生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公開特許公報(A)_金コロイドの粒径調整方法及び金コロイド溶液 |
| 出願番号： | 2006186548 |
| 年次： | 2007 |
| IPC分類： | B22F 9/00,G01N 21/27,B01J 13/00,G01N 15/02,B22F 9/24 |
特許情報キャッシュ
伊藤 佐智子 川本 道子 小堀 樹一郎 牛澤 幸司 JP 2007023384 公開特許公報(A) 20070201 2006186548 20060706 金コロイドの粒径調整方法及び金コロイド溶液 第一化学薬品株式会社 390037327 石井 良夫 100133905 吉見 京子 100113837 後藤 さなえ 100127421 藤野 清也 100090941 伊藤 佐智子 川本 道子 小堀 樹一郎 牛澤 幸司 US 60/697,746 20050708 B22F 9/00 20060101AFI20070105BHJP G01N 21/27 20060101ALI20070105BHJP B01J 13/00 20060101ALI20070105BHJP G01N 15/02 20060101ALI20070105BHJP B22F 9/24 20060101ALN20070105BHJP JPB22F9/00 BG01N21/27 ZB01J13/00 ZG01N21/27 CG01N15/02 AB22F9/24 F 11 ＯＬ 11 2G059 4G065 4K017 2G059AA03 2G059BB06 2G059EE01 2G059EE11 2G059HH02 2G059HH06 2G059JJ01 2G059MM01 4G065AA04 4G065AA05 4G065AB11Y 4G065AB30Y 4G065BA20 4G065BB03 4G065CA01 4G065DA02 4G065EA10 4G065FA02 4G065FA03 4K017AA08 4K017BA02 4K017CA07 4K017DA09 4K017EJ01 4K017FB07 本発明は、金コロイドの粒径調整方法に関する。特に、イムノクロマト法に用いられる検出用抗体を標識するための金コロイドの粒径調整方法及び粒径調整された金コロイド溶液に関する。 金コロイド溶液は、テトラクロロ金酸（III）などの塩化金酸溶液に還元剤としてクエン酸塩溶液を加えて加熱することにより、金属イオンを還元してコロイドとする溶液内還元反応を利用して製造する方法が繁用されている。 当該方法においては、塩化金酸に対する還元剤の添加量を増減することにより、金コロイド粒子の大きさを変化させることができると言われている（非特許文献１）。 しかしながら、還元剤の添加量をコントロールしただけで単一の粒径の金コロイドが得られるわけではなく、ある粒度分布をもった金コロイドが得られていた。つまり、目的とする粒径の範囲外の金コロイド粒子も同時に得られ、さらに、その粒度分布も製造バッチ（ロット）間で差が大きく、工業的な製造再現性は良好ではなかった。 このため、所望の粒径及び粒度分布を有しているか否かを製造バッチ毎に測定して選択しているのが実情である。 ここで、製造された金コロイドの粒径の測定方法としては、電子顕微鏡を用いる方法、立体排除クロマトグラフィーを用いる方法、動的光散乱式粒度分布計を用いる方法などが使用されているが、いずれも高価で特殊な機器を必要とし、また、機器の操作には熟練した技術が必要であり、工業的なルーチン検査には適さない。一方、金コロイドの粒径と最大吸収波長との間には一定の相関関係があることが知られている（非特許文献２）。しかし、相関関係にもとづいて算出される値と実際の粒径の値とが必ずしも一致しない場合があり、最大吸収波長のみを粒径の検査方法とすることはできない。