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| タイトル： | 特許公報(B2)_ＢＣＧワクチンとその利用 |
| 出願番号： | 2004505083 |
| 年次： | 2011 |
| IPC分類： | A61K 39/00,A61K 38/00,A61P 37/02 |
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本多 三男 松尾 和浩 泉 泰之 デュアンタノーム プロンカットキャウ クロアン バラチャンドラ ピライパン プタワタナ ロンプーン ステーン ノッポン シチソンブット JP 4654026 特許公報(B2) 20101224 2004505083 20021120 ＢＣＧワクチンとその利用 独立行政法人科学技術振興機構 503360115 国立感染症研究所長 591222245 タイ国 ミニストリー オブ パブリック ヘルス、デパートメント オブ メディカル サイエンシス 504434970 Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ， Ｔｈａｉｌａｎｄ 西澤 利夫 100093230 本多 三男 松尾 和浩 泉 泰之 デュアンタノーム プロンカットキャウ クロアン バラチャンドラ ピライパン プタワタナ ロンプーン ステーン ノッポン シチソンブット JP 2002145132 20020520 20110316 A61K 39/00 20060101AFI20110224BHJP A61K 38/00 20060101ALI20110224BHJP A61P 37/02 20060101ALI20110224BHJP JPA61K39/00 HA61K37/02A61P37/02 A61K 39/00 A61K 38/00 CA/MEDLINE/EMBASE/BIOSIS(STN) 国際公開第９８／０５６９１９（ＷＯ，Ａ１） 国際公開第０１／０２１２０１（ＷＯ，Ａ１） 国際公開第０２／０２４２２４（ＷＯ，Ａ１） 本多三男 他，リコンビナントHIVワクチンのプレクリニカルトライアル ，日本熱帯医学会雑誌，２００１年，Vol.29，p.144 YASUTOMI,Y.，J.VIROL.，１９９５年，V69 N4，P2279-2284 YASUTOMI,Y.，VACCINES 94:MOD.APPROACHES NEW VACCINES INCL.PREV.AIDS，１９９４年，P211-215 本田 三男，エイズ医薬品開発研究平成１２年度 国際研究グランと事業研究報告，日本，２００１年，P60-65 中里見 哲也，医学のあゆみ，日本，１９９６年，P192-195 LAGRANDERIE,M.，J.VIROL.，１９９７年，V71 N3，P2303-2309 2 JP2002012125 20021120 WO2003097087 20031127 10 20051110 福井 悟 技術分野この出願の発明は、ＢＣＧワクチンとその利用に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、各種感染症や癌等の予防や治療のための免疫誘導における初回抗原刺激に使用する組換えＢＣＧワクチンと、このＢＣＧワクチンを用いたヒトまたは動物の免疫誘導方法に関するものである。背景技術牛型結核菌弱毒ＢＣＧ株（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ。以下「ＢＣＧ」と記載する）は、その安全性から、最も一般的な生バクテリアワクチンとして知られている。一方、この十数年来の遺伝子組換え技術の開発、向上に伴い、ウイルスや細菌などの微生物に外来性の抗原性タンパク質を発現させるように改変して、様々な感染症や癌の予防および治療に対するワクチンベクターとして応用しようという研究が盛んに行われて来ている。ＢＣＧについても、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）やサル免疫免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）を標的とする組換えＢＣＧワクチンが報告されている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４９６８−４９７８，２０００；Ｊ．Ｖｉｒｏｏｌ．７１：２３０３−２３０９，１９９７；Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５７：２８３−２８８，１９８９）。