生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公開特許公報(A)_ＩｇＡ抗体測定方法 |
| 出願番号： | 2007192364 |
| 年次： | 2009 |
| IPC分類： | G01N 33/543,G01N 33/53 |
特許情報キャッシュ
小林 丘 山南 隆徳 土田 真也 宮村 達男 石川 晃一 JP 2009031001 公開特許公報(A) 20090212 2007192364 20070724 ＩｇＡ抗体測定方法 大日精化工業株式会社 000002820 国立感染症研究所長 591222245 近藤 利英子 100098707 吉田 勝広 100077698 梶原 克哲 100146042 小林 丘 山南 隆徳 土田 真也 宮村 達男 石川 晃一 G01N 33/543 20060101AFI20090116BHJP G01N 33/53 20060101ALI20090116BHJP JPG01N33/543 545JG01N33/53 NG01N33/53 UG01N33/543 545S 9 ＯＬ 15 本発明は、免疫アッセイ法に関し、より詳しくは、ＥＬＩＳＡ法で目的物質を測定する際に起こる非特異的反応の発生の程度を評価する方法に関する。 １９７０年代以降、遺伝子工学を中心としてライフサイエンス分野の研究が急速に進展している。また、研究の応用についても進展が著しく、免疫学分野では感染症予防へ向けて、新しいワクチンや抗生物質の開発が精力的に進められている。近年は我が国でも、海外旅行者の数や生鮮食品の輸入量が増加し、これに伴って我が国内での感染症の発生増加が懸念されている。また、発展途上国では依然として感染症が蔓延しており、今後の免疫学分野の研究、応用の重要性が高まっている。 ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ−Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法は、酵素で標識した抗原又は抗体を用いて、試料中に含まれる微量の目的物質を検出する方法であり、免疫学研究の根幹を成す免疫アッセイ法の中でも代表的な方法である。 ＥＬＩＳＡ法には、直接吸着法、サンドイッチ法及び競合法などの種々の変法がある。これらの変法の中でもサンドイッチ法は、サンプル中の目的物質を高感度で検出・定量できるという利点があり、広く使用されている。 サンドイッチ法においては、目的物質は、抗原でも抗体であってもよい。抗体を目的物質とする場合、まず当該抗体（目的物質）の抗原を含む溶液を固相（例えば、ポリスチレン製のプレート）に作用させ、抗原を固相に吸着させる。次いで、目的物質（抗体）を含む試料溶液を添加して、固相−抗原−目的物質の複合体を形成させる。次にこの複合体に、目的物質の別のエピトープに特異的に結合する標識抗体を作用させる。そして、標識抗体の酵素活性を測定することにより、目的物質を検出、定量することができる。 ＥＬＩＳＡ法は、目的物質の検出、定量のための非常に優れた方法であるが、ＥＬＩＳＡ法の実施に際して、試料中の目的物質以外の夾雑物に起因する非特異的反応により、目的物質の検出、定量が妨げられることがある。そのため、上記の例示したサンドイッチ法においては、抗原を含む溶液を固相表面に吸着させた後、固相の表面を抗原−抗体反応に関与しないタンパク質などで被覆するブロッキングと呼ばれる作業が行なわれる。 ブロッキングに使用するブロッキング剤についても多くの研究、開発がなされており、例えば、特許文献１は、非特異的反応を抑制するためにポリペプチドを使用する方法を開示する。また、特許文献２は、非特異的反応を抑制するために、還元変性アルブミンをブロッキング剤として使用する方法を開示する。 また、ＥＬＩＳＡプレートについても多くの改良がなされ、多くの種類のプレートが販売されている。例えば、目的物質の検出感度を向上させるために、固相表面の吸着性を向上させたプレートが販売されている。しかし、プレート表面の吸着性が高くなると、ブロッキングをしたにも拘らず、標識抗体が固相やブロッキング剤に直接結合し、又は試料中の夾雑物を介して固定化され、試料中に目的物質が存在しなくても酵素活性を示すことがある。試料中の目的物質の存在量が少ない場合、相対的に夾雑物の割合が増すため、このような現象が問題となる。 近年、粘膜での免疫応答を評価するためにＥＬＩＳＡ法を用いて免疫グロブリンの一種であるＩｇＡの検出が行なわれているが、ＩｇＡは試料中の存在量が少なく、非特異的反応の発生が問題となっている。