生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公開特許公報(A)_腎炎検出試薬 |
| 出願番号： | 2007056326 |
| 年次： | 2008 |
| IPC分類： | G01N 33/53,A01K 67/027,A61K 39/395,A61P 13/12,C07K 14/47 |
特許情報キャッシュ
横山 司甫 JP 2008191135 公開特許公報(A) 20080821 2007056326 20070206 腎炎検出試薬 横山 司甫 598100346 横山 司甫 G01N 33/53 20060101AFI20080725BHJP A01K 67/027 20060101ALI20080725BHJP A61K 39/395 20060101ALI20080725BHJP A61P 13/12 20060101ALI20080725BHJP C07K 14/47 20060101ALN20080725BHJP JPG01N33/53 DA01K67/027A61K39/395 DA61K39/395 NA61P13/12C07K14/47 8 書面 6 4C085 4H045 4C085AA13 4C085AA14 4C085BB50 4C085CC21 4C085CC29 4C085EE01 4H045BA10 4H045CA44 4H045EA20 本発明は、腎炎検出試薬に関する。 タイプ４コラーゲン関連の腎炎検出には体外診断薬として尿中タイプ４コラーゲン測定試薬がある。同キットは当初、糖尿病性腎炎の早期診断を標榜して使用されていたが、現在は腎炎検出試薬に適用拡大している。しかし、臨床の場では、より優れた腎炎検出試薬を求めていた。 発明が解決しょうとする課題 本発明者は、長い間、腎疾患の早期検出方法の開発に努めてきた。 発明が解決する為の手段 その結果、発明者は、次のように本発明を成した。タイプ４コラーゲンは基底膜コラーゲンとも呼ばれ、生体組織基底膜の主成分である。タイプ４コラーゲンはα１鎖〜α６鎖までの６種の同位体（ｉｓｏｍｅｒ）が知られている。α１鎖、α２鎖は胎盤で富み、全身に分布するが、腎基底膜ではα３鎖〜α６鎖が特徴的に存在する。 又、基底膜の由来組織をペプシン処理するとタイプ４コラーゲンは、主にＮ端の７Ｓと三本鎖中央領域（ＴＨ）が得られる（通常タイプ４コラーゲンと呼ばれる）。ペプシン処理したタイプ４コラーゲンは電気泳動すると細断片の混在像で各社市販品の泳動像でも濃淡に違いがあり、一致しない。この点は、標準物質として用いるのに大きな課題があった。 又、この標準物質を抗原として抗体を作製すると抗体間に認識部位の違いが生じやすく、免疫反応を論じる時に食い違いを生じる懸念があった。 更に、腎炎の体外診断薬として知られ唯一販売されている尿中タイプ４コラーゲン測定試薬キットは、標準がヒト胎盤由来タイプ４コラーゲンで、使用モノクロ−ナル抗体作製時の抗原もペプシン処理で得られた胎盤由来タイプ４コラーゲンである。しかし、腎炎で尿中に出現するタイプ４コラ−ゲン（７ＳやＮＣ１を含めて）は腎臓由来である。胎盤由来でペプシン処理した現行のタイプ４コラ−ゲン測定キットは、腎炎の検出に用いるには充分なもので無かった。