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松田 秀秋 友廣 教道 JP 2006273736 公開特許公報(A) 20061012 2005093527 20050329 ネオヘスペリジンの抗酸化作用に基づく美白剤または色素沈着症改善剤 株式会社 ア・ファーマ近大 504061374 松田 秀秋 598001065 株式会社 ウイル・コーポレーション 500254837 高橋 剛 100096758 高橋 雅和 100114845 松田 秀秋 友廣 教道 A61K 8/00 20060101AFI20060915BHJP A61Q 19/00 20060101ALI20060915BHJP A61K 8/60 20060101ALI20060915BHJP A61K 8/96 20060101ALI20060915BHJP A61Q 19/02 20060101ALI20060915BHJP A61K 31/7048 20060101ALI20060915BHJP A61K 36/75 20060101ALI20060915BHJP A61P 17/16 20060101ALI20060915BHJP JPA61K7/48A61K7/00 FA61K7/00 KA61K7/00 XA61K31/7048A61K35/78 KA61P17/16 3 ＯＬ 12 4C083 4C086 4C088 4C083AA111 4C083AA112 4C083AD391 4C083AD392 4C083BB47 4C083CC02 4C083CC03 4C083CC19 4C083EE07 4C083EE16 4C083EE17 4C083FF01 4C086AA01 4C086AA02 4C086EA11 4C086GA17 4C086MA01 4C086MA04 4C086MA63 4C086NA14 4C086ZA89 4C086ZB21 4C086ZC20 4C086ZC28 4C088AB62 4C088AC04 4C088BA08 4C088BA10 4C088BA13 4C088BA14 4C088CA03 4C088CA06 4C088CA19 4C088MA63 4C088ZA89 4C088ZB21 4C088ZC20 4C088ZC28 本発明はハッサク、ダイダイ、ナツダイダイ等の未成熟な柑橘類果実に含まれているフラバノン配糖体であるネオヘスペリジンを有効成分として含有することを特徴とする当該ネオヘスペリジンの抗酸化作用に基づく美白剤または色素沈着症改善剤に関する。 シミ、ソバカス、色黒、又は薬物による皮膚の黒色化症等の色素沈着症は、皮膚にメラニン色素が過剰に沈着した疾患である。 本疾患は、特に、女性にとって美容上好ましくなく、したがって、シミ、ソバカス、色黒、又は薬物による皮膚の黒色化症等を改善したり、肌を効果的に美白したりすることが望まれてきた。 前記メラニンは、動植物界に広く分布しているが、脊髄動物におけるその生合成については、メラノサイト中の細胞質顆粒メラノソームで、チロシンが酵素・チロシナーゼにより酸化されて、ドーパ、ドーパキノンが生合成され、さらにドーパキノンから紫外線による自動酸化によってインドールキノン等が生合成されるといった複雑な経路を経てメラニンが生合成されることが知られている。 一方、ミカン科植物のＣｉｔｒｕｓ属植物やＦｏｒｔｕｎｅｌｌａ属植物の果実は柑橘類果実と総称され、世界的に食用とされているものが数多くある。