生命科学関連特許情報
| タイトル： | 特許公報(B2)_チオレドキシン改変体 |
| 出願番号： | 2005504243 |
| 年次： | 2009 |
| IPC分類： | C07K 14/47,C07K 19/00,C12N 15/09,C12P 21/02,A61P 35/00,A61K 38/00 |
特許情報キャッシュ
石井 保之 淀井 淳司 中村 肇 近藤 則彦 JP 4273234 特許公報(B2) 20090313 2005504243 20040330 チオレドキシン改変体 独立行政法人産業技術総合研究所 301021533 石井 保之 淀井 淳司 中村 肇 近藤 則彦 JP 2003093342 20030331 JP 2003349109 20031008 20090603 C07K 14/47 20060101AFI20090514BHJP C07K 19/00 20060101ALI20090514BHJP C12N 15/09 20060101ALI20090514BHJP C12P 21/02 20060101ALI20090514BHJP A61P 35/00 20060101ALI20090514BHJP A61K 38/00 20060101ALI20090514BHJP JPC07K14/47C07K19/00C12N15/00 AC12P21/02 CA61P35/00A61K37/02 C07K 14/47 C12N 15/00-15/90 BIOSIS/WPI(DIALOG) GenBank/EMBL/DDBJ/GeneSeq SwissProt/PIR/GeneSeq JSTPlus/JMEDPlus/JST7580(JDreamII) CA/BIOSIS/MEDLINE/WPIDS(STN) 特開平１０−１９１９７７（ＪＰ，Ａ） J. Biol. Chem. (1994), Vol.269, No.16, p.11714-11720 J. Biol. Chem. (1993), Vol.268, No.30, p.22485-22489 Biochem. Pharmacol. (1998), Vol.55, No.7, p.987-994 Cancer Res. (1996), Vol.56, No.24, p.5765-5770 11 JP2004004523 20040330 WO2004087917 20041014 13 20050928 吉田 知美 本発明は、生体内において内因的および／または外因的要因よって引き起こされる細胞増殖異常および／または細胞機能を制御することができるチオレドキシン（以下、「ＴＲＸ」という）改変体タンパク質および必須最小化ペプチド、該改変体タンパク質および必須最小化ペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換え発現ベクター、該ＤＮＡで形質転換された細胞、該ＴＲＸ改変体タンパク質および必須最小化ペプチドの製造方法、並びに該ＴＲＸ改変体タンパク質および／または必須最小化ペプチドを含む医薬品または医薬組成物に関する。 チオレドキシンはその活性部位配列の−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−内にレドックス活性なジスルフィド／ジチオールを有する小さい１２ｋＤａの多機能タンパク質である（“Ｒｅｄｏｘ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ”Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７；１５：３５１−３６９．）。チオレドキシンはリボヌクレオチドリダクターゼに対するハイドロゲン供与体，デオキシリボヌクレオチドの合成に重要な酵素として大腸菌から単離されて以来，多くの原核生物，真核生物から単離同定されてきた。成人Ｔ細胞白血病誘導因子（ＡＤＦ）は，本発明者らがＨＴＬＶ−Ｉに感染したＴリンパ球によって産生されるＩＬ−２受容体誘導因子として最初に同定したもので，ヒトチオレドキシンである。細胞内チオレドキシンはラジカル消去や，ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ−１やｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ−κＢなどのレドックスに関する転写因子の制御に重要な役割を果たしている（“ＡＰ−１ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ａ ｄｉｒｅｃｔ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ ａｎｄ Ｒｅｆ−１”１９９７；９４：３６３３−３６３８．）。さらに，ヒトチオレドキシンはｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ（ＭＡＰＫ）やａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｓｉｇｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ−１（ＡＳＫ−１）のシグナル伝達を制御する。 一方、我々はチオレドキシンが細胞外に放出され、サイトカインまたはケモカイン作用を示すことを報告してきたが、その作用機序は不明であった。