G. Frens、NATURE PHYSICAL SCIENCE、241. 20-22 (1973)S. L. Goodman、G. M. Hodgesら、J. Microscopy、123. 201-213 (1981) 本発明は、高価な機器、熟練した技術を必要とすることなく、簡便かつ精度良く、金コロイドの粒径を測定する方法の提供を課題とする。また、粒径が所定の範囲内の金コロイド溶液の提供を課題とする。 本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、最大吸収波長の他に、金コロイド溶液の最大吸収波長における吸光度（Ａλｍａｘ）および最大吸収波長とは異なる波長Ｘにおける吸光度（ＡλＸ）の比（ＡλＸ／Ａλｍａｘ）を測定することによって、金コロイド粒子の粒度分布幅を推定し、粒径を調整することができることを見出し、本発明をするに至った。 すなわち、本発明は以下の構成を有する。（１）金コロイド溶液の最大吸収波長（λｍａｘ）及び最大吸収波長とは異なる波長Ｘにおける吸光度（ＡλＸ）の最大吸収波長における吸光度（Ａλｍａｘ）に対する比（ＡλＸ／Ａλｍａｘ）を測定することを特徴とする金コロイドの粒径調整方法。 λｍａｘ：最大吸収波長 Ａλｍａｘ：最大吸収波長における吸光度 ＡλＸ：最大吸収波長とは異なる波長Ｘにおける吸光度（２）異なる波長が５５０〜６５０ｎｍである上記（１）に記載の金コロイドの粒径調整方法。（３）粒径調整が、金コロイド溶液の粒度分布の調整である上記（１）に記載の金コロイドの粒径調整方法。（４）金コロイド溶液の最大吸収波長（λｍａｘ）及び最大吸収波長とは異なる波長Ｘにおける吸光度（ＡλＸ）の最大吸収波長における吸光度（Ａλｍａｘ）に対する比（ＡλＸ／Ａλｍａｘ）を測定し、粒径と最大吸収波長（λｍａｘ）及び吸光度の比（ＡλＸ／Ａλｍａｘ）の関係を求め、それにもとづいて所望の粒径の金コロイド溶液を得ることを特徴とする、金コロイド溶液の製造方法。（５）金コロイド溶液の最大吸収波長（λｍａｘ）及び最大吸収波長とは異なる波長Ｘにおける吸光度（ＡλＸ）の最大吸収波長における吸光度（Ａλｍａｘ）に対する比（ＡλＸ／Ａλｍａｘ）が以下の関係を満たす、金コロイド溶液。（ｉ）ａ≦λｍａｘ≦ｂ（ｉｉ）ｃ≦Ａλｘ／Ａλｍａｘ≦ｄ（６）最大吸収波長とは異なる波長Ｘが６００ｎｍであるとき、ａ，ｂ，ｃ，ｄが以下の関係を満たす、所望の平均粒径の金コロイド溶液。（７）金コロイド溶液の最大吸収波長（λｍａｘ）及び最大吸収波長とは異なる波長Ｘにおける吸光度（ＡλＸ）の最大吸収波長における吸光度（Ａλｍａｘ）に対する比（ＡλＸ／Ａλｍａｘ）が以下の関係を満たす上記（６）に記載の金コロイド溶液。（ｉ）５３０≦λｍａｘ≦５３５（ｉｉ）０．３４≦Ａλ６００／Ａλｍａｘ≦０．４４（８）イムノクロマト法、フロースルーアッセイ法、金コロイド凝集比色法に用いられるものである上記（５）〜（７）のいずれかに記載の金コロイド溶液。（９）上記（８）に記載の金コロイド溶液を用いて標識した抗体または抗原を含んで成る診断用試薬。（１０）抗体が、インフルエンザの鑑別診断用抗体である上記（９）に記載の金コロイド溶液。（１１）上記（１０）に記載の金コロイド溶液を用いて標識したインフルエンザの鑑別診断用抗体を含浸させた標識抗体パッドを含むインフルエンザ鑑別診断用キット。 本発明の粒径調整方法を用いれば、金コロイド溶液の粒径を正確かつ簡便に測定することができる。また、所定の粒径の金コロイド溶液を工業的に提供することができる。（金コロイド溶液） 金コロイドとは、液体中に分散した金微粒子をいう。赤紫色を呈することが知られており、従来よりガラスや陶磁器等のあるいは化粧品の着色剤としての利用がなされてきた。また、医療用に免疫反応を利用したイムノクロマト法、フロースルーアッセイ法、金コロイド凝集比色法等の診断用試薬にも使用されている。 