの袋内に血清を満たす。そして、内部に気体が残留しないように留意しつつ、袋を厳重に密閉する。この袋を、超高静水圧処理装置（例えば、「Ｄｒ．ＣＨＥＦ（型式）」（神戸製鋼所社製））のチャンバー内の液体中に設置し、装置を作動させる。 なお、印加時間は、所望の細胞破壊性が得られる限りにおいて特に限定されないが、通常１０分〜３０分程度でよい。 この際、血清の温度を、超高静水圧における血清の融点以上に保持することが好ましい。これにより、超高静水圧まで昇圧された条件においても、血清の凝固が抑制され、調製される血清の特性が損なわれるのを抑制できる。 具体的な手順としては、まず、予め設定した超高静水圧値における血清の融点を算出する。そして、超高静水圧処理装置を、そのチャンバー内温度が算出した融点以上となるように制御すればよい。血清の温度は、一定値に固定してもよいし、血清の融点以上の範囲で変動させてもよい。 また、血清に印加される印加圧が、血清の融解圧以上になることを制限する手順である。印加圧の昇圧や降圧の開始時には、瞬間的に血清の温度が急変し、血清の特性が大きく損なわれる場合がある。そこで、血清の融解圧を予め算出し、特に印加圧の昇圧及び／又は降圧の速度を所定値以下に低減することで、血清温度の急変を抑制する。これにより、昇圧及び降圧の過程での血清の凝固が抑制され、血清の特性の低下をより抑制できる。 なお、以上の非働化及び超高静水圧の印加は除去しようとする目的が異なるため、これら双方を組み合わせることで、安全性及び脱細胞化能を向上できる場合もある。 （希釈） 希釈は、水又は緩衝液を用いて行われる。血清（特にヒト血清）は高価であることから、血清が希釈された血清誘導体を用いることで、移植片の製造コストを低減できる。 なお、緩衝液としては、特に限定されず、ＰＢＳ水溶液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液等の従来公知の緩衝液が使用できる。 希釈倍率は、脱細胞化すべき原組織の厚み、特性等に応じて、許容される時間内に原組織内部まで脱細胞化できるよう、適宜設定されてよい。具体的には、心膜、羊膜、及び皮膚等の軟組織を脱細胞化するときには、血清濃度が０．１〜２質量％となるように希釈すればよく、血管、軟骨等の中程度の軟組織を脱細胞化するときには、血清濃度が２〜１０質量％となるように希釈すればよく、心筋等の嵩高い組織や骨等の硬組織を脱細胞化するときには、血清濃度が２０質量％となるように希釈すればよい。 以上の血清又は血清誘導体が優れた浸透性及び脱細胞化能を有する機構は、次のように推測される。血清は生体内で組織内の不要な細胞を適宜除去する役割を担い、様々な成分がバランス良く配合されている結果、アルブミンやコール酸ナトリウムを初めとする既知の活性成分を多量に含有する。実際、アルブミン及びコール酸ナトリウムの血清中濃度を、人工的条件で達成することは困難である。しかも、血清は、上記既知の成分のみならず未知の活性成分も含有する。これら未知成分及び既知成分の絶妙な相乗作用によって、優れた浸透性及び脱細胞化能が付与されるものと推測される。 ＜脱細胞化組織の調製方法＞ 以上の脱細胞処理液は、脱細胞化組織の調製に使用される。具体的には、原組織を脱細胞処理液中に含浸する。脱細胞処理液は、原組織内に迅速に浸透して原組織内の細胞を破壊し、細胞成分を溶解する。脱細胞処理液を対流もしくは循環させることによって、細胞残渣の除去が促進され、残存する残渣による免疫反応等を抑制できる。また、細胞残渣の除去を促進するべく、水もしくは緩衝液を用いて洗浄する工程を更に設けてもよい。 前述のように原組織としては、特に限定されず、例えば、心膜、羊膜、及び皮膚等の軟組織、血管、軟骨等の中程度の軟組織、心筋等の嵩高い組織や骨等の硬組織が挙げられる。含浸時間は、使用する原組織及び脱細胞処理液の組み合わせに応じて、適宜設定すればよい。 また、原組織は、液体中で超高静水圧を印加されたものであっても、されていなくてもよい。原組織の種類にもよるが、超高静水圧が印加されていない原組織の方が、本発明の脱細胞処理液を用いた脱細胞化が充分になされる場合もある。ただし、超高静水圧の印加は、原組織中に混在する異常プリオンやレトロウイルスの除去には有効であると考えられる。 このようにして調製される脱細胞化組織の保存方式は、滅菌状態である限りにおいて特に限定されず、冷凍状態、液体内での湿潤状態、又は乾燥状態であってよい。保存方式が限定されないことは、本発明の脱細胞化組織の有利な点である。 ＜移植片＞ このように調製される脱細胞化組織は、動物に移植される移植片の構成物として有用である。即ち、本発明の移植片は、前述の脱細胞化組織を備える。また、移植片は、脱細胞化組織が由来する原組織が動物体内において隣接していた隣接組織を、脱細胞化組織上に備えてよい。例えば、脱細胞化組織が由来する原組織が角膜であった場合、隣接組織は角膜上皮又は角膜内皮となる。 ＜培養部材＞ 本発明の脱細胞化組織は、隣接組織の細胞を培養するために用いられる培養部材としても有用である。即ち、本発明の培養部材は、前述した脱細胞化組織を備えるものであり、この脱細胞化組織上に隣接組織由来の細胞を載置し、適切な条件下で培養することで、特別な装置を使用する必要なく且つ感染を抑制しつつ、細胞培養を行うことができる。 食用ブタ養殖場からブタ由来の大動脈を購入し、４℃にて搬送した。この大動脈を１ｃｍずつに輪切りし、ＰＢＳ溶液が満たされたポリエチレン製フィルムの袋内に湿潤させた。この袋を、「Ｄｒ．ＣＨＥＦ」（神戸製鋼所社製）のチャンバー内に載置し、温度を２５℃に保持しつつ、６０００気圧の静水圧を１０分間印加した。この間、昇圧及び降圧速度がそれぞれ２０００気圧／分となるように、「Ｄｒ．ＣＨＥＦ」を制御した。印加後の大動脈（原組織）を清潔操作で取り出し、以下Ａ〜Ｄに示す脱細胞処理液中に含浸した（図１参照）。なお、図１に示されるように、処理液Ｄのみ白濁していた。 処理液Ａ：１００％ＦＢＳ 処理液Ｂ：１００％ＦＢＳに１０℃で１００００気圧の超高静水圧を１０分間印加した後、３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して得られた上清 処理液Ｃ：１００％ＦＢＳを５６℃にて３０分間加熱した後、３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して得られた上清 処理液Ｄ：１００％ＦＢＳを１２１℃、２気圧で高温加熱滅菌した後、３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して得られた上清 ２日ごとに処理液を交換しながら、１１日間にわたって含浸を続けた。その後、大動脈を採取し、その切片について常法に従ってヘマトキシリン・エオシン染色を行った。この結果を図２に示す。図中、斑点状に見えるものが細胞を示す。なお、図２における対照とは、処理液Ａ〜Ｄに含浸する前の大動脈である。 図２に示されるように、処理液Ａ〜Ｃに含浸させた大動脈では、７日後から細胞が減少し始め、１１日後には大部分の細胞が消滅していた。これにより、動物由来の血清又は血清誘導体を含有する処理液を用いることで、１１日間という比較的短期間において脱細胞化を充分に行うことができることが確認された。 一方、処理液Ｄに含浸させた大動脈では、１１日後においても細胞があまり減少していなかった。このことから、血清に対して高温高圧滅菌処理を行うことは、血清の脱細胞化作用を損なう場合があることが確認された。 ６０００気圧の静水圧の印加を行わなかった大動脈を、上記と同様の条件で処理液Ｃに含浸させた。含浸後の大動脈を採取し、その切片について常法に従ってヘマトキシリン・エオシン染色を行った。この結果を図３に示す。 図３に示されるように、大動脈中の細胞は、その大部分が含浸５日後に消滅していた。図２と比較してみると分かるように、５日は、６０００気圧の静水圧の印加を行った大動脈における１１日よりもはるかに短い。よって、超高静水圧が印加されていない原組織の方が、本発明の脱細胞処理液を用いた脱細胞化が充分になされる場合もあることが確認された。本発明の実施例に係る脱細胞処理液の使用状態を示す図である。本発明の実施例に係る脱細胞処理液を用いたときの、原組織の脱細胞化の状態を示す図である。本発明の実施例に係る脱細胞処理液を用いたときの、別の原組織の脱細胞化の状態を示す図である。 動物由来の原組織を脱細胞化する脱細胞処理液であって、 動物由来の血清又は血清誘導体を有効成分とする脱細胞処理液。 前記血清誘導体は、血清が非働化処理されたものである請求項１記載の脱細胞処理液。 前記血清誘導体は、血清が液体中で超高静水圧を印加されたものである請求項１又は２記載の脱細胞処理液。 前記超高静水圧は、１０００気圧以上である請求項３記載の脱細胞処理液。 動物由来の原組織が脱細胞化された脱細胞化組織の調製方法であって、 前記原組織を、請求項１から４いずれか記載の脱細胞処理液中に含浸する手順を有する調製方法。 動物に移植される移植片であって、 請求項５記載の調製方法で調製された脱細胞化組織を備える移植片。 前記脱細胞化組織上に位置し、前記動物において前記原組織に隣接する隣接組織を更に備える請求項６記載の移植片。 請求項５記載の調製方法で調製された脱細胞化組織を備え、前記動物において前記原組織に隣接する隣接組織の細胞を培養するために用いられる培養部材。 【課題】安全性及び製造効率を向上でき且つ充分に脱細胞化できる脱細胞処理液等を提供すること。【解決手段】動物由来の原組織を脱細胞化する脱細胞処理液は、動物由来の血清又は血清誘導体を有効成分とする。血清誘導体は、血清が非働化処理されたもの又は液体中で超高静水圧を印加されたものであることが好ましい。かかる脱細胞処理液に原組織を含浸することで、脱細胞化組織が調製される。【選択図】図１