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吉田 尚之 石田 和史 佐々木 修治 池田 拓生 平木 純 青山 茂之 JP 2006274245 公開特許公報(A) 20061012 2006049780 20060227 硫酸化セルロース及びその塩から選ばれた化合物並びに皮膚炎治療剤 チッソ株式会社 000002071 チッソ石油化学株式会社 596032100 小林 浩 100092783 片山 英二 100095360 田村 恭子 100128761 鈴木 康仁 100104282 吉田 尚之 石田 和史 佐々木 修治 池田 拓生 平木 純 青山 茂之 JP 2005055468 20050301 C08B 5/14 20060101AFI20060915BHJP A61K 31/717 20060101ALI20060915BHJP A61P 43/00 20060101ALI20060915BHJP A61P 17/00 20060101ALI20060915BHJP A61K 8/73 20060101ALN20060915BHJP A61Q 19/00 20060101ALN20060915BHJP JPC08B5/14A61K31/717A61P43/00 111A61P17/00A61K8/73A61Q19/00 12 ＯＬ 16 4C083 4C086 4C090 4C083AD261 4C083CC01 4C083CC02 4C083EE12 4C083EE13 4C086AA01 4C086AA02 4C086AA03 4C086EA26 4C086MA01 4C086MA04 4C086NA14 4C086ZA89 4C086ZC20 4C090AA02 4C090AA05 4C090AA09 4C090BA27 4C090BB54 4C090BB63 4C090BB85 4C090BB95 4C090BD37 4C090CA38 4C090DA23 4C090DA26 本発明は、耐加水分解性に優れた硫酸化セルロース及びその塩から選ばれた化合物、並びにそれを用いた皮膚炎治療剤及び化粧料に関する。詳しくは、特にアトピー様の皮膚症状を予防、緩和、改善または治癒することを意図して製造される皮膚外用剤の有効成分として使用可能な硫酸化セルロース及びその塩から選ばれた化合物、並びにそれを用いた皮膚炎治療剤及び化粧料に関する。 代表的な生物起源の高分子電解質であるヘパリンは抗血液凝固活性、抗ウイルス活性、あるいは抗炎症活性等の多様な生理活性を有すことが知られている（例えば、非特許文献１参照）。この多様な生理活性を示すヘパリンの類似物質を得る試みとして、これまで多くの天然多糖類の硫酸化が行なわれている（例えば、非特許文献２参照）。多くの硫酸化多糖の中、特に、多硫化ムコ多糖類の一種であるコンドロイチン硫酸は代表的なヘパリン類似物質として知られている（例えば、特許文献１参照）。コンドロイチン硫酸及びその硫酸基導入誘導体の用途として、そのヒアルロニダーゼ阻害活性能や皮膚保湿作用を有すことから、乾皮症、皮脂欠乏症、進行性指掌角皮症等の乾燥性皮膚疾患やアトピー性皮膚炎への適用が検討されている（例えば、特許文献２、３参照）。また、硫酸化多糖が黄色ブドウ球菌由来のヒアルロニダーゼの阻害活性を示すことが報告され（例えば、特許文献４参照）、硫酸化多糖のアトピー性皮膚炎の治療剤への可能性が述べられている。また、硫酸化シュクロースのヒアルロニダーゼ活性阻害と抗炎症効果の検討が実施されている（例えば、特許文献５参照）。 ヒアルロニダーゼ活性阻害による抗炎症作用や組織再生作用は次のメカニズムによるものと考えられている。ヒアルロニダーゼによってヒアルロン酸とグリコサミノグリカンが分解することによって、細胞表面もしくは支持マトリックス物質が崩壊して、細胞は暴露され、病原体、炎症媒介物質、炎症剤、及び防腐剤のような種々の薬剤によって損傷されるようになる。硫酸化多糖のようなヒアルロニダーゼ活性阻害剤は、該酵素の活性を阻害することにより、細胞表面と保護接続組織のマトリックスの再生を促進させ、その結果、抗炎症や組織再生の作用を行なうものと考えられる。 このようにアトピー様の皮膚症状の改善または治癒等を目的に、ヒアルロニダーゼの活性阻害を指標として、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デキストラン等の硫酸化物が鋭意研究されてきたが、セルロースの硫酸化物に関してはヒアルロニダーゼの阻害活性について詳細に検討された報告はない。同様に、硫酸化セルロース及びその塩のアトピー性皮膚炎への効能確認についても詳細に検討された事例はない。この原因の一つとして、天然のセルロースの構造や分子量が多様で、得られる硫酸化セルロース及びその塩の性質が一定せず、加水分解等によって経時変化しやすいことが考えられる。 また、医療現場ではアトピー性皮膚炎の治療にはステロイド系の抗炎症剤が使用されているが、これらステロイド系の治療薬は強い副作用を伴い、特に軽度な患者へのステロイド類の投与は禁忌されているのが現状である。他方、非ステロイド系抗炎症剤は一般的に効力が弱い。従って、副作用を伴わず、低濃度で十分な効能を有するアトピー性皮膚炎の治療薬の開発が望まれている。