そして、ＢＣＧにＨＩＶ遺伝子を発現させたワクチンは長期に渡って（少なくとも２年間は）免疫の誘導が可能となるが、このような長期間の免疫誘導能は他のＤＮＡワクチンではみられない優れた特徴である。しかしながら、従来の組換えＢＣＧワクチンの場合には、標的となる感染症や癌等に対する免疫誘導能の点においては必ずしも十分なものではなかった。例えば、ＨＩＶ−１を標的とする組換えＢＣＧワクチンを用いてモルモットに免疫誘導を行った場合には、通常のＢＣＧワクチンのヒトへの使用量（０．０５−０．１ｍｇ）の５０〜１００倍の量を投与する必要がある（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９２：１０６９８−１０６９７，１９９５）。またサルのモデルを用いた試験では組換えＢＣＧ単独の投与では病原性ウイルスの感染防御について好ましい結果は得られていない。組換えＢＣＧワクチンは、免疫の持続性およびその安全性と供給が容易であるという点において優れたワクチン候補であり、その有効利用は医療分野において不可欠の課題である。この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、組換えＢＣＧワクチンの有効利用のための新しい手段を提供することを課題としている。発明の開示この出願は、前記の課題を解決するための第１の発明として、外来性の抗原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターによって形質転換された組換えＢＣＧワクチンであって、複数回の抗原刺激による免疫誘導において初回抗原刺激用として使用されることを特徴とするＢＣＧワクチンを提供する。またこの出願は、第２の発明として、外来性の抗原性タンパク質を複数回刺激する免疫誘導方法であって、前記第１発明のＢＣＧワクチンによって初回抗原刺激を行い、同一の抗原性タンパク質を発現する非ＢＣＧワクチンによって１回以上の追加抗原刺激を行うことを特徴とする方法を提供する。この第２発明の方法においては、追加抗原刺激用のワクチンが、組換えワクシニアウイルスワクチン、例えば組換えＤＩｓワクチンであることを好ましい態様としている。さらに、前記第１発明および第２発明においては、抗原性タンパク質が免疫不全ウイルス由来であること、さらに詳しくは、免疫不全ウイルスの抗原性タンパク質がＨＩＶ遺伝子産物、例えばＧａｇであることをそれぞれ好ましい態様としている。すなわち、この発明の方法に従えば、例えば組換えワクシニアウイルス（例えば組換えＤＩｓ−ｇａｇワクチン）の単独投与では得られなウイルスの血中への流出をほぼ完全に防止することができ、またＣＤ４細胞の減少も抑制することが可能となる。これによって、少なくとも病原性ウイルスの体内での蔓延を抑制し、感染性疾患の進行を防止することが可能となる。発明を実施するための最良の形態第１発明は、外来性の抗原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターによって形質転換された組換えＢＣＧワクチンである。そしてこの組換えＢＣＧワクチンは、複数回の抗原刺激による免疫誘導において、その使用が初回抗原刺激用として使用されることを特徴とする。すなわち、この出願の発明者らは、単独使用では十分な免疫誘導能を持たない組換えＢＣＧワクチンであっても、初回抗原刺激（プライミング）として使用することによって、その後の追加抗原刺激（ブースティング）による特異的免疫誘導を強化することを見出してこの発明を完成させた。ＢＣＧ株は、結核の予防接種等に使用されている公知のものを対象とすることができる。発現ベクターは、従来の組換えＢＣＧワクチンの作成に使用されているような、ＢＣＧ用ベクター（例えばプラスミドｐＳＯ２４６等）を使用することができる。このベクターのクローニングサイトに、外来性（すなわち、ＢＣＧ以外）の任意の抗原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することによって発現ベクターを構築することができる。なお、以下の記載では、外来性の抗原性タンパク質を「外来ポリペプチド」、これをコードするポリヌクレオチドを「外来ポリヌクレオチド」と記載することがある。また、外来ポリヌクレオチドには、ＢＣＧ株由来の任意のプロモーターおよびターミネーター配列（例えばＢＣＧ株由来のヒートショックタンパク質Ｈｓｐのプロモーターおよびターミネーター配列）等を連結することによって、外来ポリペプチドを良好に発現させるようにする。