また細胞外ＴＲＸが細胞内へ移行することや、ＴＲＸ活性部位を改変することにより野生型ＴＲＸをはるかに凌ぐ細胞内移行活性を示すことは報告されていない。 本発明は、ＴＲＸの細胞内制御活性および細胞内移行活性を解析し、該活性に基づくＴＲＸ改変体ならびにその製造方法を提供することを目的とする。 図１は、実施例２のフローサイトメトリー解析結果を示す。図２は、実施例２のフローサイトメトリー解析結果を示す。図３は、実施例２のウエスタンブロット解析結果を示す。図４は、実施例３のアポトーシス解析結果を示す。図５は、３Ｈ−チミジンの取り込み量をシンチレーションカウンターで測定した結果を示す。図６は、実施例４の抗癌剤作用の増強効果−１の結果を示す。図６において、ＣＤＤＰ（−）はシスプラチンの不存在を示し、ＣＤＤＰ（＋）はシスプラチン３μｇ／ｍｌの存在を示し、ＴＲＸ−ＷＴは野生型チオレドキシン、ＴＲＸ−ＣＳはＣ３２Ｓ及びＣ３５Ｓの２箇所を改変した改変体チオレドキシン、ＴＲＸ−Ｃ３５ＳはＣ３５Ｓ改変体チオレドキシンを示す。ＣＤＤＰ（−）において、死細胞数は４％（ＴＲＸ−ＷＴ）、３％（ＴＲＸ−ＣＳ）と比較してＴＲＸ−Ｃ３５Ｓは４倍程度増加する。また、ＣＤＤＰ（＋）（３μｇ／ｍｌ）において、死細胞数は５％（ＴＲＸ−ＷＴ）、１３％（ＴＲＸ−ＣＳ）と比較してＴＲＸ−Ｃ３５Ｓ（２６％）は５倍ないし２倍増加する。図７は、実施例４の抗癌剤作用の増強効果−２の結果を示す。図７において、ＣＤＤＰはシスプラチンを示し、ｒｅｃ（−）は組換体チオレドキシン（Ｃ３５Ｓ−ＴＲＸ）の不存在を示し、ｒｅｃ（＋）は組換体チオレドキシン（Ｃ３５Ｓ−ＴＲＸ）の存在を示す。右上の共陽性領域が細胞死の領域（抗ガン作用を有する領域）であり、例えばＣ３５Ｓ−ＴＲＸで１時間処理した場合には、ＣＤＤＰ（３μｇ／ｍｌ）、においてＣ３５Ｓ−ＴＲＸを１０μｇ／ｍｌ存在させると、共陽性細胞数は１０％→２２％に２倍増加し、ＣＤＤＰ（６μｇ／ｍｌ）では、Ｃ３５Ｓ−ＴＲＸを１０μｇ／ｍｌ存在させると、共陽性細胞数は１８％→７６％に４倍増加する。また、Ｃ３５Ｓ−ＴＲＸで１時間処理した場合には、ＣＤＤＰ（３μｇ／ｍｌ）、においてＣ３５Ｓ−ＴＲＸを１０μｇ／ｍｌ存在させると、共陽性細胞数は７％→３３％に４．７倍増加し、ＣＤＤＰ（６μｇ／ｍｌ）では、チオレドキシン改変体を１０μｇ／ｍｌ存在させると、共陽性細胞数は２３％→７０％に３倍増加する。 本発明者らは、ＴＲＸの細胞内制御活性および細胞内移行活性を詳細に解析した結果、細胞外ヒト組換えＴＲＸ野生型の細胞内移行活性を同定することに成功した。さらに該活性に基づき、ＴＲＸ改変体を作製することに成功した。すなわち本発明の主題は以下のとおりである。１．以下のいずれかのポリペプチドからなるヒトチオレドキシン改変体：（ａ）配列番号２のアミノ酸配列の３５位のシステイン残基が他のアミノ酸残基で置換されたポリペプチド；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列の３５位のシステイン残基が化学修飾されたポリペプチド；（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列の３５位のシステイン残基が他のアミノ酸残基で置換され、さらに配列番号２のアミノ酸配列の３２位と３５位を除く部位、好ましくは３２位〜３５位を除く部位において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加され、かつ、アポトーシス誘導活性を有するポリペプチド。（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列の３５位のシステイン残基が他のアミノ酸残基で置換されたヒトチオレドキシン改変体をコードするＤＮＡ又はその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡによりコードされるポリペプチド。 ２．上記他のアミノ酸残基がセリンである、項１記載のヒトチオレドキシン改変体。 ３．以下のいずれかのＤＮＡからなるアポトーシス誘導活性を有するヒトチオレドキシン改変体をコードする遺伝子：（１）配列番号２のアミノ酸配列の３５位のシステイン残基が他のアミノ酸残基で置換され、さらに配列番号２のアミノ酸配列の３２位と３５位を除く部位、好ましくは３２位〜３５位を除く部位において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加され、かつ、アポトーシス誘導活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖。（２）配列番号２のアミノ酸配列の３５位のシステイン残基が他のアミノ酸残基で置換されたヒトチオレドキシン改変体をコードするＤＮＡ又はその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得、かつ、アポトーシス誘導活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ ４．項３に記載の遺伝子を発現可能に組み込んでなる組換え発現ベクター。 ５．項４に記載の発現ベクターで形質転換された形質転換体。 ６．項５に記載の形質転換体を培養することを特徴とするアポトーシス誘導活性を有するポリペプチドの製造方法。 ７．−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａ、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａ−、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａ−または−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａ−（ＡはＣｙｓ以外の任意のアミノ酸を示す）で表されるアミノ酸配列を含む生理活性物質の細胞内導入用ポリペプチド。 ８．−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａ、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａ−、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａ−または−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａ−（ＡはＣｙｓ以外の任意のアミノ酸を示す）で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの生理活性物質を細胞内に導入するための使用。 ９．−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａ、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａ−、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａ−または−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａ−（ＡはＣｙｓ以外の任意のアミノ酸を示す）で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに生理活性物質を結合させることを特徴とする細胞内に導入可能な生理活性物質複合体の製造方法。 １０．−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａ、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａ−、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａ−または−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａ−（ＡはＣｙｓ以外の任意のアミノ酸を示す）で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに生理活性物質を結合してなる細胞内に導入可能な生理活性物質複合体。 １１．−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａ、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａ−、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａ−または−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａ−（ＡはＣｙｓ以外の任意のアミノ酸を示す）で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列の３５位のシステイン残基が他のアミノ酸で置換されたポリペプチドである項１０に記載の複合体。 １２．上記生理活性物質がタンパク質またはポリペプチドである項１０又は１１に記載の複合体。 １３．−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａ、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａ−、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａ−または−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａ−（ＡはＣｙｓ以外の任意のアミノ酸を示す）で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと生理活性ポリペプチドを結合した複合体をコードするポリヌクレオチドを有する組換えベクターにより形質転換された形質転換体を培養することを特徴とする細胞内に導入可能なポリペプチド複合体の製造方法。 １４．項１又は２に記載のチオレドキシン改変体からなる抗癌剤。 １５．項１又は２に記載のチオレドキシン改変体からなる抗癌増強剤。 １６．項１又は２に記載のチオレドキシン改変体と他の抗ガン剤を含む抗癌剤組成物。 １７．項１又は２に記載のチオレドキシン改変体を必要に応じて他の抗癌剤と組み合わせて癌患者に投与することを包含する癌の治療方法。 １８．請求項１０〜１２のいずれかに記載の複合体と必要に応じて薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む医薬又は医薬組成物。 