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| タイトル： | 公開特許公報(A)_低分子化合物とタンパク質の結合評価方法 |
| 出願番号： | 2005147569 |
| 年次： | 2006 |
| IPC分類： | C12Q 1/68,C12Q 1/25,C12N 15/09 |
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小畠 英理 三重 正和 舟橋 久景 JP 2006320271 公開特許公報(A) 20061130 2005147569 20050520 低分子化合物とタンパク質の結合評価方法 国立大学法人東京工業大学 304021417 野村 健一 100107870 間山 世津子 100098121 小畠 英理 三重 正和 舟橋 久景 C12Q 1/68 20060101AFI20061102BHJP C12Q 1/25 20060101ALI20061102BHJP C12N 15/09 20060101ALN20061102BHJP JPC12Q1/68 AC12Q1/25C12N15/00 A 6 1 ＯＬ 9 特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１７年４月１日 社団法人電気化学会発行の「電気化学会 第７２回大会 講演要旨集」に発表 4B024 4B063 4B024AA11 4B024CA01 4B024EA04 4B063QA20 4B063QQ20 4B063QQ79 4B063QR20 4B063QR32 4B063QS25 4B063QX04 本発明は、二つのDNAの連結によって生じるシグナルDNAを指標として低分子化合物とタンパク質の結合を評価する方法に関する。 分子生物学や薬理学の発展にともない数多くの薬剤ターゲットタンパク質が発見され、コンビナトリアルケミストリーの発達にともない数多くの薬剤候補物質が合成されている。そこで、これらの候補物質を選択するにあたり、低分子化合物とタンパク質の相互作用をハイスループットに解析する手法が望まれる。しかし、低分子化合物はその分子量の小ささから、質量的な変化を捉えることが難しく低分子化合物−タンパク質間結合評価法の開発は遅れているのが現状である。たとえば現在利用可能なSPRなどの機器は、高価であるため簡便なハイスループットスクリーニングなどには十分対応していないのが現状である。 本発明者らは、低分子化合物にDNAを修飾したDNA修飾プローブを用いると、電気泳動における移動度の差を分析することにより低分子化合物−タンパク質間結合が簡便に評価可能であることを明らかにしてきた（非特許文献１）。この手法は分子生物学に携わる研究室であれば頻繁に利用する電気泳動法という手法を用い、特別高価な装置も必要としないことから、ハイスループットスクリーニングなどへの応用可能性も高い手法である。生方路人、海老原隆、舟橋久景、相澤益男、小畠英理、「DNAプローブを用いた分子間相互作用解析法の開発」2002年電気化学秋季大会講演要旨集221頁 しかし、上述した電気泳動における移動度の差を利用する方法は、電気泳動という特殊環境下でも低分子化合物とタンパク質間の結合が維持され続けている必要があり、そのような条件では結合が適切に評価できないことが懸念される。 本発明は、以上のような技術的背景のもとになされたものであり、上記問題点を解消した新たな低分子化合物とタンパク質間の結合評価手段を提供することを目的とする。 本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、連結可能な突出末端を持つ二つのDNAの一方に低分子化合物を固定し、両DNAをタンパク質とDNAリガーゼの存在下で共存させると、低分子化合物とタンパク質が結合しない場合には両DNAは連結する一方、低分子化合物とタンパク質が結合する場合には両DNAは連結しないことを見出し、この知見に基づき、本発明を完成するに至った。 即ち、本発明は、以下の〔１〕〜〔６〕を提供するものである。〔１〕低分子化合物とタンパク質との結合を評価する方法であって、（１）突出末端を持ち、その突出末端に前記低分子化合物が固定されている第一のDNAを作製する工程、（２）第一のDNAの突出末端と連結可能な突出末端を持つ第二のDNAを作製する工程、（３）第一のDNAと第二のDNAを、前記タンパク質とDNAリガーゼの存在下で共存させる工程、及び（４）第一のDNAと第二のDNAとが連結したシグナルDNAを検出する工程を含むことを特徴とする低分子化合物とタンパク質の結合評価方法。