また、柑橘類果実は古来、薬用に供されるものも多く、『第十四改正日本薬局方』には陳皮［ミカン科（Ｒｕｔａｃｅａｅ）のウンシュウミカン（Ｃｉｔｒｕｓ ｕｎｓｈｉｕ）あるいはＣｉｔｒｕｓ ｒｅｔｉｃｕｌａｔａの成熟した果皮］、枳実・枳殻［ミカン科（Ｒｕｔａｃｅａｅ）のダイダイＣｉｔｒｕｓ ａｕｒａｎｔｉｕｍ ｖａｒ． ｄａｉｄａｉ、Ｃｉｔｒｕｓ ａｕｒａｎｔｉｕｍ又はナツミカンＣｉｔｒｕｓ ｎａｔｓｕｄａｉｄａｉの未熟果をそのまま或いはそれを半分に横切したもの］、橙皮［ミカン科（Ｒｕｔａｃｅａ）のＣｉｔｒｕｓ ａｕｒａｎｔｉｕｍ又はダイダイＣｉｔｒｕｓ ａｎｒａｎｔｉｕｍ ｖａｒ． ｄａｉｄａｉの成熟した果皮］が収載されている。 これら柑橘類生薬はいずれも特有の芳香と苦味を有し、中国では、陳皮および橙皮は芳香性苦味健胃薬として用いられ、枳実は堅く充実したうっ滞、うっ血による腫脹の改善を目的とした漢方方剤に配合されている。 柑橘類生薬には、精油成分としてリモネン（ｌｉｍｏｎｅｎｅ）、フラバノン配糖体としてヘスペリジン（ｈｅｓｐｅｒｉｄｉｎ）、ネオヘスペリジン（ｎｅｏｈｅｓｐｅｒｉｄｉｎ）、ナリンギン（ｎａｒｉｎｇｉｎ）、ナリルチン（ｎａｒｉｒｕｔｉｎ）、アルカロイドとしてシネフリン（ｓｙｎｅｏｈｒｉｎ）等が含まれている。 ミカン類生薬（陳皮、橘皮、枳実、橙皮）には、消化器系に対する作用や抗アレルギー作用等が証明されている。抗アレルギー作用に関しては、陳皮水製エキスの経口投与によりラット受身皮膚アナフィラキシー反応は抑制される。ウンシュウミカン果実についてもマスト細胞からのｃｏｍｐｏｕｎｄ ４８／８０によるヒスタミン遊離抑制作用を指標に、抗アレルギー作用が検討され、成熟したものよりも未成熟なものにより強い作用が認められている（たとえば、特許文献１参照。）。また、抗アレルギー作用については、ヘスペリジンが主要成分と考えられている（たとえば、特許文献２参照。）。また、フラバノン配糖体成分のノビレチン、タンゲリチン、３−メトキシノビレチンにもラット腹腔マスト細胞からのヒスタミン遊離抑制作用が認められている。また、枳実、枳殻の水抽出エキスや５０％エタノールエキスにはラット受身皮膚アナフィラキシー反応やマウス塩化ピクリル誘発接触性皮膚炎を抑制する作用が報告されている。また、未成熟な柑橘類果実に含まれるフラバノン配糖体であるヘスペリジン自身については、美白効果やシミ、ソバカス等の色素沈着症の改善効果があることが知られている。特開昭６３−１７０３２３特開平４−２９５４２８ただし、ヘスペリジンの美白作用は、酵素・チロシナーゼを阻害し、ドーパからドーパキノンへの変換を阻害することに基づくものであり、ドーパキノンから紫外線による自動酸化によってインドールキノン等が生合成されるといった複雑な経路を経てメラニンが生合成されることを抑制することによるものではない。一般的に柑橘類果実中には、美白作用のあるビタミンＣが含まれており、柑橘類にはビタミンＣが豊富に含まれていると思われがちだが、柑橘類果実中のビタミンＣ含量は未熟な時期のもの程少なく、完熟するにつれその量は多くなる。また、ビタミンＣ自身、大変酸味が強いものであり、かつ、熱や酸化に対して極めて弱く、不活性化ならびに分解を受けやすいという問題点があった。 そこで本発明の目的は、従来、知られている美白剤に比べ、複雑な経路で生合成され、かつ酸化反応によって促進されるメラニン生合成に対して優れた効力および幅広い抑制機序を有する美白剤又は色素沈着症改善剤を提供することである。 本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、未成熟なハッサク、ダイダイ、ナツダイダイ等の柑橘類果実に含まれているフラバノン配糖体であるネオヘスペリジンが優れた抗酸化作用を有することを発見し、それに基づく美白効果および色素沈着症の改善効果を有することを見出し、本発明を完成したものである。さらに、ネオヘスぺリジンは、熱や酸化に対し強く、不活性化ならびに分解を受けにくいことを発見した。 本発明における色素沈着症としては、前述の如く、メラニン色素が皮膚に過剰に沈着した疾患であり、その具体例としては、シミ、ソバカス、色黒、ステロイド等の薬物による皮膚の黒化症等を挙げることができる。 