生命科学関連特許情報
| タイトル： | 特許公報(B2)_ハンチンチン遺伝子の発現抑制 |
| 出願番号： | 2005506175 |
| 年次： | 2008 |
| IPC分類： | C12N 15/09,A61K 48/00,A61K 31/7105,A61P 25/14 |
特許情報キャッシュ
金澤 一郎 劉 万兆 王 玉来 和田 圭司 後藤 順 村田 美穂 JP 4179562 特許公報(B2) 20080905 2005506175 20040430 ハンチンチン遺伝子の発現抑制 独立行政法人科学技術振興機構 503360115 廣田 雅紀 100107984 金澤 一郎 劉 万兆 王 玉来 和田 圭司 後藤 順 村田 美穂 JP 2003136477 20030514 20081112 C12N 15/09 20060101AFI20081023BHJP A61K 48/00 20060101ALI20081023BHJP A61K 31/7105 20060101ALI20081023BHJP A61P 25/14 20060101ALI20081023BHJP JPC12N15/00 AA61K48/00A61K31/7105A61P25/14 BIOSIS/WPI(DIALOG) PubMed JSTPlus(JDreamII) 特表２００６−５１５８６４（ＪＰ，Ａ） 特開平０７−０６７６６１（ＪＰ，Ａ） 特表２００３−５０３００８（ＪＰ，Ａ） Neurology,Vol.60,No.5 Suppl 1(2003.Mar.)p.A286 Proc.Jpn.Acad.Ser.B,Vol.79B,No.10(2003.Dec.)p.293-298 10 JP2004006360 20040430 WO2004101787 20041125 15 20051104 特許法第３０条第１項適用 平成１５年５月６日第４４回日本神経学会総会において「第４４回日本神経学会総会プログラム・抄録集」にて発表 高堀 栄二 【技術分野】【０００１】 本発明は、ＲＮＡｉ（RNA interference：ＲＮＡ干渉）法を利用するものであって、ハンチンチン遺伝子の発現を抑制することができる、ハンチンチンｍＲＮＡの標的となる特定配列に相同なセンス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡからなる二重鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：small interfering RNA）、該二重鎖ＲＮＡからなるハンチンチン遺伝子の発現抑制剤、該発現抑制剤を有効成分として含有するハンチントン病の予防及び／又は治療薬等に関する。【背景技術】【０００２】 ハンチントン病（ＨＤ）は、運動障害、認識喪失及び精神医学症状発現を特徴とする進行性の神経変性障害である（J. Med. 315, 1267-1276, 1986）。この病気は、普通、年齢３０〜５０歳の中年で発症するが、ある場合には非常に早期に、又は前記年齢よりも遅い時期に発症する場合もある。病徴は進行性であり、殆んどの場合は、運動障害の続発性の合併症の結果として発症の１０〜２０年後に死を招来する。ハンチントン病個体の脳の死後調査により、線条体に影響するニューロンの選択的喪失が判明している。ハンチントン病の原因遺伝子であるハンチンチン遺伝子は、ヒトでは染色体４の短腕における末端の細胞遺伝子学的サブバンド内にあるloci Ｄ４Ｓ１２６及びＤ４Ｓ９８に挟まれた２．２Ｍｂ領域にマッピングされている（Neuron 3, 183-190, 1989、J. Hum. Genet. 49, 7-16, 1991、Am. J. Hum. Genet. 51, 357-362, 1992）。【０００３】 ハンチントン病は、ハンチンチン遺伝子転写の第１エクソンにおいてＣＡＧリピートが伸長し、ポリグルタミン（poly Ｑ）トラクトに翻訳され、その結果脳線条体神経細胞が進行的に喪失することに因る遺伝性の神経変性疾患である（Annu. Rev. Med. 47, 201-209, 1996）。すなわち、ハンチントン病は、ハンチンチン遺伝子の第１エクソン部位上の非定常的なＣＡＧリピートの伸長によって引き起こされ、選択的脳線条体神経の死（loss）に至る。ハンチンチン遺伝子は、ハンチンチンという分子量３４８ｋＤａの細胞質タンパク質をコードし、中枢神経系（ＣＮＳ）及び非中枢神経系（non−ＣＮＳ）組織の両方において広く発現している。ハンチンチンタンパク質において、ＨＤ遺伝子のＣＡＧ３連配列（ＣＡＧ triplets）はポリグルタミン（poly Ｑ）に翻訳される。一般的に、正常及びミュータント（変異）ハンチンチンアレル中に、それぞれ６〜３７、３５〜１８０のＣＡＧリピートが含まれる。【０００４】 昨今、ハンチントン病に対する処置方法として、ハンチンチン遺伝子を処置したり、ハンチンチン遺伝子をターゲッティングにした方法、或いは、ハンチンチン遺伝子の発現するハンチンチンタンパク質に拮抗する物質を用いた方法等が開示されている。例えば、特開平７−６７６６１号公報には、患者の細胞に正常なハンチンチンタンパク質を発現するＤＮＡを導入して、ミュータントハンチンチン遺伝子を正常な遺伝子で置換する方法や、患者の細胞にハンチントン病のハンチンチン遺伝子のアンチセンスＲＮＡを転写・発現可能な配列をコードする遺伝子を導入する方法、或いはハンチントン病のハンチンチンタンパク質にアンタゴニストを投与する方法等の処置方法が開示されている。