金コロイドの製造は、テトラクロロ金酸（III）などの塩化金酸溶液に還元剤としてクエン酸塩溶液等を加えて加熱することにより、金属イオンを還元してコロイドとする溶液内還元反応を利用して行われる。得られる金コロイドを含む溶液を、本発明では金コロイド溶液という。 金コロイドの粒径は、前記のとおり、テトラクロロ金酸（III）に対するクエン酸三ナトリウムの添加量と関係があり、添加量をコントロールすることにより粒径を調整することができる。すなわち、テトラクロロ金酸（III）に対するクエン酸三ナトリウムの割合を減少させることによって次第に大きくなる。しかし、前述のとおり、添加量の調整だけでは粒径を所望の範囲に調整することは難しい。（最大吸収波長、異なる波長、吸光度の比） 最大吸収波長とは、金コロイド溶液の吸光度を測定した際の最大吸収波長をいい、通常 ５１５ｎｍ〜５６０ｎｍの範囲である。 最大吸収波長と異なる波長とは、金コロイド溶液の前記最大吸収波長とは異なる波長であって、長波長であることが望ましく、具体的には５５０ｎｍ〜６５０ｎｍ程度の波長がより望ましい。 本発明でいう吸光度の比（ＡλＸ／Ａλｍａｘ）とは、金コロイド溶液の、最大吸収波長とは異なる波長における吸光度の最大吸収波長における吸光度に対する比をいう。 本発明は、この吸光度の比と金コロイドの粒径との間に正の相関があることを初めて見出したことにもとづくものである。 本発明は、吸光度の比を測定し、粒径と最大吸収波長（λｍａｘ）及び吸光度の比（ＡλＸ／Ａλｍａｘ）の関係をあらかじめ求めておき、それにもとづいて所望の粒径の金コロイド溶液を得ることができる。（吸光度の測定） 吸光度の測定は、吸収スペクトルを測定できる機能を有する分光光度計であれば、どのような機器でも使用することができる。吸収スペクトルとしては、４００ｎｍから８００ｎｍを測定できればよい。（測定方法） 本発明における吸光度の測定は、分光光度計の精度等を考慮して、最大吸収波長における吸光度が１．０付近になるよう、製造した金コロイド溶液を精製水等で希釈し、分光光度計により４００〜８００ｎｍの吸収スペクトルを測定することにより行う。これから、最大吸収波長における吸光度、最大吸収波長とは異なる波長Ｘにおける吸光度、ブランクとして例えば８００ｎｍにおける吸光度を抽出し、最大吸収波長における吸光度とＸにおける吸光度の比を以下の式により算出する。 吸光度比＝（波長Ｘにおける吸光度−８００ｎｍにおける吸光度）／（最大吸収波長における吸光度−８００ｎｍにおける吸光度）（粒径調整方法） 本発明は、吸光度の比を測定し、粒径と最大吸収波長（λｍａｘ）及び吸光度の比（ＡλＸ／Ａλｍａｘ）の関係をあらかじめ求めておき、それにもとづいて所望の粒径の金コロイド溶液を得ることができる。具体的には、最大吸収波長と異なる波長Ｘが６００ｎｍの場合、目的とする所望の平均粒径の金コロイド溶液は、以下の表１に示す最大吸収波長及び吸光度の比の双方を満足した場合に選択（調整）可能となる。（金コロイド標識） 本発明の金コロイドは様々な抗体や抗原の標識に用いることができ、金コロイドを使用して目的物質の検出を行う測定方法であれば制限なく使用することができる。例えばインフルエンザ、呼吸器のアデノウイルス又はＢＮＰ鑑別診断用の抗体に標識するために用いられる。 金コロイド標識抗体の製造方法について説明する。まず、製造された金コロイド溶液のｐＨを各抗体に応じて調整し、抗体液と混合後、撹拌して金コロイドに抗体を結合させる。ブロッキング剤としてウシ血清アルブミンを加えて更に撹拌を加えた後、遠心分離を行い、遠心後の上清を吸引除去することにより沈殿した金コロイド標識抗体を得ることができる。（金コロイド溶液の製造） 塩化金酸・４水和物０．６１ｇを精製水５Ｌに溶解し加熱した。沸騰状態で還流させながら、これにクエン酸３ナトリウム・２水和物０．４８〜０．