外来ポリヌクレオチドは、ＢＣＧ株以外の抗原性タンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｃＤＮＡ断片）であり、外来ポリペプチドは生体内で抗原抗体反応を惹起するものであれば如何なるものであってもよい。具体的にはヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因ウイルスであるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のｇａｇ前駆体ｐ５５またはｐ２４タンパク質、ｅｎｖタンパク質ｇｐ１２０またはｇｐ１６０、ｐｏ１前駆体タンパク質、ｎｅｆタンパク質、ｔａｔタンパク質等を対象とすることができる。また、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）由来の同様の抗原性ポリペプチドを使用することもできる。あるいは、その他の病原体（他の病原性ウイルスや細菌）、もしくは癌細胞の抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチド等を用いることもできる。外来ポリヌクレオチドの取得方法としては、外来ポリペプチドをコードするゲノム遺伝子またはそのｃＤＮＡがクローン化されたプラスミドからその実質的な配列であるポリヌクレオチドを適当な制限酵素で切り出すか、適当な配列のプライマーを用いたｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）により増幅すればよい。クローン化されていない場合は、その遺伝子を持つ細菌、動物のゲノムＤＮＡを、ウイルスの場合はウイルスが感染した動物細胞由来のＤＮＡまたはＲＮＡを鋳型として、上記ＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を増幅することにより得ることができる。このようにして構築した発現ベクターを、塩化カルシウム法や電気穿孔法等の公知に方法でＢＣＧ株に導入し、形質転換菌の外来ポリペプチドの発現をウエスタンブロットや公知の免疫測定法（例えばＥＬＩＳＡ法等）によって確認することによって、この発明の組換えＢＣＧを作成することができる。このようにして作成した組換えＢＣＧを、通常のＢＣＧワクチンと同様の液状担体に懸濁するすることのよって、組換えＢＣＧワクチンを作成することができ、このワクチンは、実際には第２発明の免疫誘導方法に使用することができる。第２発明の方法は、前記第１発明のＢＣＧワクチンによって初回抗原刺激を行い、同一の抗原性タンパク質を発現する非ＢＣＧワクチンによって１回以上の追加抗原刺激を行うことを特徴としている。追加抗原刺激用のワクチン（ブースターワクチン）は、組換えワクチンに使用されている公知のウイルスや細菌（例えばポリオウイルス、インフルエンザウイルス、ライノウイルス、水痘ウイルス、ワクシニアウイルス、サルモネラ菌、リステリア菌等）を、第１発明の組換えＢＣＧワクチン（プライムワクチン）と同一の外来ポリヌクレオチドによって形質転換することによって作成することができる。この発明の方法においては、この出願の発明者らが先に開発した組換えワクシニアウイルスＤＩｓワクチン（特開２００２−０１７３７０号公報）を好ましいブースターワクチンとしている。プライムワクチンとブースターワクチンの投与は、注射または経口投与等の公知の方法によって行うことができる。投与量およびスケジュールは、被検疫個体の種類（ヒトまたは動物）、体重、誘導する免疫の種類等によって異なるが、例えば、プライムワクチンを０．０１〜１０ｍｇ、ブースターワクチンを１０５〜１０１０ＰＦＵ程度とすることができる。また、ワクチン接種の間隔は、３〜１２ヶ月程度とすることができる。以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。実施例実施例１組換えＢＣＧの作成ＳＩＶのｇａｇ遺伝子をプラスミドｐＮＬ４３２（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５９：２８４−２９１，１９８６）から単離し、この遺伝子ＤＮＡの前後にＢＣＧ株由来のｈｓｐ６０プロモーターおよびターミネーター配列をそれぞれ連結し、これを大腸菌−ＢＣＧ株シャトルベクターｐＳＯ２４６（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１３５：２３７−２４３，１９９６）のマルチクローニングサイトに挿入して発現ベクターｐＳＯ−ＳＩＶｇａｇを構築した（図１）。