〔２〕（４）の工程において、シグナルDNAの検出を電気泳動によって行うことを特徴とする〔１〕に記載の低分子化合物とタンパク質の結合評価方法。〔３〕シグナルDNAをPCRによって増幅し、増幅させたシグナルDNAを電気泳動によって検出することを特徴とする〔２〕に記載の低分子化合物とタンパク質の結合評価方法。〔４〕（４）の工程において、シグナルDNAの検出をリアルタイムPCRによって行うことを特徴とする〔１〕に記載の低分子化合物とタンパク質の結合評価方法。〔５〕（１）の工程において、長さの異なる複数の第一のDNAを作製し、その長さの異なる複数の第一のDNAの各々に種類の異なる低分子化合物を固定し、（３）の工程において、長さの異なる第一のDNAとの連結によって生じる長さの異なるシグナルDNAの各々を検出することを特徴とする〔１〕に記載の低分子化合物とタンパク質の結合評価方法。〔６〕（１）の工程において、突出末端の配列が異なる複数の第一のDNAを作製し、その突出末端の配列が異なる複数の第一のDNAを標識するとともに、その各々に種類の異なる低分子化合物を固定し、（２）の工程において、第一のDNAの一つとのみ連結可能である第一のDNAと同数の第二のDNAを作製し、その第二のDNAを基板上に固定し、（３）の工程において、第一のDNAと基板上に固定されている第二のDNAを共存させ、（４）の工程において、基板上に検出される標識の位置から、各々のシグナルDNAを検出することを特徴とする〔１〕に記載の低分子化合物とタンパク質の結合評価方法。 従来の低分子化合物とタンパク質の結合評価方法は、低分子化合物とタンパク質の結合物自体を電気泳動などによって検出していたので、その結合物を検出方法に応じた特殊な環境に置く必要があり、その環境の影響によって結合を適切に評価できない可能性があった。 本発明の評価方法では、結合物自体を検出するのではなく、低分子化合物とタンパク質の結合物の生成と関連して生成するシグナルDNAを検出するため、結合物を検出方法に応じた特殊環境に置く必要がなく、より適切に低分子化合物とタンパク質の結合を評価することができる。 以下、本発明を詳細に説明する。 本発明の低分子化合物とタンパク質の結合評価方法は、以下の（１）〜（４）の工程を含むことを特徴とするものである。 （１）の工程では、突出末端を持ち、その突出末端に低分子化合物が固定されている第一のDNAを作製する。 第一のDNAの長さは特に限定されないが、100〜1000塩基（突出末端部分を含む）ぐらいが好適である。 突出末端部分の長さも特に限定されないが、1〜8塩基ぐらいが好適である。 突出末端は、二本鎖DNAを制限酵素で処理することによって形成させ得る。使用する制限酵素は特に限定されず、例えば、Sph I、KpnI、HindIIIなどを使用することができる。なお、突出末端は5’突出末端、3’突出末端のいずれでもよい。 第一のDNAの末端のリン酸基は、突出末端側のリン酸基は残しておき、突出末端の反対側のリン酸基は脱リン酸化することが好ましい。 （２）の工程では、第一のDNAの突出末端と連結可能な突出末端を持つ第二のDNAを作製する。 第二のDNAの長さは特に限定されないが、100〜1000塩基（突出末端部分を含む）ぐらいが好適である。 第一のDNAの突出末端と連結可能な突出末端は、第一のDNAと同じ制限酵素で二本鎖DNAを処理することにより形成させ得る。 第二のDNAの末端のリン酸基は両側とも脱リン酸化しておくことが好ましい。 （３）の工程では、第一のDNAと第二のDNAを、タンパク質とDNAリガーゼの存在下で共存させる。 第一のDNAと第二のDNAを、タンパク質とDNAリガーゼの存在下で共存させる方法としては、第一のDNA、第二のDNA、タンパク質、及びDNAリガーゼの四者を溶液中で混合する方法などを例示できるが、このような方法に限定されず、第一のDNA又は第二のDNAを固相に固定して共存させてもよい。第一のDNA、第二のDNA、タンパク質、及びDNAリガーゼの四者を溶液中で混合する場合、各物質の濃度は特に限定されないが、第一のDNAは10 pM〜10 nM、第二のDNAは10 pM〜10 nM、タンパク質は10 pM〜10 nM、DNAリガーゼは1 U〜100 U/ml程度の濃度になるように混合するのが好ましい。 