また、特表２００３−５０３００８号公報には、ハンチントン病のような常染色体優性疾患に対する処置方法として、ハンチントン病のＲＮＡを標的とした対立遺伝子特異的ターゲッティングによる処置方法が開示されている。しかし、これらの処置方法は、遺伝子導入の複雑さや安定性の問題、或いは得られる処置効果の面から、必ずしも期待通りのものとはなっていない。【０００５】 一方、近年、ある種の生物（線虫：Caenorhabditis elegans）では、二重鎖ＲＮＡによって遺伝子の発現を特異的に阻害できることが見い出された（Nature 391, 806-811, 1998、ＷＯ９９／３２６１９）。この現象は、ある遺伝子と相同な、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡからなる二重鎖ＲＮＡ（double-strand RNA：ｄｓ ＲＮＡ）が、その遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）の相同部分を破壊するという現象で、ＲＮＡｉ（RNA interference）と呼ばれている。この現象は、その後、種々の動物（Cell 95, 1017-1026, 1998、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14687-14692, 1998、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 5049-5054, 1999）や、植物（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 13959-13964, 1998）を含む下等な真核細胞において見い出されている。【０００６】 ＲＮＡｉは、発見された当初、哺乳動物細胞においては、約３０ｂｐ以上のｄｓＲＮＡを細胞内へ導入すると、細胞が本来持っている免疫機能によりアポトーシスを起こし、細胞が死んでしまうため、哺乳動物細胞での利用は困難と思われていた。しかし、２０００年にマウス初期胚や哺乳動物培養細胞でも、ＲＮＡｉが起こりうることが示され、ＲＮＡｉの誘導機構そのものは、哺乳動物細胞にも存在することが明らかになってきた（FEBS Lett 479, 79-82, 2000、ＷＯ０１／３６６４６）。【０００７】 このようなＲＮＡｉの機能を利用して、哺乳動物において、ある特定の遺伝子又は遺伝子群の発現を阻害することができれば有益であることは明らかである。多くの疾病（癌、内分泌疾患、免疫疾患など）は、哺乳動物の中で、ある特定の遺伝子又は遺伝子群が異常発現することによって起こるので、遺伝子又は遺伝子群の阻害は、これらの症状を治療するために使用することができる。また、変異型タンパク質の発現に起因して疾病が発症することもあり、このような場合には、変異した対立遺伝子の発現を抑えることで、疾病の治療が可能となる。更に、このような遺伝子特異的な阻害は、例えば、ＨＩＶなどのレトロウイルス（レトロウイルス中のウイルス遺伝子は、それらの宿主のゲノム中に組み込まれて、発現される）によって引き起こされるウイルス疾患を治療するためにも使用し得る。【０００８】 ＲＮＡｉの機能を引き起こすｄｓＲＮＡは、当初、約３０ｂｐ以上のｄｓＲＮＡの細胞内への導入が必要と考えられていたが、最近、更に短い（２１〜２３ｂｐ）のｄｓＲＮＡ（短二重鎖ＲＮＡ：ｓｉＲＮＡ：small interfering RNA）が、哺乳動物細胞系でも細胞毒性を示さずにＲＮＡｉを誘導できることが明らかになった（Nature 411, 494-498, 2001）。ｓｉＲＮＡは、体細胞の全ての発生段階において遺伝子の発現を抑制する強力な手段として認識されており、進行性の遺伝病等において、発病する前に、病気の原因となる遺伝子の発現を抑制する方法として期待し得る。しかし、今までこのようなｄｓＲＮＡによる遺伝子特異的な遺伝子発現の抑制方法をハンチントン病（ＨＤ）の遺伝病に効果的に適用した報告はなされていない。【０００９】 本発明の課題は、ハンチンチン遺伝子の発現を抑制することができる、ハンチンチンｍＲＮＡの標的となる特定配列に相同なセンス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡからなる二重鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、該二重鎖ＲＮＡからなるハンチンチン遺伝子の発現抑制剤、該発現抑制剤を有効成分として含有するハンチントン病の予防及び／又は治療薬等提供することにある。【００１０】 ハンチントン病は、ＨＤ遺伝子転写の第１エクソンにおいてＣＡＧリピートが伸長し、ポリグルタミン（poly Ｑ）トラクトに翻訳され、その結果脳線条体神経細胞が進行的に喪失することに因る遺伝性の神経変性疾患である。本発明者らは、ＣＡＧリピートの上流のハンチンチンｍＲＮＡを調べたところ、ｓｉＲＮＡの有効な標的である独特な配列を有する２つの部位を見い出した。そこで、この配列に相同なｄｓＲＮＡ配列として：ａ）５’非翻訳領域を標的としたｓｉＲＮＡ−５’ＵＴＲ、及び、ｂ）ＣＡＧリピートの上流近傍領域を標的としたｓｉＲＮＡ−ＨＤエクソン１、更に、ｃ）現在知られている通常のハンチンチン遺伝子とミュータントハンチンチン遺伝子との唯一の相違点はＣＡＧリピートの長さであることから、ＣＡＧリピートを直接標的にするｓｉＲＮＡ−ＣＡＧの３種類のｓｉＲＮＡを作製し、該ｓｉＲＮＡの影響について培養組織モデルや、ハンチントン病モデルマウスを用いることにより解析したところ、ｓｉＲＮＡ−ＨＤエクソン１が極めて効果的にハンチンチン遺伝子の発現を抑制し、ハンチントン病の発症を抑制することを見い出し、本発明を完成するに至った。