また、敏感肌やアトピー様の皮膚向け化粧料用途でも、配合上の製品の品質を維持させるために、安全性が高く、低濃度で高い効能を示す基材が求められている。更に、安全性の観点で、天然材料についてはＢＳＥ（狂牛病）発生以来、医療あるいは化粧品を扱う当業者は動物種以外を起源とする材料を求める傾向にある。特に、日本薬局方外医薬品規格に記載のヘパリン類似物質以上の性能を有し、動物種以外を起源とする植物由来の物質の開発が求められている。特公昭６２−４３６２号公報特開平８−２７７２２４号公報特開平１１−３３５２８８号公報特開２０００−１７８１９６号公報特許第２７２３４７３号公報Int. J. Biochem. Cell. Biol. ２９巻、７０９−７１４頁、１９９７年Trend in Glycoscience and Glycotechnology１５巻、８１号、２９−４６頁 本発明の課題は、例えばアトピー様の皮膚症状を予防、緩和、改善または治癒することを意図して製造される皮膚外用剤の有効成分として使用可能な、耐加水分解性に優れた硫酸化セルロース及びその塩から選ばれた化合物、並びにそれを用いた皮膚炎治療剤及び化粧料などを提供することである。 本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行なった。その結果、結晶セルロースから得られた硫酸化セルロース及びその塩から選ばれた化合物であり、２０℃の純水に対する溶解度が３ｇ／Ｌ以上である化合物が、既存のコンドロイチン硫酸（ヘパリン類似物質）等と比較して、高いヒアルロニダーゼ阻害活性及びアトピー性皮膚炎に対する顕著な改善効果を示すことを知り、この知見に基づき本発明を完成した。 本発明は、以下により構成される。１）結晶セルロースから得られた硫酸化セルロース及びその塩から選ばれた化合物であり、２０℃の純水に対する溶解度が３ｇ／Ｌ以上である化合物。２）結晶セルロースの平均重合度が１５０〜３００である前記１）項記載の化合物。３）硫黄含量が６．５〜１９．０重量％である前記１）または２）記載の化合物。４）重量平均分子量が１，０００〜２００，０００である、前記１）〜３）のいずれか１項記載の化合物。５）硫酸化セルロースカルシウム塩または硫酸化セルロースナトリウム塩である、前記１）〜４）項のいずれか１項記載の化合物。６）結晶セルロースから得られた硫酸化セルロース及びその塩から選ばれた化合物であって、硫黄含量が６．５〜１９．０重量％であり、重量平均分子量が５０，０００〜８０，０００であって、２０℃の純水に対する溶解度が３ｇ／Ｌ以上である化合物。７）硫酸化セルロースカルシウム塩または硫酸化セルロースナトリウム塩である、前記６）記載の化合物。８）温度３７℃の０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）中において、ウシ睾丸由来のヒアルロニダーゼのヒアルロン酸分解活性を５０％阻害する濃度が０．０１８ｍｇ／ｍＬ以下である前記１）〜７）項のいずれか１項記載の化合物。９）ＮＣマウスを用いた皮膚炎モデルに対して皮膚炎抑制作用を示す、前記１）〜７）項のいずれか１項記載の化合物。１０）前記１）〜９）項のいずれか１項記載の化合物を少なくとも１種含有する皮膚炎治療剤。１１）アトピー性皮膚炎を治療するためのものである、前記１０）記載の皮膚炎治療剤。１２）前記１）〜９）項のいずれか１項記載の化合物を少なくとも１種含有する化粧料。 本発明の硫酸化セルロース及びその塩から選ばれた化合物は耐加水分解性に優れている。この硫酸化セルロース化合物を有効成分とする皮膚炎治療剤は、品質が安定で高い効果が経時的に低下しにくく、特にアトピー様の皮膚症状の予防、またはその症状緩和、改善または治癒に有効である。 本発明の硫酸化セルロース及びその塩から選ばれた化合物（以下、硫酸化セルロース化合物という）は、結晶セルロースが硫酸化により電解質化され水溶解性が付与された化合物、またはその塩である。硫酸化セルロース化合物の原料となるセルロースは結晶セルロースであるため、得られた硫酸化セルロース化合物は耐加水分解性に優れており、この硫酸化セルロース化合物から得られた皮膚炎治療剤は高い効果が経時的に低下しにくい。 また、本発明の硫酸化セルロース化合物の２０℃の純水に対する溶解度は３ｇ／Ｌ以上、好ましくは１５ｇ／Ｌ以上２０ｇ／Ｌ未満である。溶解度が３ｇ／Ｌ以上であれば、本発明の硫酸化セルロース化合物は、電解質化され水溶解性が付与されており、特にアトピー様の皮膚症状を予防、またはその症状緩和、改善または治癒に有効である。 本発明の硫酸化セルロース化合物に用いられる結晶セルロースは、植物由来のものなら種類を問わないが、平均重合度が１５０〜３００、特に２４０程度であると、結晶性が高く化学的に安定なものが得られやすく、好ましい。該結晶セルロースを用いて得られる硫酸化セルロース化合物も化学的に安定で耐加水分解性に優れ、その結果、該硫酸化セルロース化合物を有効成分とする皮膚炎治療剤は高い効果が経時的に低下しにくい。 本発明の硫酸化セルロース化合物に用いられる結晶セルロースとしては、第十三改正日本薬局方収載品が好ましく、例えば、セルロース微結晶（和光純薬工業（株）、大阪市）や結晶セルロース（商品名セオラス、旭化成（株）、東京）等市販のものが使用できる。