このため、ＥＬＩＳＡ法に用いるブロッキング後のプレートにおいてこのような非特異的反応が抑制されているか否かを評価する方法が求められている。また、非特異的反応の抑制（発生）の程度は、プレートの種類やプレートとブロッキング剤との組み合わせによっても異なるため、非特異的反応の発生しにくいプレート及びプレートとブロッキング剤との組み合わせを選択するための方法が求められている。特開昭５８−１４４７４８号公報特開平８−１７６１９５号公報 従って、本発明の目的は、上述した従来技術の問題点を解決し、ＥＬＩＳＡ法に用いるブロッキング後のプレートについて、非特異的反応を抑制できているか否かを評価する方法を提供することである。 上記目的は以下の本発明により達成される。すなわち、本発明は、ＥＬＩＳＡプレートの一部のウェルを抗原でコーティングする工程、当該コーティング後のＥＬＩＳＡプレートに、ブロッキング剤を作用させる工程、当該ブロッキング後のＥＬＩＳＡプレートに、上記抗原と特異的に相互作用する免疫グロブリンを作用させる工程、当該免疫グロブリンを作用させたＥＬＩＳＡプレートに、上記免疫グロブリンと特異的に相互作用する２次抗体を作用させる工程、当該２次抗体を作用させたＥＬＩＳＡプレートに、酵素標識した３次抗体を作用させる工程、当該３次抗体を作用させたＥＬＩＳＡプレートに、上記酵素の基質を添加し酵素反応をさせる工程及び、上記抗原をコーティングしたウェルの酵素反応の程度と抗原をコーティングしていないウェルの酵素反応の程度とを比較する工程、を包含することを特徴とするＥＬＩＳＡプレートにおける非特異的反応の発生の程度を評価する方法を提供する。 上記評価方法においては、抗原が卵白由来アルブミン、ｅｎｖタンパク質、ジフテリアトキソイド又はエイズウイルスであること、ブロッキング剤がウシ血清アルブミン、カゼイン、スキムミルク又はゼラチンであること、免疫グロブリンがＩｇＡであること、及び、上記抗原を接種したマウスの血液から得たものであること、２次抗体がビオチン標識ヤギ抗マウスＩｇＡであること、３次抗体がアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジンであること、酵素の基質がｐ−ニトロフェニルリン酸であること、及び、酵素反応の程度を吸光度から求めることが好ましい。 本発明によれば、ＥＬＩＳＡ法に用いるブロッキング後のプレートについて、非特異的反応の発生の程度を評価する方法が提供される。また、この評価方法を用いることにより、各種ＥＬＩＳＡプレートの固有の非特異的反応抑制能力及びプレートとブロッキング剤との組み合わせによる非特異的反応の発生を評価することができる。 次に好ましい実施の形態を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。 なお、本発明中において「部」又は「％」とあるのは、特に断りのない限り質量基準である。 本発明による評価の対象となるＥＬＩＳＡプレートは、特に制限されず、市販の種々のＥＬＩＳＡプレートに適用することができる。 本発明の評価方法では、まず、ＥＬＩＳＡプレートの一部のウェルに抗原を吸着（コーティング）させる。このコーティングは、通常、抗原を含む溶液をウェルに添加することにより行なう。市販のＥＬＩＳＡプレートは通常９６個のウェルを有するので、このうちの一部に抗原を含む溶液を添加し、残りのウェルは溶液を添加しないでおく。 上記抗原は、特に制限されず、ＥＬＩＳＡ法による検出対象に応じて自由に選択することができる。このような抗原の例として、卵白由来アルブミン、ｅｎｖタンパク質、ジフテリアトキソイド、エイズウイルスなどを挙げることができる。これらの中でも、卵白由来アルブミンは、安全性が高く、さらに水溶性が高く取り扱いが容易で、安価に入手できるので好ましい。 次いで、抗原をコーティングしたプレートを洗浄し、他の物質がプレートに吸着しないようにブロッキングを行なう。ブロッキングは、コーティングをしたウェルとコーティングをしていないウェルの両方にブロッキング剤を含む溶液を添加することにより行なう。 ブロッキング剤は、上記抗原及び後述する免疫グロブリンと特異的な相互作用をしないものを用いる必要がある。ブロッキング剤として好適に使用される物質の例としては、ウシ血清アルブミン、カゼイン、スキムミルク、ゼラチンなどを挙げることができ、ブロッキング溶液としては、０．１〜１０％ウシ血清アルブミン溶液、０．１〜１％カゼイン溶液として使用することができる。 