生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公開特許公報(A)_ＳＣＦ結合阻害剤 |
| 出願番号： | 2006206350 |
| 年次： | 2008 |
| IPC分類： | A61K 8/97,A61Q 19/02,A61K 36/18,A61P 43/00 |
特許情報キャッシュ
笠松 慎也 樋口 和彦 大内 敦 JP 2008031089 公開特許公報(A) 20080214 2006206350 20060728 ＳＣＦ結合阻害剤 花王株式会社 000000918 特許業務法人アルガ特許事務所 110000084 有賀 三幸 100068700 高野 登志雄 100077562 中嶋 俊夫 100096736 村田 正樹 100117156 山本 博人 100111028 的場 ひろみ 100101317 守屋 嘉高 100121153 大野 詩木 100134935 松田 政広 100130683 野中 信宏 100140497 笠松 慎也 樋口 和彦 大内 敦 A61K 8/97 20060101AFI20080118BHJP A61Q 19/02 20060101ALI20080118BHJP A61K 36/18 20060101ALI20080118BHJP A61P 43/00 20060101ALI20080118BHJP JPA61K8/97A61Q19/02A61K35/78 CA61P43/00 111 2 ＯＬ 7 4C083 4C088 4C083AA111 4C083AA112 4C083EE16 4C088AB12 4C088AB64 4C088AC01 4C088AC03 4C088AC04 4C088AC05 4C088AC11 4C088CA03 4C088MA63 4C088NA14 4C088ZA89 4C088ZC42 本発明は、ステムセルファクター（Stem cell factor、以下「ＳＣＦ」という）結合阻害剤及び美白剤に関する。 日焼け後の色素沈着やシミ・ソバカスは、一般に皮膚の紫外線暴露による刺激やホルモンの異常又は遺伝的要素等によって皮膚内に存在する色素細胞（メラノサイト）が活性化されメラニン産生が亢進した結果生じるものと考えられている。 ＳＣＦは、造血幹細胞の表面に発現しているｃ−ｋｉｔレセプターのリガンドであり、造血細胞の増殖・分化を促す膜結合型の増殖因子として知られているが、近年、ｃ−ｋｉｔが造血細胞の他に、肥満細胞、メラノサイト及び生殖細胞の表面にも発現していることが明らかになり（非特許文献１）、即時型アレルギーへの関与を始めとして、ＳＣＦの生体内作用に関する研究が進められている。最近では、皮膚にのみＳＣＦを発現させるトンラスジェニックマウスにおいて、肥満細胞の誘導とメラノサイトの増殖により、メラニン合成が増強されること（非特許文献２）、メラノサイト上のｃ−ｋｉｔのリン酸化によって、メラノジェネシスが亢進することが報告され（非特許文献３）、メラニンの過剰生産にＳＣＦが深く関与すると考えられている。 従って、メラノサイト上のｃ−ｋｉｔレセプターとＳＣＦとの結合を特異的に阻害することができれば、メラニンの過剰産生応を抑制することができ、皮膚の褐色化、シミ・ソバカスの発生を予防又は改善することが可能となる。 一方、ケンポナシはクロウメモドキ科の落葉高木、マツリカはモクセイ科の常緑低木であるが、これらの植物又はその抽出物にＳＣＦ結合阻害作用があることは全く知られていない。J.Exp.Med.,183,2681-2686,1996J.Exp.Med.,187,1565-1573,1998Molecular Bioloy of the Cell 3, 197-209 1992 本発明は、ｃ−ｋｉｔレセプターに対するＳＣＦの結合を阻害し、医薬又は化粧料として有用なＳＣＦ結合阻害剤及び美白剤を提供することに関する。 本発明者らは、細胞表面上のｃ−ｋｉｔレセプターに対するＳＣＦの結合を特異的に阻害する天然物を探索したところ、ケンポナシ若しくはマツリカ又はその抽出物に、ＳＣＦ結合阻害活性があり、メラニンの過剰産生に起因する色素沈着やシミ・ソバカスの予防又は改善に有効であることを見出した。 