本発明で用いられる結晶セルロースの結晶化度（Ｘ線回折法［アビセル時報、３０号、１９７３年］により測定）は、６３％以上が好ましい。 本発明の硫酸化セルロース化合物の重量平均分子量は、特に限定はされないが、１，０００〜２００，０００が好ましく、５０，０００〜８０，０００がより好ましい。重量平均分子量が上記範囲の硫酸化セルロース化合物は、上記の結晶性の高い結晶セルロースから得られるため、化学的に安定で皮膚炎治療剤の有効成分として好適である。 結晶セルロースを硫酸化する方法は特に限定されないが、例えば、次のようにして行うことができる。まず、結晶セルロースをピリジン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド等の溶媒で膨潤させ、硫酸化剤としてクロルスルホン酸、ピペリジン−Ｎ−硫酸、無水硫酸−ジメチルホルムアミド錯体、三酸化硫黄−ピリジン錯体、三酸化硫黄−トリメチルアミン錯体、硫酸−トリメチルアミン複合体等を滴下する。硫酸化剤の使用量は、目的とする硫酸化セルロースの硫酸化率（または硫黄含有率）及び反応条件に従って任意に選ぶことができるが、セルロース水酸基に対し、１．２〜３当量用いるのが適当である。反応は、溶媒、硫酸化剤によっても異なるが、不活性ガス中で、０〜１００℃、好ましくは２０〜８５℃にて、０．５〜２４時間、好ましくは０．５〜１０時間行なう。反応後、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン等を加えて、ポリマーを沈殿させる。またはメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン等の中に反応液を滴下し、ポリマーを沈殿させてもよい。また、蒸留水を加えて反応を停止し、次いで、アルカリ、例えば水酸化ナトリウムで中和してもよい。これをろ過または遠心分離し、蒸留水に溶解し、再度エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン等を加えて、ポリマーを沈殿させるか、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン等の中に滴下し、ポリマーを沈殿させ、乾燥することによって硫酸化セルロースを得ることができる。また、イオン交換樹脂カラムを用いて余剰の無機塩を除去し、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン等を加えて、ポリマーを沈殿させてもよい。あるいは蒸留水に溶解後透析し、濃縮乾燥することによって硫酸化セルロースを得ることもできる。 硫酸化セルロースは、薬学的、生理学的に許容される塩形態として使用することもできる。例えば、カルシウム等のアルカリ土類金属塩もしくはナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩等の無機塩、またはシクロヘキシルアミン等のアミン類を用いる造塩反応により得られる塩形態があげられる。特に、製造工程上の簡易さからカルシウム塩、ナトリウム塩がより好ましい。中でも、カルシウム塩は、多様な皮膚炎の症状に対して効果が期待される。 硫酸化セルロースカルシウム塩は、例えば硫酸化セルロース水溶液に塩化カルシウム水溶液を加えて中和することにより得ることができる。この場合、硫酸化セルロース水溶液の濃度は特に制限は無いが５〜２０重量％程度が好ましい。塩化カルシウム水溶液の濃度も特に制限はないが飽和水溶液が好ましい。硫酸化セルロースカルシウム塩を析出沈殿させるにはアルコール系等の両親媒性溶剤であれば良いが、好ましくはメタノール、エタノール、イソプロピルアルコールである。 硫酸化セルロース化合物の硫黄含量は、６．５〜１９．０重量％が好ましく、１２〜１５重量％がより好ましい。硫黄含量が上記の範囲であれば顕著なヒアルロニダーゼ阻害活性を呈する。 本発明の硫酸化セルロース化合物は、ヒアルロニダーゼ阻害活性を示すことができる。ヒアルロニダーゼの阻害活性はMorgana−Elson法を改良したReissig法（J.Biol.Chem.，２１７，９５９，１９５５）を定量の原理として求めることができる。例えば、ヒアルロニダーゼ５０％阻害濃度を求める方法は特許第３０６６４８４号記載の方法で行うことができる。 また、硫酸化度の違いによるヒアルロニダーゼの阻害活性の測定は、基質となるヒアルロン酸と種々の硫酸化度の硫酸化セルロース化合物からなる溶液に一定濃度のヒアルロニダーゼを加えた後、一定時間反応させ、ヒアルロン酸の分解速度を解析することによって求めることができる。 本発明の硫酸化セルロース化合物は、温度３７℃の０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）中において、ウシ睾丸由来のヒアルロニダーゼのヒアルロン酸分解活性を５０％阻害する濃度が０．０１８ｍｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、０．０１５ｍｇ／ｍＬ以下であることがより好ましい。該濃度が０．０１８ｍｇ／ｍＬ以下であれば、一般的に顕著なヒアルロニダーゼ阻害活性があると認められ、皮膚炎治療剤として高い効果が期待できる。 