次いで、ブロッキングをしたプレートを洗浄し、上記抗原と特異的に相互作用する免疫グロブリンを含む溶液を各ウェルに添加し、抗原に結合させる。本発明の使用に適する免疫グロブリンとしては、特に制限はなく、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭおよびＩｇＤなどを挙げることができる。このような免疫グロブリンは、例えば、抗原をマウスに接種し、その２〜６週間後にマウスから血液を採取し、その血液を遠心分離して得た上清を、抗原に対して特異的に相互作用するＩｇＡを含む溶液として得ることができる。上記マウスとしては、粘膜へのＩｇＡ分泌がなく、血液のみにＩｇＡが分泌されるという理由から、多量体免疫グロブリンレセプターノックアウトマウス（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ）を用いることが好ましい。また、上記接種の方法としては、経鼻接種、経肺接種、注射による接種を挙げることができるが、動物愛護の観点と、実験の容易さという理由から経鼻接種によることが好ましい。 次いで、免疫グロブリンを作用させたプレートを洗浄し、２次抗体を各ウェルに作用させる。当該２次抗体は、上記免疫グロブリンと特異的に相互作用する抗免疫グロブリン抗体である必要がある。このような２次抗体としては、免疫グロブリンがＩｇＡである場合には、例えば、ビオチン標識ヤギ抗マウスＩｇＡ、アルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＡ、西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスなどを挙げることができ、高感度で微量成分を測定できるという理由から、ビオチン標識ヤギ抗マウスＩｇＡを用いることが特に好ましい。 次いで、２次抗体を作用させたプレートを洗浄し、３次抗体を各ウェルに作用させる。３次抗体は２次抗体と特異的に相互作用する物質と酵素からなり、２次抗体がビオチン標識したものであれば、ビオチンと特異的に相互作用するアビジン又はストレプトアビジンが結合したものを使用する。 また、酵素としては当業者に周知の種々の酵素を使用することができ、例えば、アルカリフォスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼを挙げることができる。これらの酵素の中でも、アビジンとの反応性が高いこと、及び高感度で測定できるという理由から、アルカリフォスファターゼを使用することが好ましい。 次いで、３次抗体を作用させたプレートを洗浄し、３次抗体を構成する酵素の基質を各ウェルに添加し、酵素反応をさせる。上記基質は、上記３次抗体を構成する酵素の基質である必要があり、このような酵素と基質の組み合わせとしては、アルカリフォスファターゼとｐ−ニトロフェニルリン酸、西洋わさびペルオキシダーゼとトリメチルベンジジン、西洋わさびペルオキシダーゼとオルトフェニレンジアミンなどの組み合わせを挙げることができ、人体への安全性、取り扱いやすさの点から、アルカリフォスファターゼとｐ−ニトロフェニルリン酸の組み合わせを使用することが好ましい。 酵素と基質とを反応させた後、上記抗原をコーティングしたウェルの酵素反応の程度と抗原をコーティングしていないウェルの酵素反応の程度とを比較する。この酵素反応は、酵素と基質の組み合わせに依存して、蛍光、吸光度、放射能などを測定することにより検出することができる。検出の簡便性、安全性及び経済性などから、吸光度の評価をするものであることが好ましい。 上記酵素反応終了後、抗原をコーティングしたウェルの酵素反応の程度と、抗原をコーティングしていないウェルの酵素反応の程度とを比較することによって、当該ＥＬＩＳＡプレートにおける非特異的反応の発生の程度を評価することができる。具体的には、抗原をコーティングしたウェルの酵素反応の程度が有意に高く、抗原をコーティングしていないウェルの酵素反応の程度がゼロに近いほど低い場合、そのＥＬＩＳＡプレートにおいて、非特異的反応がほとんど発生していないと判断することができる。 本発明の方法において酵素反応の程度を、ウェル中の溶液の吸光度で判断する場合、ＥＬＩＳＡ法を実際に実施する際、分析対象物中の標的物質の存在を確実に検出するために、抗原をコーティングしたウェルの吸光度が０．１以上２．０未満となるものについて本発明の評価方法を適用することが好ましく、０．５以上２．０未満となるものを用いることがより好ましく、１．０以上１．