すなわち、本発明は、ケンポナシ及びマツリカから選ばれる植物又はそれらの抽出物を有効成分とするＳＣＦ結合阻害剤に係るものである。 また、本発明は、ケンポナシ及びマツリカから選ばれる植物又はそれらの抽出物を有効成分とする美白剤に係るものである。 本発明のＳＣＦ結合阻害剤又は美白剤によれば、皮膚におけるメラニンの過剰産生を抑制でき、日焼け後の色素沈着やシミ・ソバカスを予防又は改善することができる。 本発明のＳＣＦ結合阻害剤とは、細胞表面、特にメラノサイト表面上のｃ−ｋｉｔレセプターに対するＳＣＦの結合を特異的に阻害し、メラニンの過剰生成に伴う皮膚の褐色化やシミ・ソバカスの発生の予防又は改善効果を有するものをいう。 本発明におけるケンポナシとは、クロウメモドキ科（Rhamnaceae）のHovenia dulcisを意味し、マツリカとは、モクセイ科（Oleaceae）のJasminum sambacを意味する。 上記植物は、その植物の全草、葉、樹皮、枝、果実又は根等をそのまま又は粉砕して用いることができるが、ケンポナシについては実、マツリカについては花を使用することが好ましい。 本発明の植物抽出物としては、前記植物の用部を、そのままあるいは乾燥した後に適当な大きさに切断したり、粉砕加工したりしたものを抽出して得られる抽出エキスの他、さらに分離精製して得られるより活性の高い画分（成分）が包含される。 抽出は、室温又は加熱した状態で溶剤に含浸させるか又はソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて行われる溶剤抽出の他に、水蒸気蒸留等の蒸留法を用いて抽出する方法、炭酸ガスを超臨界状態にして行う超臨界抽出法、あるいは圧搾して抽出物を得る圧搾法等を用いることができる。 溶剤抽出に用いられる抽出溶剤としては、極性溶剤、非極性溶剤のいずれをも使用することができ、これらを混合して用いることもできる。例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；ピリジン類；超臨界二酸化炭素；油脂、ワックス、その他オイル等が挙げられ、これらは単独で又は２種以上を組み合わせて使用でき、溶剤を変えて繰り返し行うことも可能である。このうち、水、エタノール、プロピレングリコール、ブチレングリコール等を用いるのが好ましく、特に水・エタノール混液を用いるのが好ましい。 抽出は、例えば植物１質量部に対して１〜５０質量部の溶剤を用い、３〜１００℃で数時間〜数週間浸漬又は加熱還流するのが好ましい。 また、抽出物の分離精製手段としては、例えば、抽出物を活性炭処理、液液分配、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、ゲル濾過、精密蒸留等を挙げることができる。 本発明の植物抽出物は、斯くして得られる抽出液や画分をそのまま用いてもよく、適宜な溶媒で希釈した希釈液として用いてもよく、或いは濃縮エキスや乾燥粉末としたり、ペースト状に調製したものでもよい。また、凍結乾燥し、用時に、通常抽出に用いられる溶剤、例えば水、エタノール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、水・エタノール混液、水・プロピレングリコール混液、水・ブチレングリコール混液等の溶剤で希釈して用いることもできる。また、リポソーム等のベシクルやマイクロカプセル等に内包させて用いることもできる。 本発明の植物又はその抽出物は、後記実施例に示すように、ｃ−ｋｉｔへのＳＣＦの結合阻害活性を有し、またメラノサイトのｃ−ｋｉｔのリン酸化を抑制する作用を有することから、メラノサイト上のｃ−Ｋｉｔの活性化によって引き起こされるメラニンの過剰産生応を抑制することができると考えられる（文献：The Journal of Biological Chemistry 275, 33321-33328, 2000）。従って、本発明の植物又はその抽出物は、ＳＣＦ結合阻害剤或いは美白剤として使用でき、またＳＣＦ結合阻害剤或いは美白剤を製造するために使用できる。当該ＳＣＦ結合阻害剤及び美白剤は、皮膚の褐色化、シミ・ソバカスの発生を予防又は改善するための医薬品、医薬部外品、化粧品等として使用できる。