DNAリガーゼは、第一のDNAと第二のDNAを連結させ得るものであればどのようなものでもよく、例えば、T4DNAリガーゼ、E.coliリガーゼ、T7DNAリガーゼなどを使用できる。 （４）の工程では、第一のDNAと第二のDNAとが連結したシグナルDNAを検出する。 シグナルDNAを検出する方法は特に限定されず、例えば、電気泳動、リアルタイムPCRなどによって検出することができる。また、第一のDNA又は第二のDNAを標識しておき、その標識によってシグナルDNAを検出してもよい。 電気泳動によって検出する場合、第一のDNAと第二のDNAの連結によって生じたシグナルDNAをPCRによって増幅し、増幅させたシグナルDNAを電気泳動で検出してもよい。 評価の対象とする低分子化合物は、第一のDNAと第二のDNAの連結を妨げないものであれば特に限定されないが、分子量1000以下程度のものであることが好ましい。また、評価の対象とするタンパク質は、低分子化合物と結合することにより第一のDNAと第二のDNAの連結を妨げるものであれば特に限定されない。 本発明の結合評価方法は、１種類のタンパク質と多種類の低分子化合物の結合を一度に評価することもできる。 例えば、長さの異なる複数の第一のDNAを作製し、その長さの異なる複数の第一のDNAの各々に種類の異なる低分子化合物を固定する。これにより、各低分子化合物がタンパク質と結合するかどうかは、長さの異なる各々のシグナルDNAの生成によって判定することができるようになる。長さの異なる各々のシグナルDNAの生成は、電気泳動などによって検出することができる。 また、DNAチップを利用して、１種類のタンパク質と多種類の低分子化合物の結合を一度に評価することも可能である。即ち、突出末端の配列が異なる複数の第一のDNAを作製し、その突出末端の配列が異なる複数の第一のDNAを標識するとともに、その各々に種類の異なる低分子化合物を固定し、また、第一のDNAの一つとのみ連結可能である第一のDNAと同数の第二のDNAを作製し、その第二のDNAを基板上に固定する。これにより、各低分子化合物がタンパク質と結合するかどうかは、第一のDNAと基板上の第二のDNAとの結合に判定することができるようになる。第一のDNA中のどのDNAが第二のDNAと結合したかは、基板上の標識の位置によって判断することができる。 以下、本発明の低分子化合物とタンパク質の結合評価方法の原理を図１を用いて説明する。 低分子化合物が3’突出末端に固定されている第一のDNAと、第一のDNAの突出部分と相補的な配列を持つ第二のDNAを作製する（図１Ａ）。第一のDNAでは、低分子化合物が固定されている側の5'末端にはリン酸基が存在するが、反対側の5’末端は脱リン酸化されている。第二のDNAでは、両側の5’末端が脱リン酸化されている。この二種類のDNAを混合し、DNAリガーゼにより連結反応を行うと、相補配列特異的に連結が起こり（図１Ｂ）、シグナルDNAが生成する（図１Ｄ）。ところがこのとき、低分子化合物結合能を有するタンパク質が存在すると、第一のDNAと第二のDNAとの連結反応が阻害され（図１Ｃ）、シグナルDNAが生成しない（図１Ｅ）。従って、シグナルDNAを電気泳動やリアルタイムPCRなどで検出することにより低分子化合物とタンパク質の結合を評価することができる。 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。 ビオチンとビオチン結合タンパク質であるストレプトアビジン（StAv）の結合性を以下の実験によって評価した。実験に使用したDNA材料を図２に示す。 プラスミドpACYC184をHindIIIで制限酵素処理し、末端を脱リン酸化処理した。引き続きSalIで制限酵素処理した。またこれとは別にDNAプローブの末端にビオチンを修飾するために、3’ビオチン修飾オリゴヌクレオチドとその相補鎖をT4 ポリヌクレオチド キナーゼで処理した後、アニーリングさせた。先の制限酵素処理断片とこれを結合し、精製したものをプローブA(638bp)とした。またpACYC184をHindIIIで制限酵素処理し、脱リン酸化処理した後、SphIで制限酵素処理し精製したものを、3’ビオチン修飾されていないコントロール（プローブA-）（533bp）とした。さらに、プラスミドpET32c(+)をHindIIIとSphIでダブルダイジェストし、DNA断片の両末端を脱リン酸化処理し、精製したものをプローブB(823bp)とした。 