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| タイトル： | 公開特許公報(A)_イムノアッセイデバイス及び検出方法 |
| 出願番号： | 2004088758 |
| 年次： | 2005 |
| IPC分類： | 7,G01N33/543 |
特許情報キャッシュ
元田 昭策 JP 2005274385 公開特許公報(A) 20051006 2004088758 20040325 イムノアッセイデバイス及び検出方法 デンカ生研株式会社 591125371 平木 祐輔 100091096 石井 貞次 100096183 藤田 節 100118773 田中 夏夫 100111741 元田 昭策 7G01N33/543 JPG01N33/543 521 2 ＯＬ 9 本発明は、検体試料液中の抗原または抗体を検出するために用いられるエンザイムイムノアッセイデバイス及びそれを用いた検出方法に関する。 検体試料液中の抗原を検出する方法としてストリップ状のニトロセルロースメンブラン等のメンブランストリップを用いたエンザイムイムノアッセイが用いられている（特許文献１および特許文献２参照）。 従来のメンブランストリップを用いたエンザイムイムノアッセイデバイスの態様を図２に示す。 メンブランストリップ部６の一方の端に吸収パッド部７、もう一方の端に基質溶解液パッド部８を設け、検出すべき抗原と反応する抗体を酵素で標識した標識抗体が乾燥状態で含有されている標識抗体部９、標識抗体部９と吸収パッド部７の間のメンブランストリップ部に検出すべき抗原と反応する抗体が固相化された検出部１０、標識抗体部９と基質溶解液パッド部８の間であって基質溶解液パッドとは分離した部分のメンブランストリップ部上に酵素反応により発色する酵素の基質が直接乾燥状態で含有されている基質部１１がそれぞれ設けられている。 使用時に、検体試料液を標識抗体部９に加え、つづいて基質溶解液パッド部８に基質溶解液を加える。検体試料液は標識抗体を溶解させ、検体試料液中の検出すべき抗原と抗原抗体反応しながら泳動し、検出部１０に到達すると固相化されている抗体に捕捉される。基質溶解液は基質を溶解させ、共に同方向に泳動し、捕捉された標識抗体の標識酵素が基質と酵素反応するので検出部１０が着色する。 一方、検体試料液中に検出すべき抗原が存在しない場合は、標識抗体が検出部１０に捕捉されないので検出部１０は着色しない。 従って、検体試料液中に検出すべき抗原が存在するか否かを、検出部１０の着色の有無で知ることができる。特許3248436号公報特許3284896号公報 上記したような従来のエンザイムイムノアッセイデバイスは、メンブランストリップ部に酵素反応により発色する酵素の基質が直接乾燥状態で含有されている。 しかしながら、メンブランストリップに直接基質を含有している従来のイムノアッセイデバイスでは、測定に必要な充分量の基質を含有させることができないため、検出感度が得られないという問題がある。 従って、本発明の目的は、充分量の基質を含有しており、従来のデバイスに比べて、検出感度が高く、正確な検出を行うことができるエンザイムイムノアッセイデバイス及び該デバイスを用いた検出方法を提供することにある。 本願発明者は、鋭意研究を行った結果、酵素の基質を乾燥状態で含有させたパッドをメンブランストリップ部上に設け、検体試料液で乾燥した標識抗体または標識抗原を、基質溶解液で乾燥した酵素の基質をそれぞれ溶解して泳動させることにより、上記目的が達成できることを見出し本発明を完成させた。 すなわち、本発明は、検体試料液中の被検出物を検出するための、メンブランストリップを用いたエンザイムイムノアッセイデバイスであって、メンブランストリップ部の一方の端に吸収パッド部、もう一方の端のメンブランストリップ部上に酵素の基質が乾燥状態で含有されている基質パッド部、前記メンブランストリップ部に検出すべき抗原または抗体と反応する抗体または抗原を酵素で標識した標識抗体または標識抗原が乾燥状態で含有されている標識部、該標識部と前記吸収パッド部の間のメンブランストリップ部に検出すべき抗原または抗体と反応する抗体または抗原が固相化された検出部を設けたエンザイムイムノアッセイデバイスおよび上記のエンザイムイムノアッセイデバイスを用いて検体試料液中の被検出物を検出する方法であって、検体試料液を標識部に加え、つづいて基質溶解液を基質パッド部に加えて泳動させ、連続した一連の反応により起こる前記検出部における着色の有無を観察することにより検体試料液中の被検出物を検出する方法を提供する。 本発明の方法により、高感度で特異的な抗原または抗体を検出できるエンザイムイムノアッセイデバイス及び該デバイスを用いた検出方法を確立することができた。 本発明のエンザイムイムノアッセイデバイスの構成及びそれを用いた検出方法の具体例を以下に詳細に説明する。１．デバイスの構成 図１は、本発明のエンザイムイムノアッセイデバイスの好ましい実施態様の模式図である。 