生命科学関連特許情報

タイトル:特許公報(B2)_補酵素結合型グルコース脱水素酵素
出願番号:2004562920
年次:2010
IPC分類:C12N 9/04,C12N 1/14,C12Q 1/32,C12Q 1/54,C12R 1/66


特許情報キャッシュ

小村 啓悟 眞田 浩一 矢田 貴子 森田 哲成 久山 美加 池田 篤治 加納 健司 辻村 清也 JP 4494978 特許公報(B2) 20100416 2004562920 20031224 補酵素結合型グルコース脱水素酵素 池田食研株式会社 000210067 阿部 正博 100100181 小村 啓悟 眞田 浩一 矢田 貴子 森田 哲成 久山 美加 池田 篤治 加納 健司 辻村 清也 JP 2002373297 20021224 20100630 C12N 9/04 20060101AFI20100610BHJP C12N 1/14 20060101ALI20100610BHJP C12Q 1/32 20060101ALI20100610BHJP C12Q 1/54 20060101ALI20100610BHJP C12R 1/66 20060101ALN20100610BHJP JPC12N9/04 DC12N1/14 AC12Q1/32C12Q1/54C12N9/04 DC12R1:66C12N1/14 AC12R1:66C12Q1/32C12R1:66C12Q1/54C12R1:66 C12N 9/00-9/99 C12Q 1/00-1/70 PubMed 特開昭59−025700(JP,A) 特開2000−312588(JP,A) 特開平10−243786(JP,A) 特開2001−346587(JP,A) 国際公開第02/034919(WO,A1) Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology,1967, Vol.139, pp.277-293 Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology,1967, Vol.146, pp.317-327 Proceedings of the National Academy of Sciences of USA,1999, Vol.96, No.21, pp.11787-11791 14 FERM BP-08578 JP2003016603 20031224 WO2004058958 20040715 36 20061006 伊達 利奈 本発明は、新規な可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素、該補酵素結合型グルコース脱水素酵素の製造方法、および該補酵素結合型グルコース脱水素酵素の生産能を有する微生物に関する。 また、本発明は試料中のグルコースの測定に際し、該補酵素結合型グルコース脱水素酵素を使用した測定方法、該補酵素結合型グルコース脱水素酵素を含有する試薬および試薬組成物に関する。さらには有機化合物の製造方法などを含む製造原料などの物質生産および分析の用途に関する。 さらに、本発明は試料中の特定成分を迅速かつ簡便に高精度で定量することができるバイオセンサに関する。具体的には、該補酵素結合型グルコース脱水素酵素を使用したグルコースセンサに関する。 グルコースは血液中に存在し、糖尿病の重要なマーカーとして利用されている。グルコース測定法としては、従来から化学法と酵素法が存在するが、一般的に特異性、安全性の面で酵素法が優れているとされている。酵素法としては、グルコースオキシダーゼ、グルコース−6−リン酸脱水素酵素あるいはNAD(P)依存性グルコース脱水素酵素を使用した測定法がある。しかし、グルコースオキシダーゼあるいはグルコース−6−リン酸脱水素酵素を使用した測定法は、複数の酵素を使用するため簡便な反応系ではない。また、このグルコース−6−リン酸脱水素酵素を使用したおよびNAD(P)依存性グルコース脱水素酵素を使用した測定法では反応系に補酵素であるNAD(P)を添加しなければならないという煩雑性があった。 近年、試料中の特定成分について、試料液の希釈や撹拌などを行うことなく簡易に定量する方式として、様々なバイオセンサが提案されている。例えば、バイオセンサは、絶縁性の基板上にスクリーン印刷などの方法で作用極、対極および参照極からなる電極系を形成し、この電極系上に接して親水性高分子と酸化還元酵素と電子受容体を含む酵素反応層を形成したものなどがある。 糖尿病患者が年々増加しており、病院のみならず在宅でも利用可能でかつ簡便な血糖の測定方法および血糖値の管理手段が求められている。現在、血糖測定用として、簡易型のグルコースセンサが使用されているが、こうしたセンサに広く使用されているグルコースオキシダーゼは、溶存酸素濃度によって測定値に誤差が生じる可能性が高い。また、ニコチンアミド系補酵素依存性のグルコース脱水素酵素を用いたバイオセンサは、バックグラウンドのノイズが高く、補酵素や補助酵素などを別途添加する必要があるため反応系が複雑であり、さらに発色系による測定の場合は高価な光学系を必要とするなどの欠点がある。 溶存酸素濃度の影響を受けず、かつNAD(P)非存在下においてグルコースに作用する酵素として、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素が知られているが、該ピロロキノリンキノンは酵素と解離しやすいという問題点があった。さらに、特開2000−350588号公報および特開2001−197888号公報において開示されたピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素は、グルコースに対する選択性が低いという欠点があった。一方、大腸菌(Escherichia coli)由来ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素(特開平10−243786号公報)、シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)由来ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素(Agric.Biol.Chem.(1980)44:1505−1512)、およびグルコノバクター・サブオキシダンス(Gluconobacter suboxydans)由来ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素(Agric.Biol.Chem.(1981)45:851−861)のマルトースに対する作用性は、それぞれ3%、3.2%、5%であるが、菌体の膜画分に存在しているため、可溶化による酵素の抽出操作が必要という煩雑性があった。 また、グルコースの3位の水酸基を酸化する補酵素結合型グルコース−3−脱水素酵素が、J.Biol.Chem.(1967)242:3665−3672、Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)51:58−64、Appl.Biochem.Biotechnol.(1996)56:301−310およびEnzyme Microb.Technol.(1998)22:269−274で報告されているが、いずれもグルコースに対する選択性が低い。マルトースは輸液成分として広く使用されており、輸液を投与した患者の血中マルトース濃度は高いため、グルコースに特異的に作用し、特にマルトースへの作用性が低い血糖測定用酵素の開発が望まれていた。 本発明は、上に述べた産業上の要請に応えるため、グルコースに対する基質認識性に優れ、マルトースに対する作用性の低い、新規なグルコース脱水素酵素を提供すること、その製造方法および生産能をもつ微生物を提供することを課題としている。 また、本発明は新規なグルコース脱水素酵素を利用したグルコースを迅速かつ簡便に高精度で定量可能な優れたグルコース測定方法、測定試薬およびバイオセンサ、さらにはグルコース消去試薬を提供することを課題としている。 本発明は前記課題を解決するためになされたものであって、本発明者らは、各方面から検討した結果、新規な可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素に着目した。該補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、電子受容体存在下でグルコースを酸化する反応を触媒し、例えば、EC(酵素番号)1.1.99に分類される酵素である。さらに、本発明者らは、該補酵素結合型グルコース脱水素酵素を生産する各種微生物を鋭意検索した結果、補酵素結合型グルコース脱水素酵素の生産微生物および補酵素結合型グルコース脱水素酵素を見出した。 本発明は、触媒反応時において補酵素が常に結合したグルコース脱水素酵素を提供する。該補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、電子受容体存在下で、グルコース、特にグルコースの1位の水酸基を酸化する反応を触媒するという理化学的性質をもつ。該補酵素結合型グルコース脱水素酵素はマルトースへの作用性が5%以下、好ましくは3%以下であり、マルトースへの作用性が低い。また、該補酵素結合型グルコース脱水素酵素は1,10−フェナントロリンで酵素反応が阻害される性質を有し、終濃度5mMの1,10−フェナントロリンで50%以上阻害され、好ましくは2mM 1,10−フェナントロリンで50%以上阻害され、より好ましくは1mM 1,10−フェナントロリンで50%以上阻害される。また、該補酵素結合型グルコース脱水素酵素は50mMクエン酸・ナトリウム緩衝液(pH5.5)存在下において、50℃で15分の熱処理後も85%以上の残存酵素活性を有する。本発明のグルコース脱水素酵素に結合する補酵素は、例えばフラビン化合物であればよく、例えばフラビンアデニンジヌクレオチドなどの補酵素である。また、本発明は、該補酵素結合型グルコース脱水素酵素の性質および/または実質的に同等な性質を有するタンパク質またはその塩について、該タンパク質をコードするアミノ酸配列あるいは当該配列に1またはそれ以上のアミノ酸残基の欠失、置換もしくは付加による変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的に活性で安定なタンパク質を含む。さらに、本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、微生物由来の補酵素結合型グルコース脱水素酵素であり、好ましくは真核微生物由来の補酵素結合型グルコース脱水素酵素、より好ましくは寄託菌株FERM BP−08578由来の補酵素結合型グルコース脱水素酵素である。 現在までにアスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)の細胞質画分および培養液中に、フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素とするグルコース脱水素酵素の存在が確認されている(TCHAN−GI BAK(BIOCHEMICA ET BIOPHYSICA ACTA.(1967)139:277−293))。しかし、該グルコース脱水素酵素は重金属イオンのみで阻害され、1,10−フェナントロリンを含む金属キレーターで阻害されないという特徴の理化学的性質を有する。そのため、該グルコース脱水素酵素を使用した測定系における反応停止試薬として重金属以外は使用できず、反応停止後の重金属廃液の処理が煩雑であるといった問題を有している。