５未満となるものを用いることがさらに好ましい。吸光度が０．１未満の場合、陰性コントロールとの吸光度の差が小さくなり、測定誤差が大きくなるという点で好ましくなく、吸光度が２．０以上となる場合、吸光度が飽和し測定誤差を生じ得るという点で問題がある。 抗原をコーティングしたウェルの吸光度が０．１以上２．０未満となる場合に、抗原をコーティングしていないウェルの吸光度が十分に低い場合、そのプレートでは、非特異的反応はほとんど発生しないと判断することができる。非特異的反応がほとんど発生していないと判断できる吸光度の基準の例としては、抗原をコーティングをしていないウェルの吸光度が０．１未満であり、かつ抗原をコーティングしたウェルの吸光度がコーティングをしていないウェルの３倍以上であるという条件が挙げられる。 以下、実施例及び比較例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。［実施例１］ 粘膜免疫アジュバントとして定評のある、コレラ毒素（以下、ＣＴと略す。）を１×ＰＢＳで２ｍｇ／ｍＬに調製したＣＴ溶液１部に対して抗原として０．２５％ＯＶＡ（卵白由来アルブミン）２部を加え、ピペッティングにより十分に混合し、ＣＴ−ＯＶＡ混合液を調製した。 当該ＣＴ−ＯＶＡ混合液３μＬを、ジエチルエーテルで麻酔した６週齢、雌の多量体免疫グロブリンレセプターノックアウトマウス５匹に経鼻接種した。この経鼻接種の日から１週間おきに計３回、上記混合液３μＬを経鼻接種した。この３回目の経鼻接種の日を第０週として、その後、ジエチルエーテルで麻酔を掛け、尾静脈から採血し血液サンプルを得た。 次いで、血液サンプルを、室温にて１５，０００ｒ．ｐ．ｍ．で１５分間遠心分離し、その上清を再度同じ条件で遠心分離して得た上清を、血清サンプルとした。当該サンプルは、使用するまで−３０℃で冷凍保存した。 ＥＬＩＳＡ法を用いて上記血清サンプルの吸光度を測定し、この値をＩｇＡ抗体価（免疫グロブリンの抗体価）としてプレートの評価を行った。当該評価は以下の手順で行った。 （コーティング） ＯＶＡ抗原（生化学工業株式会社製）をコーティングバッファー（精製水１ＬにＮａ2ＣＯ3：１．６ｇ、ＮａＨＣＯ3：２．８２ｇ、ＮａＮ3：０．１ｇを含む；ｐＨ９．０）で５μｇ／ｍＬとなるようにしてＯＶＡ抗原溶液を調製し、この溶液を９６穴ＥＬＩＳＡプレート（住友ベークライト株式会社、ＳＵＭＩＬＯＮ ＥＬＩＳＡプレート Ｓ ＭＳ−８４９６Ｆ）の左半面の４８穴に、１穴あたり１００μＬずつ分注し、４℃で一晩静置して抗原を結合（コーティング）させた。この際、プレート表面にプレートシールを貼って溶液の乾燥を防いだ。 （ブロッキング） 上記コーティング終了後、プレートからコーティングバッファーを廃棄し、次いでブロッキングバッファー（１０×ダルベッコＰＢＳ：１００ｍＬにアルブミン（Ｆｒ．Ｖ）：１０ｇ、ＮａＮ3：１ｇを加えて、精製水で１Ｌとしたもの）をプレートの全穴に２００μＬずつ分注し、１時間放置した。 （免疫グロブリンの適用） 免疫グロブリンの抗体価の高低にかかわらず非特異的反応の発生を検出・判定するために、抗体価の高いサンプル（サンプルＨ）及び低いサンプル（サンプルＬ）について、実験を行った。具体的には、ＥＬＩＳＡプレートとは別にＵ底プレートを用意し、血清サンプルをブロッキングバッファーを用いて４０倍に希釈した。抗原をコーティングしたプレートにおいて、血清サンプルのＩｇＡ抗体価を予備的に測定し、吸光度が０．８以上のサンプルをサンプルＨ、吸光度が０．１以上０．４未満のサンプルをサンプルＬとし、両方のサンプルを用いてプレートの評価を行った。 １時間経過後、プレートからブロッキングバッファーを廃棄し、上記の手順で調製した血清サンプルＨ及びＬをプレートの左右に同じように１穴あたり１００μＬずつ分注して３７℃で１時間インキュベートした。この際、プレート表面にプレートシールを貼って溶液の乾燥を防いだ。 インキュベート終了後溶液を廃棄し、ＥＬＩＳＡプレート洗浄機（バイオテック社、ＭＷ−９６Ｆ）を用いて、洗浄液（１×ＰＢＳ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０）を１穴あたり４００μＬ分注後、廃棄することを４回繰り返してプレートを洗浄した。 （２次抗体の適用） ２次抗体として、ビオチン標識ヤギ抗マウスＩｇＡ（ＫＰＬ社）を希釈液（１×ＰＢＳ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０）で１，０００倍に希釈したものを、１穴あたり１００μＬずつ分注して３７℃で１時間インキュベートした。