また、当該ＳＣＦ結合阻害剤或いは美白剤は、ＳＣＦ結合阻害或いは美白をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した医薬部外品、化粧品として使用することもできる。 本発明のＳＣＦ結合阻害剤又は美白剤を医薬品として用いる場合の投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与又は注射剤、外用剤、坐剤、経皮吸収剤等による非経口投与のいずれでもよい。当該医薬製剤を調製するには、本発明の植物又はその抽出物を単独で、又は他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を適宜組み合わせて用いることができる。該製剤中の本発明植物の含有量は、乾燥固形成分として０．１〜２０質量％、特に０．５〜１０質量％含有することが好ましく、植物抽出物としては、固形分換算で０．０００１〜１０質量％、特に０．００１〜５質量％含有することが好ましい。尚、本発明のＳＣＦ結合阻害剤又は美白剤を医薬品として使用する場合、成人１人当たりの１日の投与量は、本発明の植物又はその抽出物（乾燥固形分換算）として、例えば０．００１〜１０００ｍｇ、特に０．０１〜１００ｍｇであることが好ましい。 また、本発明のＳＣＦ結合阻害剤又は美白剤を医薬部外品や化粧料として用いる場合は、皮膚外用剤、洗浄剤、メイクアップ化粧料とすることができ、使用方法に応じて、ローション、乳液、ゲル、クリーム、軟膏剤、粉末、顆粒等の種々の剤型で提供することができる。このような種々の剤型の医薬部外品や化粧料は、本発明の植物又はその抽出物を単独で、又は医薬部外品、皮膚化粧料及び洗浄料に配合される、油性成分、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、可溶化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、増粘剤、薬効成分、香料、樹脂、防菌防黴剤、植物抽出物、アルコール類等を適宜組み合わせることにより調製することができる。尚、薬効成分としては、ホルモン剤やコウジ酸、アルブチン、プラセンタエキス、カミツレエキス、ルシノール等の他の美白成分が挙げられる。 当該医薬部外品、化粧料中の本発明植物の含有量は、乾燥固形成分として０．０１〜１００質量％とすることが好ましく、特に０．０５〜７０質量％とすることが好ましい。一方、抽出物の含有量は、一般的に固形分換算で０．００００１％〜１００質量％とすることが好ましく、特に０．０００１〜７０質量％とすることが好ましい。製造例１ ケンポナシ抽出物の製造 市販のケンポナシ（Hovenia dulcis、栃本天海堂（株）製）１００ｇを、室温下、５０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液１Ｌで７日間抽出後ろ過し、エキス０．７Ｌを得た（固型分１．８％）。製造例２ マツリカ抽出物の製造 市販のマツリカ（Jasminum sambac、栃本天海堂（株）製）１００ｇを、室温下、５０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液１Ｌで７日間抽出後ろ過し、エキス０．７Ｌを得た（固型分０．７％）。実施例１ ＳＣＦ結合阻害活性 ＰＢＳで２００μｇ／ｍｌに溶解したRecombinant human c-kit (Soluble c-kit ; s-kit（R&D systems社）)を９６ウェルプレートに５０μｌ／ウェルとなるように添加し、４℃で一晩放置した。翌日ウェルをＰＢＳで２回洗浄した後、５％ＢＳＡ（Bovine Serum Albumin；和光純薬工業株式会社）−ＰＢＳＴ（0.1% Tween20-PBS）をウェルが満杯になるまで添加し、室温で１時間以上放置した。ウェルをＰＢＳＴで２回洗浄後、評価サンプル（前記植物抽出物：終濃度５％（ｖ／ｖ））、終濃度１００ｐＭのＳＣＦ（「Recombinant Human SCF」（Peprotech社））、終濃度０．５％のＢＳＡ、ＰＢＳを加え計１００μｌ／ウェルを添加し、室温で２時間以上振とうさせた。ウェルをＰＢＳＴで５回洗浄した後、終濃度０．