すなわち、メンブランストリップ部１の一方の端に吸収パッド部２、もう一方の端のメンブランストリップ部上に酵素の基質が乾燥状態で含有されている基質パッド部３、前記メンブランストリップ部１に検出すべき抗原または抗体と反応する抗体または抗原を酵素で標識した標識抗体または標識抗原が乾燥状態で含有されている標識部４、該標識部４と前記吸収パッド部２の間のメンブランストリップ部に検出すべき抗原または抗体と反応する抗体または抗原が固相化された検出部５を設けたデバイスである。（１）メンブランストリップ部 メンブランストリップ部の材質は、特に限定されないが、多孔性の吸水性の材質であり、検体試料液や基質溶解液が毛管作用により展開し得る材質である。例えば、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエーテルスルホン、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ガラス繊維、ポリオレフィン、セルロース、これらの混合繊維からなる人工ポリマーが用いられ、好ましくはニトロセルロースメンブランが用いられる。メンブランの厚さは特に限定されないが、好ましくは１００〜２００μｍ程度である。また、メンブランは長方形のストリップで用い、その大きさは、特に限定されないが、通常、３ｍｍ〜９ｍｍ×４０ｍｍ〜６０ｍｍ程度である。（２）吸収パッド部 吸収パッド部は、本発明のエンザイムイムノアッセイデバイスの一端に設けられデバイスを展開する液体を吸収することによりメンブレン上の液体の流れを促進する。吸収パッド部は、多量の液を吸収できるよう、吸水性の材質でできており、例えば、ろ紙、ガラス繊維などでできた不織布等が用いられる。また、その大きさは、特に限定されないが、通常、３ｍｍ〜１５ｍｍ×１０ｍｍ〜４０ｍｍ、厚さ０．５ｍｍ〜３ｍｍ程度である。（３）検出部 検出部は、検出すべき抗原または抗体と抗原抗体反応により特異的に結合して検出すべき抗原または抗体を捕捉するための抗体または抗原がメンブランに固相化されている。抗体または抗原は、例えばライン状に固相化すればよい。固相化は、タンパク質をニトロセルロース膜等の固相に固相化するための公知の方法で行うことができる。抗体は精製したポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が用いられる。抗原は、精製した天然の抗原またはリコンビナント抗原が用いられる。（４）標識部 吸水性の材質、例えばスポンジ及びガラス繊維などでできた不織布等の材質が用いられ、その大きさは、特に限定されないが、通常、３ｍｍ〜１０ｍｍ×３ｍｍ〜１０ｍｍ、厚さ０．５ｍｍ〜３ｍｍ程度で、酵素標識した標識抗体または標識抗原が乾燥状態で含有されている。 標識部は、上記の吸収性の材質に標識抗体または標識抗原を含浸させ、乾燥させればよい。標識抗体または標識抗原は、検出すべき抗原または抗体と抗原抗体反応により特異的に結合する抗体または抗原に酵素を標識したものが用いられる。抗体は精製したポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が用いられる。抗原は、精製した天然の抗原またはリコンビナント抗原が用いられる。標識に用いる酵素としては、一般的にエンザイムイムノアッセイに用いられるアルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ等を用いることができる。（５）基質パッド部 吸水性の材質、例えば吸水性のあるスポンジ及びガラス繊維などの不織布等の材質が用いられ、その大きさは、特に限定されないが、通常、３ｍｍ〜１０ｍｍ×８ｍｍ〜３０ｍｍ、厚さ０．５ｍｍ〜３ｍｍ程度で、酵素の基質が乾燥状態で含有されている。上記吸水性の材質に基質を含浸させ、乾燥させればよい。基質としては、酵素反応時に色素が不溶化となる性質を有する基質を用いることが好ましく、例えば、標識酵素がアルカリフォスファターゼの場合には５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸／ニトロテトラゾリウムブルー、β−ガラクトシダーゼの場合には５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ペルオキシダーゼの場合には３，３'−ジアミノベンチジン等を用いることができる。（６）基質溶解液 基質溶解液は用いる基質により適宜選択されるが、緩衝液又は精製水が用いられる。（７）検体試料液 本発明にいう検体試料液は、咽頭あるいは鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、咽頭あるいは鼻腔洗浄液、唾液、血清、便懸濁液、尿、培養液及びそれらを緩衝液で希釈したものを用いることができるがこれらに限定されない。 希釈に用いる緩衝液としては、免疫学的試験に通常使用される緩衝液等を使用することができ、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グッドの緩衝液等が挙げられ、塩化ナトリウム、界面活性剤、ウシ血清アルブミン、アジ化ナトリウム等を適宜加えることができるが、これらに限定されない。（８）被検出物 本発明にいう検出すべき抗原は、何ら限定されず、検出しようとするいかなる物質であってもよい。