またこの酵素は安定性が低く、実用性に難が有る。一方、本発明で見出した補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、その特徴として、従来知られていたアスペルギルス・オリゼ由来補酵素結合型グルコース脱水素酵素に比べて安定性が高く、また重金属イオンの他、微量の1,10−フェナントロリンで阻害されるため反応停止などの作業が簡便という性質を有している。 本発明は、新規な可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素の製造方法を提供する。 本発明は、新規な可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素生産能を有する微生物を提供する。該微生物は好ましくは真核微生物であり、より好ましくはアスペルギルス(Aspergillus)属、さらに好ましくはアスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)であり、最も好ましくは寄託菌株FERM BP−08578である。 本発明は、新規な可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素を使用した方法を提供する。好ましくは試料中のグルコースの測定に際し、該補酵素結合型グルコース脱水素酵素を使用したグルコースの測定方法である。補酵素結合型グルコース脱水素酵素を使用したグルコースの消去方法および有機化合物の製造方法である。 本発明は、新規な可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素を含有する試薬を提供する。該試薬は、好ましくは試料中のグルコースの測定に用いる該補酵素結合型グルコース脱水素酵素を含有するグルコースの測定試薬、および補酵素結合型グルコース脱水素酵素を含有するグルコースの消去試薬および有機化合物の製造試薬である。 本発明は、新規な可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素を含有する試薬組成物を提供する。該組成物は、好ましくは試料中のグルコースの測定に用いる該補酵素結合型グルコース脱水素酵素を含有するグルコースの測定組成物、補酵素結合型グルコース脱水素酵素を含有するグルコースの消去組成物および有機化合物の製造用原料である。 本発明は、新規な可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素を使用するバイオセンサを提供し、試料中の特定成分を定量および/または定性可能なバイオセンサを提供する。該バイオセンサは、好ましくは、該補酵素結合型グルコース脱水素酵素を使用したグルコースセンサである。 これら本発明の提供する測定方法、測定試薬、測定化合物、バイオセンサのひとつの好ましい態様は、かかる測定反応系にフェリシアン化カリウム(ヘキサシアノ鉄(III)酸カリウム)を終濃度2mM−500mMで用いることを特徴とするものである。 本発明において、該補酵素結合型グルコース脱水素酵素の「マルトースに対する作用性」、「マルトースへの作用性」およびこれに類似する表現で「作用性」として表示される値(%)は、該酵素のグルコースに対する酵素活性を100%とし、そのマルトースもしくは作用性の対象とされる物質に対する該活性の相対強度を百分率で表した数値である。 図1は、実施例3(3.2)の補酵素結合型グルコース脱水素酵素の相対活性(%)とpHとの関係を示した図である。記号は測定値および緩衝液の種類を示し、緩衝液はそれぞれ、□クエン酸・リン酸ナトリウム緩衝液(pH4.6〜6.2)、◆リン酸カリウム緩衝液(pH6.8〜7.2)、○トリス・塩酸緩衝液(pH7.8〜8.6)および▲グリシン・水酸化ナトリウム(pH9.2〜9.5)である。該酵素の至適pHはpH7.0〜9.0であった。図2は、実施例3(3.3)の補酵素結合型グルコース脱水素酵素の残存活性(%)とpHとの関係を示した図である。記号は測定値および緩衝液の種類を示し、緩衝液はそれぞれ、□クエン酸・リン酸ナトリウム緩衝液(pH3.2〜6.4)、◆リン酸カリウム緩衝液(pH6.3〜6.9)、○トリス・塩酸緩衝液(pH7.3〜8.6)および▲グリシン・水酸化ナトリウム緩衝液(pH9.1〜11.4)である。該酵素の安定pHはpH4.5〜8.5であった。図3は、実施例3(3.4)の補酵素結合型グルコース脱水素酵素相対活性(%)と温度との関係を示した図である。該酵素の至適温度は、55℃付近であった。図4は、実施例3(3.5)の補酵素結合型グルコース脱水素酵素の熱処理後の残存活性(%)と処理温度との関係を示した図である。酵素は約50℃以下で安定であることが示された。図5は、実施例4のグルコース定量のための検量線で、DCIP吸光度変化−グルコース濃度を示す。図6は、実施例5の補酵素結合型グルコース脱水素酵素固定化電極でのグルコース定量の検量線である。記号はそれぞれ、×はアルゴン飽和、△は酸素飽和、○は空気飽和条件下を示す。 本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、例えば、EC1.1.99に分類される酵素であり、好ましくはEC1.1.99.10、EC1.1.99.13もしくはEC1.1.99.17で示される酵素であればよく、補酵素結合型の酵素であり、好ましくは可溶性の補酵素結合型酵素である。つまり、酵素の抽出および/または精製過程で界面活性剤を使用することなく、水溶液の状態で取出し得る酵素である。ここでいう補酵素とは、フラビン化合物であればよく、フラビンアデニンジヌクレオチド、フラビンモノヌクレオチドなどが挙げられる。 本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、触媒反応時において、補酵素が常に結合したグルコース脱水素酵素であればよい。該補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、少なくとも以下の性質を有する。電子受容体存在下でグルコースを酸化する反応を触媒し、特にグルコースの1位の水酸基を酸化する反応を触媒するという理化学的性質を有する。また、該補酵素結合型グルコース脱水素酵素のマルトースへの作用性は低く、たとえば5%以下、好ましくは3%以下である。さらに、該補酵素結合型グルコース脱水素酵素の酵素活性は終濃度5mM 1,10−フェナントロリンで50%以上阻害され、好ましくは2mM 1,10−フェナントロリンで50%以上阻害され、より好ましくは1mM 1,10−フェナントロリンで50%以上、より最適には1mM 1,10−フェナントロリンで60%以上阻害される。また、該補酵素結合型グルコース脱水素酵素は50mM クエン酸・ナトリウム緩衝液(pH5.5)存在下において、50℃で15分の熱処理後も85%以上の残存酵素活性率を有する。また、本発明は、上述する理化学的性質を有する補酵素結合型グルコース脱水素酵素に関し、または該補酵素結合型グルコース脱水素酵素と実質的に同等な活性を有するタンパク質またはその塩について、該タンパク質をコードするアミノ酸配列あるいは当該配列に1またはそれ以上のアミノ酸残基の欠失、置換もしくは付加による変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的に活性で安定なタンパク質および塩であり、該理化学的性質をコードするアミノ酸配列に関する。 本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素であるタンパク質およびその塩は、上記理化学的性質を有する微生物由来が好ましい。本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素の由来となる微生物、本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素の生産能を有する微生物としては、例えば、原核生物に属するアーカンギウム(Archangium)属、アーケオグロバス(Archaeoglobus)属、アーセノフォナス(Arsenophonus)属、アーレンシア(Ahrensia)属、アウレオバクテリウム(Aureobacterium)属、アエロコッカス(Aerococcus)属、アエロピルム(Aeropyrum)属、アエロミクロビウム(Aeromicrobium)属、アエロモナス(Aeromonas)属、アキフェクス(Aquifex)属、アクアスピリラム(Aquaspirillum)属、アクアバクター(Aquabacter)属、アクアバクテリウム(Aquabacterium)属、アクアミクロビウム(Aquamicrobium)属、アクチノアロテイクス(Actinoalloteichus)属、アクチノキネオスポラ(Actinokineospora)属、アクチノコラリア(Actinocorallia)属、アクチノシネマ(Actinosynnema)属、アクチノスポランギウム(Actinosporangium)属、アクチノバクルム(Actinobaculum)属、アクチノバチルス(Actinobacillus)属、アクチノピクニジウム(Actinopycnidium)属、アクチノビスポラ(Actinobispora)属、アクチノプラネス(Actinoplanes)属、アクチノポリスポラ(Actinopolyspora)属、アクチノポリモルファ(Actinopolymorpha)属、アクチノマイセス(Actinomyces)属、アクチノマジュラ(Actinomadura)属、アクロカルポスポラ(Acrocarpospora)属、アグロコッカス(Agrococcus)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、アグロマイセス(Agromyces)属、アクロマチウム(Achromatium)属、アグロモナス(Agromonas)属、アクロモバクター(Achromobacter)属、アコレプラズマ(Acholeplasma)属、アサイア(Asaia)属、アシジアヌス(Acidianus)属、アシジスファエラ(Acidisphaera)属、アシジフィリウム(Acidiphilium)属、アシジミクロビウム(Acidimicrobium)属、アシジロバス(Acidilobus)属、アシダミノコッカス(Acidaminococcus)属、アシダミノバクター(Acidaminobacter)属、アシヂチオバチルス(Acidithiobacillus)属、アジトコッカス(Agitococcus)属、アシドサーマス(Acidothermus)属、アシドセラ(Acidocella)属、アシドバクテリウム(Acidobacterium)属、アシドボラクス(Acidovorax)属、アシドモナス(Acidomonas)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、アスチカコーリス(Asticcacaulis)属、アステロレプラズマ(Asteroleplasma)属、アセチトマクラム(Acetitomaculum)属、アセチビブリオ(Acetivibrio)属、アセトアナエロビウム(Acetoanaerobium)属、アセトゲニウム(Acetogenium)属、アセトサーマス(Acetothermus)属、アセトネマ(Acetonema)属、アセトバクター(Acetobacter)属、アセトバクテリウム(Acetobacterium)属、アセトハロビウム