【発明の開示】【００１１】 すなわち本発明は、（１）ハンチンチン遺伝子の発現を抑制することができる、ハンチンチンｍＲＮＡの標的となる特定配列に相同なセンス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡからなる二重鎖ＲＮＡであって、配列表の配列番号３に示される塩基配列及び配列表の配列番号４に示される塩基配列からなることを特徴とする二重鎖ＲＮＡや、（２）合成により製造されたセンス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡから形成された（１）記載の二重鎖ＲＮＡや、（３）遺伝子組換え方法を用いることにより製造されたセンス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡから形成された（１）記載の二重鎖ＲＮＡや、（４）遺伝子組換え方法を用いることにより製造されたセンス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡが、それらＲＮＡをそれぞれ転写することができるＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを宿主細胞に導入し、生成されたＲＮＡを取得することによって形成されたものである（３）記載の二重鎖ＲＮＡに関する。【００１２】 また本発明は、（５）上記（１）〜（４）のいずれか記載の二重鎖ＲＮＡからなるハンチンチン遺伝子の発現抑制剤や、（６）上記（１）〜（４）のいずれか記載の二重鎖ＲＮＡを、ＨＩＶ−１由来のprotein transduction domainであるＴＡＴ配列に付加した融合物からなるハンチンチン遺伝子の発現抑制剤や、（７）上記（１）〜（４）のいずれか記載の二重鎖ＲＮＡと、正電荷リボソーム／脂質との複合体からなるハンチンチン遺伝子の発現抑制剤や、（８）上記（１）記載の二重鎖ＲＮＡを転写することができるＤＮＡを組み込んだ発現ベクターからなるハンチンチン遺伝子の発現抑制剤に関する。【００１３】 更に本発明は、（９）上記（５）〜（８）のいずれか記載の発現抑制剤を有効成分として含有するハンチントン病の予防及び／又は治療薬や、（１０）さらに薬学的に許容される担体を含む（９）記載のハンチントン病の予防及び／又は治療薬に関する。【発明を実施するための最良の形態】【００１４】 本発明の二重鎖ＲＮＡとしては、ハンチンチン遺伝子の発現を抑制することができる、ハンチンチンｍＲＮＡの標的となる特定配列に相同なセンス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡからなるものであれば特に制限されるものではなく、上記ハンチンチン遺伝子の由来としては特に限定されないがヒト由来のハンチンチン遺伝子が好ましい。かかるハンチンチン遺伝子としては、配列表の配列番号１に示される塩基配列からなるハンチンチン遺伝子の第１エクソン（ＮＣＢＩアクセッション番号 Ｌ１２３９２及びＮＭ＿００２１１１の１〜５８４番目；配列表の配列番号１、その遺伝子の対応するアミノ酸配列については、配列番号２に示される）（Cell 72, 6, 971-983, 1993）を例示することができる。【００１５】 上記ハンチンチンｍＲＮＡの標的となる特定配列とは、ハンチンチンｍＲＮＡの特定の領域の部分配列、好ましくは１９〜２４ｂｐ、より好ましくは２１〜２３ｂｐ、特に好ましくは２１ｂｐの塩基長の部分配列をいい、かかるハンチンチンｍＲＮＡの標的配列としては、ハンチンチン遺伝子のエクソン１のＣＡＧリピートの上流近傍の領域に由来するＲＮＡ、特に、配列表の配列番号１に示される塩基配列の３４３〜３６３番目の塩基配列に由来するＲＮＡを好適に例示することができる。【００１６】 また、ハンチンチンｍＲＮＡの標的となる特定配列に相同なセンス鎖ＲＮＡとは、上記配列番号１に示される塩基配列の３４３〜３６３番目の塩基配列などに由来するＲＮＡをいい、ハンチンチンｍＲＮＡの標的となる特定配列に相同なアンチセンス鎖ＲＮＡとは、上記センス鎖ＲＮＡと相補的なＲＮＡをいい、具体的には、センス鎖ＲＮＡとしては、ＧＣＣＵＵＣＧＡＧＵＣＣＣＵＣＡＡＧＵＣＣ（配列番号３）を、アンチセンス鎖ＲＮＡとしては、ＵＣＣＧＧＡＡＧＣＵＣＡＧＧＧＡＧＵＵＣＡ（配列番号４）を好適に例示することができる。また、センス鎖ＲＮＡとしてＧＡＵＧＧＡＣＧＧＣＣＧＣＵＣＡＧＧＵＵＵ（配列番号５）を、アンチセンス鎖ＲＮＡとしてＵＵＣＵＡＣＣＵＧＣＣＧＧＣＧＡＧＵＣＣＡ（配列番号６）を挙げることもできる。【００１７】 本発明の二重鎖ＲＮＡは、通常これらセンス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡ同士が結合したｓｉＲＮＡとして構築されるが、便宜上、センス鎖ＲＮＡ配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換或いは付加された変異センス鎖ＲＮＡ配列と該変異センス鎖ＲＮＡ配列に相補的な変異アンチセンス鎖ＲＮＡ配列とのｓｉＲＮＡとして構築した二重鎖ＲＮＡも本発明の範囲に含まれる。