又、症例によっては腎臓由来のタイプ４コラーゲン（７ＳやＮＣ１を含めて）が血流中にも出現するが、肝臓の線維化などのタイプ４コラーゲン（７ＳやＮＣ１を含めて）との識別が必要であった。 それゆえ、腎炎の検出に用いるタイプ４コラーゲン（７ＳやＮＣ１を含めて）測定キットなら、腎臓由来の抗原とその抗原に基ずく抗体を利用するほうが理に適うだろうと思い至った。 そこで、出発材料に腎臓組織を用いる事とした。 予備試験としての胎盤由来と腎臓由来の比較（１）ペプシン処理にて取り出した、胎盤由来タイプ４コラーゲンとウシ腎糸球体基底膜（ＧＢＭ）由来タイプ４コラ−ゲンを抗原として腎炎患者尿中の抗タイプ４コラーゲン抗体をＥＬＩＳＡ法で測定したところ、明らかに腎ＧＢＭ由来タイプ４コラーゲンに良く反応した。従って、抗原に腎由来を用いることの妥当性を裏付けた。［測定手順；マイクロプレート固相化抗原（抗原５ｕｇ／ｍｌ ＰＢＳ，ｐＨ７．６を１２０ｕｌ／ｗｅｌｌ添加し４Ｃ×一夜放置）−洗浄後、４倍希釈検体１００ｕｌ添加−室温×２時間放置−洗浄後、酵素標識抗ヒト抗体１００ｕｌ添加−室温×１時間放置−洗浄後、基質溶液（ＴＭＢ）１００ｕｌ−青色を目安に反応（室温×５〜３０分）−反応停止液（１Ｎ−Ｈ２ＳＯ４）５０ｕｌ添加し、直ちに４５０ｎｍで吸光度測定］ 予備試験としての胎盤由来と腎臓由来の比較（２）更に、ペプシン処理にて得られたウシ腎ＧＢＭ由来タイプ４コラーゲンでラットとウサギで抗体を作製した（プロテインＧ精製）。この２種の抗体で、サンドイッチＥＬＩＳＡ法でウシ腎ＧＢＭ由来タイプ４コラ−ゲンを測定した。その結果、０．１３ｎｇ／ｍｌまで測定できたが、ヒト胎盤由来タイプ４コラーゲン（Ｋ３４ コラ−ゲン技術研修会製）を検体とした時は、吸光度は半分以下でバックも極めて高かった。この結果は、尿中のタイプ４コラーゲンを測定するには、腎由来のタイプ４コラーゲンを標準とし、腎由来の抗タイプ４コラーゲン抗体を用いる事が良いと判断できた。つまり、腎由来の物質を測定するには腎由来の抗原、標準、腎由来抗原に対応する抗体を用いるのが適切である。［測定手順；マイクロプレート固相化抗体（ウサギＩｇＧ２０００倍希釈ＰＢＳ．ｐＨ７．６を１２０ｕｌ／ｗｅｌｌ添加し４Ｃ×一夜放置）−洗浄後、段階希釈抗原（タイプ４コラ−ゲン）１００ｕｌ添加−室温×２時間放置−洗浄後、抗体（ラットＩｇＧ１０００倍希釈）１００ｕｌ添加−室温×２時間放置−洗浄後、酵素標識抗ラット抗体１００ｕｌ添加−室温×１時間放置−洗浄後、基質溶液（ＴＭＢ）１００ｕｌ−青色を目安に反応（室温×５〜３０分）−反応停止液（１Ｎ−Ｈ２ＳＯ４）５０ｕｌ添加し、直ちに４５０ｎｍで吸光度測定］ さらに、酵素処理は細菌コラゲナ−ゼを用いる事とした。ペプシン処理ではタイプ４コラーゲンが細断片となり、一定の分子量のものを得る事は困難である。又、７Ｓを取り出す時にも、最初にペプシン処理を行うと更にコラゲナ−ゼ処理を行う必要があり二度手間を要する。最初から細菌コラゲナ−ゼで処理すれば１回の手間で済み、カラムクロマトグラフィーで７ＳとＮＣ１が簡単に分取でき、その電気泳動像は一定である。 そこで、電気泳動像が一定の７ＳやＮＣ１を用いる事とした。