本発明の硫酸化セルロース化合物のアトピー性皮膚炎に対する薬効は、例えば平澤らの例のように、ＮＣマウスを用いた動物試験で確認することが可能である（平澤ら。Pharmacometrics，５９，１２３−１３４，２０００）。ＮＣマウスはコンベンショナル環境下で飼育するとダニや黄色ブドウ球菌を抗原として人のアトピー性皮膚炎症状と非常によく似た症状を自然発症するモデル動物で、アトピー性皮膚炎治療薬の開発に広く使用されている（CRJ Letters，１１、１−８，１９９８）。症状を発したＮＣマウスの患部に本発明の硫酸化セルロース化合物を一定の時間的間隔で一定量投与し、皮膚の状態を観察する。皮膚炎の状態は、ヒトのアトピー性皮膚炎の臨床症状における評価基準等に基づいて定められた皮膚炎のスコアにより評点化することができる。その際、既存のコンドロイチン硫酸等を対照群として用いることによって、本発明の硫酸化セルロース化合物との効能比較ができる。なお、本発明においてＮＣマウスを用いた皮膚炎モデルに対して皮膚炎抑制作用を示すというときは、病理組織学的所見により皮膚炎の症状進展が抑制されていることを意味する。 本発明の皮膚炎治療剤は有効成分として前記硫酸化セルロース化合物の少なくとも１種を含有する。該皮膚炎治療剤における硫酸化セルロース化合物の含有量は、皮膚炎治療剤の形態や適用部位、適用の方法や回数等により異なり、また症状の軽重等に依存して広範囲に変えることができるが、皮膚炎治療剤の全成分量に対する硫酸化セルロース化合物の含有量が、好ましくは０．００１〜５重量％、より好ましくは０．００５〜１．０重量％になるように配合する。 本発明の硫酸化セルロース化合物を有効成分とする皮膚炎治療剤は、その薬理学的作用を実質的に害さない限りにおいて他の成分を含有してもよい。含有されるものの例として、医薬や化粧料で常用される保存剤、安定化剤、保湿剤、香料、界面活性剤等があげられる。 尚、本発明の皮膚炎治療剤はアトピー様の皮膚症状の予防、またはその症状を緩和または改善または治癒を意図するものであるが、アトピー様のみならず敏感肌や乾燥肌からくるかゆみ等の炎症やアレルギー様の症状に対する、予防、悪化防止、症状緩和、及び治療の意図も包含する。 本発明の皮膚炎治療剤は、ローション、乳剤、軟膏剤等の形態で用いられる。具体的には軟膏剤、硬膏剤、エアゾール剤、液剤、懸濁剤、貼付剤、ローション剤等の製剤を挙げることができる。また液剤等をガーゼ、脱脂綿、創傷被覆材、粘着プラスター等に含浸させ用いることもできる。 尚、本発明の皮膚炎治療剤は、更に化粧水、乳液、クリーム等の化粧料の形態でも用いられる。 本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、特に断りのない限り、％は重量％である。以下に、実施例・比較例で用いた評価試験方法を述べる。１）溶解度 溶解度は温度２０℃で水１０ｍＬ中に溶解する重量を測定した。２）硫黄含量 硫黄含量は酸素フラスコ燃焼−イオンクロマトグラフ法により測定した。３）硫酸化セルロース化合物の重量平均分子量 硫酸化セルロース化合物の重量平均分子量はゲルろ過法により測定した。即ち、プルラン（Pullulan Shodex Standard Ｐ−８２）を分子量標準とし、被測定物質を、カラムとしてShodex OHpak ＳＢ−８０４ＨＱ、移動層として０．２ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム溶液を用い、流速０．５ｍＬ／分で溶出させ、溶出液を示差屈折器で分析し、溶出時間を測定し、重量平均分子量を求めた。４）結晶セルロースの平均重合度 結晶セルロースの平均重合度は第十三改正日本薬局方解説書（１９９６年、廣川書店刊行）Ｄ−５８６〜５８９に記載された確認試験（３）の方法により測定した。（硫酸化セルロースカルシウム塩の合成）合成例１ 温度計、滴下ロート、攪拌装置、及び窒素ガス導入管を備えた３Ｌ（リットル）のセパラブルフラスコに、結晶セルロース（セオラスＰＨ−１０１（商品名）、平均重合度２４２）１８０．０ｇ及びジメチルホルムアミド１６０ｍＬを投入し、一晩攪拌した。次に、氷冷下１８％−無水硫酸−ジメチルホルムアミド錯体１２２０．７５ｇを３５分かけて投入した後、反応容器を２０℃の恒温槽に浸け、２０分かけて昇温させ２０℃で６時間反応させた。 反応終了後、反応容器を５℃まで氷冷し、氷冷しながら反応液を水１２２０ｍＬ中に７５分かけて徐々に投入し、続いて、水酸化カルシウムを反応液のｐＨが７になるまで徐々に投入した。このとき中和に要した水酸化カルシウムは７０．８２ｇであった。生じた沈殿をろ別し、ろ液を２０Ｌのイソプロピルアルコール中に投入してポリマーを析出させ、ろ別し、ろ液を４０℃で８時間減圧乾燥し、硫酸化セルロースカルシウム塩を得た。得られた硫酸化セルロースカルシウム塩の収量は１３０ｇであり、２０℃の純水に対する溶解度は１５ｇ／Ｌ、硫黄含量は１４．０重量％、重量平均分子量は７７，０００であった。合成例２ 温度計、滴下ロート、攪拌装置、及び窒素ガス導入管を備えた３．０Ｌのセパラブルフラスコに、結晶セルロース（セオラスＰＨ-１０１）１５．０ｇ及びジメチルホルムアミド７５ｍＬを投入し、室温で１５時間攪拌した。次に、氷冷下、１８．８重量％濃度の無水硫酸−ジメチルホルムアミド溶液３３７．