この発現ベクターを、文献（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５：６９８７−６９９１，１９８８）の記載に従い、Ｇｅｎｅ−ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いてＢＣＧ東京株に導入し、２０μｇ／ｍｌのカナマイシン含有のＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ７Ｈ１０寒天培地（Ｄｉｆｃｏ社）上で形質転換菌を選択し、ｐＳＯ−ＳＩＶｇａｇを保有する組換えＢＣＧ株（ｒＢＣＧ−ＳＩＶｇａｇ）を作成した。ウェスタンブロッティングによってＳＩＶ ｇａｇタンパク質の産生を確認した結果、図２に示したように、ｒＢＣＧ−ＳＩＶｇａｇの抽出物において５５ｋＤａタンパク質が検出された。一方、コントロールのｒＢＣＧ−ｐＳＯ２４６ではＧａｇタンパク質は検出されなかった。またＳＩＶ Ｇａｇタンパク質の濃度は、ｒＢＣＧ−ＳＩＶｇａｇ１ｍｇ当たり４５±１２ｎｇであり、この産生レベルは少なくとも４５０回のｉｎ ｖｉｔｒｏ継代の間維持されていた。実施例２免疫誘導実施例１で作成した組換えＢＣＧ株（ｒＢＣＧ−ＳＩＶｇａｇ）、および組換えワクシニアＤＩｓ（ｒＤＩｓ−ＳＩＶｇａｇ）を用いてカニクイサルに免疫誘導を行った。なお、ｒＤＩｓ−ＳＩＶｇａｇは、特開２００２−０１７３７０号公報の実施例１におけるＨＩＶ−１ｇａｇの代わりにＳＩＶｇａｇ遺伝子を用いて、前記公報記載と同様の方法により作製した。カニクイサル１４匹を以下の５群に分け、初回抗原刺激から０、４７、５４週後の時点で免疫（ブースティング）した。第１群（４匹）：コントロール（１匹はナイーブサル、３匹はｒＢＣＧ−ｐＳＯ２４６（１０ｍｇ）の皮内接種１回とｒＤＩｓ−ＬａｃＺ（１０６ＰＦＵ）の静脈接種を２回）第２群（２匹）：ｒＢＣＧ−ＳＩＶｇａｇ（１０ｍｇ）の皮内接種１回第３群（２匹）：ｒＤＩｓ−ＳＩＶｇａｇ（１０６ＰＦＵ）の静脈接種２回第４群（３匹）：ｒＤＩｓ−ＳＩＶｇａｇ（１０６ＰＦＵ）の静脈接種２回＋ｒＢＣＧ−ＳＩＶｇａｇ（１０ｍｇ）の皮内接種１回第５群（３匹）：ｒＢＣＧ−ＳＩＶｇａｇ（１０ｍｇ）の皮内接種１回＋ｒＤＩｓ−ＳＩＶｇａｇ（１０６ＰＦＵ）の静脈接種２回次いで、２回目のブースター免疫から１０週間後に、病原性ウイルス（ＳＨＩＶ−ＫＳ６６１：２０００ＴＣＩＤ５０）を粘膜感染させ（チャレンジ）、経時的に血中のウイルスＲＮＡコピー数およびＣＤ４細胞数を計測した。コントロール群のサルにＳＨＩＶ−ＫＳ６６１を感染させると、図３に示したように、ＣＤ４は約２週間後に１桁から２桁に減少し、それに反してウイルスＲＮＡの血中コピー数は１０８−９レベルに増加し、速やかにセットポイントに達し、１０５−６レベルを推移した。また、ｒＢＣＧ−ＳＩＶｇａｇ単独（第２群：図４）、およびｒＤＩｓ−ＳＩＶｇａｇ単独（第３群：図５）の場合も、ＣＤ４およびウイルスＲＮＡ数の経時的変化はコントロールと同様であった。さらに、ｒＤＩｓ−ＳＩＶｇａｇ（プライミング）＋ｒＢＣＧ−ＳＩＶｇａｇ（ブースティング）を行ったサル（第４群）の場合もコントロールや単独免疫と同様の経時的変化を示した。これに対して、第５群（ｒＢＣＧ−ＳＩＶｇａｇ＋ｒＤＩｓ−ＳＩＶｇａｇ）のサルの場合には、図７に示したように、ウイルスＲＮＡコピー数は顕著に減少し、強いＧａｇ特異的免疫が誘導された。また、ＣＤ４細胞の減少も有意に抑制された。以上の結果から、組換えＢＣＧワクチン（ｒＢＣＧ−ＳＩＶｇａｇ）でプライミングを行い、組換えＤＩｓワクチン（ｒＤＩｓ−ＳＩＶｇａｇ）でブースティングを行うことによって、強い特異的免疫が誘導されることが確認された。実施例３ＢＣＧの既往症反応の制御この発明の免疫誘導方法におけるＢＣＧ既往症反応の影響を検討した。すなわち、ヒトでの実際の投与の影響を想定して約２年前にＢＣＧ東京株（０．１ｍｇ）をカニクイサルに接種し、２年後でもＤＴＨが明らかに誘導されていることを確認した後、以下の３群のサルにワクチン接種を行った。第１群（３匹）：ｒＢＣＧ−ｐＳＯ２４６（８０ｍｇ）の経口接種２回＋ｒＤＩｓ−ＬａｃＺ（１０６ＰＦＵ）の静脈接種を２回）第２群（２匹）：ｒＢＣＧ−ＳＩＶｇａｇ（８０ｍｇ）の経口接種２回＋ｒＤＩｓ−ＳＩＶｇａｇ（１０６ＰＦＵ）の静脈接種２回第３群（２匹）：ｒＢＣＧ−ＳＩＶｇａｇ（１０ｍｇ）の静脈接種１回＋ｒＤＩｓ−ＳＩＶｇａｇ（１０ｍｇ）の静脈接種１回なお、２回のプライミングは−４８週および０週時点で、２回のブースティングは２７週および５７週後の時点で行った。