７ＳやＮＣ１は、いわゆるタイプ４コラーゲンを使用するのに比べ、均質の分子量が得られるので、動物に投与して抗体を作製する時も、ロット間でのばらつきが少ないし、抗原でアフィニテ−精製しても力価に差が生じにくい。この事は、７ＳやＮＣ１の検出キット作製に有用である。同時に、７ＳやＮＣ１を抗原として生体試料から自己抗体を検出するにも作成時の抗原による差が生じないと言う利点がある。ＮＣ１については、抗糸球体基底膜抗体腎炎（狭義のグッドパスチャ−症）などで研究が進んでいるので、ここでは、研究の進んでいない７Ｓについて述べ、基礎研究にも役立つようにする。ＮＣ１についても７Ｓについて述べることと同様である。 以上の様にして、腎炎時に出現する腎特異的な７Ｓの検出にふさわしい「ウシ腎糸球体基底膜由来」を出発原料に、簡便な１回の酵素処理「細菌コラゲナ−ゼ」で得た均質な分子量の「７Ｓ」を抗原として、抗体を作製した。７Ｓ抗体作製に用いる抗原は腎糸球体由来ならいずれの動物種でも良い。抗体作製動物もいずれの動物でも良い。抗体作製には、ウサギとモルモットの２種を用いた例を示す。一般的にモルモットでの抗体作製は他の動物に比べ例示が少ない。ウサギに作製する時には、背部皮内に同容量のＦＣＡと共に初回０．１−０．１５ｍｇ、追加免疫は２週後、４週後に０．２−４５ｍｇを投与し、ＥＬＩＳＡで充分抗体価が上っている事を確認して５週後に採血した。続いて、７Ｓでアフィニテ−精製を行い、１ｍｇ／ＰＢＳ１ｍｌ液で冷凍保存した。モルモットを用いる時は、背部皮内に同容量のＦＣＡと共に初回０．０５−０．１ｍｇ、追加免疫は２週後、４週後に０．１−０．３ｍｇを投与し、以降同様にして精製した抗体をＢｉｏｔｉｎ標識し、検出にはＡｖｉｄｉｎ−ＨＲＰを用いる。腎由来７Ｓ測定ＥＬＩＳＡキットは、次の仕様とした。固相化抗原（ウサギ由来５ｕｇ／ｍｌ）マイクロプレ−トを１夜放置−洗浄後、ブロックエ−ス２５％−ＰＢＳを加え保存。使用時、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄後、検体（標準、４倍希釈尿、１０倍希釈血清）を加え−２時間室温放置後洗浄し、Ｂｉｏｔｉｎ−抗体（モルモット由来）を加え−２時間室温放置後洗浄し、Ａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（４千倍希釈）を加え−３０分放置後洗浄し、ＴＭＢ発色基質液を加え−室温２０分放置後、反応停止液（１Ｎ硫酸）を加えて、４５０ｎｍで吸光度を測定する。 ヒト７Ｓ由来ペプチドの作製方法α１鎖からα６鎖まで７Ｓのアミノ酸配列は公表されているので、これを用いる。α３鎖７Ｓ（約１９０個のアミノ酸配列）は、Ｎ端から２０個単位のアミノ酸配列を、１０個を重ねながらＣ端まで１８個に合成する（ｙ３０１−ｙ３１８）。全部の合成ペプチド（１８個）を抗原として、９６穴マイクロプレートに固相化する（５−１０ｕｇ／ｍｌ ＰＢＳ，ｐＨ７．６）。対象抗原はウシ腎糸球体基底膜由来７Ｓを用いた。検体には、あらかじめウシ腎糸球体基底膜由来７Ｓを抗原として抗７Ｓ抗体がある腎炎患者尿を用いる。ペプチドは、対象抗原より反応したものを選ぶ（以下７Ｓ様ペプチド）。