本発明のネオヘスペリジンを含有する未成熟な柑橘類果実とは、一般に柑橘類果実の着果後の生長過程において、果皮が黄変する以前の未成熟段階のハッサク、ダイダイ、ナツダイダイ等の果実を意味するものである。たとえば、実施例で実験材料に供した和歌山有田郡金屋町産のハッサクにおいては、５月２０日頃に着果し、その後２ヶ月ないし３ヶ月を経過した横径が約３．０ ｃｍ以上、約６．５ ｃｍ以下の未成熟な柑橘類果実がこれに相当する。また、これらの果実は日本でのみ生産されており、入手が簡単で費用も安く済むものである。 未成熟なハッサク、ダイダイ、ナツダイダイ等の果実に含まれているネオヘスペリジンは、その果実の乾燥粉末、抽出エキスから得られる。 当該未成熟なハッサク、ダイダイ、ナツダイダイ等の果実に含まれているネオヘスペリジンは乾燥粉末として、又は抽出したエキスとして使用されるのが好適である。当該未成熟なハッサク、ダイダイ、ナツダイダイ果実の乾燥粉末は、一般の乾燥方法によって得られる。すなわち、未成熟なハッサク、ダイダイ、ナツダイダイ果実をそのままあるいは細切後、日陰あるいは陽干し、あるいは乾燥機を用いて乾燥し、粉末とするものである。 当該未成熟なハッサク、ダイダイ、ナツダイダイ等の果実のエキスについては、水、温湯、エタノール、含水エタノール等の通常生薬エキスの抽出に使用される溶媒を用いて抽出したものや、又、その抽出液から前記溶媒を凍結乾燥、噴霧乾燥、減圧留去等の方法で除去することにより得られる粉末や、さらにはカラムクロマト等の精製技術を駆使して得た単独の成分をも挙げることができる。 当該未成熟なハッサク、ダイダイ、ナツダイダイ等の柑橘類果実に含まれるフラバノン配糖体であるネオヘスペリジンの投与方法としては、経口投与、局所投与、外用投与等種々の方法を挙げることができる。 これらの製剤は、当該未成熟なハッサク、ダイダイ、ナツダイダイ等の柑橘類果実に含まれるフラバノン配糖体であるネオヘスペリジンに、製剤学的に受容可能な添加剤、賦形剤等を混合し、公知の製剤技術を用いて製造することができる。 当該未成熟なハッサク、ダイダイ、ナツダイダイ等の柑橘類果実に含まれるフラバノン配糖体成分であるネオヘスペリジンの投与量は、投与方法により異なるが、外用剤として投与する場合には、皮膚疾患部に外用剤を適当量塗布すればよい。 本発明における、未成熟なハッサク、ダイダイ、ナツダイダイ等の柑橘類果実に含まれるネオヘスペリジンは、メラニン色素の産生に対して、優れた抗酸化作用に基づく抑制効果を示す。したがって、美白剤に好適である。 本発明における、ハッサク、ダイダイ、ナツダイダイ等の柑橘類果実に含まれるネオヘスペリジンは、シミ、ソバカス、色黒、又は薬物による黒化症等の色素沈着症の原因であるメラニン色素の産生に対して、優れた抗酸化作用に基づく抑制効果を示し、色素沈着改善剤として好適である。 以下、ハッサク、ダイダイ、ナツダイダイ等の柑橘類果実のうち、ハッサクの検体例、実験例を挙げて、本発明を説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。 検体１；２００４年７月１０日、８月８日、９月８日、１０月８日に和歌山県有田郡金屋町内で栽培されているハッサク果実を採取、細切後乾燥し、粉砕、粉末とした。 検体２；上記に示したハッサク果実の粉末に１０倍量の５０％エタノールを加え、約８０℃で２時間抽出した。抽出液をろ紙ろ過し、そのろ液をエバポレーターで減圧下濃縮しエタノールを留去した。濃縮した抽出液を凍結乾燥し、エキスとした。ネオヘスペリジンは７月１０日に採取したハッサク果実の乾燥粉末を５倍量の８０％メタノールで３回熱時抽出した。抽出液をろ紙ろ過し、そのろ液をエバポレーターで減圧下濃縮した。その後、クロロホルムで洗浄放置したところ、多量の結晶を得た。