以下、本発明をより詳細に説明する。 本明細書において、ヒトチオレドキシン（ｈＴＲＸ）とは、配列番号２に示される１０５個のアミノ酸からなるポリペプチドを意味する。 本発明のｈＴＲＸは、ヒトチオレドキシン以外に「チオレドキシンスーパーファミリーに属するものであってもよく、その活性中心に−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−を有するポリペプチド類を有するものが例示される。これらの中でも、活性中心に配列−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−を有するポリペプチド類が好ましい。 本発明の第１の実施形態においては、ＴＲＸの３５位のシステインを他のアミノ酸に変換してＴＲＸ改変体とすることにより、細胞死（アポトーシス）誘導活性及び細胞増殖抑制活性を発現し、抗ガン剤として有用であることが見出された。 また、本発明の第２の実施形態は、ＴＲＸの３５位のシステイン残基を他のアミノ酸に変換して改変体とするか、該システイン残基（特にチオール残基）を化学修飾するかのいずれかの方法によりＴＲＸ改変体とすることにより、細胞内へのＴＲＸ改変体の取り込みが劇的に上昇するとの知見に基づくものであり、その細胞内取り込み促進作用の本体が−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａ、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａ−、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａ−または−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａ−（ＡはＣｙｓ以外の任意のアミノ酸又はシステインの化学修飾体を示す）で表されるアミノ酸配列にあることは本発明者により初めて明らかにされた。 上記のＴＲＸ活性中心のＣ末端側の３５位Ｃｙｓは、任意の１９種のアミノ酸（Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｍｅｔ，Ｓｅｒ，Ｔｈｅ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｈｉｓ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，Ｐｒｏ，Ｇｌｙ，Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ａｓｎ）のいずれで置換されてもよく、好ましくはＳｅｒで置換される。 ３５位システインの化学修飾体としては、システインのチオール（ＳＨ）基が、ＳＲで表される基（Ｒは任意の有機基、例えば炭素数１〜１８の直鎖又は分枝を有するアルキル基、炭素数２〜１８の直鎖又は分枝を有するアルケニル基、炭素数２〜１８の直鎖又は分枝を有するアルキニル基、炭素数２〜１８の直鎖又は分枝を有するアルコキシアルキル基、炭素数１〜１８の直鎖又は分枝を有するヒドロキシアルキル基、炭素数１〜１８のアシル基、炭素数６〜１８のアリール基、炭素数７〜１８のアラルキル基などが挙げられ、これらの基は、ハロゲン原子、水酸基、ニトロ基、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、メトキシ基、カルボキシル基、エステル基などの置換基で置換されていてもよい。）に化学修飾されたものが挙げられる。このような化学修飾体は公知の方法により、容易に合成可能である。 本発明の好ましいチオレドキシン改変体及び該改変体をコードする遺伝子は、配列番号１１に示される。 本発明のチオレドキシン改変体は、細胞死（アポトーシス）誘導活性及び細胞増殖抑制活性を発現し、抗ガン剤として有用であることが見出された。 さらに、本発明のチオレドキシン改変体は、抗ガン剤と併用することにより、抗ガン作用を増強することができる。特に、抗ガン有効量未満の濃度の抗ガン剤と併用することにより、抗ガン作用を発現することができ、抗ガン剤の作用を増強し、副作用を軽減できる。 併用により効果を増強される抗ガン剤としては、アドリアマイシン、メトトレキセート、タキソール、５−フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、マイトマイシン、シスプラチン、ダウノマイシン、エトポシド、タキソテールなどが挙げられる。 本発明のチオレドキシン改変体と抗ガン剤は、同時に投与しても良く、別々に投与してもよい。 本発明の好ましい実施形態の１つは、チオレドキシン改変体と抗ガン剤を投与する癌の治療方法に関する。 治療され得るガンとしては特に限定されず、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝癌、胆のう・胆管癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮頚癌等が挙げられる。 本発明のチオレドキシン改変体からなる抗癌剤の治療的有効量は、成人癌患者１日当たり０．０１〜１００ｍｇ程度であり、抗癌増強剤として使用する場合の治療的有効量は０．００１〜１０ｍｇ程度である。 