５ｇを投入した後、反応容器を２４℃の恒温槽に浸け、２０分かけて昇温させ２４℃で６時間反応させた。 反応容器を５℃まで氷冷し、氷冷しながらイソプロピルアルコール３７５ｍＬを投入し、析出物を得た。３０分攪拌後、沈殿物をろ別し、これを１０℃以下に冷却したイオン交換水３７５ｍＬに溶解し１５分間攪拌した。次いで飽和塩化カルシウム水溶液１０４．０ｇ、イソプロピルアルコール７５０ｍＬを加えて沈殿を析出させた。これをろ別し、ろ液を４０℃で８時間減圧乾燥し、硫酸化セルロースカルシウム塩を得た。得られた硫酸化セルロースカルシウム塩の収量は４０．３ｇであり、２０℃の純水に対する溶解度は１５ｇ／Ｌ、硫黄含量は１５．４重量％であった。重量平均分子量は７６，０００であった。 以下、無水硫酸−ジメチルホルムアミド溶液の使用量を表１のように変化させた以外は合成例２と同様な方法で反応させ合成例３〜７の硫酸化セルロースカルシウム塩を得た。合成例２〜７で得た硫酸化セルロースカルシウム塩の２０℃の純水に対する溶解度、硫黄含量、及び重量平均分子量を表１に示した。（硫酸化セルロースナトリウム塩の合成）合成例８ 温度計、滴下ロート、攪拌装置、及び窒素ガス導入管を備えた５００ｍＬのセパラブルフラスコに、結晶セルロース（セオラスＰＨ−１０１）１５．０ｇ及びジメチルホルムアミド７５ｍＬを投入した。次に、氷冷下１９％−無水硫酸−ジメチルホルムアミド錯体１６３．８ｇを２２分かけて投入した後、反応容器を２０℃の恒温槽に浸け、２０分かけて昇温させ２０℃で６時間反応させた。 反応容器を５℃まで氷冷し、氷冷しながらイソプロピルアルコール５００ｍＬを投入し、析出物を得た。３０分攪拌後、沈殿物をろ別し、これを１０℃以下に冷却したイオン交換水２００ｍＬに溶解し１５分間攪拌した。次いで２０％水酸化ナトリウム水溶液を反応液のｐＨが７になるまで徐々に投入した。続いて、イソプロピルアルコール５００ｍＬを加えてポリマーを析出させ、ろ別した。これを４０℃で８時間減圧乾燥し、硫酸化セルロースナトリウム塩を得た。得られた硫酸化セルロースナトリウム塩の収量は２６．８ｇであり、２０℃の純水に対する溶解度は１８０ｇ／Ｌ、硫黄含量は１３．６重量％であった。合成例９ 温度計、滴下ロート、攪拌装置、及び窒素ガス導入管を備えた３．０Ｌのセパラブルフラスコに、結晶セルロース（セオラスＰＨ-１０１）７５．０ｇ及びジメチルホルムアミド３７５ｍＬを投入し、室温で１５時間攪拌した。次に、氷冷下、１７．７重量％濃度の無水硫酸−ジメチルホルムアミド溶液８４５．９ｇを投入した後、反応容器を２０℃の恒温槽に浸け、２０分かけて昇温させ２０℃で６時間反応させた。 反応終了後、反応液を水３０００ｍＬ中に投入し、続いて、２０％水酸化ナトリウム水溶液を反応液のｐＨが７になるまで徐々に投入した。生じた沈殿をろ別し、ろ液に塩化ナトリウム１４０．０ｇを投入し、３０分攪拌した。次いで、3Ｌのメチルアルコール中に投入してポリマーを析出させ、ろ別し、これを４０℃で８時間減圧乾燥し、硫酸化セルロースナトリウム塩を得た。得られた硫酸化セルロースカルシウム塩の収量は１２８．５ｇであり、２０℃の純水に対する溶解度は１８０ｇ／Ｌ、硫黄含量は１３．９重量％であった。実施例１ 合成例１で得た硫酸化セルロースカルシウム塩を日本薬局方注射用水で希釈して、硫酸化セルロースカルシウム塩濃度０．５重量％の皮膚炎治療剤を調製した。実施例２ 合成例１で得た硫酸化セルロースカルシウム塩を日本薬局方注射用水で希釈して、硫酸化セルロースカルシウム塩濃度０．１重量％の皮膚炎治療剤を調製した。比較例１ 比較例１として、ヒルドイドソフト（マルホ（株）製、１ｇ中に硫酸化コンドロイチン硫酸３ｍｇ含有の軟膏）を用いた。［アトピー性皮膚炎モデルＮＣマウスの皮膚炎の進展に対する抑制効果試験１］ ＮＣ／Ｎｇａ系雄性マウス（日本エスエルシー（株））の頭部後方から頸部背面及び背部にかけて注意深く剃毛し、上記実施例１及び２で調製した試料は１００μＬを、比較例１で調製した試料は１００ｍｇを、一日一回、１０日間にわたり、剃毛部及び耳の外側にプラスチック製のヘラで塗布した。試験は各群６匹ずつで行った。 全例について一日一回、被験物質塗布部位の外表の症状の状態観察を塗布終了後に行った。症状は次の分類表現に基づき耳及び頸背部についてスコア付けし、耳及び頸背部のスコアを合わせた総合スコアを算出した。 ０：無症状 １：表皮剥離（鱗屑、落屑）、発赤 ２：浮腫 ３：痂皮（びらん・潰瘍）が被験物質塗布部位の１／４未満のもの ４：痂皮（びらん・潰瘍）が被験物質塗布部位の１／２未満のもの ５：痂皮（びらん・潰瘍）が被験物質塗布部位の１／２以上のもの また、被験物質最終塗布の翌日に、エーテル麻酔下で放血致死させ、頭部、頸部及び背部の皮膚を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリン液で固定した。この皮膚組織を常法に従い、パラフィン包埋後、薄切し、ヘマトキシリン・エオジン染色及びトルイジンブルー染色標本を作製し、(1)炎症性細胞浸潤、(2)真皮の線維化、(3)扁平上皮過形成、(4)びらん、及び(5)痂皮を診断した。以下に各病理組織学的所見の診断基準を示す。(1)炎症性細胞浸潤 リンパ球、顆粒球、マクロファージ等が混じる細胞浸潤を炎症性細胞浸潤とした。