９１ｇを精製水１０ｍＬに溶解した水溶液を加え、１０分間撹拌した。氷水中で室温まで冷却して金コロイド溶液を得た。これを１バッチとする。用いた試薬を以下に示す。＜試薬＞ 塩化金酸・４水和物 関東化学株式会社製 クエン酸３ナトリウム・２水和物 キシダ化学株式会社製（金コロイド溶液の評価） 粒度分布測定装置による平均粒子径５７ｎｍ〜６２ｎｍを目標として前記「金コロイド溶液の製造方法」に従って製造した金コロイド溶液１６９バッチについて、各々精製水にて２倍に希釈し、粒度分布測定装置により平均粒径を、及び分光光度計により４００〜８００nmの吸収スペクトルを測定した。 １６９バッチの粒度測定装置による測定値の分布を図１に示す。全１６９バッチのうち目標とした５７ｎｍ〜６２ｎｍのものは１１３バッチであった。 ＜測定機器＞ 分光光度計：日立製作所 Ｕ３３１０ 粒度分布測定装置：動的散乱式粒度分布測定装置 ＮＩＣＯＭＰ Ｃ３７０〔比較例１〕（最大吸収波長における規格設定） 各バッチの粒度測定装置による測定値と最大吸収波長の関係は図２の様になり、両者間に相関性が認められたため、最大吸収波長に規格幅を設け、目標とした５７ｎｍ〜６２ｎｍのバッチの選択を試みた。 ５７ｎｍ〜６２ｎｍ金コロイド溶液の最大吸収波長の規格を５３０ｎｍ〜５３５ｎｍとし、含まれる金コロイドの粒径を確認した。条件に該当する金コロイドは全部で１５３バッチあり、全１６９バッチの９０．５％に相当した。しかし、その中で実際に粒径が５７ｎｍ〜６２ｎｍであるのは１１３バッチであり、粒径が規格外となるバッチは４０に及んだ。そのほとんどは大粒径の金コロイド溶液であり、最大吸収波長が長波長となるにつれ大粒径の金コロイドの割合が増加するため、最大吸収波長の上限を５３４nmとし再度検証を行った。しかし、粒径が規格外となるバッチが１２６バッチ中２２バッチと依然高い割合で存在した。そこで 最大吸収波長の規格をさらに狭め上限を５３３ｎｍとすると、粒径が規格外となるバッチは８３バッチ中４バッチであったが、最大吸収波長で不合格となるバッチが全体の約５０％を占め、粒径が規格内にあるにも関わらず不合格となるものが３８バッチ存在する事が判明した。これは粒径５７ｎｍ〜６２ｎｍの金コロイド溶液、全１１３バッチの１／３にも相当する数であった（図３）。 〔実施例１〕（最大吸収波長及び吸光度の比による規格設定） 吸光度の比と最大吸収波長との組合せについて検証を行った。吸収スペクトルから最大吸収波長における吸光度に対する６００ｎｍにおける吸光度の比を算出した。 このとき、８００ｎｍの吸光度をブランクとし、以下の式により吸光度の比を求めた。 吸光度比＝（６００ｎｍにおける吸光度−８００ｎｍにおける吸光度）／（最大吸収波長における吸光度−８００ｎｍにおける吸光度） 粒径５７ｎｍ〜６２ｎｍの範囲の金コロイド溶液の吸光度の比の最小・最大値から下限は０．３４に固定し、上限を０．５から徐々に引き下げ、該当する金コロイド溶液とその内訳について観察した（図４）。 その結果、条件に適合する金コロイドのうち粒径が規格外となるバッチの割合を１０％以下とするには、（ｉ）最大吸収波長５３０ｎｍ〜５３５ｎｍ かつ 吸光度比０．３４〜０．４６、あるいは（ｉｉ）最大吸収波長５３０ｎｍ〜５３４ｎｍ かつ 吸光度比０．３４〜０．４７が必要であった。ただし条件（ｉ）や（ｉｉ）では大粒径の金コロイドを除外しきれなかったため、吸光度比の上限をさらに引き下げたところ、極大吸収波長に関わらず吸光度比０．４４以上でほとんどの大粒子金コロイドが除外でき、吸光度比０．４２以下では平均粒子径６０ｎｍ以上の金コロイド溶液を全て除外できた。このように最大吸収波長に吸光度比を組み合わせて規格を設定した場合、効率よく目的とする粒径５７〜６２ｎｍの金コロイド溶液を選択できることが判明した。 これと同様に他の所望の粒径、３７〜４２ｎｍ、４７〜５２ｎｍ、６７〜７２ｎｍについても試験を行った。併せて結果を表２に示す。