(Acetohalobium)属、アセトフィラメンタム(Acetofilamentum)属、アセトミクロビウム(Acetomicrobium)属、アゾアーカス(Azoarcus)属、アゾスピラ(Azospira)属、アゾスピリラム(Azospirillum)属、アゾトバクター(Azotobacter)属、アゾネクサス(Azonexus)属、アゾビブリオ(Azovibrio)属、アゾモナス(Azomonas)属、アゾモノトリコン(Azomonotrichon)属、アゾリゾビウム(Azorhizobium)属、アゾリゾフィラス(Azorhizophilus)属、アトポバクター(Atopobacter)属、アトポビウム(Atopobium)属、アナプラズマ(Anaplasma)属、アニューリニバチルス(Aneurinibacillus)属、アネロアルカス(Anaeroarcus)属、アネロコッカス(Anaerococcus)属、アネロシナス(Anaerosinus)属、アネロバクター(Anaerobacter)属、アネロバクルム(Anaerobaculum)属、アネロビオスピリラム(Anaerobiospirillum)属、アネロビブリオ(Anaerovibrio)属、アネロフィルム(Anaerofilum)属、アネロプラズマ(Anaeroplasma)属、アネロブランカ(Anaerobranca)属、アネロボラクス(Anaerovorax)属、アネロムサ(Anaeromusa)属、アネロラブダス(Anaerorhabdus)属、アノキシバチルス(Anoxybacillus)属、アビオトロフィア(Abiotrophia)属、アフィピア(Afipia)属、アマリコッカス(Amaricoccus)属、アミコラタ(Amycolata)属、アミコラトプシス(Amycolatopsis)属、アミノバクター(Aminobacter)属、アミノバクテリウム(Aminobacterium)属、アミノモナス(Aminomonas)属、アメボバクター(Amoebobacter)属、アモニフィラス(Ammoniphilus)属、アモニフェクス(Ammonifex)属、アモルフォスポランギウム(Amorphosporangium)属、アラクニア(Arachnia)属、アリシエラ(Alysiella)属、アリシクロバチルス(Alicyclobacillus)属、アリシュワネラ(Alishewanella)属、アルカニボラクス(Alcanivorax)属、アルカノバクテリウム(Arcanobacterium)属、アルカリゲネス(Alcaligenes)属、アルカリバクテリウム(Alkalibacterium)属、アルカリフィラス(Alkaliphilus)属、アルコバクター(Arcobacter)属、アルスロバクター(Arthrobacter)属、アルテロコッカス(Alterococcus)属、アルテロモナス(Alteromonas)属、アルビバクター(Albibacter)属、アロイオコッカス(Alloiococcus)属、アロクロマティウム(Allochromatium)属、アロドモナス(Arhodomonas)属、アロモナス(Allomonas)属、アロリゾビウム(Allorhizobium)属、アンカロクロリス(Ancalochloris)属、アンカロミクロビウム(Ancalomicrobium)属、アンギオコッカス(Angiococcus)属、アングロミクロビウム(Angulomicrobium)属、アンシロバクター(Ancylobacter)属、アンタクトバクター(Antarctobacter)属、アンフィバチルス(Amphibacillus)属、アンプラリエラ(Ampullariella)属、イグナビグラナム(Ignavigranum)属、イジオマリナ(Idiomarina)属、イソクロマチウム(Isochromatium)属、イソスフェエラ(Isosphaera)属、イデオネラ(Ideonella)属、イリオバクター(Ilyobacter)属、イントラスポランギウム(Intrasporangium)属、ウィークセラ(Weeksella)属、ウィグルスワーシア(Wigglesworthia)属、ウィリアムシア(Williamsia)属、ウォリネラ(Wolinella)属、ウォルバキア(Wolbachia)属、ウレアプラズマ(Ureaplasma)属、ウレイバチルス(Ureibacillus)属、エイケネラ(Eikenella)属、エーリキア(Ehrlichia)属、エクシグオバクテリウム(Exiguobacterium)属、エクセロスポラ(Excellospora)属、エクトチオロドスピラ(Ectothiorhodospira)属、エジプシアネラ(Aegyptianella)属、エッガーセラ(Eggerthella)属、エッシェリヒア(Escherichia)属、エドワードシエラ(Edwardsiella)属、エビンゲラ(Ewingella)属、エペリスロゾーン(Eperythrozoon)属、エリシペロスリクス(Erysipelothrix)属、エリスロバクター(Erythrobacter)属、エリスロミクロビウム(Erythromicrobium)属、エリスロモナス(Erythromonas)属、エリトロスポランギウム(Elytrosporangium)属、エルシニア(Yersinia)属、エルビニア(Erwinia)属、エレモコッカス(Eremococcus)属、エンシファー(Ensifer)属、エンテロコッカス(Enterococcus)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、エントモプラズマ(Entomoplasma)属、エンヒドロバクター(Enhydrobacter)属、エンペドバクター(Empedobacter)属、オエノコッカス(Oenococcus)属、オエルスコビア(Oerskovia)属、オーシャニモナス(Oceanimonas)属、オーシャノスピリラム(Oceanospirillum)属、オキサロバクター(Oxalobacter)属、オキサロファガス(Oxalophagus)属、オキソバクター(Oxobacter)属、オクタデカバクター(Octadecabacter)属、オクロバクトラム(Ochrobactrum)属、オシロクロリス(Oscilochloris)属、オシロスピラ(Oscillospira)属、オベスムバクテリウム(Obesumbacterium)属、オリエンチア(Orientia)属、オリゲラ(Oligella)属、オリゴトロファ(Oligotropha)属、オリバクラム(Oribaculum)属、オルニチニコッカス(Ornithinicoccus)属、オルニチニミクロビウム(Ornithinimicrobium)属、オルニトバクテリウム(Ornithobacterium)属、オレニア(Orenia)属、ガードネレラ(Gardnerella)属、カーニモナス(Carnimonas)属、カーノバクテリウム(Carnobacterium)属、カウチオプラネス(Couchioplanes)属、カウドリア(Cowdria)属、カウロバクター(Caulobacter)属、カセオバクター(Caseobacter)属、カテニバクテリウム(Catenibacterium)属、カテニュロプラネス(Catenuloplanes)属、カテノコッカス(Catenococcus)属、カテラトスポラ(Catellatospora)属、カトネラ(Catonella)属、カプスラリス(Capsularis)属、カプノシトファーガ(Capnocytophaga)属、ガリオネラ(Gallionella)属、カリオファノン(Caryophanon)属、ガリコラ(Gallicola)属、カリマトバクテリウム(Calym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また、例えば真核微生物に属するイッサチェンキア(Issatchenkia)属、カンジダ(Candida)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、クリベロマイセス(Kluyveromyces)属、クロエッケラ(Kloeckera)属、サッカロマイコデス(Saccharomycodes)属、サッカロマイセス(Saccharomyces)属、ジゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、シロバシジウム(Sirobasidium)属、ステリグマトマイセス(Sterigmatomyces)属、スポリドボラス(Sporidobolus)属、スポロボロマイセス(Sporobolomyces)属、デッケラ(Dekkera)属、デバリオマイセス(Debaryomyces)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、トリゴノプシス(Trigonopsis)属、トルラスポラ(Torulaspora)属、トレメラ(Tremella)属、ナドソニア(Nadsonia)属、ネマトスポラ(Nematospora)属、ハンセニアスポラ(Hanseniaspora)属、ピキア(Pichia)属、フィブロバシジウム(Fibulobasidium)属、フィロバシジウム(Filobasidium)属、フィロバシジエラ(Filobasidiella)属、ブレラ(Bullera)属、ブレッタノマイセス(Brettanomyces)属、ホルターマンニア(Holtermannia)属、マラッセジア(Malassezia)属、メチニコイア(Metschnikowia)属、リポマイセス(Lipomyces)属、ロイコスポリジウム(Leucosporidium)属、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属、ロドトルラ(Rhodotorula)属、アカウロペイジ(Acaulopage)属、アクアモルチエレラ(Aquamortierella)属、アセラリア(Asellaria)属、アモエビジウム(Amoebidium)属、アモエボフィルス(Amoebophilus)属、アルンジヌラ(Arundinula)属、ウサロミケス(Utharomyces)属、エキノスポランジウム(Echinosporangium)属、エンテロブリウス(Enterobryus)属、エンドゴネ(Endogone)属、エントモフトラ(Entomophthora)属、キクセラ(Kickxella)属、ゲニステロスポラ(Genistellospora)属、コアネフォラ(Choanephora)属、コエマンシア(Coemansia)属、コクロネマ(Cochlonema)属、コニジオボルス(Conidiobolus)属、サクセナエア(Saksenaea)属、サムニジウム(Thamnidium)属、サムノセファリス(Thamnocephalis)属、ジスピラ(Dispira)属、ジマルガリス(Dimargaris)属、シンセファラストルム(Syncephalastrum)属、シンセファリス(Syncephalis)属、ズーペイジ(Zoopage)属、スクレロキスチス(Sclerocystis)属、スミチウム(Smittium)属、バシジオボルス(Basidiobolus)属、パラタエニエラ(Parataeniella)属、パラモエビジウム(Paramoebidium)属、パラワスキア(Palavascia)属、ハルペラ(Harpella)属、ピプトセファリス(Piptocephalis)属、ピロボルス(Pilobolus)属、フィコミケス(Phycomyces