また、第３群は、０週時点でプライミング、５７週時点でブースティングを行った。最後のワクチン接種から約３か月後に病原性ウイルス（ＳＨＩＶ−Ｃ２／１２０ＴＣＩＤ５０）をチャレンジし、ＣＤ４細胞数およびウイルスＲＮＡコピー数を経時的に計測した。結果は図８−１０に示したとおりである。ｒＢＣＧ−ＳＩＶｇａｇプライミング（静脈）＋ｒＢＣＧ−ＳＩＶｇａｇブースティング（静脈）（第３群）のウイルスＲＮＡ数およびＣＤ４数の経時的変化（図１０）はコントロール（第１群）と同様であった。これに対して、ｒＢＣＧ−ＳＩＶｇａｇプライミング（経口）＋ｒＢＣＧ−ＳＩＶｇａｇブースティング（静脈）（第２群）では、血中ウイルス量の有意な減少と、ＣＤ４細胞の減少抑制が観察された。以上の結果から、ｒＢＣＧ−ＳＩＶｇａｇを経口接種によってプライミングを行い、ｒＢＣＧ−ＳＩＶｇａｇを静脈接種によってブースティングすることによって、免疫誘導のみならず、防御免疫においても既往症反応の影響を除外することが可能であることが確認された。産業上の利用可能性以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、組換えＢＣＧワクチンを用いた効果的な免疫誘導が可能となり、様々な感染症や癌等に対して、有効な予防が実現される。【図面の簡単な説明】図１は、実施例１における組換えＢＣＧ株（ｒＢＣＧ−ＳＩＶｇａｇ）の作成に使用した発現ベクターｐＳＯ−ＳＩＶｇａｇの構成を例示した模式図である。図２は、ｒＢＣＧ−ＳＩＶｇａｇのＧａｇタンパク質産生量を測定したウェスタンブロット分析の結果である。図３は、コントロールのサルに病原性ウイルスを感染させた場合の血中ウイルスＲＮＡコピー数の経時的変化（左図）およびＣＤ４細胞数の経時的変化（右図）である。図４は、ｒＢＣＧ−ＳＩＶｇａｇ単独をワクチン接種したサルにおける病原性ウイルス感染後の血中ウイルスＲＮＡコピー数の経時的変化（左図）およびＣＤ４細胞数の経時的変化（右図）である。図５は、ｒＤＩｓ−ＳＩＶｇａｇ単独をワクチン接種したサルにおける病原性ウイルス感染後の血中ウイルスＲＮＡコピー数の経時的変化（左図）およびＣＤ４細胞数の経時的変化（右図）である。図６は、ｒＤＩｓ−ＳＩＶｇａｇ＋ｒＢＣＧ−ＳＩＶｇａｇをワクチン接種したサルにおける病原性ウイルス感染後の血中ウイルスＲＮＡコピー数の経時的変化（左図）およびＣＤ４細胞数の経時的変化（右図）である。図７はｒＢＣＧ−ＳＩＶｇａｇ＋ｒＤＩｓ−ＳＩＶｇａｇをワクチン接種したサルにおける病原性ウイルス感染後の血中ウイルスＲＮＡコピー数の経時的変化である。図７／１はｒＢＣＧ−ＳＩＶｇａｇ＋ｒＤＩｓ−ＳＩＶｇａｇをワクチン接種したサルにおける病原性ウイルス感染後のＣＤ４細胞数の経時的変化である。図８はＢＣＧ既往反応を有するサルにコントロールワクチン（ベクター）を接種した場合の、病原性ウイルス感染後の血中ウイルスＲＮＡコピー数の経時的変化である。図８／１はＢＣＧ既往反応を有するサルにコントロールワクチン（ベクター）を接種した場合の、病原性ウイルス感染後のＣＤ４細胞数の経時的変化である。図９はＢＣＧ既往反応を有するサルにｒＢＣＧ−ＳＩＶｇａｇ（経口）＋ｒＤＩｓ−ＳＩＶｇａｇ（静脈）のワクチン接種をした場合の、病原性ウイルス感染後の血中ウイルスＲＮＡコピー数の経時的変化である。図９／１はＢＣＧ既往反応を有するサルにｒＢＣＧ−ＳＩＶｇａｇ（経口）＋ｒＤＩｓ−ＳＩＶｇａｇ（静脈）のワクチン接種をした場合の、病原性ウイルス感染後ＣＤ４細胞数の経時的変化である。図１０はＢＣＧ既往反応を有するサルにｒＢＣＧ−ＳＩＶｇａｇ（静脈）＋ｒＤＩｓ−ＳＩＶｇａｇ（静脈）のワクチン接種をした場合の、病原性ウイルス感染後の血中ウイルスＲＮＡコピー数の経時的変化である。図１０／１はＢＣＧ既往反応を有するサルにｒＢＣＧ−ＳＩＶｇａｇ（静脈）＋ｒＤＩｓ−ＳＩＶｇａｇ（静脈）のワクチン接種をした場合の、病原性ウイルス感染後ＣＤ４細胞数の経時的変化である。 複数回の抗原刺激による免疫誘導に用いるワクチンセットであって、初回抗原刺激用の組換えBCGワクチンと、追加抗原刺激用の組換えワクシニアウイルスDIs株ワクチンとからなり、両ワクチンは免疫不全ウイルスの抗原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターによって形質転換されているワクチンセット。 免疫不全ウイルスの抗原性タンパク質がHIV遺伝子産物である請求項１のワクチンセット。