上記「１又は数個の塩基が欠失、置換或いは付加された塩基配列」とは、例えば１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個の任意の数の塩基が欠失、置換或いは付加された塩基配列を意味する。【００１８】 本発明の二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を作製するには、合成による方法及び遺伝子組換え技術を用いる方法等、公知の方法を適宜用いることができる。合成による方法では、配列情報に基づき、常法により二重鎖ＲＮＡを合成することができる。また、遺伝子組換え技術を用いる方法では、センス鎖ＤＮＡやアンチセンス鎖ＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを構築し、該ベクターを宿主細胞に導入後、転写により生成されたセンス鎖ＲＮＡやアンチセンス鎖ＲＮＡをそれぞれ取得することによって作製することもできる。また、ハンチンチン遺伝子の特定配列のセンス鎖ＤＮＡ−リンカー−アンチセンス鎖ＤＮＡを用いて、ヘアピン構造を形成するＲＮＡを発現させることにより、所望の二重鎖ＲＮＡを作製することもできる。【００１９】 本発明のハンチンチン遺伝子の発現抑制剤としては、上記本発明の二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、該二重鎖ＲＮＡをＨＩＶ−１由来のprotein transduction domainであるＴＡＴ配列に付加した融合物、該二重鎖ＲＮＡと正電荷リボソーム／脂質との複合体、又は該二重鎖ＲＮＡを転写することができるＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを挙げることができる。上記発現ベクターとしては、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ベクター等のウイルスベクターや、動物細胞発現用プラスミドを挙げることができる。【００２０】 本発明のハンチントン病の予防及び／又は治療薬としては、上記本発明のハンチンチン遺伝子の発現抑制剤を有効成分として含有するものであれば特に制限されないが、この分野で通常用いられる薬学的に許容される担体、例えば結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分とともに用いることができる。該薬学的に許容される担体とともに用いる薬学的組成物は、その投与形態、例えば経口（口腔内又は舌下を含む）投与、或いは非経口投与（注射剤等）等に合わせて、薬学の分野ではそれ自体周知の製剤形態で製剤化することができる。【００２１】 また、本発明のハンチンチン遺伝子の発現抑制方法や、本発明のハンチントン病の予防及び／又は治療方法としては、上記本発明の発現抑制剤やハンチントン病の予防及び／又は治療薬を、哺乳動物の生体、組織又は細胞に導入する方法であれば特に制限されるものではなく、例えば、二重鎖ＲＮＡのそれぞれのＲＮＡを転写する遺伝子、ヘアピン状の二重鎖ＲＮＡを転写する遺伝子を哺乳動物の生体或いは生体細胞に導入するには、それ自体公知の遺伝子導入方法によって行うことができる。例えば、以下の導入方法を挙げることができる。（１）脳内注入法：胎児期や新生児期に二重鎖ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡを組み込んだ生体内で合成できる既に公知のウイルスベクターやプラスミド、ＴＡＴ−ｓｉＲＮＡ、正電荷リボソーム／脂質−ｓｉＲＮＡ複合体を直接に脳内注入する。成熟期に脳室内に投与する。（２）四肢や尻尾の静脈よりパルス注射法：短時間内に相当量の二重鎖ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡを組み込んだ生体内で合成できる既に公知のウイルスベクターやプラスミド、正電荷リボソーム／脂質−ｓｉＲＮＡ複合体を注入する。（３）腹腔内投与法：ｓｉＲＮＡを組み込んだ生体内で合成できる既に公知のウイルスベクター、ＴＡＴ−ｓｉＲＮＡを注入する。（４）鼻粘膜点滴導入法：二重鎖ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡを組み込んだ生体内で合成できる既に公知のウイルスベクター、ＴＡＴ−ｓｉＲＮＡを鼻粘膜から吸収させる。【実施例】【００２２】 以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。【実施例１】【００２３】［材料及び方法］（ｓｉＲＮＡｓの作製）アンチセンス鎖ＲＮＡとしては、ＵＣＣＧＧＡＡＧＣＵＣＡＧＧＧＡＧＵＵＣＡ（配列番号４） ハンチンチン遺伝子のエクソン１領域（ＮＣＢＩ アクセッション番号：Ｌ１２３９２及びＮＭ＿００２１１１の１〜５８４番目；配列番号１）を基にして、３種類のＲＮＡｓを設計した（図１）。