この際、プレート表面にプレートシールを貼って溶液の乾燥を防いだ。 インキュベート終了後溶液を廃棄し、洗浄液（１×ＰＢＳ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０）を１穴あたり４００μＬずつ分注後、廃棄することを４回繰り返してプレートを洗浄した。 （３次抗体の適用） ３次抗体として、アルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（インビトロジェン社）を希釈液（１×ＰＢＳ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０）で２，０００倍に希釈し、これを１穴あたり１００μＬずつ分注して３７℃で１時間インキュベートした。この際、プレート表面にプレートシールを貼って溶液の乾燥を防いだ。インキュベート終了後、ＥＬＩＳＡプレートから溶液を廃棄し、次いで、洗浄液（１×ＰＢＳ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０）を１穴あたり４００μＬずつ分注後、廃棄することを４回繰り返してプレートを洗浄した。 （酵素反応） フォスファターゼ用発色基質ｐ−ニトロフェニルリン酸（ＫＰＬ社）の１粒を発色基質用緩衝液（ジエタノールアミン：０．９７ｍＬ、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ：０．１ｇ、ＮａＮ3：０．１ｇに精製水を加えて１Ｌとしたもの、ｐＨ９．８）５ｍＬに溶解して発色液を調製し、この溶液を１穴あたり１００μＬずつ分注して３７℃で１時間インキュベートした。この際、プレート表面にプレートシールを貼って溶液の乾燥を防いだ。 （非特異的反応の評価） １時間後反応停止液として１Ｎ ＮａＯＨを各穴に５０μＬずつ分注して反応を止め、波長４０５ｎｍ及び６３０ｎｍで各穴の吸光度を測定し、メインの吸収を４０５ｎｍで測定し、リファレンスを６３０ｎｍで測定した。なお、吸光度の測定には、ＥＬＩＳＡ用プレートリーダー Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＥＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用した。 ＯＶＡ抗原をコーティングしたウェルとＯＶＡ抗原をコーティングしていないウェルにおけるサンプルＨ及びＬ（以下「サンプル」と略すことがある。）の吸光度を求め、抗原をコーティングしていないウェルの吸光度が０．１未満であり、かつ抗原をコーティングしたウェルの吸光度がコーティングしていないウェルの吸光度の３倍以上である、という条件をサンプルＨ及びＬの両方が満たすプレートをＡ、サンプルＨ又はＬのいずれかが満たすプレートをＢ、サンプルＨ及びＬのいずれもが満たさないプレートをＣとして、ＥＬＩＳＡプレートにおける非特異的反応の発生の程度を評価した。その結果を表１に示す。なお、本実験に用いたいずれのウェルも、抗原をコーティングしたウェルの吸光度が０．１以上２．０未満となるという条件を満たす。［実施例２］ ＥＬＩＳＡプレートとしてヌンクマキシソープイムノプレート ４４２４０４ ９６穴（ナルジェヌンク社製）を用いたこと以外は、実施例１と同様の手順及び方法でサンプルを調製し、実施例１と同様の測定を行った。吸光度の測定結果と評価の結果を表１に示す。［実施例３］ ＥＬＩＳＡプレートとしてヌンクイムノプレート ４６８６６７ ９６穴（ナルジェヌンク社製）を用いたこと以外は、実施例１と同様の手順及び方法でサンプルを調製し、実施例１と同様の測定を行った。吸光度の測定結果と評価の結果を表１に示す。［実施例４］ ＥＬＩＳＡプレートとしてヌンクＣＯＶＡＬＥＮＴ ＢＩＮＤＩＮＧ ９６穴（ナルジェヌンク社製）を用いたこと以外は、実施例１と同様の手順及び方法でサンプルを調製し、実施例１と同様の測定を行った。吸光度の測定結果と評価の結果を表１に示す。［実施例５］ ＥＬＩＳＡプレートとしてヌンク ポリソープイムノプレート ４７５０９４ ９６穴（ナルジェヌンク社製）を用いたこと以外は、実施例１と同様の手順及び方法でサンプルを調製し、実施例１と同様の測定を行った。吸光度の測定結果と評価の結果を表１に示す。［実施例６］ ＥＬＩＳＡプレートとしてヌンク ４４６１４０ ９６穴（ナルジェヌンク社製）を用いたこと以外は、実施例１と同様の手順及び方法でサンプルを調製し、実施例１と同様の測定を行った。