本発明の１つの好まし実施形態において、本発明のチオレドキシン改変体は、配列番号２のヒトチオレドキシンをもとにして公知の遺伝子工学的手法により改変体を製造することができる。該改変体は、配列番号２の３２位と３５位以外、好ましくは３２位〜３５位以外のアミノ酸の１又は複数個、好ましくは１又は数個が置換、欠失、付加、挿入され、且つ、アポトーシス誘導活性を有するものである。このような変異（置換、欠失、付加、挿入）の導入は，自然界において生じる（例えば対立遺伝子）他に，人為的な変異も含む。人為的変異を生じさせる手段としては，部位特異的変異誘導法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０，６４８７−６５００，１９８２）などを挙げることができるが，これに限定されるわけではない。変異したアミノ酸の数は，アポトーシス誘導活性が失われない限り，その個数は制限されないが，好ましくは２０アミノ酸以内であり，より好ましくは１５アミノ酸以内であり，更に好ましくは１０アミノ酸以内であり，最も好ましくは５アミノ酸以内である。 本発明の他の好ましい実施形態において、配列番号２のアミノ酸配列の３５位のシステイン残基が他のアミノ酸残基で置換されたヒトチオレドキシン改変体をコードするＤＮＡ又はその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得、かつ、アポトーシス誘導活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ（例えば配列番号１１に記載のＤＮＡ）が挙げられ、該ＤＮＡがコードするタンパクは，アポトーシス誘導活性を有する。 本明細書において「ストリンジェントな条件」とは，特異的なハイブリダイゼーションのみが起き，非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は，通常，「１ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，３７℃」程度であり，好ましくは「０．５ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，４２℃」程度であり，更に好ましくは「０．２ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，６５℃」程度である。本発明のＤＮＡは３５位が変異された本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ（例えば配列番号１１に記載のＤＮＡ）と通常高い相同性を有する。高い相同性とは，７５％以上の相同性，好ましくは９０％以上の相同性，更に好ましくは９５％以上の相同性、特に９９％以上の相同性を指す。 本発明のタンパクは，後述する本発明の遺伝子を発現ベクターに組み込み，適当な宿主細胞内で発現させることにより得ることができる。ベクターとしては、適宜公知のものを選定して用いることができ、例えば、ｐＴｒｃ−ＨｉｓＡなどを用いることができる。宿主細胞としては哺乳動物細胞、酵母などの真核生物細胞、大腸菌、枯草菌、藻類、真菌類などの原核生物細胞が挙げられ、そのいずれを用いてもよい。 理論により限定されることを意図するものではないが、３５位のＣｙｓをＳｅｒなどの他のアミノ酸で置換すると、ＴＲＸのアンタゴニストとして機能するようになるため、ＴＲＸ改変体はアポトーシスの誘導活性ないし細胞増殖抑制活性を発現するものと考えられる。 さらに、３５位をＳｅｒなどの他のアミノ酸で置換したＴＲＸ改変体は、３２位のＣｙｓで細胞表面に結合し、３５位にＣｙｓがないことから３５位における細胞表面での結合が行われず、結果としてＴＲＸ改変体は細胞内に急速に取り込まれることになると考えている。このメカニズムはＴＲＸのＳｅｒ３２改変体（３５位はＣｙｓ；配列番号１４）、Ｓｅｒ３２Ｓｅｒ３５改変体（配列番号１３）と野生型（３２位と３５位がＣｙｓ；配列番号２）は、いずれも細胞内にほとんど取り込まれないことからも支持される。 即ち、−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａ、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａ−、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａ−または−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａ−（ＡはＣｙｓ以外の任意のアミノ酸を示す）で表されるアミノ酸配列、特に−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａ（Ａは前記に同じ）は細胞内に生理活性物質を取り込ませるための先導ペプチドの役割を果たすことが明らかであり、該テトラペプチドを生理活性物質に結合させることにより、細胞内への取り込みが困難であった生理活性物質を細胞内に導入することが可能である。 本明細書において、「改変体」は変異体と修飾体を両方とも包含する言葉として使用する。 生理活性物質としては、細胞内に取り込まれて機能する医薬化合物、オリゴペプチド、ポリペプチド、単糖、二糖ないし多糖類、脂質、などが挙げられ、好ましくは医薬化合物、オリゴペプチド、ポリペプチド（糖蛋白を含む）が例示される。