得られた粗結晶を含水メタノールで再結晶し、ネオヘスペリジンを得た。その他、ヘスペリジン、ナリルチン、ナリンギンは市販（Ｅｘｔｒａｓｙｔｈｅｓｅ）のものを用いた。 実験例１ ハッサク果実中のネオヘスペリジン及びヘスペリジン含量の季節的推移 （試験方法） 各検体を５００ ｍｇ精秤した。１００ｍＬのメタノールで３０分、３回還流抽出した（水浴８０℃）。抽出液をろ紙ろ過し、そのろ液をエバポレーターで濃縮した。濃縮した抽出液をメタノールで５０ ｍＬにメスアップ後、メタノールで１０倍に希釈した。希釈液をウルトラフリーＭＣ（０．２２μｍ）（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）にてろ過した後、下記の方法でＨＰＬＣ分析を行った。 ［ＨＰＬＣ分析条件］ １）検量線の作成；ネオヘスペリジン及びヘスペリジンの標準品はＳＩＧＭＡ社より購入したものを使用した。メタノールにて１ ｍｇ／ｍＬに調製後、２５、５０、１００、２５０、５００（μｇ／ｍＬ）に調製し、ウルトラフリーＭＣ（０．２２μｍ）（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）にてろ過したものを検量線作成用の溶液とした。これについて、下記の条件により、ＨＰＬＣ分析を行い、得られたネオヘスペリジン及びヘスペリジンのピーク面積値から検量線を作成した。 ２）ＨＰＬＣの分析条件装置 ；送液ユニット：ＬＣ−１０ＡＴｖｐ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ製）検出器；ＵＶ−Ｖｉｓ検出器ＳＰＤ−１０ＡＶＰ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ製）カラム恒温槽；Ｕ−６２０（Ｓｕｇａｉ製）記録およびデータ解析；Ｃｈｒｏｍａｔｏｃｏｄｅｒ ２１（システムインスルメンツ）カラム；ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｐｒｏ Ｃ１８（１５０×４．６ｍｍ、ｉ．ｄ．）（ＹＭＣ製）ガードカラム；Ｃ−ＫＧＣ−３２４ＡＳＣ−３（ＹＭＣ製）移動相；ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ／１０ ｍＭ Ｈ３ＰＯ４（２０：８０（ｖ／ｖ））流速；０．５ｍＬ／ｍｉｎ温度；３７℃検出波長；２８０ｎｍ注入量；１０μＬネオヘスペリジンのＲｅｔｅｎｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ；２１．５−２３．１ｍｉｎヘスペリジンのＲｅｔｅｎｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ；１７．１−１９．５ｍｉｎ 結果を下記表１に示す。 表１に示したように、７月１０日に採取した未成熟なハッサク果実には高含量にネオヘスペリジンが含まれ、８月８日に採取されたものも高い含量を示したが、９月８日採取分では急激に低下し、１０月８日ではさらに低下した。さらに、ヘスペリジンの量はネオヘスペリジンの量と比較し非常に少なかった。 実験例２ ハッサク果実中の総ビタミンＣ含量の季節的推移 （試験方法） 各検体を５００ ｍｇ精秤し、５％メタリン酸溶液とケイ砂を加え、摩砕抽出した。５０ｍＬのメスフラスコに５％メタリン酸溶液で洗いこみ、定容とした後、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、ろ過した。抽出後のろ液をビタミンＣの測定溶液として１０ μｇ／ｍＬとなるように希釈して、その１０ ｍＬを試験管に分注し、５％メタリン酸溶液１ｍＬを加えた。インドフェノール溶液を３０秒間経過しても色が消失しなくなるまで滴下し、２％チオ尿素・メタリン酸溶液２ｍＬを加え、最後に２％ ２，４−ジニトロフェニルヒドラジン・４．