吸光度の測定結果と評価の結果を表１に示す。［実施例７］ ＥＬＩＳＡプレートとしてＦＡＬＣＯＮ アッセイプレート ３５３９１５ ９６穴（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）を用いたこと以外は、実施例１と同様の手順及び方法でサンプルを調製し、実施例１と同様の測定を行った。吸光度の測定結果と評価の結果を表１に示す。［実施例８］ ＥＬＩＳＡプレートとしてＩＷＡＫＩアッセイプレート ３８８１−０９６ ９６穴（岩城硝子株式会社）を用いたこと以外は、実施例１と同様の手順及び方法でサンプルを調製し、実施例１と同様の測定を行った。吸光度の測定結果と評価の結果を表１に示す。［実施例９］ ＥＬＩＳＡプレートとしてＩＷＡＫＩエライサプレート ３８０１−０９６ ９６穴（岩城硝子株式会社）を用いたこと以外は、実施例１と同様の手順及び方法でサンプルを調製し、実施例１と同様の測定を行った。吸光度の測定結果と評価の結果を表１に示す。［実施例１０］ ＥＬＩＳＡプレートとしてＳＵＭＩＬＯＮ ＥＬＩＳＡプレート Ｈ ＭＳ−８５９６Ｆ ９６穴（住友ベークライト株式会社）を用いたこと以外は、実施例１と同様の手順及び方法でサンプルを調製し、実施例１と同様の測定を行った。吸光度の測定結果と評価の結果を表１に示す。［実施例１１］ ＥＬＩＳＡプレートとしてＳＵＭＩＬＯＮ ＥＬＩＳＡプレート Ｈ検定書付 ＭＳ−８８９６Ｆ ９６穴（住友ベークライト株式会社）を用いたこと以外は、実施例１と同様の手順及び方法でサンプルを調製し、実施例１と同様の測定を行った。吸光度の測定結果と評価の結果を表１に示す。［実施例１２］ ＥＬＩＳＡプレートとしてＣｏｓｔａｒ ３６９０ Ａ／２ ９６穴（コーニング社）を使用し、実験に使用した各溶液の量を実施例１の半分とし、血清サンプルをブロッキングバッファーで８０倍に希釈して用いたこと以外は、実施例１と同様の手順及び方法でサンプルを調製し、実施例１と同様の測定を行った。すなわち、ＯＶＡ抗原溶液：５０μＬ、ブロッキングバッファー：１００μＬ、試料溶液：５０μＬ、洗浄液：２００μＬ、２次抗体溶液：５０μＬ、３次抗体溶液：５０μＬ、発色液：５０μＬとした。ただし、反応停止液は実施例１と同じ５０μＬとした。吸光度の測定結果と評価の結果を表１に示す。［実施例１３］ ブロッキングバッファーとして、１０×ダルベッコＰＢＳ：１００ｍＬ、アルブミン（Ｆｒ．Ｖ）：５０ｇ及びＮａＮ3：１ｇに精製水を加え１Ｌにメスアップしたものを使用したこと以外は、実施例１と同様の手順及び方法でサンプルを調製し、その吸光度を測定した。吸光度の測定結果と評価の結果を表１に示す。［実施例１４］ ＥＬＩＳＡプレートとしてヌンクマキシソープイムノプレート ４４２４０４ ９６穴（ナルジェヌンク社製）を用いたこと以外は、実施例１３と同様の手順及び方法でサンプルを調製し、実施例１３と同様の測定を行った。吸光度の測定結果と評価の結果を表１に示す。［実施例１５］ ＥＬＩＳＡプレートとしてヌンクイムノプレート ４６８６６７ ９６穴（ナルジェヌンク社製）を用いたこと以外は、実施例１３と同様の手順及び方法でサンプルを調製し、実施例１３と同様の測定を行った。吸光度の測定結果と評価の結果を表１に示す。［実施例１６］ ＥＬＩＳＡプレートとしてヌンクＣＯＶＡＬＥＮＴ ＢＩＮＤＩＮＧ ９６穴（ナルジェヌンク社製）を用いたこと以外は、実施例１３と同様の手順及び方法でサンプルを調製し、実施例１３と同様の測定を行った。吸光度の測定結果と評価の結果を表１に示す。［実施例１７］ ＥＬＩＳＡプレートとしてヌンクポリソープイムノプレート ４７５０９４ ９６穴（ナルジェヌンク社製）を用いたこと以外は、実施例１３と同様の手順及び方法でサンプルを調製し、実施例１３と同様の測定を行った。吸光度の測定結果と評価の結果を表１に示す。［実施例１８］ ＥＬＩＳＡプレートとしてヌンク４４６１４０ ９６穴（ナルジェヌンク社製）を用いたこと以外は、実施例１３と同様の手順及び方法でサンプルを調製し、実施例１３と同様の測定を行った。吸光度の測定結果と評価の結果を表１に示す。［実施例１９］ ＥＬＩＳＡプレートとしてＦＡＬＣＯＮ アッセイプレート ３５３９１５ ９６穴（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）を用いたこと以外は、実施例１３と同様の手順及び方法でサンプルを調製し、実施例１３と同様の測定を行った。吸光度の測定結果と評価の結果を表１に示す。