次に、図３に示すような3 nM DNAプローブの組み合わせにおいて1μM ストレプトアビジンと混合、4℃1時間のインキュベーションの後、T4DNAリガーゼによる連結反応を行った。フェノール・クロロフォルム処理の後電気泳動によりシグナルDNAの合成を確認した。その結果、A-とBの連結反応においてはストレプトアビジンの有無にかかわらず合成反応が進行するのに対し、AとBの連結反応ではストレプトアビジンの存在によりシグナルDNAの合成が阻害された（白矢印）。そこでシグナルDNA合成量のストレプトアビジン濃度依存性を評価したところ（プローブA濃度：3 nM）、図４に示すようにストレプトアビジンの濃度に依存してシグナルDNAの合成が阻害されていることが明らかとなった。このことから、温和な条件下で予め低分子化合物−タンパク質間結合をシグナルDNAの合成量に変換する、ライゲーション反応を利用した新規低分子化合物−タンパク質の結合評価法の基本原理を確立したと結論した。また、遊離のビオチンとの競合反応を行い、電気泳動によりシグナルDNAの合成を解析したところ（プローブA濃度：10 nM）、図５に示すようにビオチンの濃度に依存してシグナルDNAの合成が復活した。このことは本法が薬剤候補物質などのターゲットタンパク質結合能の評価が可能であること示している。本発明の低分子化合物とタンパク質の結合評価方法の原理を示す図。実施例で使用したDNAを示す図。ストレプトアビジン存在又は非存在下でのプローブAとプローブBの連結反応の結果を示す図。ストレプトアビジン濃度とシグナルDNAの生成量との関係を示す図。ビオチン濃度とシグナルDNAの生成量との関係を示す図。 低分子化合物とタンパク質との結合を評価する方法であって、（１）突出末端を持ち、その突出末端に前記低分子化合物が固定されている第一のDNAを作製する工程、（２）第一のDNAの突出末端と連結可能な突出末端を持つ第二のDNAを作製する工程、（３）第一のDNAと第二のDNAを、前記タンパク質とDNAリガーゼの存在下で共存させる工程、及び（４）第一のDNAと第二のDNAとが連結したシグナルDNAを検出する工程を含むことを特徴とする低分子化合物とタンパク質の結合評価方法。 （４）の工程において、シグナルDNAの検出を電気泳動によって行うことを特徴とする請求項１に記載の低分子化合物とタンパク質の結合評価方法。 シグナルDNAをPCRによって増幅し、増幅させたシグナルDNAを電気泳動によって検出することを特徴とする請求項２に記載の低分子化合物とタンパク質の結合評価方法。 （４）の工程において、シグナルDNAの検出をリアルタイムPCRによって行うことを特徴とする請求項１に記載の低分子化合物とタンパク質の結合評価方法。 （１）の工程において、長さの異なる複数の第一のDNAを作製し、その長さの異なる複数の第一のDNAの各々に種類の異なる低分子化合物を固定し、（３）の工程において、長さの異なる第一のDNAとの連結によって生じる長さの異なるシグナルDNAの各々を検出することを特徴とする請求項１に記載の低分子化合物とタンパク質の結合評価方法。 （１）の工程において、突出末端の配列が異なる複数の第一のDNAを作製し、その突出末端の配列が異なる複数の第一のDNAを標識するとともに、その各々に種類の異なる低分子化合物を固定し、（２）の工程において、第一のDNAの一つとのみ連結可能である第一のDNAと同数の第二のDNAを作製し、その第二のDNAを基板上に固定し、（３）の工程において、第一のDNAと基板上に固定されている第二のDNAを共存させ、（４）の工程において、基板上に検出される標識の位置から、各々のシグナルDNAを検出することを特徴とする請求項１に記載の低分子化合物とタンパク質の結合評価方法。 【課題】 従来の低分子化合物とタンパク質の結合評価方法では、結合物自体を検出していたので、その結合物を検出方法に応じた特殊な環境に置く必要があり、環境の影響によって結合を適切に評価できない可能性があった。この問題を解決するため、結合物自体を検出対象としない結合評価方法を提供する。【解決手段】 （１）突出末端を持ち、その突出末端に低分子化合物が固定されている第一のDNAを作製する工程、（２）第一のDNAの突出末端と連結可能な突出末端を持つ第二のDNAを作製する工程、（３）第一のDNAと第二のDNAを、タンパク質とDNAリガーゼの存在下で共存させる工程、及び（４）第一のDNAと第二のDNAとが連結したシグナルDNAを検出する工程を含むことを特徴とする低分子化合物とタンパク質の結合評価方法。【選択図】 図１