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伊藤 敦 市橋 素子 JP 2008128743 公開特許公報(A) 20080605 2006312253 20061117 水晶振動子を使用した液状物の撹拌方法 株式会社アルバック 000231464 清水 善廣 100087745 阿部 伸一 100098545 辻田 幸史 100106611 伊藤 敦 市橋 素子 G01N 1/36 20060101AFI20080509BHJP G01N 5/02 20060101ALI20080509BHJP JPG01N1/28 YG01N5/02 A 6 5 ＯＬ 8 2G052 2G052AD26 2G052FB02 2G052FB07 本発明は、液状物中に含まれる微量物質を測定するために使用される水晶振動子を使用した液状物の撹拌方法に関する。 ＤＮＡ・タンパク質などの生体物資の相互作用の測定や抗原抗体反応を応用した測定にＱＣＭが利用されている。 前記ＱＣＭによる測定は、水晶振動子の電極にバッファー液を接しさせておき、この液に測定対象となる試料を含んだ溶液を加えることで、あらかじめ前記水晶振動子の電極に固定化しておいた物質との結合からおこる周波数変化を測定することより行われる。 その際、例えば、試料がバッファー液の底に淀んだり、液面に浮き出して溶液が混ざらないと、溶液の終濃度が一定にならず、正確な結合量が測定ができない、また結合の速度解析もできない。 これを解決するためのひとつの方法として、バッファー液が注入されている容器に攪拌棒を入れ、その中の溶液を機械的に上下方向に振動させたり、或いは、溶液を回転させたりする方法等がある（例えば、特許文献１）。 しかしながら、上記方法により溶液を攪拌するためには溶液の量がある程度は必要であるために、溶液が微量の場合には十分な攪拌ができないという問題があった。そして、溶液の撹拌が不十分となるために精度の高い測定が困難であった。 また、測定の際に加えられる電力による水晶振動子の振動から、share waveや圧力波（compressional wave）という波が生じるが、share waveは、例えば、２７ＭＨｚのＡＴ−カットの水晶振動子の場合には、水晶振動子の表面から１００ｎｍ程度の距離で減衰するため撹拌に使用することはできず、また、圧力波もそれ自体で液状物を攪拌することはできないということが実験的にわかっている。特開２００２−３１０８７２号公報 そこで、本発明は上記問題を解決するために、水晶振動子を利用した測定において、バッファー液等の溶液と被検出物との混合を、撹拌専用の手段を設けることなく十分に攪拌することができることができる撹拌方法を提供する。 上記課題を解決するために、本発明者は、鋭意検討の結果、下記の知見を得た。 本発明の水晶振動子を使用した液状物の撹拌方法は、請求項１に記載の通り、水晶振動子を所定の周波数で振動させ、前記水晶振動子に接触する物質による前記周波数の変動を測定する際に、前記水晶振動子を、前記所定の周波数から基本波振動周波数以上の異なる他の周波数により振動させて前記物質を含む液体を撹拌することを特徴とする。 また、請求項２に記載の本発明は、請求項１に記載の液状物の撹拌方法において、前記他の周波数は、基本波振動周波数、副振動周波数又はＮ倍波（Ｎ＝３，５，７，・・・）振動周波数であることを特徴とする。 また、請求項３に記載の本発明は、請求項１又は２に記載の水晶振動子を使用した液状物の撹拌方法において、前記撹拌時に、前記他の周波数に固定又は前記他の周波数を中心に±１００ｋＨｚの間でスイープさせて振動させることを特徴とする。 また、請求項４に記載の本発明は、請求項１乃至３の何れかに記載の水晶振動子を使用した液状物の撹拌方法であって、前記撹拌時に前記水晶振動子に印加される電力は、前記測定時の１０倍以上としたことを特徴とする。 また、請求項５に記載の本発明は、請求項１乃至４の何れかに記載の水晶振動子を使用した液状物の撹拌方法であって、前記測定時に、前記水晶振動子をＮ倍波（Ｎ＝３，５，７，・・・）振動周波数で振動させることを特徴とする。 また、請求項６に記載の本発明は、請求項１乃至５の何れかに記載の水晶振動子を使用した液状物の撹拌方法において、前記撹拌は、前記測定の前又は前記測定を連続して行う場合には測定と測定との間に行うことを特徴とする。 本発明によれば、ＱＣＭの測定の際に特別な撹拌手段を別に設ける必要がない。