２１ヌクレオチドからなる３種類のＲＮＡｓ、すなわち（１）ｓｉＲＮＡ−ＨＤエクソン１ センス鎖：配列番号１の３４３〜３６３番目；ＧＣＣＵＵＣＧＡＧＵＣＣＣＵＣＡＡＧＵＣＣ（配列番号３）、アンチセンス鎖：配列番号１の３４１〜３６１番目に相補的；ＵＣＣＧＧＡＡＧＣＵＣＡＧＧＧＡＧＵＵＣＡ（配列番号４）、（２）ｓｉＲＮＡ−５’ＵＴＲ センス鎖：配列番号１の１９０〜２１０番目；ＧＡＵＧＧＡＣＧＧＣＣＧＣＵＣＡＧＧＵＵＵ（配列番号５）、アンチセンス鎖：配列番号１の１８８〜２０８番目に相補的；ＵＵＣＵＡＣＣＵＧＣＣＧＧＣＧＡＧＵＣＣＡ（配列番号６）、（３）ｓｉＲＮＡ−ＣＡＧ センス鎖：配列番号１の３６７〜３８７番目；ＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡ（配列番号７）、アンチセンス鎖：配列番号１の４０９〜４２９番目に相補的；ＧＵＣＧＵＣＧＵＣＧＵＣＧＵＣＧＵＣＧＵＣ（配列番号８）、すべて図１参照）を化学的に合成し、ＨＰＬＣ精製を行った（Xeragan, USA）。二重鎖ｓｉＲＮＡｓは、アニーリングバッファー（１００ｍＭ酢酸カリウム、２ｍＭ酢酸マグネシウム、３０ｍＭＨＥＰＥＳ、０．１Ｎ水酸化カリウムでｐＨ７．４に調整、４℃で保存）中で、２０ｍＭのセンス鎖及びアンチセンス鎖ＲＮＡをアニールさせた。反応混合物を９５℃ ５分で反応させた後、１．５時間かけて３７℃まで徐々に冷却し、６〜２０時間室温下においた。アニール後のｓｉＲＮＡｓは、使用時まで、−２０℃若しくは−８０℃で保存した。【００２４】（プラスミドの構築） ５’ＵＴＲエクソン１及びＨＤエクソン１の２種類の発現ベクターを構築した。２つのタイプのコンストラクトは、５’ＵＴＲを含むもの、又は含まないもの、そして、両タイプとも通常（３４のＣＡＧリピートを含む）又は変異（３５以上のＣＡＧリピートを含む）ＨＤ遺伝子を用いて作製した。コンストラクトは、ヒトＨＤ ５’ＵＴＲ断片及びエクソン１の完全長pd1EGFP-N1（de-stabled EGFP, Clontech）ＥＧＦＰを持つインフレームと融合させた（図２参照）。【００２５】（細胞系及び培地） ＣＯＳ−７細胞（African green monkey fibroblasts：アフリカミドリザル繊維芽細胞）、ＳＨ−ｓｙ５ｙ細胞（human neuroblastoma：ヒト神経芽細胞腫）、及びNeuro-2A細胞（mouse neuroblastoma：マウスヒト神経芽細胞腫）のそれぞれ異なる起源を持つ３種の細胞系を用いた。ＣＯＳ−７細胞は、Minimum Essential Medium-Alpha Medium（Gibco BRL）、ＳＨ−ｓｙ５ｙ細胞及びNeuro-2A細胞は、ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）培地（Gibco BRL）中でそれぞれ培養した。なお、培地中には、１０％熱非動化ウシ胎児血清、１０Ｕ／ｍＬペニシリン（明治製菓社製）、及び５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（明治製菓社製）をそれぞれ含む。【００２６】（トランスフェクション） トランスフェクション２４時間前に播種した培養細胞を、抗生物質を含まない１０％ＦＢＳ含有培地中で増殖させた。２種類のトランスフェクション試薬を用いることにより、構造プラスミド及びｓｉＲＮＡｓの細胞への導入を行った。【００２７】 ａ．Effectene（Qiagen, Germany）：細胞培養及びトランスフェクション実験には、９６穴プレートを用いた。製造者の取扱説明書にしたがって、約４０〜６０％コンフルエントの細胞を、トランスフェクション前に２４時間前培養した。０．５μＬのEffectene試薬を各穴に添加し、２４時間後に結果を解析した。【００２８】 ｂ．Lipofectamine 2000（Invitrogen, USA）：製造者の取扱説明書にしたがって、約８０％コンフルエントの細胞を、トランスフェクション前に２４時間の前培養を行った。０．３μＬのLipofectamine 2000試薬を各穴に添加した。【００２９】 なお、ａ、ｂいずれの試薬を用いた実験においても、２４〜４８時間後に発現レベルを解析した。【００３０】 ｃ．ヒト内因性ＨＤ遺伝子発現の抑制に対するｓｉＲＮＡｓの影響を調べるために、Lipofectamine 2000試薬を用いて、ｓｉＲＮＡｓをＳＨ−ｓｙ５ｙ細胞に導入した。トランスフェクション後４８時間後に細胞を回収し、全ＲＮＡをTrizol（Invitrogen, USA）を用いて抽出した。【００３１】（ｓｉＲＮＡ効果の定量的評価） トランスフェクション後２４時間及び４８時間後に培養プレートを蛍光顕微鏡で観察した。ｓｉＲＮＡの効果を定量的に評価するために、Wallac 1420 ARVO sx（ParkinElmer, USA）又はFluoreScan IIを用いて、ＧＦＰ蛍光を測定した（励起：４８５ｎｍ、発光：５３８ｎｍ）。【００３２】（ｍＲＮＡレベルの定量） トランスジェニックＨＤエクソン１−ＥＧＦＰｍＲＮＡの定量的解析は、LightCycler（Roche, USA）を用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより行った。ＳＨ−ｓｙ５ｙ細胞の内因性ＨＤ発現におけるｓｉＲＮＡ−ＨＤエクソン１の効果をLightCycler（Roche, USA）を用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。コントロールとして、各サンプルごとのＧＡＰＤＨ及びβ−アクチンの発現レベルを定量した。【００３３】（哺乳類モデル動物） ハンチントン病モデルマウス（系統名：B6CBA-Tg(HDexon1)62oGpb/J、一般名：Ｒ６／２、購入元：The Jackson Laboratory, USA）を用いた。