)属、ブラケスレア(Blakeslea)属、ヘッセルチネラ(Hesseltinella)属、ヘリコケファルム(Helicocephalum)属、ミコチファ(Mycotypha)属、ラジオミケス(Radiomyces)属、レゲリオミケス(Legeriomyces)属、ロパロミケス(Rhopalomyces)属、アクラシス(Acrasis)属、アシトステリウム(Acytostelium)属、アルシリア(Arcyria)属、エキノステリウム(Echinostelium)属、エキノステリオプシス(Echinosteliopsis)属、オリゴネマ(Oligonema)属、カボステリウム(Cavostelium)属、グツリノプシス(Guttulinopsis)属、クラストデルマ(Clastoderma)属、クリブラリア(Cribraria)属、コエノニア(Coenonia)属、コプロミクサ(Copromyxa)属、コマトリカ(Comatricha)属、コロデルマ(Colloderma)属、ジアネマ(Dianema)属、ジクチオステリウム(Dictyostelium)属、ジジミウム(Didymium)属、ジデルマ(Diderma)属、ステモニチス(Stemonitis)属、スラウストキトリウム(Thraustochytrium)属、セラチオミクサ(Ceratiomyxa)属、セラチオミクセラ(Ceratiomyxella)属、トリキア(Trichia)属、フィサルム(Physarum)属、プラスモジオフォラ(Plasmodiophora)属、フリゴ(Fuligo)属、ブルスラ(Bursulla)属、プロトステリウム(Protostelium)属、プロトスポランジウム(Protosporangium)属、ヘミトリキア(Hemitrichia)属、ペリカエナ(Perichaena)属、ポリスフォンジリウム(Polysphondylium)属、ポリミクサ(Polymyxa)属、ラビリンツラ(Labyrinthula)属、ランプロデルマ(Lamproderma)属、リコガラ(Lycogala)属、リセア(Licea)属、ワードミケス(Wardmyces)属、アクチノペルテ(Actinopelte)属、アステロスポリウム(Asterosporium)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、アルタナリア(Alternaria)属、オイジウム(Oidium)属、クラボスポリウム(Clabosporium)属、クラドボトリウム(Cladobotryum)属、グラフィウム(Graphium)属、コレトトリクム(Colletotrichum)属、スクレロチウム(Sclerotium)属、スタゴノスポラ(Stagonospora)属、スチベラ(Stibella)属、ツベルクラリア(Tubercularia)属、バクトリジウム(Bactridium)属、ピクノスリウム(Pycnothyrium)属、ファエオイサリア(Phaeoisaria)属、ペスタロッチエラ(Pestalozziella)属、リゾクトニア(Rhizoctonia)属、リノクラジエラ(Rhinocladiella)属、レプトスリウム(Leptothyrium)属、アクリオゲトン(Achlyogeton)属、アニソルピジウム(Anisolpidium)属、アルブゴ(Albugo)属、エクトロゲラ(Ectrogella)属、オリピジウム(Olipidium)属、オルピジオプシス(Olpidiopsis)属、カテナリア(Catenaria)属、キトリジウム(Chytridium)属、クラドキトリウム(Cladochytrium)属、コエロモミケス(Coelomomyces)属、ゴナポジア(Gonapodya)属、サプロレグニア(Saprolegnia)属、シロルピジウム(Sirolpidium)属、シンキトリウム(Synchytrium)属、ハリフトロス(Haliphthoros)属、ハルポキトリウム(Harpochytrium)属、ピチウム(Pythium)属、ヒフォキトリウム(Hyphochytrium)属、フィソデルマ(Physoderma)属、フィリクチジウム(Phlyctidium)属、ブラストクラジア(Blastocladia)属、ペロノスポラ(Peronospora)属、ペロノフィトラ(Peronophythora)属、ミクロミコプシス(Micromycopsis)属、メガキトリウム(Megachytrium)属、モノブレファリス(Monoblepharis)属、ラゲニジウム(Lagenidium)属、リジジオミケス(Rhizidiomyces)属、リソジウム(Rhizidium)属、リピジウム(Rhipidium)属、レプトミタス(Leptomitus)属、レプトレグニエラ(Leptolegniella)属、アクレモニウム(Acremonium)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、アブシジア(Absidia)属、アラクニオタス(Arachniotus)属、アルスロボトリス(Arthrobotrys)属、ウロクラジウム(Ulocladium)属、エキノボトリウム(Echinobotryum)属、エクソフィアラ(Exophiala)属、エピコックム(Epicoccum)属、オイジオデンドロン(Oidiodendron)属、オエドセファラム(Oedocephalum)属、オーレオバシジウム(Aureobasidium)属、クルブラリア(Curvularia)属、カンデラブレラ(Candelabrella)属、カンニングハメラ(Cunninghamella)属、ギムノアスカス(Gymnoascus)属、クラドスポリウム(Cladosporium)属、グラフィウム(Graphium)属、グリオクラジウム(Gliocladium)属、クリソスポリウム(Chrysosporium)属、クロメロスポリウム(Chromelosporium)属、ゲオトリクム(Geotrichum)属、ゲオミケス(Geomyces)属、ケトミウム(Chaetomium)属、ゲニクリフェラ(Geniculifera)属、ゴナトボトリス(Gonatobotrys)属、コニオチリウム(Coniothyrium)属、サーシネラ(Circinella)属、ジゴリンクス(Zygorhynchus)属、ジプロジア(Diplodia)属、シリンドロカーポン(Cylindrocarpon)属、スコプラリオプシス(Scopulariopsis)属、スタチボトリス(Stachybotrys)属、ステンフィリウム(Stemphylium)属、スポロスリックス(Sporothrix)属、セペドニウム(Sepedonium)属、ダクチレラ(Dactylella)属、タラロミケス(Talaromyces)属、ドラトミケス(Dratomyces)属、トリクルス(Trichurus)属、トリコクラジウム(Trichocladium)属、トリコセシウム(Trichothecium)属、トリコデルマ(Trichoderma)属、トリコフィトン(Trichophyton)属、ニグロスポラ(Nigrospora)属、バーチシクラジエラ(Verticicladiella)属、バーチシリウム(Verticillium)属、パエシロミケス(Paecilomyces)属、ピトミケス(Pithomyces)属、ビポラリス(Bipolaris)属、ピレノキエタ(Pyrenochaeta)属、フィアロセファラ(Phialocephala)属、フィアロフォラ(Phialophora)属、フォーマ(Phoma)属、フザリウム(Fusarium)属、ペスタロチオプシス(Pestalotiopsis)属、ペニシリウム(Penicillium)属、ボトリチス(Botrytis)属、ミクロスポルム(Microsporum)属、ミロセシウム(Myrothecium)属、ムコール(Mucor)属、メムノニエラ(Memnoniella)属、モナクロスポリウム(Monacrosporium)属、モニリア(Monilia)属、モルチエレラ(Mortierella)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ユーロチウム(Eurotium)属、リゾプス(Rhizopus)属、レプトグラフィウム(Leptographium)属、ロビラーダ(Robillarda)属、アウストロボレトゥス(Austroboletus)属、アウリクラリア(Auricularia)属、アウリスカルピウム(Auriscalpium)属、アガリクス(Agaricus)属、アグロキベ(Agrocybe)属、アステロフォナ(Asterophona)属、アストラエウス(Astraeus)属、アセロエ(Aseroe)属、アネルラリア(Anellaria)属、アマウロデルマ(Amauroderma)属、アマニタ(Amanita)属、アルミルラリア(Armillaria)属、アルミルラリエルラ(Armillariella)属、アレウリア(Aleuria)属、イスクノデルマ(Ischnoderma)属、イノキベ(Inocybe)属、イノノトゥス(Inonotus)属、イレオディクティオン(Ileodictyon)属、ウィンネア(Wynnea)属、ヴェルパ(Verpa)属、ヴォルヴァリエルラ(Volvariella)属、ウルヌラ(Urnula)属、エキノドンティウム(Echinodontium)属、エクシディア(Exidia)属、エルフヴィンギア(Elfvingia)属、オウデマンシエルラ(Oudemansiella)属、オムファリナ(Omphalina)属、オンニア(Onnia)属、カタテラスマ(Catathelasma)属、ガノデルマ(Ganoderma)属、カマロフィルス(Camarophyllus)属、カルキポルス(Chalciporus)属、ガレリナ(Galerina)属、カロケラ(Calocera)属、カロストマ(Calostoma)属、カンタレルス(Cantharellus)属、カンタレルラ(Cantharellula)属、キアトゥス(Cyathus)属、キクロミケス(Cyclomyces)属、キストデルマ(Cystoderma)属、キプトトラマ(Cyptotrama)属、キマトデルマ(Cymatoderma)属、ギムノピルス(Gymnopilus)属、キューネロミケス(Kuehneromyces)属、ギロドン(Gyrodon)属、ギロポルス(Gyroporus)属、ギロミトラ(Gyromitra)属、グエピニア(Guepinia)属、クサントコニウム(Xanthoconium)属、クシラリア(Xylaria)属、クセロコムス(Xerocomus)属、クセロンファリナ(Xeromphalina)属、クドニア(Cudonia)属、クラヴァティア(Clavatia)属、クラヴァリア(Clavaria)属、クラヴァリアデルフス(Clavariadelphus)属、クラヴィコロナ(Clavicorona)属、クラヴゥリナ(Clavulina)属、クラヴゥリノプシス(Clavulinopsis)属、クラテレルス(Craterellus)属、クラトルス(Clathrus)属、クリトキベ(Clitocybe)属、クリトピルス(Clitopilus)属、クリニペルリス(Crinipellis)属、グリフォラ(Grifola)属、クリプトデルマ(Cryptoderma)属、クリプトポルス(Cryptoporus)属、クルキブルム(Crucibulum)属、クレオロフス(Creolophus)属、クレピドトゥス(Crepidotus)属、クロオゴムフス(Chroogomphus)属、クロロスプレニウム(Chlorosplenium)属、ゲアストルム(Geastrum)属、ゲオロッスム(Geolossum)属、コティリディア(Cotylidia)属、コノキベ(Conocybe)属、コバヤシア(Kobayasia)属、コプリヌス(Coprinus)属、ゴムフィディウス(Gomphidius)属、ゴムフス(Gomphus)属、コリオルス(Coriolus)属、コルディケプス(Cordyceps)属、コルティナリウス(Cortinarius)属、コルトリキア(Coltricia)属、コルリビア(Collybia)属、サルコスキファ(Sarcoscypha)属、サルコドン(Sarcodon)属、サルコドンティア(Sarcodontia)属、スイルス(Suillus)属、スキゾフィルム(Schizophyllum)属、スクアマニタ(Squamanita)属、スクテルリニア(Scutellinia)属、スクレロデルマ(Scleroderma)属、ステレウム(Stereum)属、ストロビロミケス(Strobilomyces)属、ストロファリア(Stropharia)属、スパトゥラリア(Spathularia)属、スパラッシス(Sparassis)属、ダエダレオプシス(Daedaleopsis)属、ダクリオミケス(Dacryomyces)属、ダルディニア(Daldinia)属、ディクティオフォラ(Dictyophora)属、ティロピルス(Tylopilus)属、ティロミケス(Tyromyces)属、デスコレア(Descolea)属、テレフォラ(Thelephora)属、トゥロストマ(Tulostoma)属、トラメテス(Trametes)属、トリコグロッスム(Trichoglossum)属、トリココマ(Trichocoma)属、トリコロマ(Tricoloma)属、トリコロモプシス(Tricholomopsis)属、トレメルラ(Tremella)属、トレメルロドン(Tremellodon)属、ナエマトロマ(Naematoloma)属、ニドゥラ(Nidula)属、ネオブルガリア(Neobulgaria)属、バエオスポラ(Baeospora)属、パクシルス(Paxillus)属、バッタレア(Battarea)属、パナエオルス(Panaeolus)属、パヌス(Panus)属、パネルス(Panellus)属、バンケラ(Bankera)属、ヒグロキベ(Hygrocybe)属、ヒグロフォルス(Hygrophorus)属、ヒグロフォロプシス(Hygrophoropsis)属、ビスポレルラ(Bisporella)属、ピソリトゥス(Pisolithus)属、ヒドヌム(Hydnum)属、ヒドネルム(Hydnellum)属、ヒプシジグス(Hypsizygus)属、ピプトポルス(Piptoporus)属、ヒポクシロン(Hypoxylon)属、ヒメノカエテ(Hymenochaete)属、ヒルシオポルス(Hirschioporus)属、ピルロデルマ(Pyrrhoderma)属、ファヴォルス(Favolus)属、ファエオルス(Phaeolus)属、ファエオレピオタ(Phaeolepiota)属、ファルス(Phallus)属、フィストウゥナ(Fistulina)属、フィルロトプシス(Phyllotopsis)属、フィルロポルス(Phylloporus)属、フィロボレトゥス(Filoboletus)属、フェルリヌス(Phellinus)属、フォミトプシス(Fomitopsis)属、フォメス(Fomes)属、フォリオタ(Pholiota)属、プサティレルラ(Psathyrella)属、プシロキベ(Psilocybe)属、プセウドコルス(Pseudocolus)属、プセウドヒアトゥラ(Pseudohiatula)属、プテルラ(Pterula)属、フランムリナ(Flammulina)属、プルヴェロボレトゥス(Pulveroboletus)属、ブルガリア(Bulgaria)属、プルテウス(Pluteus)属、プレウロキベルラ(Pleurocybella)属、プレウロトゥス(Pleurotus)属、プレクタニア(Plectania)属、フロギオティス(Phlogiotis)属、ペジザ(Peziza)属、ペニキルリオプシス(Penicilliopsis)属、ヘベロマ(Hebeloma)属、ヘリキウム(Hericium)属、ヘルヴェルラ(Helvella)属、ポドストロマ(Podostroma)属、ポリオゼルス(Polyozellus)属、ポリポルス(Polyporus)属、ポリポレルス(Polyporellus)属、ホルターマンニア(Holtermannia)属、ボルビティウス(Bolbitius)属、ポルフィレルス(Porphyrellus)属、ボレティヌス(Boletinus)属、ボレテルス(Boletellus)属、ボレトゥス(Boletus)属、ボレトプシス(Boletopsis)属、ポロディスクルス(Porodisculus)属、ボンダルゼウィア(Bondarzewia)属、マクロキスティディア(Macrocystidia)属、マクロポディア(Macropodia)属、マクロレピオタ(Macrolepiota)属、マラスミウス(Marasmius)属、マラスミエルス(Marasmiellus)属、ミクロポルス(Microporus)属、ミケナ(Mycena)属、ミトルラ(Mitrula)属、ムティヌス(Mutinus)属、メラノレウカ(Melanoleuca)属、メルリウス(Merulius)属、モルケラ(Morchella)属、ラエティポルス(Laetiporus)属、ラクタリウス(Lactarius)属、ラシオスファエラ(Lasiosphaera)属、ラッカリア(Laccaria)属、ラマリア(Ramaria)属、ランプテロミケス(Lampteromyces)属、リオフィルム(Lyophyllum)属、リギドポルス(Rigidoporus)属、リコペルドン(Lycoperdon)属、リジナ(Rhizina)属、リスルス(Lysurus)属、リマケルラ(Limacella)属、リンデラ(Lindera)属、ルッスラ(Russula)属、レウココプリヌス(Leucocoprinus)属、レウコパクシルス(Leucopaxillus)属、レオティア(Leotia)属、レスピナトゥス(Resupinatus)属、レッキヌム(Leccinum)属、レピオタ(Lepiota)属、レピスタ(Lepista)属、レンジテス(Lenzites)属、レンタリア(Lentaria)属、レンティヌス(Lentinus)属、レンティヌラ(Lentinula)属、レンティネルス(Lentinellus)属、ロジテス(Rozites)属、ロドキベ(Rhodocybe)属、ロドトゥス(Rhodotus)属、ロドフィルス(Rhodophyllus)属などに属するものが挙げられる。 本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素の生産能を有する上記微生物は、受託番号でIFOやATCCなどに寄託されており、公知の分譲機関、法人より入手可能である。該微生物として、好ましくは真核微生物、より好ましくは糸状菌に属する微生物が挙げられる。また「97508」として命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、FERM BP−08578として寄託された微生物を使用してもよい。 本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素の製造方法としての一態様は、本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素の生産能を有する微生物を栄養培地にて培養し、培養液中に補酵素結合型グルコース脱水素酵素を生成蓄積せしめこれを採取し、補酵素結合型グルコース脱水素酵素であるタンパク質およびその塩を取得することが挙げられる。 以下、本発明の寄託菌株FERM BP−08578、該菌株に由来する補酵素結合型グルコース脱水素酵素、および該酵素の取得方法について説明する。1.FERM BP−08578由来の該酵素の理化学的性質(1)作用:国際生化学連合(IUB)の分類でEC 1.1.99.10に該当する酵素であり、電子受容体存在下でグルコースの1位の水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する以下の反応を触媒する。 グルコース+電子受容体→グルコノ−δ−ラクトン+還元型電子受容体 本発明においては、電子受容体として例えばフェナジンメトサルフェート、1−メトキシ−5−メチルフェナジウムメチルサルフェイト、2,6−ジクロロフェノールインドフェノール、フェリシアン化合物などが挙げられ利用できる。(2)基質特異性:下記する活性測定方法1でD−グルコースおよび他の各基質(D−セロビオースは193mM、D−トレハロースおよびD−ラフィノースは121mMを除き、いずれも終濃度333mM)を使用した場合の該酵素の相対反応性(基質特異性)は、表1の様であった。また、終濃度550mM、100mMのD−グルコースおよびマルトースを使用した場合の相対反応性(基質特異性)は、表2の様であった。D−グルコースには強く作用し、D−マンノース、1,5−アンヒドロ−D−グルシトール、D−セロビオース、D−トレハロース、マルトース、D−ガラクトース、D−グルコース−6−リン酸、D−フルクトースには弱く作用した。また、L−アラビノース、ラクトース、D−ソルビトール、グルコン酸、スクロース、D−マンニトール、L−ソルボース、D−リボース、L−ラムノース、D−グルコース−1−リン酸、D−ラフィノース、エタノール、グリセロールにはほとんど作用しなかった。(3)至適pH:pH7.0からpH9.0(4)安定pH:pH4.5からpH8.5(5)至適温度:55℃付近(6)温度安定性:50℃以下で安定である(7)分子量:ゲル濾過法で測定した分子量は約130kDaであり、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法では約85kDaであった。(8)Km値:49.7mM D−グルコース(9)等電点:等電点電気泳動法で測定した補酵素結合型グルコース脱水素酵素の等電点(pI)は、約4.4であった。(10)阻害剤:下記する活性測定方法1に、終濃度1mMの各添加物を添加し、活性を測定したところ、対照区に対し、各添加物により表3の様な阻害効果が認められた。また、下記する活性測定法1に、各終濃度の1,10−フェナントロリン(メタノールに溶解)を添加したところ表4の様な阻害効果が認められた。本酵素の活性は、重金属イオン(Ag+、Cu2+、Hg2+)で強く阻害され、1,10−フェナントロリン、プロフラビン、Mn2+で60%以上阻害された。(11)補酵素:フラビンアデニンジヌクレオチド 補酵素結合型グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子の塩基配列に関しても本発明に属する。 本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素の製造に際し、該補酵素結合型グルコース脱水素酵素製造に使用される微生物は、本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素を生産可能な生物であればよく、例えば、微生物、好ましくは真核微生物、より好ましくは糸状菌に属する微生物を使用して効率的に製造することができる。特には、「97508」と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、FERM BP−08578として寄託された微生物を使用してもよい。