［実施例２０］ ＥＬＩＳＡプレートとしてＩＷＡＫＩアッセイプレート ３８８１−０９６ ９６穴（岩城硝子株式会社）を用いたこと以外は、実施例１３と同様の手順及び方法でサンプルを調製し、実施例１３と同様の測定を行った。吸光度の測定結果と評価の結果を表１に示す。［実施例２１］ ＥＬＩＳＡプレートとしてＩＷＡＫＩエライサプレート ３８０１−０９６ ９６穴（岩城硝子株式会社）を用いたこと以外は、実施例１３と同様の手順及び方法でサンプルを調製し、実施例１３と同様の測定を行った。吸光度の測定結果と評価の結果を表１に示す。［実施例２２］ ＥＬＩＳＡプレートとしてＳＵＭＩＬＯＮ ＥＬＩＳＡプレート Ｈ ＭＳ−８５９６Ｆ ９６穴（住友ベークライト株式会社）を用いたこと以外は、実施例１３と同様の手順及び方法でサンプルを調製し、実施例１３と同様の測定を行った。吸光度の測定結果と評価の結果を表１に示す。［実施例２３］ ＥＬＩＳＡプレートとしてＳＵＭＩＬＯＮ ＥＬＩＳＡプレート Ｈ検定書付 ＭＳ−８８９６Ｆ ９６穴（住友ベークライト株式会社）を用いたこと以外は、実施例１３と同様の手順及び方法でサンプルを調製し、実施例１３と同様の測定を行った。吸光度の測定結果と評価の結果を表１に示す。［実施例２４］ ＥＬＩＳＡプレートとしてＣｏｓｔａｒ ３６９０ Ａ／２ ９６穴（コーニング社）を用い、ＯＶＡ抗原溶液及びブロッキングバッファーの使用量を実施例１３の半分のそれぞれ、５０μＬ及び１００μＬとし、血清サンプルをブロッキングバッファーで８０倍に希釈して用いたこと以外は、実施例１３と同様の手順及び方法でサンプルを調製し、実施例１３と同様の測定を行った。吸光度の測定結果と評価の結果を表１に示す。［実施例２５］ ブロッキングバッファーとして、１０×ダルベッコＰＢＳ：１００ｍＬ及びカゼイン：２ｇに精製水を加えて、１Ｌにメスアップしたものを使用したこと以外は、実施例１と同様の手順及び方法でサンプルを調製し、実施例１と同様の測定を行った。吸光度の測定結果と評価の結果を表１に示す。［実施例２６］ ＥＬＩＳＡプレートとしてヌンクマキシソープイムノプレート ４４２４０４ ９６穴（ナルジェヌンク社製）を用いたこと以外は、実施例２５と同様の手順及び方法でサンプルを調製し、実施例２５と同様の測定を行った。吸光度の測定結果と評価の結果を表１に示す。［実施例２７］ ＥＬＩＳＡプレートとしてヌンクイムノプレート ４６８６６７ ９６穴（ナルジェヌンク社製）を用いたこと以外は、実施例２５と同様の手順及び方法でサンプルを調製し、実施例２５と同様の測定を行った。吸光度の測定結果と評価の結果を表１に示す。［実施例２８］ ＥＬＩＳＡプレートとしてヌンク ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＢＩＮＤＩＮＧ ９６穴（ナルジェヌンク社製）を用いたこと以外は、実施例２５と同様の手順及び方法でサンプルを調製し、実施例２５と同様の測定を行った。吸光度の測定結果と評価の結果を表１に示す。［実施例２９］ ＥＬＩＳＡプレートとしてヌンクポリソープイムノプレート ４７５０９４ ９６穴（ナルジェヌンク社製）を用いたこと以外は、実施例２５と同様の手順及び方法でサンプルを調製し、実施例２５と同様の測定を行った。吸光度の測定結果と評価の結果を表１に示す。［実施例３０］ ＥＬＩＳＡプレートとしてヌンク ４４６１４０ ９６穴（ナルジェヌンク社製）を用いたこと以外は、実施例２５と同様の手順及び方法でサンプルを調製し、実施例２５と同様の測定を行った。吸光度の測定結果と評価の結果を表１に示す。［実施例３１］ ＥＬＩＳＡプレートとしてＦＡＬＣＯＮ アッセイプレート ３５３９１５ ９６穴（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）を用いたこと以外は、実施例２５と同様の手順及び方法でサンプルを調製し、実施例２５と同様の測定を行った。吸光度の測定結果と評価の結果を表１に示す。［実施例３２］ ＥＬＩＳＡプレートとしてＩＷＡＫＩアッセイプレート ３８８１−０９６ ９６穴（岩城硝子株式会社）を用いたこと以外は、実施例２５と同様の手順及び方法でサンプルを調製し、実施例２５と同様の測定を行った。吸光度の測定結果と評価の結果を表１に示す。［実施例３３］ ＥＬＩＳＡプレートとしてＩＷＡＫＩエライサプレート ３８０１−０９６ ９６穴（岩城硝子株式会社）を用いたこと以外は、実施例２５と同様の手順及び方法でサンプルを調製し、実施例２５と同様の測定を行った。吸光度の測定結果と評価の結果を表１に示す。