また、測定に使用する液状物が微量であっても撹拌することができる。更に、本発明によれば微量の試料を含む液状物を十分に撹拌することができるため、精度の高い測定が可能となる。 本発明において使用することができる水晶振動子は、通常ＱＣＭに利用されるものも含め特に制限をするものではない。 本発明では、測定に使用する所定の周波数に対して、少なくとも前記水晶振動子の基本波振動周波数以上の異なる他の周波数により撹拌を行う。この他の周波数としては、基本波振動周波数、副振動周波数又はＮ倍（オーバートーン）波（Ｎ＝３，５，７，・・・）振動周波数であることが好ましい。例えば、２７ＭＨｚの基本波振動周波数の水晶振動子を例にして説明すると、測定周波数が３倍波振動周波数である８１ＭＨｚの場合には、他の周波数として２７ＭＨｚや１３５ＭＨｚを選択し、測定周波数が２７ＭＨｚの場合には、他の周波数として８１ＭＨｚを選択することが好ましい。また、前記周波数のなかでも、撹拌の効率をより高めるためには、基本波振動周波数又は副振動周波数を選択することが好ましい。 測定に使用する周波数は基本波振動周波数でもよいが、より圧力波の影響を受けにくいＮ倍波振動周波数を使用するのが望ましい。 また、撹拌の際に、前記いずれか１つの周波数で固定して振動させつづけるか、或いは、前記いずれか１つの周波数を中心として±１００ｋＨｚの範囲でスイープすることが好ましい。 前記水晶振動子は、測定の場合には、１ｍＷ程度の電力を加えて発振させその周波数変化を測定、或いは、ネットワークアナライザー又はインピーダンスアナライザーを用いて共振周波数の変化を測定する等して使用されるが、測定時に水晶振動子に加えられる電力に対して、１０〜１００倍の範囲で電力を加えるようにして攪拌を行うことが好ましい。また、上記電力の場合、測定周波数が安定せず、大きなノイズを伴う可能性もあるため、攪拌と測定とを交互に行うか、或いは、測定の前に撹拌を行うことが好ましい。 周波数の測定は、ネットワークアナライザを用いても、インピーダンスアナライザを用いても、直接水晶振動子を発振させ周波数カウンタで測定する方法のいずれかであっても良い。また、ネットワークアナライザを使用時はπ回路を使用しても、使用せずにｆｒ測定ともに可能である。また測定及び攪拌する水晶振動子の数は１ｃｈだけでなく、多ｃｈ化も可能である。 次に、本発明について具体的に図面を参照して説明する。 本発明において使用する水晶振動子としては、例えば、図１に示される構造の水晶振動子がある。この水晶振動子は、通常ＱＣＭに利用されるものであり、水晶板１の両側に対向電極３，３を備えている。この水晶板１は、２７ＭＨｚの仕様の場合、厚さ６０μｍ程度で、直径（Ｒｃ）８．９ｍｍ程度であり、対向電極３は、金等からなり、直径（Ｒｅ）２．５ｍｍ程度である。 また、上記構造に対して、図２に示すように、電極２の直径（Ｒｅ）を８ｍｍ程度に形成し、通常の水晶振動子の電極よりも大きく形成することがより好ましい。攪拌時に発生する熱が分散し、水晶振動子及び溶液の温度上昇をおさえることができ、より低ノイズでの測定ができるからである。尚、電極は、表裏の何れか、或いは、両方であってもよい。 上記水晶振動子を利用して、これに液状物を接触させるためには、図３に示すように金電極２上に溶液４を載置する方法や、図５に示すように容器５の底面に水晶振動子を配置して、その上から少量（約５００μｌ以下）の溶液４を注入する方法、或いは、その他フローセルなどが挙げられるが、特に限定するものではない。 次に、本発明の一実施例について説明する。 本実施例では、取り扱いの対象となる液量が極微量となるように、図３に示すように、基本波振動周波数２７ＭＨｚの水晶振動子の両面に設けられた金電極のうちの一方の電極上に溶液を載置して測定を行うこととした。 水晶振動子は、図５に示す回路に接続した。 図示した回路は、水晶振動子６をπ回路７を介してネットワークアナライザー８に接続する回路と、水晶振動子６をＲＦジェネレーター９に接続する回路とから構成されており、これらの回路は、２個のリレー＃１，＃２により切り換え自在となっている。これらのリレー＃１，＃２はパソコン１０により制御され、リレー＃１を閉じた場合は水晶振動子は測定のための発振を行い、リレー＃２を閉じた場合には水晶振動子は撹拌を行うこととなる。 