該寄託菌株は、本発明者らによって土壌中より分離され、その菌学的性質は、下記の通りである。なお、本発明においては、前記菌株の変異株も使用できる。変異株は、紫外線、エックス線などの放射線または化学的変異剤(NTGなど)などの処理によって得られる。2.FERM BP−08578の菌学的性質(1)形態的性質:ポテト・デキストロース寒天培地上で生育した本菌株の光学顕微鏡下での形態的特徴を以下に記述する。菌糸は幅2μmから4μm、規則的な隔壁を有する。菌糸の大半は直線的な生育で、膨化した菌糸はほとんどみられず、分枝を有する。数本の菌糸がより集まり、菌糸束を形成する。菌糸幅はほぼ一定。菌糸の表面は平滑で、壁はやや厚い。気中菌糸基部を中心に結晶体の形成がある。かすがい連結の形成はみられない。培養2週間後までの菌体からは有性・無性生殖器官の形成はみられず、分裂子および厚壁胞子の存在もみられない。(2)各培地での生育状態:全ての寒天培地上において菌糸は綿毛状。気中菌糸色調は白色を呈する。ポテト・デキストロース寒天培地培養では淡橙色から橙色の裏面着色を呈する。生育は中程度で、25℃1週間培養後のコロニーはポテト・デキストロースおよびオートミール寒天培地で直径30mmから35mm、麦芽エキス寒天培地では直径37mmから38mmであった。また、ポテト・デキストロース寒天培地培養で淡黄色、オートミール寒天培地で薄赤色ないし灰赤色の可溶性色素の産生がみられた。培養2週間後までの菌体からは分生子柄などの生殖器官の形成はみられず、滲出液の産生もみられなかった。(3)生理的性質:本菌株は、好気性で、ポテト・デキストロース寒天培地において生育至適温度は37℃付近である。3.FERM BP−08578の分類学的特徴 以上の性質に基づき寄託菌株である「97508」を、ホークスワース、サットン、エーンズワース編、エーンズワース・アンド・ビスビーズ・ディクショナリー・オブ・ザ・ファンジャイ第7版に従って検索を行った。この検索から該寄託株は、アスペルギルス(Aspergillus)属に属する微生物であることが示された。さらに、BLAST相同性検索を行った。ゲノムDNAをテンプレートとして、PCR法により18srDNAフラグメントの増幅を行った後、精製したPCR産物の配列を解読した。類似の塩基配列をGenBank(GenBank/EMBL/DDBJ国際DNA配列データベース)から検索するため、BLAST(Altschul et al.,1997)による相同性検索を行った結果、該寄託株「97508」は、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)であることが判明した。 本発明における補酵素結合型グルコース脱水素酵素の製造方法の一態様として、上記の微生物を培養し、微生物菌体内および/または菌体外に該補酵素結合型グルコース脱水素酵素を発現、もしくは生産させ得る方法が挙げられる。 本発明で使用される微生物の培養には、通常の微生物培養用培地が使用でき、炭素源、窒素源、無機物その他使用微生物が必要とする微量栄養素を程よく含有するものであれば、合成培地、天然培地の何れでも使用可能である。炭素源としては、グルコース、シュクロース、デキストリン、澱粉、グリセリン、糖蜜などが使用できる。窒素源としては、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機塩類、DL−アラニン、L−グルタミン酸などのアミノ酸類、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカーなどの窒素含有天然物が使用できる。無機物としては、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第二鉄などが使用できる。 本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素を得るための培養は、通常、振盪培養や通気攪拌などの方法による好気的条件下で行うのがよく、25℃から60℃、かつpH5よりpH8の範囲で行うのが好ましい。培養期間は2日から4日の範囲が好ましい。この様な方法で培養することにより、培養物中、特に培養液中に補酵素結合型グルコース脱水素酵素を生成蓄積することが出来る。また、本培養方法により、培養微生物内にも補酵素結合型グルコース脱水素酵素を生成蓄積することができる。ついで、培養物中から補酵素結合型グルコース脱水素酵素を得る方法は、通常の蛋白質の精製方法が使用できる。この方法とは、例えば、微生物を培養後、遠心分離などにより微生物を除き培養上清を得る方法、もしくは、微生物を培養後、培養液を遠心分離して培養微生物を得、適当な方法で該培養微生物を破砕し、破砕液から遠心分離などによって上清液を得る方法である。これらの上清液中に含まれる補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、塩析、溶媒沈殿、透析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動などの適当な精製操作を組み合わせることによって精製できる。 また、本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素を得るための培養は、固体培地も使用できる。培養方法には特に制限はなく、静置培養によってもよく、培養物を常時混合するような回転培養や流動層培養などによっても行うことができるが、設備投資の少ない培養装置としては静置培養が好ましい。ついで、培養物中から補酵素結合型グルコース脱水素酵素を得る方法は、通常の蛋白質の精製方法が使用できる。即ち、培養物に水などの抽出剤を加えて攪拌したのち、ふすまなどの培地固形分を遠心分離、濾過などの分離法により除去して抽出液を得ることにより行うことができる。また、菌体内に蓄積された補酵素結合型グルコース脱水素酵素の回収は、上記の抽出液を得た培養物残渣を海砂などの研磨剤とともに磨砕したのち、水などを加えて、菌体から遊離された補酵素結合型グルコース脱水素酵素を抽出する方法などで行うことができる。また、全補酵素結合型グルコース脱水素酵素を得るには、培養物全体を海砂などの研磨剤とともに磨砕したのち、水などを加えて、菌体から遊離された補酵素結合型グルコース脱水素酵素と培地中に分泌された補酵素結合型グルコース脱水素酵素の両方を一挙に抽出する方法などで行うことができる。これらの上清液中に含まれる補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、塩析、溶媒沈殿、透析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動などの適当な精製操作を組み合わせることによって精製できる。 また、本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、合成による補酵素結合型グルコース脱水素酵素や遺伝子工学によって得られた組換え型の補酵素結合型グルコース脱水素酵素であってもよい。当業者は本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素の理化学的性質に由来するタンパク質およびその塩の開示に基づいて容易に補酵素結合型グルコース脱水素酵素を得ることができる。例えば、補酵素結合型グルコース脱水素酵素については、糸状菌を含む微生物や動植物などの天然物から抽出するほか、そのアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子の塩基配列をもとに合成法によって得ることができるし、該補酵素結合型グルコース脱水素酵素遺伝子の遺伝子断片を市販の発現ベクターなど公知の発現ベクターに挿入し、得られたプラスミドを使用して大腸菌などの宿主を形質転換し、形質転換体を培養して目的の補酵素結合型グルコース脱水素酵素を得るといった遺伝子工学によって該補酵素結合型グルコース脱水素酵素を工業的に製造することも可能である。 本酵素の活性測定においては、該酵素を、好ましくは終濃度0.1−1unit/mlになるように適宜希釈して用いる。なお、該酵素の酵素活性単位(unit)は1分間に1μmolのグルコースを酸化する酵素活性である。本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素の酵素活性は、次の方法で測定できる。(i)酵素活性測定法−1 0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)1.0ml、1.0M D−グルコース1.0ml、3mM 2,6−ジクロロフェノールインドフェノール(以下DCIPという)0.1ml、3mM 1−メトキシ−5−メチルフェナジウムメチルサルフェイト0.2ml、水0.65mlを3ml石英セル(光路長1cm)に添加し、恒温セルホルダー付き分光光度計にセットして37℃で5分間インキュベート後、酵素溶液0.05mlを添加後、DCIPの600nmにおける吸光度変化(ΔABS/min)を測定する。DCIPのpH7.0におけるモル吸光係数を16.3×103cm−1M−1とし、1分間に1μmolのDCIPが還元される酵素活性が実質的に該酵素活性1unitと等価であることから、吸光度変化より該酵素活性を次式に従って求めた。(ii)酵素活性測定法−2 1.0Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)3.4μl、1.0M D−グルコース0.1ml、20mM DCIP86.6μlを37℃で5分間インキュベート後、酵素溶液0.01mlを添加して攪拌し、5分間反応後100℃で3分間インキュベートし反応を停止した。さらに100mMグリシン・ナトリウム緩衝液(pH13.0)0.19ml、2.0N水酸化カリウム0.01mlを添加し37℃で10分間インキュベートし、溶液中のD−グルコン酸をD−グルコノ−δ−ラクトンに変換した後、100mMトリス・塩酸緩衝液(pH7.5)0.39ml、1.0N塩酸0.01mlを添加し、pHを中性にした。溶液中のD−グルコン酸をD−グルコン酸/D−グルコノ−δ−ラクトン定量キット(ベーリンガー・マンハイム社製)により定量した。1分間に1μmolのD−グルコノ−δ−ラクトンを生成する酵素活性が実質的に該酵素活性1unitと等価であることから、D−グルコノ−δ−ラクトンの生成量から該酵素活性を同定した。 本発明は、本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素を使用した物質生産および分析用途の提供に関し、医薬用または食品素材の改質加工への使用に関する。一例として、該補酵素結合型グルコース脱水素酵素を試薬として生体物質を含む該試料中のグルコースの消去方法、測定方法およびそれらの試薬、試薬組成物に使用する。また、本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素を使用した有機化合物の製造方法および製造原料に使用する。 本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、電子受容体存在下で、グルコースを酸化する反応を触媒する酵素である。本発明では、前記反応に本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素を使用する。補酵素結合型グルコース脱水素酵素としては、限定されるわけではないが、該補酵素結合型グルコース脱水素酵素を生産する真核微生物に由来する補酵素結合型グルコース脱水素酵素が好ましく、特に、糸状菌に由来する補酵素結合型グルコース脱水素酵素が好ましい。 