［実施例３４］ ＥＬＩＳＡプレートとしてＳＵＭＩＬＯＮ ＥＬＩＳＡプレート Ｈ ＭＳ−８５９６Ｆ ９６穴（住友ベークライト株式会社）を用いたこと以外は、実施例２５と同様の手順及び方法でサンプルを調製し、実施例２５と同様の測定を行った。吸光度の測定結果と評価の結果を表１に示す。［実施例３５］ ＥＬＩＳＡプレートとしてＳＵＭＩＬＯＮ ＥＬＩＳＡプレート Ｈ検定書付 ＭＳ−８８９６Ｆ ９６穴（住友ベークライト株式会社）を用いたこと以外は、実施例２５と同様の手順及び方法でサンプルを調製し、実施例２５と同様の測定を行った。吸光度の測定結果と評価の結果を表１に示す。［実施例３６］ ＥＬＩＳＡプレートとしてＣｏｓｔａｒ ３６９０ Ａ／２ ９６穴（コーニング社）を用い、ＯＶＡ抗原溶液及びブロッキングバッファーの使用量を実施例２５の半分のそれぞれ、５０μＬ及び１００μＬとし、血清サンプルをブロッキングバッファーで８０倍に希釈して用いたこと以外は、実施例２５と同様の手順及び方法でサンプルを調製し、実施例２５と同様の測定を行った。吸光度の測定結果と評価の結果を表１に示す。 上記の表から、同一のプレートを使用しても、ブロッキング条件を変えることにより、非特異的反応の発生の程度が異なる場合があることがわかる（例えば、実施例９、２１、３３を参照のこと）。 また、実施例１、１３、２５で使用したＳＵＭＩＬＯＮ ＥＬＩＳＡプレート Ｓ ＭＳ−８４９６Ｆ（住友ベークライト株式会社）はいずれのブロッキング条件でも非特異的反応の発生の程度が少なく、本発明の方法による評価の結果から、血清サンプル中のＩｇＡなどの微量な試料の測定に好適に使用できることが示唆される。 本発明によれば、ＥＬＩＳＡ法に用いるブロッキング後のプレートについて、非特異的反応が発生する程度を評価する方法が提供される。また、この評価方法を用いることにより、各種ＥＬＩＳＡプレートの固有の非特異的反応抑制能力、ブロッキング剤に依存して発生する非特異的反応の発生の程度を評価することができる。 ＥＬＩＳＡプレートの一部のウェルを抗原でコーティングする工程； 該コーティング後のＥＬＩＳＡプレートに、ブロッキング剤を作用させる工程； 該ブロッキング後のＥＬＩＳＡプレートに、上記抗原と特異的に相互作用する免疫グロブリンを作用させる工程； 該免疫グロブリンを作用させたＥＬＩＳＡプレートに、上記免疫グロブリンと特異的に相互作用する２次抗体を作用させる工程； 該２次抗体を作用させたＥＬＩＳＡプレートに、酵素標識した３次抗体を作用させる工程； 該３次抗体を作用させたＥＬＩＳＡプレートに、上記酵素の基質を添加し酵素反応をさせる工程；及び、 上記抗原をコーティングしたウェルの酵素反応の程度と抗原をコーティングしていないウェルの酵素反応の程度とを比較する工程、 を包含することを特徴とするＥＬＩＳＡプレートにおける非特異的反応の発生の程度を評価する方法。 上記抗原が、卵白由来アルブミン、ｅｎｖタンパク質、ジフテリアトキソイド又はエイズウイルスである請求項１に記載の評価方法。 上記ブロッキング剤が、ウシ血清アルブミン、カゼイン、スキムミルク又はゼラチンである請求項１に記載の評価方法。 上記免疫グロブリンが、ＩｇＡである請求項１に記載の評価方法。 上記免疫グロブリンが、上記抗原を接種したマウスの血液から得たものである請求項１に記載の評価方法。 上記２次抗体が、ビオチン標識ヤギ抗マウスＩｇＡである請求項１に記載の評価方法。 上記３次抗体が、アルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジンである請求項１に記載の評価方法。 上記酵素の基質が、ｐ−ニトロフェニルリン酸である請求項１に記載の評価方法。 上記酵素反応の程度を、吸光度から求める請求項１に記載の評価方法。 【課題】ＥＬＩＳＡ法に用いるブロッキング後のプレートについて、非特異的反応の発生の程度を評価する方法を提供すること。【解決手段】ＥＬＩＳＡプレートの一部のウェルを抗原でコーティングする工程、ブロッキング剤を作用させる工程、上記抗原と特異的に相互作用する免疫グロブリンを作用させる工程、上記免疫グロブリンと特異的に相互作用する２次抗体を作用させる工程、酵素標識した３次抗体を作用させる工程、上記酵素の基質を添加し酵素反応をさせる工程、及び、上記抗原をコーティングしたウェルの酵素反応の程度と抗原をコーティングしていないウェルの酵素反応の程度とを比較する工程、を包含することを特徴とするＥＬＩＳＡプレートにおける非特異的反応の発生の程度を評価する方法。【選択図】なし