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸溶液０．５ｍＬを加え、振り混ぜた。試験管に栓をし、５０℃の温浴中で１．５時間加温し、オサゾンを生成させた後、水冷して室温に戻した。酢酸エチル２．０ｍＬを加えて1時間振とうし、生成したオサゾンを酢酸エチル層に転用させた。静置後、下層を除き、無水硫酸ナトリウムで酢酸エチルを脱水し、試験溶液とし、下記の方法でＨＰＬＣ分析を行った。 ［ＨＰＬＣ分析条件］ １）検量線の作成；ビタミンＣ（アスコルビン酸）の標準品はＷＡＫＯ社より購入したものを使用した。５％メタリン酸にて１ ｍｇ／ｍＬに調製後、２５、５０、１００、２５０、５００（μｇ／ｍＬ）に調製し、ウルトラフリーＭＣ（０．２２ μｍ）（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）にてろ過したものを検量線作成用の溶液とした。これについて、下記の条件により、ＨＰＬＣ分析を行い、得られたアスコルビン酸のピーク面積値から検量線を作成した。 ２）ＨＰＬＣの分析条件装置 ；送液ユニット：ＬＣ−１０ＡＴｖｐ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ製）検出器；ＵＶ−Ｖｉｓ検出器ＳＰＤ−１０ＡＶＰ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ製）カラム恒温槽；Ｕ−６２０（Ｓｕｇａｉ製）記録およびデータ解析；Ｃｈｒｏｍａｔｏｃｏｄｅｒ ２１（システムインスルメンツ）カラム；Ｓｉｌｉｃａ−２１５０−Ｎ（１５０×４．６ｍｍ、ｉ．ｄ．）（センシュー製）移動相；酢酸エチル／ヘキサン／酢酸（５：４：１（ｖ／ｖ））流速；１．５ｍＬ／ｍｉｎ温度；４０℃検出波長；４９５ｎｍ注入量；１０μＬ 結果を下記表２に示す。 表２に示したように、７月１０日および８月８日に採取した未成熟なハッサク果実にはビタミンＣ含量は低く、９月８日および１０月８日に採取した成熟してきたハッサク果実のビタミンＣ含量は高かった。 実験例３ チロシナーゼ活性抑制試験；Ｍａｓｏｎらの方法に従った。被検体をディメチル スルフォキサイド（dimethyl sulfoxide）、リン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ ６．８）の１：９溶液に溶解した。０．０３％に調整した基質ドーパ溶液（ＰＢＳに溶解）０．５ｍLに被検液０．５ｍＬを加え、２５℃、１０分間インキュベートした。１３５Ｕ／ｍＬに調整した酵素チロシナーゼ液（ＰＢＳに溶解）を０．５ｍＬ加え、５分間インキュベートした．反応後４７５ｎｍにおける吸光度を測定（ＵＶ−２４００ＰＣ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ）した。 結果を下記表３および表４に示す。 抑制率は、次式により求めた。 抑制率（％）＝（検体無添加である対照の吸光度−被検体の吸光度）／（検体無添加である対照の吸光度）×１００ 表３に示したように、９月８日、１０月８日に採取したハッサク果実よりも７月１０日、８月８日に採取された未成熟なハッサク果実のエキスの方がチロシナーゼ活性を抑制する作用が強かった。また、ネオヘスペリジン含量の低下する９月、１０月に採取した果実では、その活性は認められなかった。表４に示したように、未熟な時期のハッサク果実に高含量に含まれるフラバノン配糖体のネオヘスペリジンにチロシナーゼ活性を抑制する作用が認められた。実験例４ＳＯＤ様作用試験；ＳＯＤ様活性試験はＯｙａｎａｇｉらの方法に準じた。すなわち、緩衝液（６５ ｍＭリン酸２水素カリウムおよび３５ｍＭホウ酸ナトリウム、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ−２ナトリウム；ｐＨ ８．