また、前記テトラペプチドを含む先導ペプチドのＮ末端及びＣ末端に適切な配列を結合させることにより標的となる細胞への選択性を高めることも可能である。 生理活性物質としての医薬化合物には、抗ガン剤、抗ウイルス剤などが例示され、生理活性ポリペプチドとしては、酵素、抗体、ホルモンなどが例示される。 本発明の先導ペプチドは、必要に応じてスペーサーペプチドを介して生理活性物質、を結合することができる。例えば、生理活性物質がポリペプチドの場合には、前記先導ペプチドと必要に応じてスペーサーペプチドを介して生理活性ポリペプチドを結合させて複合体とし、該複合体をコードするＤＮＡを適当な組換えベクターに導入し、大腸菌などの細菌、ＣＨＯなどの動物細胞、酵母等の宿主を形質転換し、該形質転換体を培養することにより、複合体を製造することが可能である。 前記スペーサーとして、細胞内で切断可能な短鎖ペプチド配列を導入することにより、細胞内で生理活性物質、特に生理活性オリゴペプチドまたはポリペプチドに導くことも可能である。このような切断可能なペプチドとしては、Ｃａｓｐａｓｅ−１によって特異的に切断されるｈｕｍａｎ ｐｒｏ−ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β（ｐｒｏ−ＩＬ−１β）の切断部位の配列である−ＡＹＶＨＤＡＰＶＫ−、及びＣａｓｐａｓｅ−３，−７などによって切断されるｈｕｍａｎ ｐｏｌｙ−ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＰＡＲＰ）の切断部位の配列である−ＧＤＥＶＤＧＶＫ−が例示される。 以下、実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。 組換えＴＲＸ野生型および改変体の作製１．大腸菌発現系の構築ＴＲＸポリペプチドに存在する３２位および／または３５位のシステイン残基について、配列番号１のＴＲＸ遺伝子の当該部位のヌクレオチドに変異を入れてセリン残基に置換した。ＴＲＸ ３２位システイン残基のセリン残基への変異体（ＴＲＸ−Ｃ３２Ｓ；配列番号１４）遺伝子の作製には、テンプレートＤＮＡとしてベクターｐｃＤＮＡ３．１にヒトＴＲＸ ｃＤＮＡ（配列番号１）を挿入したプラスミドＤＮＡを用い、プライマーに５’−ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＴＧ ＡＡＧ ＣＡＧ ＡＴＣ ＧＡＧ ＡＧＣ ＡＡＧ−３’（配列番号３）と５’−ＣＴＴ ＧＡＴ ＣＡＴ ＴＴＴ ＧＣＡ ＡＧＧ ＣＣＣ ＡＧＡ ＣＣＡ−３’（配列番号５）および５’−ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＴＡ ＧＡＣ ＴＡＡ ＴＴＣ ＡＴＴ ＡＡＴ ＧＧＴ ＧＧＣ−３’（配列番号４）と５’−ＴＧＧ ＴＣＴ ＧＧＧ ＣＣＴ ＴＧＣ ＡＡＡ ＡＴＧ ＡＴＣ ＡＡＧ−３’（配列番号６）をそれぞれ用いたＰＣＲを実行した。次に増幅した２つのＤＮＡ断片を等量で混合し、さらに５’−ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＴＧ ＡＡＧ ＣＡＧ ＡＴＣ ＧＡＧ ＡＧＣ ＡＡＧ−３’（配列番号３）と５’−ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＴＡ ＧＡＣ ＴＡＡ ＴＴＣ ＡＴＴ ＡＡＴ ＧＧＴ ＧＧＣ−３’（配列番号４）プライマーを添加した後、ＰＣＲでＴＲＸ−Ｃ３２Ｓ全長を増幅した。各ＰＣＲサイクルにおける条件は、９５℃、１分間、アニーリングは５６℃、１分間、伸長は７２℃、２分間の条件で行った。同様にＴＲＸ３５位システイン残基のセリン残基への変異体（ＴＲＸ−Ｃ３５Ｓ；配列番号１２）遺伝子またはＴＲＸ３２位と３５位両方のシステイン残基のセリン残基への変異体（ＴＲＸ−Ｃ３２Ｓ／Ｃ３５Ｓ；配列番号１３）遺伝子の作製には、ＴＲＸ−Ｃ３２Ｓ遺伝子作製時に使用したプライマー（配列番号５と６）の代わりに、５’−ＣＴＴ ＧＡＴ ＣＡＴ ＴＴＴ ＧＧＡ ＡＧＧ ＣＣＣ ＡＣＡ ＣＣＡ−３’（配列番号７）と５’−ＴＧＧ ＴＧＴ ＧＧＧ ＣＣＴ ＴＣＣ ＡＡＡ ＡＴＧ ＡＴＣ ＡＡＧ−３’（配列番号８）または５’−ＴＧＧ ＴＣＴ ＧＧＧ ＣＣＴ ＴＣＣ ＡＡＡ ＡＴＧ ＡＴＣ ＡＡＧ−３’（配列番号９）と５’−ＣＴＴ ＧＡＴ ＣＡＴ ＴＴＴ ＧＧＡ ＡＧＧ ＣＣＣ ＡＧＡ ＣＣＡ−３’（配列番号１０）をそれぞれ用いたＰＣＲを行った。また野生型ＴＲＸ（ＴＲＸ−ＷＴ）はテンプレートＤＮＡとしてベクターｐｃＤＮＡ３．１にヒトＴＲＸ ｃＤＮＡ（配列番号１）を挿入したプラスミドＤＮＡを用い、プライマーに５’−ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＴＧ ＡＡＧ ＣＡＧ ＡＴＣ ＧＡＧ ＡＧＣ ＡＡＧ−３’（配列番号３）と５’−ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＴＡ ＧＡＣ ＴＡＡ ＴＴＣ ＡＴＴ ＡＡＴ ＧＧＴ ＧＧＣ−３’（配列番号４）を用いて、ＰＣＲでＴＲＸ−ＷＴ全長を増幅した。ＰＣＲで増幅したＴＲＸ−ＷＴ、ＴＲＸ−Ｃ３２Ｓ，ＴＲＸ−Ｃ３５ＳまたはＴＲＸ−Ｃ３２Ｓ／Ｃ３５ＳのＤＮＡ断片をＴＯＰＯクローニングベクター（インビトロジェン社製）にライゲートした後、大腸菌宿主細胞に導入した。