このマウスはハンチンチン遺伝子の一部（ハンチンチンプロモーター及び１１４個のＣＡＧリピート領域を含むエクソン１）約１ｋｂの長さのヒト遺伝子を導入したトランスジェニックマウスのＦ１のメスの卵巣を移植したhemizygoteである。生後約９週から１１週の間に発症し、臨床症状としては体重の減少、振戦、不安定歩行及び痙攣様発作などが示され、生後１５週までに全例が死亡する。神経病理学的な所見としてほとんどすべての神経細胞の核内に抗ハンチンチン抗体及び抗ユビキチン抗体に染まる核内封入体が検出できる。【００３４】（生体内投与方法） 生後２日のマウスの脳内に５０μｌのハミルトンのシリンジでｓｉＲＮＡ−ＨＤエクソンとリポフェクタミン（Lipofectamine 2000, Invitrogen, USA）とのコンプレクス５μｌの量（約２００ｎｇ ｓｉＲＮＡ−ＨＤエクソン含有）を注入した。針の注入位置はプレグマより後方へは１ｍｍ、右方へは１ｍｍであり、注入の深さは２ｍｍである。【００３５】（生体内でのｓｉＲＮＡ効果の定量的評価） ｍＲＮＡレベルの定量：脳内投与後ミュータントハンチンチンのｍＲＮＡの定量的解析は、ABI 7700 sequence detector system（ABI,USA）を用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより行った。プライマー配列：５’−ＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＴＣＣＴ−３’（フォワード；配列番号９）；５’−ＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴ−３’（リバース；配列番号１０）。内部標準としてＧＡＰＤＨとβ−アクチンを使用した。【００３６】 病理組織学的定量解析：室温でＰＢＳによる５分間前灌流してから、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で灌流固定した後、速やかに抜脳し、手早く同一固定液にて４℃で一晩後固定した。その後、脳組織をパラフィンで包埋し、４ｍｍの厚さの切片を作成した。ＡＢＣ法（Vectorstain Elite ABC kit, Vector Labs, Burlinggame, USA）にて免疫染色した。ウサギ抗ユビキチンポロクローナル抗体（1:100; Dako, CA, USA）とマウス抗ハンチンチンモノクローナル抗体（mEM48, 1:500; Chemicon, Temecula, USA）を用いた。ＤＡＢ発色した後、ヘマトキシリンにて後染色し、脱水、透明、封入後光顕で観察し写真を撮った。【００３７】個体レベルでの定量解析：体重変化：生後４週齢から体重を週ごとに測定した。尾吊り下げ試験：生後４週齢から１４週齢の間、「発症」という判定するまでに週ごとにマウスの尻尾を掴んで吊り下げて後肢が腹側に抱き込む姿勢をとるまでの時間を計った。判定標準として１５秒以内に出てきたら発症という判定を下す。生存期間：個別飼育にて病死までの寿命（日数）を記録した。【００３８】［結果］（インビトロデータ） ＣＯＳ−７培養細胞を用いて、合成ｓｉＲＮＡの抑制効果を、発現コンストラクトと共にコトランスフェクトすることにより解析した。その結果、本発明者のｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡによって効果が異なるものの、外因性ＨＤ遺伝子エクソン１の発現を抑制したことを示した（図３〜５、参考写真１〜３参照）。調べた３種のｓｉＲＮＡのうち、ｓｉＲＮＡ−ＨＤエクソン１は非常に高い効果を示し、培地中のｓｉＲＮＡの終濃度が４０ｎＭのときに、標的である導入遺伝子の発現を８０％以上抑制した。これに対して、他の２種のｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ−５’ＵＴＲ、ｓｉＲＮＡ−ＣＡＧ）は中程度から弱い効果しか示さなかった（図６ａ、ＧＦＰ光による測定により判断）。さらに、本発明者は、２種のｓｉＲＮＡによる抑制効果は遺伝子特異的であるが、ｓｉＲＮＡ−ＣＡＧは、ＨＤ遺伝子エクソン１がないベクターの発現を抑制する非特異的な抑制効果があることが観察された（図６ｂ）。予想通り、ｓｉＲＮＡは、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより推測された標的であるトラスフェクト遺伝子のｍＲＮＡ分解を誘導した。【００３９】 ハンチントン病（ＨＤ）は選択的な神経細胞死によって引き起こされるものであり、神経細胞内のＨＤの発現を抑制することが最も重要である。神経細胞はＲＮＡｉに対し最も抵抗力があるとみなされてきたが（Gene 263, 103-112, 2001）、神経細胞内でうまく機能していることが実証された（PNAS 99, 18, 11926-11929, 2002）。本発明者による、ｓｉＲＮＡと発現コンストラクトを、ＳＨ−ｓｙ５ｙ（ヒト神経芽細胞腫）培養細胞内にコトランスフェクトした実験によれば、ｓｉＲＮＡ−ＨＤエクソン１がＣＯＳ−７細胞培養と比較して効果は少ないものの、他の２種のｓｉＲＮＡは低程度の効果しかないか、もしくは効果がなかった（図６ａ）。【００４０】 上記の結果により、ｓｉＲＮＡ−ＨＤエクソン１が、ハンチントン病（ＨＤ）の発現を最も抑制することが明らかになったので、本発明者は、ＳＨ−ｓｙ５ｙ細胞における内因性ＨＤの発現に対する影響を調べた。