２）０．２ｍＬに１０ｍＭヒドロキシルアミンと１ｍｇ／ｍＬヒドロキシルアミン-o-スルホン酸の混合液０．１ｍＬ、被検体０．１ｍＬおよび０．５ｍＭヒポキサンチン溶液０．２ｍＬを加え、３７℃、１０分間プレインキュベートした。この混合液に５ｍＵ／ｍＬキサンチン酸化酵素液０．２ｍＬを添加し、３７℃、３０分間反応させた。その反応液に発色液（３０μＭ Ｎ-１-ナフチル・エチレン・ジアミン・２塩酸、および３ｍＭスルファニル酸、２５％酢酸の混合液）２．０ｍＬを加え、３０分間室温放置し発色させた。吸光波長５５０ｎｍで吸光度を測定した。 その結果を表５および表６に示した。 抑制率は、次式により求めた。 抑制率（％）＝（検体無添加である対照の吸光度−被検体の吸光度）／（検体無添加である対照の吸光度）×１００ 表５に示したように、７月から８月に採取された未成熟なハッサク果実に強いＳＯＤ様作用が認められた。表６に示したように、未成熟な時期のハッサク果実に高含量に含まれるフラバノン配糖体のネオヘスペリジンにも強いＳＯＤ様作用が認められた。他の柑橘類に含まれているフラバノン配糖体のヘスペリジン、ナリルチン、ナリンギンにもＳＯＤ様作用が認められたが、その作用はネオヘスペリジンよりも極めて弱かった。 実験例５ 自動酸化によるメラニン産生抑制試験；０．０３％に調整した基質ドーパ溶液（リン酸緩衝液に溶解）０．５ｍＬを２５℃、１０分間インキュベートし、１３５Ｕ／ｍＬに調整した酵素チロシナーゼ液（リン酸緩衝液に溶解）を０．５ｍＬ加えた。５分間インキュベートした後、被検液０．５ｍＬを加え、さらに４５分間インキュベートした。次に、１Ｎ塩酸０．２ｍＬで反応を停止させ、室温で３０００ｒｐｍ、１５分間の遠心分離にて沈査を得た。この沈査を、さらに６Ｎ塩酸１．０ｍＬで１回、蒸留水２．０ｍＬで1回の遠心分離（４０００ ｒｐｍ、２０分、室温）にて洗浄後、２．０ｍＬのｓｏｌｕｅｎｅ ３５０（Ｐａｃｋｅｒｄ）に溶解（約１２時間）し、溶解し難いときはソニケーターを用いて強制溶解させた。溶解液の吸光度４００ｎｍで測定し、標準品メラニンの吸光度曲線から生成メラニン量を算出した。 その結果を表７および表８に示した。 抑制率は、次式により求めた。 抑制率（％）＝（検体無添加である対照の吸光度−被検体の吸光度）／（検体無添加である対照の吸光度）×１００ 表７に示したように、７月１０日の未成熟な時期に採取されたハッサク果実エキスにドーパクロムからメラニンへの生合成を抑制する作用が認められた。表８に示したように、未成熟な時期のハッサク果実に高含量に含まれるフラバノン配糖体のネオヘスペリジンにも同様にメラニンの生合成を抑制する作用が認められた。 未熟な柑橘類果実に含まれているネオヘスペリジンを有効成分として含有することを特徴とする当該ネオヘスペリジンの抗酸化作用に基づく美白剤。 未成熟な柑橘類果実に含まれているネオヘスペリジンを有効成分として含有することを特徴とする当該ネオヘスペリジンの抗酸化作用に基づく色素沈着症改善剤。 前記改善すべき色素沈着症がシミ、ソバカス、色黒、又は薬物による皮膚の黒化症であることを特徴とする請求項２記載の色素沈着症改善剤。 【課題】 従来、知られている美白剤に比べ、複雑な経路で生合成され、かつ酸化反応によって促進されるメラニン生合成に対して優れた効力および幅広い抑制機序を有する美白剤又は色素沈着症改善剤を提供すること。【解決手段】 美白剤が、未熟な柑橘類果実に含まれているネオヘスペリジンを有効成分として含有すること。また、シミ、ソバカス、色黒、又は薬物による皮膚の黒化症等による色素沈着症改善剤が、未熟な柑橘類果実に含まれているネオヘスペリジンを有効成分として含有すること【選択図】 なし

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