グレード分けについては組織破壊を伴わないものを軽度（＋）、組織破壊を伴わないが、真皮全体に認められる場合を中程度（＋＋）、組織破壊を伴わないが、真皮を超えて認められる場合を高度（＋＋＋）とした。また、びらんの周辺のみに細胞浸潤が認められる場合には異常所見とはしなかった。(2)真皮の線維化 真皮の表層のみに線維化が認められる場合または真皮の厚さに変化が認められない場合を軽度（＋）、真皮全体の線維化により、真皮が肥厚している場合を中程度（＋＋）、標本上の真皮全体が肥厚している場合を高度（＋＋＋）とした。(3)扁平上皮過形成 細胞の肥大または細胞数の増加により扁平上皮（表皮）の厚さが明らかに肥厚している場合を軽度（＋）、乳頭状の間質を伴う場合を中程度（＋＋）、標本全体に肥厚が認められる場合を高度（＋＋＋）とした。(4)びらん 表皮の欠損が２００倍の倍率で１視野以内の大きさのものが２箇所以内に認められる場合または２視野以内の大きさのものが１箇所に認められる場合を軽度（＋）、２視野を超える大きさのものが１箇所以上に認められる場合を中程度（＋＋）、標本全体に認められる場合を高度（＋＋＋）とした。(5)痂皮 全体の１／３未満の皮膚を被うものを軽度（＋）とした（ただし、びらんの部分は除く）。 被験物質塗布部位の外表の症状の状態観察結果を表２に示した。また、(1)炎症性細胞浸潤、(2)真皮の線維化、(3)扁平上皮過形成、(4)びらん、及び(5)痂皮の診断結果を表３に示した。 本試験で用いた近交系ＮＣ／Ｎｇａマウスは、７−８週齢を境に顔、耳、頸、背部等に強い痒覚を伴う皮膚炎を自然発症し、その皮膚症状は加齢とともに悪化が見られる。このＮＣ／Ｎｇａマウスの強い痒覚を伴う皮膚炎は、引っかき行動の出現から始まり、出血を伴い、進行すると皮膚のびらん、潰瘍形成へと到り、皮膚は乾燥、肥厚する。これらはヒトのアトピー性皮膚炎ときわめて類似した症状と考えられている。試験には、頸部または背部に痂皮形成（スコア４）が観察された動物を順次使用し、症状及び体重が均一になるよう群分けを行った。 表２に示すように、今試験では、投与期間終了までに、実施例１で調製した皮膚炎治療剤では、６例全例（うち１例で症状の消失）で、実施例２で調製した皮膚炎治療剤では、６例中５例（うち２例で症状の消失）で、比較例１の皮膚炎治療剤では、６例中４例で、それぞれ症状の軽減が見られた。これらの結果は無処置群ではスコアの平均が増加傾向を示す（塗布０日目：４．０、塗布１１日目：４．５）ことを考慮すると、症状進展の抑制効果を示唆するものと考えられた。更に表２に示すように、実施例１及び実施例２で調製した皮膚炎治療剤は、比較例の皮膚炎治療剤に比べて、症状進展の抑制効果に優れていることが示された。 また、表３に示すように、実施例１及び実施例２で調製した皮膚炎治療剤は、比較例の皮膚炎治療剤に比べて、病理組織学的所見が認められる固体数の減少が認められた。特に、(1)炎症性細胞浸潤においては、実施例２で調製した皮膚炎治療剤は、比較例の皮膚炎治療剤に比べて、炎症性細胞浸潤が認められる固体数の有意な減少（ｐ＜０．０１、片側ノンパラメトリック型 Tukey's test）が認められた。実施例３〜６、比較例２、３［アトピー性皮膚炎モデルＮＣマウスの皮膚炎の進展に対する抑制効果試験２］ 合成例２〜５で得られた硫酸化セルロースカルシウム塩を用いて、アトピー性皮膚炎モデルマウスＮＣマウスの皮膚炎の進展に対する抑制効果を評価した。比較例２としてヒルドイドソフト（マルホ（株）製、１ｇ中に硫酸化コンドロイチン硫酸を３ｍｇ含有）を用い、比較例３として注射用水（（株）大塚製薬工場）を用いた。（誘発用２，４，６−トリニトロクロロベンゼンの調整） ２，４，６−トリニトロクロロベンゼン（東京化成工業（株））を１００ｍｇ秤量し、０．４ｍＬのアセトン（和光純薬工業（株））を加え溶解した後、１．６ｍＬのエタノール（（株）ワコーケミカル）を加えた溶液を調整し、感作用２，４，６−トリニトロクロロベンゼンとした。この溶液に最終濃度が０．８％（Ｗ／Ｖ）となるようオリーブオイル（和光純薬工業（株））を加え、誘発用２，４，６−トリニトロクロロベンゼン溶液とした。この作業は、黄色灯下、褐色ガラス製の容器を用い、投与直前におこなった。（ＮＣマウスの２，４，６−トリニトロクロロベンゼンによるアトピー性皮膚炎の誘発） ８週齢に達した雄のＮＣ/Ｎｇａ Ｔｎｄ Ｃｒｊマウス（日本チャールズ・リバー（株））の腹部を、エーテル麻酔下でバリカンを用いて毛刈りし、毛刈りした腹部及び足蹠に感作用２，４，６−トリニトロクロロベンゼン溶液の０．１５ｍＬをプラスチック製の棒を用いて塗布し、感作させた。誘発は、感作後の４日目に実施した。即ち、感作済みのＮＣマウスの背部を毛刈りし、毛刈りした背部及び左右の耳に誘発用２，４，６−トリニトロクロロベンゼン溶液を０．１５ｍＬをプラスチック製の棒を用いて塗布した。尚、本実施例に用いたＮＣマウスは、この方法による１回目の誘発で、後述する臨床症状に従った皮膚炎スコアの総計がｎ＝８で２５となるモデルマウスである。（投与） 合成例２〜５の硫酸化セルロースカルシウム塩を注射用水（（株）大塚製薬工場）に溶解し０．１％（Ｗ／Ｖ）溶液を調製した。この溶液をＮＣマウスの誘発した部位に０．１５ｍＬをプラスチック製の棒を用いて塗布した。投与は、各群ｎ＝８匹の２，４，６−トリニトロクロロベンゼン誘発ＮＣマウスを用い、１日１回塗布した。