ＨＤ ｍＲＮＡの定量的測定により、ｓｉＲＮＡ−ＨＤエクソン１を使用してから４８時間後には、内因性ＨＤ遺伝子の発現が６０％以上阻害されることが示された。ところが、ＧＡＰＤＨとβ−アクチン両方のｍＲＮＡレベルはどちらも明らかに変化しなかったので、ｓｉＲＮＡ−ＨＤエクソン１がＨＤ遺伝子を特異的に抑制することが証明された（図６ｃ）。【００４１】（インビボデータ） 個体レベルでの効果は発症する証拠とする尾吊り下げ試験ではｓｉＲＮＡ−ＨＤエクソン治療群は有意に遅れることがわかった。また、５週齢以後、未治療群Ｒ６／２マウスにおける持続的な体重の減少と比べｓｉＲＮＡ−ＨＤエクソン治療群Ｒ６／２マウスにおいては有意に改善された（図７）。また、ｓｉＲＮＡ−ＨＤエクソン治療群と未治療群における累積生存率曲線の比較（Kaplan-Meter法）から、未治療群（黒線）と比べ治療群（赤線）の生存期間も有意に延長された（図８）。【００４２】 この臨床効果とともに、脳内では注入後４８時間で線条体のミュータントのハンチンチンのｍＲＮＡ発現量が６０パーセント減少した（図９）。病理学的に抗ユビキチン抗体と抗ハンチンチン抗体を用いた免疫染色の結果、ｓｉＲＮＡ−ＨＤエクソン治療群では線条体におけるユビキチンとハンチンチン陽性の核内凝集体の出現頻度が両方とも顕著に減少していた（図１０）。第１０図には、１０週齢のＲ６／２トランスジェニックマウスの線条体におけるハンチンチン及びユビキチン陽性の核内封入体の免疫染色像が示されている。Ａ−Ｆはハンチンチン、Ｇ−Ｈはユビキチンの染色性を示す。ハンチンチンの場合、全く検出されない野生型マウス（Ａ，Ｄ）と比べＲ６／２マウス（Ｂ，Ｅ，Ｃ，Ｆ）では、はっきりとした核内強陽性の所見が見られる。一方、ｓｉＲＮＡ−ＨＤエクソン治療群のマウス（Ｃ，Ｆ）では、対照となる未治療群（Ｂ，Ｅ）と比べ、核内封入体の数が顕著に減少している。同様にｓｉＲＮＡ−ＨＤエクソン治療群のマウスのユビキチン核内封入体の数も減っている（Ｇは未治療群；ＨはｓｉＲＮＡ−ＨＤエクソン治療群）。【００４３】 上記のように、ただ一回注入だけで生体内でハンチンチン遺伝子の転写レベルが抑制され、Ｒ６／２マウスにおいて新しい核内凝集体の形成が減少しており、結果としてこのマウスの寿命が延びた。【００４４】［考察］ 理想的なアプローチとしては、毒性が現れる前に、（３５以上のＣＡＧリピートを持つ）変異対立遺伝子の発現を抑えることである。しかし、ｓｉＲＮＡとそれぞれ異なるＣＡＧリピートの長さ（１４〜１４９）を含むコンストラクトとの組合わせたところ、抑制効果がＣＡＧリピートの長さとは無関係であることが明らかになった。【００４５】 本研究により、ｓｉＲＮＡの一つが、ハンチントン病（ＨＤ）の発現の特異的抑制を効率的に仲介することが明らかになった。ＲＮＡｉは成熟したマウスにおいても機能することが示されたので（Nature 418, 38-39, 2002）、ＨＤ発現の効率的な抑制は、様々の種類の細胞及びモデル動物の生体内における内因性ハンチンチンを抑制した後、未だ解明されていないハンチンチンの機能を研究するのに有用である。ｓｉＲＮＡ技術を治療法として利用することはＨＤ患者の治療の戦略となりうる（Mol. Med. Today 3, 175-183, 1997）。特定の範囲でのＨＤ発現の抑制により、疾病の進行を停止させることができる。なぜなら、ハンチンチンの機能は、ＨＤ患者において発現した遺伝子産物の量に対して敏感に（もしくは、検出限界以下）現れるようには見えないからである（Cell 101, 57-66, 2000）。【産業上の利用可能性】【００４６】 本発明においては、ハンチンチン遺伝子発現を特異的かつ効率的に抑制する二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の作製に成功した。本発明のｄｓＲＮＡは、ゲノム中での配列の希少性の検索及びハンチンチン遺伝子産物の予測二次構造の検討結果からｄｓＲＮＡ配列を決定し、作製したものである。本発明のｄｓＲＮＡは、ＲＮＡ干渉により遺伝子発現を抑制するが、その効果が特異的かつ効率的であり、ハンチンチン遺伝子発現を特異的かつ効率的に抑制する。特に、本発明で構築された短二重鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は顕著な抑制効果を奏し、ハンチントン病の遺伝子治療実現化のための薬剤としての期待が大きい。【００４７】 ハンチントン病は進行性で有用な治療法が確立されていない遺伝性疾患である故に、疾患原因である変異遺伝子を特異的かつ効率的に発現抑制すれば有用な治療法となると期待されている。本発明の二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によるＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）の応用は上記目的を達成するに有望な手段であり、ハンチントン病治療法の開発における本発明の寄与は大きい。【００４８】 また、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、脊髄小脳失調症、球脊髄性筋萎縮症やＭａｃｈａｄｏ−Ｊｏｓｅｐｈ病などはハンチントン病と共通の発症機序を持つトリプレットリピート病である。従って、本発明によるハンチントン病の治療方法の確立は、これらの共通点を持つ疾患の克服の可能性を広げるものである。