形質転換クローンよりプラスミドＤＮＡを回収した後、インサートＤＮＡの配列をＤＮＡシークエンス法で確認した。引き続きプラスミドＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩで切断し、得られたフラグメントをヒスチジンタグ付加組換えタンパク質発現ベクターｐＱＥ８０Ｌ（キアゲン社製）にライゲートした後、ＸＬ−１ Ｂｌｕｅに大腸菌宿主細胞を形質転換した。２．組換えＴＲＸ野生型および改変体を生産する大腸菌の培養ＴＲＸ野生型または改変体遺伝子を挿入したｐＱＥ８０ＬプラスミドＤＮＡで形質転換した大腸菌株を前培養後、３リットルのｔｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ（ＢＲＬ）（１００ｕｇ／ｍｌ Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ入り）にシードし、４時間培養した。その後、最終濃度が１ｍＭになるようにＩＰＴＧを加え、さらに２−４時間培養した。３．組換えＴＲＸ野生型および改変体の精製 回収した細胞は、ｌｙｓｏｚｙｍｅ（２ｍＭ）入りのｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，０．８ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌ，２−ｍｅｒｃａｐｔ ｅｔｈａｎｏｌ）を加え懸濁した後、超音波破砕機にて細胞を破砕した。１５０００ｒｐｍ３０分の遠心後、上清を回収し、ＰＢＳで平衡化したＮｉアガロースカラム（キアゲン社製）にアプライした（ＮｉカラムはあらかじめＰＢＳで置換しておく）。サンプルをアプライ後、２０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌ含有ＰＢＳを用いてカラムを洗浄し、８０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌ含有ＰＢＳで溶出した。溶出されたサンプルはＰＤ−１０カラムを用いてＰＢＳ溶液に置換した。 組換えＴＲＸ野生型および改変体の培養細胞内への移行１．細胞結合能 ５ｘ１０５個のＨＴＬＶ−Ｉ感染ヒトＴ細胞株ＡＴＬ２に最終濃度が１ｕｇ／ｍｌになるように蛍光標識したＴＲＸ−ＷＴ、ＴＲＸ−Ｃ３５ＳまたはＴＲＸ−Ｃ３２ＳＣ３５Ｓを添加し、４℃で３０分インキュベート後フローサイトメトリー用バッファー（０．１％アジ化ナトリウム含有燐酸緩衝液）で洗浄した。続いて、フローサイトメトリー解析を行った（図１）。その結果、ＴＲＸ−Ｃ３５Ｓのみが細胞に結合できることが確認された。この結合は大過剰のＴＲＸ−ＷＴを共存させることによって阻害されることも確認された（図２）２．細胞内移行 組換え体ヒスチジンタグ化タンパク質ＴＲＸ−ＷＴ、ＴＲＸ−Ｃ３５ＳまたはＴＲＸ−Ｃ３２ＳＣ３５Ｓを最終濃度１０ｕｇ／ｍｌでＡＴＬ２細胞に添加し、４℃または３７℃で１時間インキュベートした。つぎに細胞を回収し燐酸緩衝液で洗浄後、１ｘ１０７個の細胞を１ｍｌのバッファー（ｈｙｐｏｔｏｎｉｃ ｂｕｆｆｅｒ）に懸濁し、窒素ガス細胞破砕装置（パール社製）で細胞を破砕した。１０００ｇで遠心後、上清を回収し続いて１０，０００ｇの遠心分離で上清の細胞質画分を回収した。細胞質画分をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動と抗ＴＲＸモノクローナル抗体を用いるウエスタンブロット解析を行った（図３）。その結果、ＴＲＸ−Ｃ３５Ｓのみが細胞質画分に検出されることが確認された。 ＴＲＸ野生型および改変体の生物学的活性１．細胞死誘導活性 ＴＲＸ−ＷＴ、ＴＲＸ−Ｃ３５ＳまたはＴＲＸ−Ｃ３２Ｓ／Ｃ３５Ｓ遺伝子を導入したヒトＴ細胞株Ｊｕｒｋａｔを無血清ＲＰＭＩ培地で７２時間培養することにより誘導されるアポトーシスを解析した（図４）。その結果、ＴＲＸ−Ｃ３５Ｓを細胞内に高発現したＪｕｒｋａｔ細胞は、ＴＲＸ−ＷＴまたはＴＲＸ−Ｃ３５Ｓを導入したＪｕｒｋａｔ細胞よりもアポトーシスが亢進された。２．細胞増殖抑制活性 ５ｘ１０５個のヒト末梢血単核球を１ｍｌの１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ培地にけん濁後、ＰＨＡを最終濃度２８ｎｇ／ｍｌと１０ｕｇ／ｍｌのＴＲＸ−ＷＴ，またはＴＲＸＣ３２Ｓ／Ｃ３５Ｓ，またはＴＲＸ−Ｃ３５Ｓをそれぞれ添加し培養した。９６時間後に３Ｈ−チミジンを添加しその取り込み量をシンチレーションカウンターで測定した（図５）。その結果、組換え体ＴＲＸ−ＷＴタンパク質添加群が無添加群に比べて細胞増殖能が上昇しているのに対して、組換え体ＴＲＸ−Ｃ３５Ｓタンパク質添加群は細胞増殖が抑制されていることが確認された。 １． 抗癌剤作用の増強効果−１ ヒトＴ細胞株Ｊｕｒｋａｔに野生型（ＷＴ）ＴＲＸ、Ｃ３２Ｓ／Ｃ３５Ｓ誘導体（ＣＳ）ＴＲＸまたはＣ３５Ｓ誘導体−ＴＲＸ遺伝子を導入し樹立した高発現細胞に、最終濃度３μｇ／ｍｌのシスプラチン（ＣＤＤＰ；ｃｉｓ−ＰＬＡＴＩＮＵＭ（ＩＩ）−ＤＩＡＭＭＩＮＥ ＤＩＣＨＬＯＲＩＤＥ，Ｓｉｇｍａ）を添加した。