たとえば、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ＲＳウイルス、ノーウォーク様ウイルス等のウイルス抗原、レジオネラ属菌、溶連菌、ＭＲＳＡ等の細菌抗原、ホルモン等を挙げることができるが、これらに限定されない。 また、検出すべき抗体も限定されず、上記細菌、ウイルス等に対する抗体が挙げられる。２．本発明のデバイスを用いた検出方法 使用時に本発明のデバイスを用い、検体試料液を標識部４に加え、つづいて基質溶解液を基質パッド部３に加えると、検体試料液は標識抗体または標識抗原を溶解させ、基質溶解液は基質を溶解させる。標識抗体または標識抗原は、検体試料液中に検出すべき抗原または抗体が存在すれば抗原抗体反応しながら泳動し、検出部５に到達すると固相化されている抗体または抗原に捕捉される。 基質も同方向に泳動し、捕捉された標識抗体または標識抗原の標識酵素が基質と酵素反応するので検出部５が着色する。 一方、検体試料液中に検出すべき抗原または抗体が存在しない場合は、標識抗体または標識抗原が検出部５に捕捉されないので検出部５は着色しない。 従って、検体試料液中に検出すべき抗原または抗体が存在するか否かを、検出部５の着色の有無で判定することができる。なお、捕捉されなかった他の成分及び検体試料液等は吸収パッド部に吸収される。 検体試料液及び基質溶解液をそれぞれ所定の場所に加えてから着色の有無を判定するまでに要する時間は通常１０〜３０分間程度である。 本発明のエンザイムイムノアッセイデバイスでは、従来のデバイスと異なり、パッド中に基質が乾燥状態で含有されている基質パッド部が設けられている。このことにより、検出に必要な充分量の基質を反応の場に供給でき検出感度が上がる。 検体試料液の量は、被検出物により異なるが、通常２０〜１００μＬ程度である。 以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。実施例１１．抗インフルエンザウイルスモノクローナル抗体の作製（１）抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体 Ａ型インフルエンザウイルス抗原をＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫し、一定期間飼育したマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975)）によりマウスミエローマ細胞（Ｐ３×６３）と融合した。得られた融合細胞（ハイブリドーマ）を、３７℃インキュベーター中で維持し、Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗原を固相したプレートを用いたＥＬＩＳＡにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化（単クローン化）を行った。取得した該細胞２株をそれぞれプリスタン処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与し、約２週間後、抗体含有腹水を採取した。 得られた腹水からプロティンＡカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー法により、それぞれＩｇＧを精製し、２種類の精製抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体を得た。（２）抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体 Ｂ型インフルエンザウイルス抗原を用い、（１）と同様の方法で、２種類の精製抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体を得た。２．酵素標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体の作製 （１）アルカリフォスファターゼ標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体の作製 精製抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体のうち１種類について４５ｍｇを０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．６）で透析後、ペプシン１０ｍｇを添加し、３７℃で１時間、Ｆａｂ'消化処理を行った。処理液をウルトロゲルＡｃＡ３４カラムで分画して抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体Ｆ（ａｂ'）２精製画分を得た。前記画分を約１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮後、０．１Ｍメルカプトエチルアミンと１０：１の体積比で混合し、３７℃で９０分間還元処理を行った。