水晶振動子６により測定を行う場合には、周波数を３倍波である８１ＭＨｚ付近で振動させるように設定し、攪拌を行う場合は、周波数を基本波（２７ＭＨｚ）又は基本波の該基本周波数の副振動周波数付近で振動（±１００ｋＨｚをスキャン）させるように設定した。投入する電力は、測定の場合は２ｍＷとし、攪拌の場合は２００ｍＷとした。 リレー＃１は、図６に示すように、１秒間隔でＯＮとＯＦＦを繰り返すように制御し、リレー＃２は、リレー＃１がＯＦＦになると同時に３００ｍ秒間ＯＮとして、その後ＯＦＦとなることを繰り返すように制御した。 次に、水晶振動子６の金電極上にバッファー溶液を９μｌ載置し、０．１ｍｇ／ｍＬのＮ−Ａｖｉｄｉｎを１μＬ添加した際に、上記リレー＃１，＃２を制御して撹拌を行った場合と、撹拌を行わない場合の測定結果を図８及び図９に示す。 図８から、本発明の撹拌を行う場合には、Ｎ−Ａｖｉｄｉｎ注入後に測定周波数変化は緩やかなカーブを示し、周波数が安定するまでにかかる時間は、撹拌しない場合に比べて短いことがわかった。これに対して、攪拌しない場合には、図９に示すとおり、Ｎ−Ａｖｉｄｉｎを注入後すぐに、測定周波数が−１０００Ｈｚほど下り、その後やや横這い状態が続き、その後また測定周波数が下がり始めた。このことから、撹拌しな場合には測定周波数が安定するまで時間がかかることがわかった。 上記結果から、本発明では、数μＬレベルの極微量の溶液の撹拌を、撹拌専用の手段を用いることなく行うことができ、精度の高い結合量及び結合の速度解析ができることがわかった。 また、上記回路の構成例は例示に過ぎず、図７に示すように、ネットワークアナライザーの代わりに水晶振動子を発振させるために、周波数カウンター１１を使用した回路であっても使用することができる。 本発明は、ＤＮＡやタンパク質等の生体物質の相互作用や抗原抗体反応を利用した測定等の広い分野において利用することができる。水晶振動子の構造説明図（（ａ）平面図，（ｂ）側面図）本発明の一実施の形態の好ましい態様の水晶振動子の説明図水晶振動子に液状物を接触させる一態様の説明図水晶振動子に液状物を接触させる他の態様の説明図本発明の一実施例で使用するバイオセンサ装置の回路構成図同回路におけるリレー＃１，＃２の制御方法の説明図図５の回路構成の変形例を示す回路構成図本発明の一実施例による測定結果を示すグラフ比較例による測定結果を示すグラフ符号の説明 １ 水晶板 ２ 電極 ３ リード線 ４ 液状物 ５ 容器 ６ 水晶振動子 ７ π回路 ８ ネットワークアナライザー ９ ＲＦジェネレーター １０ パソコン １１ 周波数カウンター 水晶振動子を所定の周波数で振動させ、前記水晶振動子に接触する物質による前記周波数の変動を測定する際に、前記水晶振動子を、前記所定の周波数から基本波振動周波数以上の異なる他の周波数により振動させて前記物質を含む液体を撹拌することを特徴とする水晶振動子を使用した液状物の撹拌方法。 前記他の周波数は、基本波振動周波数、副振動周波数又はＮ倍波（Ｎ＝３，５，７，・・・）振動周波数であることを特徴とする請求項１に記載の水晶振動子を使用した液状物の撹拌方法。 前記撹拌時に、前記他の周波数に固定又は前記他の周波数を中心に±１００ｋＨｚの間でスイープさせて振動させることを特徴とする請求項１又は２に記載の水晶振動子を使用した液状物の撹拌方法。 前記撹拌時に前記水晶振動子に印加される電力は、前記測定時の１０倍以上としたことを特徴とする請求項１乃至３の何れかに記載の水晶振動子を使用した液状物の撹拌方法。 前記測定時に、前記水晶振動子をＮ倍波（Ｎ＝３，５，７，・・・）振動周波数で振動させることを特徴とする請求項１乃至４の何れかに記載の水晶振動子を使用した液状物の撹拌方法。 前記撹拌は、前記測定の前又は前記測定を連続して行う場合には測定と測定との間に行うことを特徴とする請求項１乃至５の何れかに記載の水晶振動子を使用した液状物の撹拌方法。 【課題】 水晶振動子を利用した測定において、バッファー液等の溶液と被検出物との混合を、撹拌専用の手段を設けることなく十分に攪拌することができることができる撹拌方法を提供する。【解決手段】 水晶振動子を所定の周波数で振動させ、前記水晶振動子に接触する物質による前記周波数の変動を測定する際に、前記水晶振動子を、前記所定の周波数から基本波振動周波数以上の異なる他の周波数により振動させて前記物質を含む液体を撹拌することを特徴とする。【選択図】 図５

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