２４時間培養後の細胞にＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ，ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ（Ｍｅｄｉｃａｌ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＣＯ．，ＬＴＤ）を結合させ、フローサイトメーターで細胞死の状態を示す共陽性細胞数を解析した。その結果、Ｃ３５Ｓ−ＴＲＸを高発現する細胞株では、ＷＴ−ＴＲＸやＣＳ−ＴＲＸ発現細胞株に比べてＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣとｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅの共陽性の死細胞数が４倍近く増加していることが確認された。２． 抗癌剤作用の増強効果−２ ヒトＴ細胞株Ｊｕｒｋａｔの培養液中に、１０μｇ／ｍｌの濃度で組換えＣ３５Ｓ−ＴＲＸタンパク質を添加し、１時間または３時間インキュベートした後、最終濃度３μｇ／ｍｌまたは６μｇ／ｍｌのシスプラチンを添加した。２４時間培養後の細胞にＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ−＝ＦＩＴＣとｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅを結合させ、フローサイトメーターで細胞死の状態を示す共陽性細胞数を解析した。その結果、組換えＣ３５Ｓ−ＴＲＸタンパク質を予め添加した群では、添加していない群に比べてＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ−＝ＦＩＴＣとｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅの共陽性細胞数が多く、３μｇ／ｍｌのシスプラチンを添加した群では約２倍、６μｇ／ｍｌのシスプラチンを添加した群では約４倍増加していた。またその効果はＣ３５Ｓ−ＴＲＸタンパク質の前処理時間が１時間の群よりも３時間の群の方が高かった。 以上、本発明の好ましい態様について記載したが本発明の精神を逸脱することなく種々の変更および改良が可能であることが当業者には明らかであることが理解されよう。従って、本発明の範囲は、以下の請求の範囲によってのみ決定されるべきであろう。 本発明により、高い細胞増殖抑制活性を有するＴＲＸ改変体タンパク質の安定かつ大量生産及び、迅速な細胞内移行を可能にするＴＲＸ改変体由来ペプチド配列を利用したベクター開発が可能になる。ＴＲＸ改変体タンパク質及びＴＲＸ改変体由来ペプチドを融合させた生理活性物質（タンパク質、脂質、核酸、有機化合物、無機化合物）は、多様な疾患領域の治療および／または予防に利用することができる。 -Cys-Gly-Pro-Ser-、-Cys-Pro-Tyr-Ser-、-Cys-Pro-His-Ser-または-Cys-Pro-Pro-Ser-で表されるアミノ酸配列を含むチオレドキシンの改変体ポリペプチドからなる、生理活性物質の細胞内導入剤。 -Cys-Gly-Pro-Ser-、-Cys-Pro-Tyr-Ser-、-Cys-Pro-His-Ser-または-Cys-Pro-Pro-Ser-で表されるアミノ酸配列を含むチオレドキシンの改変体ポリペプチドの生理活性物質を細胞内に導入するための使用（ただし、ヒトin vivoでの細胞内への導入を除く）。 -Cys-Gly-Pro-Ser-、-Cys-Pro-Tyr-Ser-、-Cys-Pro-His-Ser-または-Cys-Pro-Pro-Ser-で表されるアミノ酸配列を含むチオレドキシンの改変体ポリペプチドに生理活性物質を結合させることを特徴とする、細胞内に導入可能な生理活性物質複合体の製造方法。 -Cys-Gly-Pro-Ser-、-Cys-Pro-Tyr-Ser-、-Cys-Pro-His-Ser-または-Cys-Pro-Pro-Ser-で表されるアミノ酸配列を含むチオレドキシンの改変体ポリペプチドに生理活性物質を結合してなる、細胞内に導入可能な生理活性物質複合体。 -Cys-Gly-Pro-Ser-、-Cys-Pro-Tyr-Ser-、-Cys-Pro-His-Ser-または-Cys-Pro-Pro-Ser-で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列の35位のシステイン残基がSerで置換されたポリペプチドである請求項４に記載の複合体。 前記生理活性物質がタンパク質またはポリペプチドである請求項４又は５に記載の複合体。 -Cys-Gly-Pro-Ser-、-Cys-Pro-Tyr-Ser-、-Cys-Pro-His-Ser-または-Cys-Pro-Pro-Ser-で表されるアミノ酸配列を含むチオレドキシンの改変体ポリペプチドと、生理活性ポリペプチドを結合した複合体をコードするポリヌクレオチドを有する組換えベクターにより形質転換された形質転換体を培養することを特徴とする、細胞内に導入可能なポリペプチド複合体の製造方法。 請求項４〜６のいずれかに記載の複合体からなる抗癌剤。 請求項４〜６のいずれかに記載の複合体からなる抗癌増強剤。 請求項４〜６のいずれかに記載の複合体と他の抗ガン剤を含む抗癌剤組成物。 請求項４〜６のいずれかに記載の複合体と、薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む医薬又は医薬組成物。配列表