処理液をウルトロゲルＡｃＡ３４カラムで分画して抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体Ｆａｂ'精製画分を得た後、約１ｍＬにまで濃縮した。 １０ｍｇ／ｍＬのアルカリフォスファターゼ１．５ｍＬを１ｍＭ塩化マグネシウムならびに０．１ｍＭ塩化亜鉛を含む５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ７．６）に透析後、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド０．７ｍｇを添加し、３０℃で１時間処理した。処理後の溶液をセファデックスＧ−２５カラムで分画し、最初のピークを回収してマレイミド−アルカリフォスファターゼを得た後、約１ｍＬにまで濃縮した。 濃縮した抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体Ｆａｂ'とマレイミド−アルカリフォスファターゼを１：２．３の蛋白比で混合し、４℃で２０時間穏やかに撹拌して反応させ、アルカリフォスファターゼ標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体Ｆａｂ'を得た。更に、反応液をウルトロゲルＡｃＡ３４カラムで分画し、未反応物を除去して精製アルカリフォスファターゼ標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体Ｆａｂ'を得た。 精製アルカリフォスファターゼ標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体Ｆａｂ'は、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、１％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミン、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１５ｍＭ塩化亜鉛、０．０９％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）の組成からなる標識抗体希釈液で希釈した後、０．２２μｍ孔径の濾過フィルターで濾過し、アルカリフォスファターゼ標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体を得た。（２）アルカリフォスファターゼ標識抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体の作製 精製抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体のうち１種類について、（１）と同様の方法で、アルカリフォスファターゼ標識抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体を得た。デバイスの作製（１）Ａ型インフルエンザウイルス用デバイス ニトロセルロースメンブラン（HiFlow Plus HF06504 ミリポア社製）を２０ｃｍ×５ｃｍに切り、このニトロセルロースメンブランの吸収パッド部側のメンブラン端から1ｃｍの位置に精製水を用いて至適濃度に希釈した抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体液（上記と別のクローン）で幅０．５ｍｍの２０ｃｍラインを描き、減圧下で乾燥して抗体を固相化し、カッターで５ｍｍ×５ｃｍのストリップに裁断してメンブランストリップ部を作製した。濾紙（ＷＡ１．５ ワットマン社製）を５ｍｍ×３ｃｍの大きさに裁断し、メンブランストリップ部の端に５ｍｍ重ねて吸収パッド部を設けた。 ついで、６ｍｍ×６ｍｍ×０．５ｍｍのポリビニルスポンジに標識抗体を含有させた標識部を検出部から４ｍｍ離れたメンブラン上に設けた。該標識部は、１０％（Ｗ／Ｖ）トレハロース、４％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミン、０．２％（Ｗ／Ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１５ｍＭ塩化亜鉛を含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）にアルカリフォスファターゼ標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体を至適濃度に加えたものを２５μＬ量ポリビニルスポンジ（Ｆ(Ａ)アイオン社製）に含浸させたのち減圧下で乾燥して用いた。 更に、該標識部から１０ｍｍ離れたメンブランストリップ部上に、５ｍｍ×２０ｍｍ×２ｍｍのポリビニルスポンジに基質を含有させた基質パッド部を設けてデバイスを作製した。 該基質パッド部は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸／ニトロテトラゾリウムブルー（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）溶液（Ｂ１９１１ シグマアルドリッチ社製）にトレハロース１０％を加えたものをポリビニルスポンジ（Ｆ(Ａ）アイオン社製）に含浸させたのち凍結乾燥して用いた。