比較例２としてヒルドイドソフト１００ｍｇ、比較例３として注射用水（（株）大塚製薬工場）０．１５ｍＬを一日一回同様に塗布した。誘発後の７日目の症状を観察し、次に従ってＮＣマウスの皮膚症状をスコア化した。その結果を表４に示した。 皮膚炎スコアは(a)掻痒症、(b)発赤、出血、(c)浮腫、(d)擦傷・組織欠損、(e)痂皮形成・乾燥の項目について、無症状（０点）、軽度（１点）、中等度（２点）、高度（３点）を評点化し、その合計を用いた。合計スコアが大きい程、モデルマウスのアトピー症状が重篤になることを意味する。 本実施例の結果から、特に、硫黄含量が９．８％以上の硫酸化セルロースカルシウム塩が、誘発初期のアトピー症状が発症しつつある症状が非常に軽度なマウスに対して有効に機能することが判った。 尚、本実施例は平澤らの先例に従って実施した（平澤ら。Pharmacometrics, ５９，１２３−１３４，２０００）。実施例７〜１２［ウシ睾丸由来のヒアルロニダーゼの活性阻害試験１］ 合成例２〜７で得た硫黄含量の異なる硫酸化セルロースカルシウム塩を用い、ウシ睾丸由来のヒアルロニダーゼの活性阻害試験を行った。尚、用いた試薬は特に記載しない限り和光純薬工業（株）製である。 下記の６種の溶液を作製した。溶液Ａ：ウシ睾丸由来ヒアルロニダーゼ（シグマ社製）の０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）溶液（濃度 ２．８３ｍｇ／ｍＬ）。溶液Ｂ：０．３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム−０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝溶液（ｐＨ４．０）。溶液Ｃ：ヒアルロン酸ナトリウム（チッソ（株）製）の０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）溶液（濃度 １．８３ｍｇ／ｍＬ）。溶液Ｄ：０．４ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液。溶液Ｅ：０．８ｍｏｌ／Ｌホウ酸ナトリウム水溶液。溶液Ｆ：パラ−ジメチルアミノベンズアルデヒド１ｇに、１０Ｎ塩酸１．２５ｍＬ及び酢酸９８．７５ｍＬを添加した溶液。（試験溶液の調製） 溶液Ａ０．０２５ｍＬを溶液Ｂ０．２ｍＬと混合して３７℃で２０分間保った。これに合成例２から７で得た硫黄含量の異なる硫酸化セルロースカルシウム塩を０．００１ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０２ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ、及び１０．０ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した水溶液０．１ｍＬを各々添加し、３７℃で２０分間恒温槽に静置した。更に溶液Ｃ０．２ｍＬを加えて３７℃で２０分間恒温槽に静置した。次いで溶液Ｄ０．１ｍＬ及び溶液Ｅ０．１ｍＬを添加して３分間煮沸した後冷却し、溶液Ｆ３．０ｍＬを加え３７℃で２０分間恒温槽に静置し試験溶液を調製した。この試験溶液について、ヒアルロニダーゼの分解により生成した還元端のＮ−アセチルヘキソサミンを指標として、対照を純水に、５８５ｎｍにおける吸光度ＱEを測定した。（対照溶液１の調製） 溶液Ａの代わりに０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）を用い、硫酸化セルロースカルシウム塩水溶液の代わりに純水を用いた以外は、上記の試験溶液の調製と同様にして対照溶液１を調製した。この対照溶液１につき、試験溶液の場合と同様にして、５８５ｎｍにおける吸光度Ｑ1を測定した。（対照溶液２の調製） 硫酸化セルロースカルシウム塩水溶液の代わりに純水を用い、溶液Ｃの代わりに０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）を用いた以外は、上記の試験溶液の調製と同様にして対照溶液２を調製した。この対照溶液２につき、試験溶液の場合と同様にして、５８５ｎｍにおける吸光度Ｑ2を測定した。 ヒアルロニダーゼ活性阻害率を下記の式に従って求め、硫酸化セルロースカルシウム塩の濃度と該阻害率をプロットして、合成例２から７で得た硫酸化セルロースカルシウム塩のヒアルロン酸分解活性を５０％阻害する濃度（５０％阻害濃度）を求めた。 阻害率（％）＝{（Ｑ2−Ｑ1）−（ＱE−Ｑ1）}／（Ｑ2−Ｑ1） 表５に硫黄含量の異なる硫酸化セルロースカルシウム塩溶液の５０％阻害濃度と０．０１５ｍｇ／ｍＬにおける阻害率を示す。 合成例２〜７で得た硫酸化セルロースカルシウム塩はいずれも高い阻害活性を示した。実施例１３［ウシ睾丸由来のヒアルロニダーゼの活性阻害試験２］（試験溶液の調製） 実施例７〜１２と同様に、溶液Ａ０．０２５ｍＬを溶液Ｂ０．２ｍＬと混合して３７℃で２０分間保った後、これに合成例８で得た硫酸化セルロースナトリウム塩を０．００１ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０２ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ、及び１０．０ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した水溶液０．１ｍＬを各々添加し、３７℃で２０分間恒温槽に静置した。更に溶液Ｃ０．２ｍＬを加えて３７℃で２０分間恒温槽に静置した。次いで溶液Ｄ０．１ｍＬ及び溶液Ｅ０．１ｍＬを添加して３分間煮沸した後冷却し、溶液Ｆ３．０ｍＬを加え３７℃で２０分間恒温槽に静置し試験溶液を調製した。この試験溶液について、ヒアルロニダーゼの分解により生成した還元端のＮ−アセチルヘキソサミンを指標として、対照を純水に、５８５ｎｍにおける吸光度ＱEを測定した。対照溶液１と対照溶液２の調製は、実施例７〜１２と同様に行った。 ヒアルロニダーゼ活性阻害率を下記の式に従って求め、硫酸化セルロースナトリウム塩の濃度と該阻害率をプロットして、合成例８で得た硫酸化セルロースナトリウム塩のヒアルロン酸分解活性を５０％阻害する濃度（５０％阻害濃度）を求めた。 阻害率（％）＝{（Ｑ2−Ｑ1）−（ＱE−Ｑ1）}／（Ｑ2−Ｑ1） 表６に硫黄含量の異なる硫酸化セルロースナトリウム塩溶液の５０％阻害濃度と０．０１５ｍｇ／ｍＬにおける阻害率を示す。 表６に示すように、合成例８で得た硫酸化セルロースナトリウム塩は高い阻害活性を示した。比較例４、５、６ 硫酸化セルロースカルシウム塩または硫酸化セルロースナトリウム塩に代えて皮膚炎治療、保湿効果をうたわれているヒルドイドソフト（マルホ（株）製、１ｇ中に硫酸化コンドロイチン硫酸を３ｍｇ含有の軟膏。本品の溶液は軟膏の成分含有量を計算して調製した）と、そのヒアルロニダーゼ阻害活性が高いと言われているヘパリノイドの代表的化合物であるコンドロイチン硫酸二種に対し、実施例７〜１３と同様の方法によりヒアルロニダーゼ活性阻害試験を行った。その結果を表７に示す。 即ち、ヒルドイドソフトにおいては硫酸化セルロースカルシウム塩の１／３〜１／４程度、コンドロイチン硫酸においては１／５０〜１／１００程度の阻害活性しか見られなかった。また、ヒルドイドソフトにおいては硫酸化セルロースナトリウム塩の１／６程度、コンドロイチン硫酸においては硫酸化セルロースナトリウム塩の１／５０〜１／１００程度の阻害活性しか見られなかった。 表５〜７から明らかなように、硫黄含量が６．５〜１９．０重量％の実施例７〜１２の硫酸化セルロースカルシウム塩は、５０％阻害濃度が０．０１８ｍｇ／ｍＬ以下の低い値を示し、比較例４〜６の化合物等に比べて顕著なヒアルロニダーゼ活性阻害効果を示す。また、実施例１３の硫酸化セルロースナトリウム塩は、５０％阻害濃度が０．０１１ｍｇ／ｍＬを示し、比較例４〜６の化合物等に比べて顕著なヒアルロニダーゼ活性阻害効果を示す。 本発明の硫酸化セルロース化合物は、ヒアルロニダーゼ阻害活性を有するので、皮膚炎治療剤や化粧料として有用である。本発明の硫酸化セルロース化合物は特にアトピー様の皮膚症状の予防、またはその症状緩和、改善または治癒に有用である。 結晶セルロースから得られた硫酸化セルロース及びその塩から選ばれた化合物であり、２０℃の純水に対する溶解度が３ｇ／Ｌ以上である化合物。 結晶セルロースの平均重合度が１５０〜３００である、請求項１記載の化合物。 硫黄含量が６．５〜１９．０重量％である、請求項１または２記載の化合物。 重量平均分子量１，０００〜２００，０００を有する、請求項１〜３のいずれか１項記載の化合物。 硫酸化セルロースカルシウム塩または硫酸化セルロースナトリウム塩である、請求項１〜４のいずれか１項記載の化合物。 結晶セルロースから得られた硫酸化セルロース及びその塩から選ばれた化合物であって、硫黄含量が６．５〜１９．０重量％であり、重量平均分子量が５０，０００〜８０，０００であって、２０℃の純水に対する溶解度が３ｇ／Ｌ以上である化合物。 硫酸化セルロースカルシウム塩または硫酸化セルロースナトリウム塩である、請求項６記載の化合物。 温度３７℃の０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）中において、ウシ睾丸由来のヒアルロニダーゼのヒアルロン酸分解活性を５０％阻害する濃度が０．０１８ｍｇ／ｍＬ以下である、請求項１〜７のいずれか１項記載の化合物。 ＮＣマウスを用いた皮膚炎モデルに対して皮膚炎抑制作用を示す、請求項１〜７のいずれか１項記載の化合物。 請求項１〜９のいずれか１項記載の化合物を少なくとも１種含有する皮膚炎治療剤。 アトピー性皮膚炎を治療するためのものである、請求項１０記載の皮膚炎治療剤。 請求項１〜９のいずれか１項記載の化合物を少なくとも１種含有する化粧料。 【課題】本発明はアトピー様の皮膚症状を予防、緩和、改善または治癒することを意図して製造される皮膚外用剤の有効成分として使用可能な、耐加水分解性に優れた硫酸化セルロース及びその塩から選ばれた化合物、並びにそれを用いた皮膚炎治療剤及び化粧料を提供する。 【解決手段】結晶セルロースから得られた硫酸化セルロース及びその塩から選ばれた化合物であり、２０℃の純水に対する溶解度が３ｇ／Ｌ以上である化合物、並びにそれを用いた皮膚炎治療剤及び化粧料。 【選択図】なし

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