次に、本発明によって得られた補酵素結合型グルコース脱水素酵素の用途について説明する。補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、電子受容体存在下で、グルコースを酸化する反応を触媒する酵素であるから、この反応による変化が利用できる用途であれば、特に制限されない。例えば、補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、生体物質を含む該試料中のグルコースの測定用試薬、消去用試薬へ使用することが可能である。また、医療分野、臨床分野への使用が可能であり、補酵素結合型グルコース脱水素酵素を使用した物質生産および分析の用途において使用が可能となる。 本発明のバイオセンサは、酵素として本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素を含む反応層に使用したセンサであればよい。例えば、該バイオセンサは、絶縁性基板上にスクリーン印刷などの方法を利用して作用極、その対極および参照極からなる電極系を形成し、この電極系上に接して親水性高分子と酸化還元酵素と電子受容体とを含む酵素反応層を形成することによって作製される。このバイオセンサの酵素反応層上に基質を含む試料液を滴下すると、酵素反応層が溶解して酵素と基質が反応し、これにともなって電子受容体が還元される。酵素反応終了後、還元された電子受容体を電気化学的に酸化させ、このとき、このバイオセンサは得られる酸化電流値から試料液中の基質濃度を測定することが可能である。また、この他に、発色強度或いはpH変化などを検知する方式のバイオセンサも構築可能である。これらのバイオセンサにより、測定対象物質を基質とする酵素を選択することによって、様々な物質の測定が可能である。例えば、酵素に本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素を選択すると、試料液中のグルコース濃度を測定するグルコースセンサを作製することができる。 バイオセンサの電子受容体としては、電子の授受能に優れた化学物質を用いることができる。電子の授受能に優れた化学物質とは、一般的に「電子伝達体」、「メディエータ」あるいは「酸化還元媒介剤」と呼ばれる化学物質であり、これらに該当する化学物質として、例えば、特表2002−526759に挙げられた電子伝達体や酸化還元媒介剤などを利用してもよい。 バイオセンサは、安価なフェリシアン化カリウム(ヘキサシアノ鉄(III)酸カリウム)を電子受容体として用いることが多く、一般に終濃度1mM以下で用いられる。しかし本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素はフェリシアン化カリウムを2−500mM、より好ましくは30−100mMと高濃度で用いる事で、より感度良くD−グルコースを測定する事が可能である。本発明の測定方法、測定試薬、測定化合物、バイオセンサなどの好ましい態様は、それにかかる測定反応系にフェリシアン化カリウムを終濃度2−500mMで用いられることを特徴とするものである。 以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例によって限定されるものではない。以下の実施例における補酵素結合型グルコース脱水素酵素活性の定量は前記の方法に従って行った。 寄託菌株97508株の培養 グルコース(和光純薬工業社製)1%、脱脂大豆(日本食販社製)2%、コーンスティープリカー(共同商事社製)0.5%、および硫酸マグネシウム(ナカライテスク社製)0.1%より成る培地(pH6.0)100mlを500ml容の培養フラスコに入れ、121℃で20分間殺菌し、冷却後、培養フラスコに寄託菌株97508株を一白金耳接種し、30℃で88時間振盪培養して、該菌株の種培養液とした。前記と同様の組成からなる培地に消泡剤を添加した培地4Lを5L容のジャーファーメンターに入れ、121℃で30分間殺菌し、冷却後、ジャーファーメンターに前記の種培養液を40ml接種し、28℃で31時間、通気撹拌の条件で培養して、該菌株の前培養液とした。ついで、前記と同様の組成からなる培地に消泡剤を添加した培地160Lを200L容量のジャーファーメンターに入れ、121℃で20分間殺菌して冷却したのち、前記の前培養液1.6Lを接種し、28℃で41時間、通気攪拌の条件で該菌株を培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して培養上清を回収した。 培養上清からの補酵素結合型グルコース脱水素酵素の単離 以下のステップ2.1〜2.5により補酵素結合型グルコース脱水素酵素を単離した。2.1.濃縮:実施例1の培養上清160Lを限外濾過膜「ペリコン2モジュール」(ミリポア社製)で濃縮し、20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)に置換し、粗酵素液を得た。2.2.Butyl−TOYOPEARL650M(東ソー社製)による精製(第1回): 前記粗酵素液を、65%飽和硫酸アンモニウム液(pH7.5)になるように調整後、遠心分離し上清を得た。65%硫酸アンモニウムを含む20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)で予め平衡化したButyl−TOYOPEARL650Mカラム(直径4.7cm×高さ7.7cm)に、この粗酵素液を通液して酵素を吸着させた。このカラムを同緩衝液で洗浄したのち、30%硫酸アンモニウムを含む20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)で酵素を溶出させて活性画分を集めた。さらに、同緩衝液から20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて前記活性画分とあわせた。2.3.DEAE−セルロファインA−500(生化学工業社製)による精製: 前記活性画分を限外濾過膜「ペリコン2モジュール」で濃縮し、脱塩後15mMトリス・塩酸緩衝液(pH8.5)と平衡化させた。同緩衝液で平衡化したDEAE−セルロファインA−500カラム(直径4.7cm×高さ5.2cm)にこの画分を通液し、溶出液を集めた。2.4.Butyl−TOYOPEARL650M(東ソー社製)による精製(第2回): 前記溶出液を、65%飽和硫酸アンモニウム液(pH7.5)になるように調整後、遠心分離し上清を得た。65%硫酸アンモニウムを含む20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)で予め平衡化したButyl−TOYOPEARL650Mカラム(直径4.7cm×高さ3.6cm)に、この上清を通液して酵素を吸着させた。該カラムを同緩衝液で洗浄したのち、30%硫酸アンモニウムを含む20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)で酵素を溶出させて活性画分を集めた。2.5.TSKgel G3000SW(東ソー社製)による精製: 前記活性画分をペンシル型膜濃縮モジュール「ACP−0013」(旭化成工業社製)で濃縮し、脱塩後0.2M塩化ナトリウムを含む50mMリン酸カリウム緩衝液(pH5.5)と平衡化させた。前記緩衝液で平衡化したTSKgel G3000SW(直径2.15cm×高さ60cm)に、この画分を通液し、同緩衝液で酵素を溶出させ活性画分を分取した。活性画分をセントリプラス10(アミコン社製)で濃縮し、脱塩後50mMクエン酸・リン酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)に置換した。得られた酵素は、比活性約1,100unit/mgであり、その精製度は粗酵素液に対し約170倍であった。 補酵素結合型グルコース脱水素酵素の性質試験 上記の実施例2によって単離した補酵素結合型グルコース脱水素酵素について、作用性、至適pH、安定pH、至適温度、温度安定性、基質特異性、分子量、阻害剤および補酵素を調べた。 3.1.作用性: 補酵素結合型グルコース脱水素酵素を、8.66mM DCIP存在下で500mM D−グルコースと反応させ、反応産物をD−グルコン酸/D−グルコノ−δ−ラクトン定量キットで定量した。その結果、D−グルコン酸の生成が確認され、これより本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素はD−グルコースの1位の水酸基を酸化する反応を触媒する酵素であることが明らかになった。3.2.至適pH: 酵素活性測定法−2の緩衝液を、それぞれクエン酸・リン酸ナトリウム緩衝液(pH4.0〜5.5)、リン酸カリウム緩衝液(pH6.5〜7.5)、トリス・塩酸緩衝液(pH8.0〜9.0)もしくはグリシン・水酸化ナトリウム緩衝液(pH9.5〜10.0)(各緩衝液とも終濃度で17mM)に適宜置き換えて、酵素活性測定法−2と同様の方法で様々なpH域における該精製酵素の酵素活性を測定した(図1)。その結果、補酵素結合型グルコース脱水素酵素の至適pHは、7.0〜9.0であった。3.3.安定pH: 補酵素結合型グルコース脱水素酵素を、それぞれ50mM濃度の緩衝液、すなわちクエン酸・リン酸ナトリウム緩衝液(pH3.2〜6.4)、リン酸カリウム緩衝液(pH6.3〜6.9)、トリス・塩酸緩衝液(pH7.3〜8.6)およびグリシン・水酸化ナトリウム緩衝液(pH9.1〜11.4)に溶解し、40℃で60分間保持した後に、活性測定方法−1で酵素活性を測定し、酵素活性の残存率を分析した(図2)。その結果、補酵素結合型グルコース脱水素酵素の安定pHは、4.5〜8.5であった。3.4.至適温度: 補酵素結合型グルコース脱水素酵素を50mMクエン酸・リン酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)に溶解し、上記の活性測定方法−1により30℃〜62℃までの範囲で酵素活性を測定した(図3)。その結果、補酵素結合型グルコース脱水素酵素の至適温度は、55℃付近であった。3.5.温度安定性: 補酵素結合型グルコース脱水素酵素を50mMクエン酸・リン酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)に溶解し、0℃より55℃までのいくつかの温度で15分間保持したのち、活性測定方法1で酵素活性を測定し、酵素活性の残存率を分析した(図4)。ここで、酵素活性の残存率は、0℃で15分間保持した時の酵素活性値を100%として算出した。その結果、補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、50℃においても89%の酵素活性が保持され、約50℃以下で安定であった。3.6.基質特異性およびKm値: 活性測定方法−1における活性測定用反応液の基質を、D−グルコースおよび他の各基質(いずれも終濃度333mM、D−セロビオースは193mM、D−トレハロースおよびD−ラフィノースは121mM)を使用し、酵素活性測定法−1に則り該酵素の酵素活性を測定した。該酵素のD−グルコースに対する活性値を100%として、各基質に対する活性値はそれに対する相対値として表1に示した。 また同様に、D−グルコースおよびマルトースについてそれぞれ終濃度550mMおよび100mMの2種類を設定し、相対反応性(酵素活性)を測定した。結果はD−グルコースの値を基準に相対値として表2に示した。 