（２）Ｂ型インフルエンザウイルス用デバイス（１）と同様の方法で、Ｂ型インフルエンザウイルス用デバイスを作製した。検出 検体としてＡ型インフルエンザウイルス抗原液並びにＢ型インフルエンザウイルス抗原液をそれぞれ用いた。 インフルエンザウイルス抗原液を０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．１％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミン、１％（Ｗ／Ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む２５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で１０倍階段希釈し検体試料液とした。 検体試料液をデバイスの標識部に２５μＬ加え、つづいて基質溶解液を基質パッド部に２００μＬ加え、１５分後に判定を行った。比較検討 同時に、従来法デバイスを作製して、操作し比較試験を行った。結果 Ａ型インフルエンザウイルス用デバイスを用いた時、Ａ型インフルエンザウイルス抗原は１０５（pfu/mL）まで陽性で、Ｂ型インフルエンザウイルス抗原は陰性となり特異的にＡ型インフルエンザウイルス抗原を検出できることが確かめられた。 Ｂ型インフルエンザウイルス用デバイスを用いた時、Ｂ型インフルエンザウイルス抗原は１０５（pfu/mL）まで陽性で、Ａ型インフルエンザウイルス抗原は陰性となり特異的にＢ型インフルエンザウイルス抗原を検出できることが確かめられた。 一方、比較法は特異的に抗原を検出できるが検出感度が本発明法より低かった。 得られた結果を表１及び表２に示す。表１ Ａ型インフルエンザウイルス用デバイスを用いた成績 ウイルス濃度（pfu/mL） １０６ １０５ １０４ 本発明法 Ａ型インフルエンザウイルス抗原 ＋ ＋ − Ｂ型インフルエンザウイルス抗原 − − − 比較法 Ａ型インフルエンザウイルス抗原 ＋ − − Ｂ型インフルエンザウイルス抗原 − − − 判定基準 ＋ ： 青の着色が見られるもの − ： 青の着色が見られないもの表２ Ｂ型インフルエンザウイルス用デバイスを用いた成績 ウイルス濃度（pfu/mL） １０６ １０５ １０４ 本発明法 Ｂ型インフルエンザウイルス抗原 ＋ ＋ − Ａ型インフルエンザウイルス抗原 − − − 比較法 Ｂ型インフルエンザウイルス抗原 ＋ − − Ａ型インフルエンザウイルス抗原 − − − 判定基準 ＋ ： 青の着色が見られるもの − ： 青の着色が見られないもの 表１及び２に示すように、高感度で特異的な抗原を検出できることがわかる。本発明のエンザイムイムノアッセイデバイスの態様を示す図である。従来のエンザイムイムノアッセイデバイスの態様を示す図である。符号の説明 １ メンブランストリップ部 ２ 吸収パッド部 ３ 基質パッド部 ４ 標識部 ５ 検出部 ６ メンブランストリップ部 ７ 吸収パッド部 ８ 基質溶解液パッド部 ９ 標識抗体部 １０ 検出部 １１ 基質部 検体試料液中の被検出物を検出するための、メンブランストリップを用いたエンザイムイムノアッセイデバイスであって、メンブランストリップ部の一方の端に吸収パッド部、もう一方の端のメンブランストリップ部上に酵素の基質が乾燥状態で含有されている基質パッド部、前記メンブランストリップ部に検出すべき抗原または抗体と反応する抗体または抗原を酵素で標識した標識抗体または標識抗原が乾燥状態で含有されている標識部、該標識部と前記吸収パッド部の間のメンブランストリップ部に検出すべき抗原または抗体と反応する抗体または抗原が固相化された検出部を設けたエンザイムイムノアッセイデバイス。 請求項１記載のエンザイムイムノアッセイデバイスを用いて検体試料液中の被検出物を検出する方法であって、検体試料液を標識部に加え、つづいて基質溶解液を基質パッド部に加えて泳動させ、連続した一連の反応により起こる前記検出部における着色の有無を観察することにより検体試料液中の被検出物を検出する方法。 【課題】 メンブランストリップを用いたＥＩＡにおいて、検出感度が高く、正確に検出できるＥＩＡデバイス及びそれを用いた検出方法を提供する。【解決手段】 検体試料液中の被検出物を検出するための、メンブランストリップを用いたＥＩＡデバイスであって、ストリップ部の一端が吸収パッド部、ストリップ部の他端上に酵素基質を乾燥状態で含有する基質パッド部、ストリップ部に被検出物と反応する標識抗体又は標識抗原を乾燥状態で含有する標識部、標識部と吸収パッド部間のストリップ部に被検出物と反応する抗体又は抗原が固相化された検出部を設けたＥＩＡデバイス並びにそのデバイスを用いて試料液中の被検出物を検出する方法であって、試料液を標識部に加え、つづいて基質溶解液を基質パッド部に加えて泳動させ、連続した一連の反応により起こる検出部における着色の有無を観察することにより検体試料液中の被検出物を検出する。【選択図】 なし