これらの試験により、金コロイド溶液の最大吸収波長（λｍａｘ）及び最大吸収波長とは異なる波長Ｘにおける吸光度（ＡλＸ）の最大吸収波長における吸光度（Ａλｍａｘ）に対する比（ＡλＸ／Ａλｍａｘ）が以下の表２の関係を満たす場合に、所望の平均粒径の金コロイド溶液を得ることができることが判明した。〔実施例２〕（インフルエンザ鑑別診断用キット）（１）抗体 市販の抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体（マウス）および抗Ｂ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体（マウス）を用いた。（２）本発明の金コロイドによる標識 実施例１で得られた粒径の調整された金コロイド溶液を炭酸カリウム水溶液によりｐＨ９．０に調整し、これにホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で希釈した抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体又は抗Ｂ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体を加え、室温にて１０分間撹拌した。ウシ血清アルブミン水溶液を添加し、室温下さらに５分間撹拌の後、８０００ｒｐｍで４５分間遠心分離を行った。遠心後の上清を吸引除去し得られた沈渣をウシ血清アルブミンおよびスクロース等を含むリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁させ、最大吸収波長が７．５となるように調整し、金コロイド標識抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体液又は金コロイド標識抗Ｂ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体液を得た。金コロイド標識抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体液および金コロイド標識抗Ｂ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体液を等量ずつ混合し、金コロイド標識抗インフルエンザ抗体液とした。（３）標識抗体パッド 上記で作製した金コロイド標識抗インフルエンザ抗体液１２８μＬを８．５ｍｍ×２５４ｍｍのガラス繊維パッドにしみ込ませ、恒温乾燥機で７０℃、３０分間乾燥し、標識抗体パッドを作製した。（４）テストデバイス ニトロセルロース膜に抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体液および抗Ｂ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体液をライン状に塗布し、恒温乾燥機で７０℃、３０分間乾燥させ、抗体固相化膜とした。抗体固相化膜、標識抗体パッド、吸収紙をプラスチック製粘着シートに貼り付け、７．１ｍｍ幅に切断し、テストストリップとした。テストストリップを、測定検体液を添加するための開口部および抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体並びに抗Ｂ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体のラインが露出する別の開口部を設けたプラスチック製ケースに入れ、テストデバイスを作製した。（５）キット インフルエンザ鑑別診断用キットは、ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）から成る検体希釈液入りプラスチック製チューブおよび上記で作製したテストデバイスを本質とする。 （６）診断テスト インフルエンザウイルス感染の疑いのある患者より検体採取した綿棒を検体希釈液入りプラスチック製チューブに入れて上下に７〜８回動かして検体を浮遊させた後、綿棒を抜き取った。チューブの開口部にフィルターノズルを装着し、テストデバイスの測定検体液を添加するための開口部に５滴滴下した。１５分後にテストデバイスの判定窓に現れる赤紫色のラインで判定した結果、インフルエンザの鑑別診断が可能であった。 本発明によれば、製造した金コロイド溶液の簡便な粒径調整方法を提供することができる。すなわち、一般的な分光光度計による測定により、最大吸収波長及び最大吸収波長とは異なる波長における吸光度の最大吸収波長における吸光度に対する比率を組み合わせることにより、容易に目的とするサイズの金コロイド溶液を高率で選択することができる。粒径別のヒストグラムを示す。最大吸収波長別のヒストグラムを示す。最大吸収波長による規格設定結果を示す。最大吸収波長と吸光度比の組み合わせによる規格設定結果を示す。 金コロイド溶液の最大吸収波長（λｍａｘ）及び最大吸収波長とは異なる波長Ｘにおける吸光度（ＡλＸ）の最大吸収波長における吸光度（Ａλｍａｘ）に対する比（ＡλＸ／Ａλｍａｘ）を測定することを特徴とする金コロイドの粒径調整方法。 λｍａｘ：最大吸収波長 Ａλｍａｘ：最大吸収波長における吸光度 ＡλＸ：最大吸収波長とは異なる波長Ｘにおける吸光度 異なる波長が５５０〜６５０ｎｍである請求項１に記載の金コロイドの粒径調整方法。 粒径調整が、金コロイド溶液の粒度分布の調整である請求項１に記載の金コロイドの粒径調整方法。 金コロイド溶液の最大吸収波長（λｍａｘ）及び最大吸収波長とは異なる波長Ｘにおける吸光度（ＡλＸ）の最大吸収波長における吸光度（Ａλｍａｘ）に対する比（ＡλＸ／Ａλｍａｘ）を測定し、 粒径と最大吸収波長（λｍａｘ）及び吸光度の比（ＡλＸ／Ａλｍａｘ）の関係を求め、それにもとづいて所望の粒径の金コロイド溶液を得ることを特徴とする、金コロイド溶液の製造方法。 金コロイド溶液の最大吸収波長（λｍａｘ）及び最大吸収波長とは異なる波長Ｘにおける吸光度（ＡλＸ）の最大吸収波長における吸光度（Ａλｍａｘ）に対する比（ＡλＸ／Ａλｍａｘ）が以下の関係を満たす、金コロイド溶液。（ｉ）ａ≦λｍａｘ≦ｂ（ｉｉ）ｃ≦Ａλｘ／Ａλｍａｘ≦ｄ 最大吸収波長とは異なる波長Ｘが６００ｎｍであるとき、ａ，ｂ，ｃ，ｄが以下の関係を満たす、所望の平均粒径の金コロイド溶液。 金コロイド溶液の最大吸収波長（λｍａｘ）及び最大吸収波長とは異なる波長Ｘにおける吸光度（ＡλＸ）の最大吸収波長における吸光度（Ａλｍａｘ）に対する比（ＡλＸ／Ａλｍａｘ）が以下の関係を満たす請求項６に記載の金コロイド溶液。（ｉ）５３０≦λｍａｘ≦５３５（ｉｉ）０．３４≦Ａλ６００／Ａλｍａｘ≦０．４４ イムノクロマト法、フロースルーアッセイ法、金コロイド凝集比色法に用いられるものである請求項５〜７のいずれかに記載の金コロイド溶液。 請求項８に記載の金コロイド溶液を用いて標識した抗体または抗原を含んで成る診断用試薬。 抗体が、インフルエンザの鑑別診断用抗体である請求項９に記載の金コロイド溶液。 請求項１０に記載の金コロイド溶液を用いて標識したインフルエンザの鑑別診断用抗体を含浸させた標識抗体パッドを含むインフルエンザ鑑別診断用キット。 【課題】本発明は、高価な機器、熟練した技術を必要とすることなく、簡便かつ精度良く、金コロイドの粒径を調整する方法の提供を課題とする。また、粒径が所定の範囲内の金コロイド溶液の提供を課題とする。【解決手段】最大吸収波長の他に、金コロイド溶液の最大吸収波長における吸光度（Ａλｍａｘ）および最大吸収波長とは異なる波長における吸光度（ＡλＸ）の比（ＡλＸ／Ａλｍａｘ）を測定することによって、金コロイド粒子の粒度分布幅を推定し、金コロイド粒径を調整する方法および、本方法を用いて得られる金コロイド溶液を提供する。【選択図】なし