５μｇ／ｍｌの抗ＳＣＦ抗体（「Rabbit polyclonal to SCF」（abcam社））、終濃度０．５％のＢＳＡ、ＰＢＳを加え計１００μｌ／ウェルを添加し、室温で２時間以上振とうまたは、４℃で一晩放置した。ウェルをＰＢＳＴで５回洗浄した後、０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳＴで１０００倍希釈したＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ECL Anti-rabbit IgG（Amersham Biosciences社））を１００μｌ／ウェル添加し、室温で２時間以上振とうさせた。ウェルをＰＢＳＴで１０回洗浄した後、ＴＭＢ基質液（「TMB Microwell Peroxidase Substrate System」（KPL社））を１００μｌ／ウェル添加し、遮光して室温で１０℃、２０分放置した。さらにＴＭＢ反応停止液（「TMB Stop Solution」（KPL社））を１００μｌ／ウェル添加し反応を停止させ、プレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定しｓ−ｋｉｔに結合したＳＣＦ量を計測した。なおコントロールとして、評価サンプルの代わりにその溶媒を同量添加したウェルを作製した。また、ｓ−ｋｉｔを固相化せずに、評価サンプルの代わりにその溶媒を添加したウェルを作製し、この吸光度をブランク（非特異的結合量）とした。得られた吸光度はブランクの値を差し引くことで特異的結合量を求め、コントロールの値を１００とした相対値で表した。 表１に示したとおり、本発明の植物抽出物は、ｃ−ｋｉｔに対するＳＣＦの結合阻害活性を有することが認められた。実施例２ c-kitリン酸化検出方法 ６ウェルプレートにヒト培養メラノサイト（「正常ヒト新生児包皮表皮メラニン細胞」（クラボウ株式会社））を４×１０5個／ウェルで播き込んだ。翌日、増殖培地からＰＭＡ（Phorbol 12-myristate 13-acetate）を取り除いた培地に交換した。３日後、増殖培地からＰＭＡを取り除いた培地に再び交換し、評価サンプル（前記植物抽出物）を終濃度１％（ｖ／ｖ）となるように添加した。１０分後、終濃度１０ｎＭのＳＣＦ（「Recombinant Human SCF」（Peprotech社））を添加した。さらに１０分後、培地を除き、氷冷ＰＢＳで２回洗浄し反応を停止させ、市販の溶解バッファー（「10X Cell Lysis Buffer」（Cell Signaling Technology社））を用いて細胞を回収した。なお、ネガティブコントロールとして、評価サンプルの溶媒を１％（ｖ／ｖ）添加し、ＳＣＦを添加しなかったウェル、ポジティブコントロールとして、評価サンプルの溶媒を１％（ｖ／ｖ）添加し、ＳＣＦを添加したウェルを作製した。回収した細胞は、抗リン酸化ｃ−ｋｉｔ抗体（「Phospho-c-Kit (Tyr719) Antibody」（Cell Signaling Technology社））及び抗ｃ−ｋｉｔ抗体（「Anti- c-Kit (K963) Rabbit IgG Affinity Purify」（株式会社免疫生物研究所））を用いて定法に従いウェスタンブロット法を行うことで、リン酸化ｃ−ｋｉｔ及びｃ−ｋｉｔのバンドを得た後、定量を行った。得られた定量値は、リン酸化ｃ−ｋｉｔの値をｃ−ｋｉｔの値で割ることでリン酸化率とし、ポジティブコントロールの値を１００とした相対値で表した。 表２より、本発明の植物抽出物には、メラノサイト上のｃ−ｋｉｔのリン酸化抑制効果を有することが認められた。従って、本発明の植物抽出物は、メラニンの生成抑制効果を有すると考えられる。 ケンポナシ及びマツリカから選ばれる植物又はそれらの抽出物を有効成分とするＳＣＦ結合阻害剤。 ケンポナシ及びマツリカから選ばれる植物又はそれらの抽出物を有効成分とする美白剤。 【課題】ｃ−ｋｉｔレセプターに対するＳＣＦの結合を阻害し、医薬又は化粧料として有用なＳＣＦ結合阻害剤及び美白剤の提供。【解決手段】ケンポナシ及びマツリカから選ばれる植物又はそれらの抽出物を有効成分とするＳＣＦ結合阻害剤。【選択図】なし