【図面の簡単な説明】【００４９】【図１】本発明の実施例における、ｓｉＲＮＡｓ及び標的部位の配列を示す写真である。【図２】本発明の実施例における、ｓｉＲＮＡの標的部位とｐｄ１ＥＧＦＰ Ｎ１の発現コンストラクトを示す写真である。なお、ａは、ｓｉＲＮＡを用いた標的部位（黒い矢印）を、ｂは、pd1EGFP N1プラスミドを、ｃは、さまざまな数のＣＡＧリピート（poly Ｑ）を含むＨＤエクソン１を挿入したpd1EGFP N1の発現コンストラクトを示す写真である。【図３】本発明の実施例における、ｓｉＲＮＡ−ＨＤエクソン１をコトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の蛍光顕微鏡による観察を示す写真である。【図４】本発明の実施例における、ｓｉＲＮＡ−５’ＵＴＲをコトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の蛍光顕微鏡による観察を示す写真である。【図５】本発明の実施例における、ｓｉＲＮＡ−ＣＡＧをコトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の蛍光顕微鏡による観察を示す写真である。【図６】本発明の実施例における、ｓｉＲＮＡ−ＣＡＧをコトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の蛍光顕微鏡による観察を示す写真である。なお、ａは、未処理のコントロール（４つの独立した実験）をＥＧＦＰ光の平均値で標準化することにより、ｓｉＲＮＡの効果及びｓｉＲＮＡの効果が標的位置と細胞種により異なることを示した図を、ｂは、親ベクター（ＨＤエクソン１なし）をそれぞれ３種のｓｉＲＮＡとコトランスフェクトした結果を、ｃは、未処理のコントロールに対する、ＨＤ、β−アクチン、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量の相対的平均を示す写真である。【図７】本発明の実施例における、ｓｉＲＮＡ−ＨＤエクソン治療群のＲ６／２マウスが１４週齢の時点で体重の減少が有意に抑えられたことを示す写真である。ｓｉＲＮＡ−ＨＤエクソン治療群と未治療群を比較すると、野生型タイプ（ＷＴ；黒バー）に比べて、未治療群（グレーバー）の体重が顕著に減少していることに対し、治療群（赤バー）の方はわずかしか減少が見られない。【図８】本発明の実施例における、ｓｉＲＮＡ−ＨＤエクソン治療群のＲ６／２マウスにおける生存期間が有意に伸びていたことを示す写真である。【図９】本発明の実施例における、ｓｉＲＮＡ−ＨＤエクソン治療群のＲ６／２マウスに脳内注入４８時間後線条体におけるミュータントハンチンチンｍＲＮＡの発現量が抑制されたことを示す定量ＲＴ−ＰＣＲの結果の写真である。縦軸がミュータントハンチンチンのｍＲＮＡレベルの相対値を示し、グレーのバーがβ−アクチンを内部標準とし、赤のバーがＧＡＰＤＨを内部標準とした値を示す。【図１０】本発明の実施例における、ｓｉＲＮＡ−ＨＤエクソン治療群のＲ６／２マウスにおいて線条体の神経細胞核内封入体の出現頻度が顕著に減少したことを示す写真である。Ａ−Ｆは、抗ハンチンチン抗体、Ｇ−Ｈは抗ユビキチン抗体で染まったことを示している。 ハンチンチン遺伝子の発現を抑制することができる、ハンチンチンｍＲＮＡの標的となる特定配列に相同なセンス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡからなる二重鎖ＲＮＡであって、配列表の配列番号３に示される塩基配列及び配列表の配列番号４に示される塩基配列からなることを特徴とする二重鎖ＲＮＡ。 合成により製造されたセンス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡから形成されたことを特徴とする請求項１記載の二重鎖ＲＮＡ。 遺伝子組換え方法を用いることにより製造されたセンス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡから形成されたことを特徴とする請求項１記載の二重鎖ＲＮＡ。 遺伝子組換え方法を用いることにより製造されたセンス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡが、それらＲＮＡをそれぞれ転写することができるＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを宿主細胞に導入し、生成されたＲＮＡを取得することによって形成されたものであることを特徴とする請求項３記載の二重鎖ＲＮＡ。 請求項１〜４のいずれか記載の二重鎖ＲＮＡからなるハンチンチン遺伝子の発現抑制剤。 請求項１〜４のいずれか記載の二重鎖ＲＮＡを、ＨＩＶ−１由来のprotein transduction domainであるＴＡＴ配列に付加した融合物からなるハンチンチン遺伝子の発現抑制剤。 請求項１〜４のいずれか記載の二重鎖ＲＮＡと、正電荷リボソーム／脂質との複合体からなるハンチンチン遺伝子の発現抑制剤。 請求項１記載の二重鎖ＲＮＡを転写することができるＤＮＡを組み込んだ発現ベクターからなるハンチンチン遺伝子の発現抑制剤。 請求項５〜８のいずれか記載の発現抑制剤を有効成分として含有するハンチントン病の予防及び／又は治療薬。 さらに薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする請求項９記載のハンチントン病の予防及び／又は治療薬。配列表