このようにして用意した７Ｓ様ペプチドは、７Ｓの代用抗原として自己抗体の検出に、更に抗体作製の抗原として使用できる。７Ｓ様ペプチド及び又は抗７Ｓ様ペプチド抗体は血清や試料中の抗７Ｓ様ペプチド抗体及び又は７Ｓ様ペプチドの除去装置にも用いられる。７Ｓ様ペプチドの作製は、α４鎖からα６鎖の７Ｓについても同様にして行う。α５鎖ＮＣ１では、Ｎ端から１個から１２個が無い（公表文献の記載が空白）ので、最初の２０個のペプチドは無しにして２個目のペプチドを１８アミノ酸残基で作製する。他のα鎖ＮＣ１の欠損ついても同様に処理する。途中域のアミノ酸欠損残基は少ないので、そのままで合成する。又、α１鎖、α２鎖は、α３鎖〜α６鎖までと相同性が約５０％程度あるので、α１鎖、α２鎖についてもペプチドを同様に実施しても良いが腎炎検出試薬の作製には十分で無い。 α３鎖からα６鎖までのそれぞれの抗７Ｓ様ペプチド抗体を用いたアフィニテ−カラムを用意して、腎糸球体基底膜由来７Ｓ（例えばウシ）を通すことで、各α鎖の７Ｓ（α３鎖〜α６鎖の７Ｓ）が得られる。これら各α鎖の７Ｓを用いる事で、又その抗体を用いる事で、抗７Ｓ抗体や７Ｓが測定できる。 ７Ｓ投与又は抗７Ｓ抗体投与による腎炎の寛容化動物（ウサギやラットなど）にあらかじめ一定期間微量の７Ｓ（以下、含む７Ｓ様ペプチド）又は抗７Ｓ抗体を経口投与もしくは注射投与（皮下、皮内、筋肉、静注他）することで、後日の免疫惹起が緩和もしくは抑制される。 発明の効果 本発明は、腎炎の早期発見、治療薬の開発、医薬品の腎臓への副作用評価指標、ジン疾患治療薬のスクリ−ニング方法、腎炎の透析装置、腎炎モデルの作製として、更には各種研究に於ても利用できるがこれに限定されない。 〔添付１〕ヒト７Ｓのアミノ酸配列例〔添付２〕ウシ腎糸球体基底膜を細菌コラゲナ−ゼ処理で得た７ＳとＮＣ１ 抗腎由来タイプＩＶコラーゲン７Ｓ領域（７Ｓ）抗体及び又は抗腎由来７Ｓ由来ペプチド抗体を用いた７Ｓ（以下７Ｓ由来ペプチドも含む）測定試薬 腎由来７Ｓを抗原とした腎由来７Ｓ抗体測定腎炎検出試薬 腎糸球体基底膜由来タイプＩＶコラーゲンα３鎖及び又はα４鎖及び又はα５鎖及び又はα６鎖の７Ｓを抗原とし、及び又はそのペプタイド（以下７Ｓ）を抗原とした尿中抗７Ｓ抗体測定法 腎糸球体基底膜由来タイプＩＶコラーゲンα３鎖及び又はα４鎖及び又はα５鎖及び又はα６鎖の７Ｓを抗原とし、及び又はそのペプタイド（以下７Ｓ）を抗原として反応する抗体を用いた尿中７Ｓ測定法 腎由来７Ｓ薬剤 抗腎由来７Ｓ抗体薬剤 腎由来７Ｓ及び又は抗腎由来７Ｓ抗体を用いた抗７Ｓ抗体及び又は７Ｓ除去装置 腎由来７Ｓ及び又は抗腎由来７Ｓ抗体で惹起させた腎炎モデル 【課題】本発明は、腎炎検出試薬に関する。【解決手段】以下の通り、構成する。イ、腎糸球体基底膜（ＧＢＭ）の主成分であるタイプＩＶコラーゲンα３鎖及び又はα４鎖及び又はα５鎖及び又はα６鎖の７Ｓを抗原とし、及び又はそのペプタイド（以下７Ｓ）を抗原として、腎炎特有の抗７Ｓ自己抗体を検出する方法と試薬。ロ、腎糸球体基底膜（ＧＢＭ）の主成分であるタイプＩＶコラーゲンα３鎖及び又はα４鎖及び又はα５鎖及び又はα６鎖の７Ｓを抗原とし、及び又はそのペプタイド（以下７Ｓ）を抗原として反応する抗体を用いて、腎炎特有の７Ｓを検出する方法と試薬。【選択図】なし