これより補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、D−グルコースには強く作用し、D−マンノース、1,5−アンヒドロ−D−グルシトール、D−セロビオース、D−トレハロース、マルトース、D−ガラクトース、D−グルコース−6−リン酸、D−フルクトースには弱く作用した。また、該酵素はL−アラビノース、ラクトース、D−ソルビトール、グルコン酸、スクロース、D−マンニトール、L−ソルボース、D−リボース、L−ラムノース、D−グルコース−1−リン酸、D−ラフィノース、エタノール、グリセロールにはほとんど作用しなかった。該酵素のKm値は、D−グルコースに対し、49.7mMであった。3.7.分子量およびサブユニット分子量: 補酵素結合型グルコース脱水素酵素を、0.2M NaClを含む50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)に溶解し、移動相に同緩衝液を使用してTSKgel−3000SW(直径0.75cm×長さ60cm、東ソー社製)にて分析した。分子量マーカー(オリエンタル酵母工業社製)を指標にして、補酵素結合型グルコース脱水素酵素の分子量は約130kDaであった。12.5%ポリアクリルアミドゲルを使用しLaemmliらの方法(Nature(1970)227:680−685)に従い、この発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)に掛けた。泳動後にクマシー・ブリリアント・ブルー染色し、移動度を分子量マーカー(アマシャムファルマシアバイオテク社製)のそれと比較した結果、本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素のサブユニット分子量は約85kDaであった。3.8.阻害剤 活性測定方法−1の反応系に終濃度が1mMになるように表3の各種添加物を阻害剤としてそれぞれ加え、活性測定方法−1により補酵素結合型グルコース脱水素酵素の活性を測定した。対照区は、表3の添加物を加えない以外は活性測定方法−1に従い行った。該対照区における該酵素活性値を100%として、それぞれの添加物を加えた場合の相対活性値と対照区との差分を阻害効果(%)とした。その結果、表3に示す阻害効果が認められた。 また、前記の活性測定方法−1において、それぞれ終濃度が1mM、5mM、10mM、25mMおよび50mMになるようにメタノールに溶解した1,10−フェナントロリンをそれぞれ加え、本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素の活性を活性測定方法−1に従い測定した。なお、反応系に対するメタノールはいずれも終濃度10%(v/v)であった。対照区は、活性測定方法−1に、終濃度が10%(v/v)になるようにメタノールを添加して測定を行った。結果を表4に示した。その結果、1,10−フェナントロリンによる阻害効果は、1,10−フェナントロリンが、最終濃度1mMで62.0%、5mMで76%、10mMで85%、25mMで91%、50mMで95%と高かった(表3)。 本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素に対する阻害効果は各添加物によって異なり、重金属イオン(Ag+、Cu2+およびHg2+)で最も強く、1,10−フェナントロリン、プロフラビンおよびMn2+で60%以上の阻害効果が認められた。3.9.補酵素: 本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素溶液にD−グルコースを添加し、吸光分析を行ったところ、385nmおよび465nmに認められた吸収極大が該添加により消失したことから、補酵素がフラビンアデニンジヌクレオチドであることが明らかになった。なお、これらの吸収極大はFADに特有であり、FADのみ加えない対照反応系を構築した場合に観測されないものであった。 グルコースの定量 前記の実施例2で精製した寄託菌株97508株由来の補酵素結合型グルコース脱水素酵素を使用し、活性測定方法1における333mM D−グルコースを、0.333から33mMの範囲のD−グルコースに代えて使用した場合の吸光度の減少速度を測定した。すなわちD−グルコースの濃度が、0.333mM、0.5mM、1mM、2mM、5mM、6.67mM、10mM、20mM、33mMの各濃度における吸光度変化を測定した。測定結果を図5に示す。 その結果、検量線(相関係数r=0.997)が作成できた。これより、補酵素結合型グルコース脱水素酵素を使用したD−グルコースの定量が可能であることが示された。 酵素固定化電極によるグルコースの測定 前記の実施例2で精製した寄託菌株97508株由来の補酵素結合型グルコース脱水素酵素を使用し、酵素固定化電極によるD−グルコースの測定を行った。本酵素3.4Uを固定化したグラッシーカーボン(GC)電極を用いて、グルコース濃度に対する応答電流値を測定した。電解セル中に、100mMリン酸ナトリウムバッファー(pH7.0)2.7mlおよび1Mヘキサシアノ鉄(III)酸カリウム(フェリシアン化カリウム)水溶液0.3mlを添加した。GC電極をポテンショスタットBAS100B/W(BAS製)に接続し、40℃、アルゴン飽和、酸素飽和、空気飽和、各条件下で溶液を撹拌し、銀塩化銀参照電極に対して+500mVを印加した。これらの系に1M D−グルコース溶液を30μl添加し、定常状態の電流値を測定した。更に同量の1M D−グルコース溶液を添加し電流値を測定するという作業を、各々3回繰り返した。この電流値を既知のグルコース濃度(約10、20、30、40mM)に対してプロットしたところ、検量線が作成できた(図6)。これより本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素を使用した酵素固定化電極でグルコースの定量が可能であることが示された。さらに、気体の飽和条件によらず検量線が一致したことにより、該補酵素結合型グルコース脱水素酵素が酸素に対して極めて不活性であること、および該酵素を利用した酵素固定化電極で、酸素の影響を受けずに、D−グルコースを定量可能であることが示された。 酵素固定化電極による標準血清中のグルコースの測定 実施例5に準じた方法で、酵素固定化電極によりコントロール血清IワコーB(和光純薬製)を用いて、血清中のグルコース濃度の測定を行った。電解セル中に、100mMリン酸ナトリウムバッファー(pH7.0)2.4mlおよび1Mヘキサシアノ鉄(III)酸カリウム(フェリシアン化カリウム)水溶液0.3mlを添加し、電流値が定常状態になったところで、血清を添加し電流値を測定した。同様にして既知濃度のD−グルコース溶液用いて測定を行い、検量線を作成した。該血清中のグルコース濃度は、検量線法により4.5mMと同定され、これはヘキソキナーゼ・グルコース−6−リン酸脱水素酵素法で同定した該血清中のグルコース濃度と一致した。これより本発明で用いた補酵素結合型グルコース脱水素酵素を使用した酵素固定化電極で、血清中のD−グルコースが定量可能であることを示された。 本発明によって、マルトースへの作用性が5%以下であり、1,10−フェナントロリンで阻害される、可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素の提供が可能となった。さらには工業的生産に適した該補酵素結合型グルコース脱水素酵素の製造方法、その為の生産微生物が提供される。これによって、補酵素結合型グルコース脱水素酵素の産業的用途への応用が可能となり、詳細には、マルトースを成分とする輸液を投与した糖尿病患者の血糖値をも正確に測定可能となった。また、本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素を使用することで、グルコースセンサにおいても微量のグルコースが測定可能で、かつ利用可能となった。また、該補酵素結合型グルコース脱水素酵素を使用した試料中のグルコースの測定方法、消去方法、有機化合物の製造方法などを含む物質生産および分析の用途において使用が可能となり、医薬、臨床分野および食品分野での素材の改質加工に使用可能であるなど、利用価値の高い酵素の提供が可能となった。 電子受容体存在下でグルコースの1位の水酸基を酸化する反応を触媒し、EC1.1.99.10に分類される、可溶性のフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素であって、以下の性質:(1)分子量:130kDa(ゲルろ過法による測定)及び85kDa(SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による測定);(2) グルコースに対する酵素活性を100%とした場合のマルトースに対する酵素活性が5%以下である;(3)1,10−フェナントロリンで阻害される;(4)至適pH:7.0〜9.0;(5)安定pH:4.5〜8.5;(6)至適温度:55℃;及び、(7)温度安定性:50℃以下で安定である、を有する前記グルコース脱水素酵素。 終濃度1mMの1,10−フェナントロリンを添加した場合の酵素活性が、添加しない場合の酵素活性と比べて50%以上阻害されることを特徴とする、請求項1記載のグルコース脱水素酵素。 アスペルギルス属の微生物由来である請求項1又は2記載のグルコース脱水素酵素。 アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)由来である請求項3のグルコース脱水素酵素。 受託番号FERM BP−08578のアスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)由来である請求項4記載のグルコース脱水素酵素。 請求項1〜5のいずれか一項に記載のフラビン化合物結合型グルコース脱水素酵素の製造方法であって、アスペルギルス属の微生物を培養し、培養によりフラビン化合物結合型グルコース脱水素酵素を生成せしめ、これを採取することを特徴とする該グルコース脱水素酵素の製造方法。 アスペルギルス属の微生物がアスペルギルス・テレウスである、請求項6記載の該グルコース脱水素酵素の製造方法。 アスペルギルス・テレウスが受託番号FERM BP−08578で寄託されているアスペルギルス・テレウス株である、請求項7記載の方法。 請求項1〜5のいずれか一項に記載のフラビン化合物結合型グルコース脱水素酵素、又は、請求項6〜8のいずれか一項に記載の製造方法によって得られるグルコース脱水素酵素を使用することを特徴とするグルコースの測定方法。 使用に際し、フェリシアン化物を終濃度2mM−500mMで用いることを特徴とする請求項9記載の測定方法。 請求項1〜5のいずれか一項に記載のフラビン化合物結合型グルコース脱水素酵素、又は、請求項6〜8のいずれか一項に記載の製造方法によって得られるグルコース脱水素酵素を含有することを特徴とするグルコース測定試薬組成物。 使用に際し、フェリシアン化物を終濃度2mM−500mMで用いることを特徴とする請求項11記載の測定試薬組成物。 請求項1〜5のいずれか一項に記載のフラビン化合物結合型グルコース脱水素酵素、又は、請求項6〜8のいずれか一項に記載の製造方法によって得られるグルコース脱水素酵素を使用することを特徴とするグルコース測定用のバイオセンサ。 使用に際し、フェリシアン化物を終濃度2mM−500mMで用いることを特徴とする請求項13記載のバイオセンサ。


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