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| タイトル： | 公開特許公報(A)_アコニット酸ヒドラターゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質 |
| 出願番号： | 2004080863 |
| 年次： | 2005 |
| IPC分類： | 7,C12N15/09,C12N1/15,C12N1/19,C12N1/21,C12N5/10,C12N9/88 |
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倉光 成紀 増井 良治 JP 2005261348 公開特許公報(A) 20050929 2004080863 20040319 アコニット酸ヒドラターゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質 国立大学法人大阪大学 504176911 特許業務法人池内・佐藤アンドパートナーズ 110000040 倉光 成紀 増井 良治 7C12N15/09C12N1/15C12N1/19C12N1/21C12N5/10C12N9/88 JPC12N15/00 AC12N1/15C12N1/19C12N1/21C12N9/88C12N5/00 A 7 1 ＯＬ 9 4B024 4B050 4B065 4B024AA03 4B024BA07 4B024CA04 4B024DA06 4B024EA04 4B024GA11 4B050CC03 4B050DD02 4B050LL05 4B065AA01Y 4B065AA26X 4B065AB01 4B065AC02 4B065AC14 4B065BA02 4B065BB37 4B065BC02 4B065BC03 4B065CA27 4B065CA60 本発明は、アコニット酸ヒドラターゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質に関する。本出願は、国の委託の成果に係る出願である。 アコニット酸ヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．３）は、クエン酸回路中において、クエン酸から、シスアコニット酸に変化する反応を触媒する酵素であり、種々の生物に広く分布している。細胞内では、ミトコンドリア内に局在している。また、アコニット酸ヒドラターゼの工業的利用法としては、代謝中間体を原料とした酵素法によるＬ−リジン合成がある（例えば、特許文献１参照）。酵素を工業的に利用する場合、耐熱性のものが好ましいが、従来、知られている耐熱性アコニット酸ヒドラターゼとしては、サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)由来の酵素（例えば、特許文献１参照）、スルホロブス・アシドカルダリス(Sulfolobus acidocaldarius)由来の酵素（例えば、非特許文献１参照）、スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）由来の酵素（例えば、非特許文献２参照）がある。このような耐熱性菌由来のアコニット酸ヒドラターゼは、工業的用途を広げるものと期待されているが、前記３種類の菌由来のものだけでは、未だ不十分である。 他方、前記の菌以外の超好熱性古細菌（例えば、非特許文献３参照）についての研究があり、スルホロブス属細菌の１種であるスルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（JCM１０５４５）（例えば、非特許文献４参照）は、その遺伝子が既に解析されている（例えば、非特許文献５参照）。したがって、この超好熱古細菌が、アコニット酸ヒドラターゼを産生するとすれば、それは優れた耐熱性を有すると予想され、これによって工業的用途さらに広がる可能性がある。特開2001-157276号公報Eur. J. Biochem., 268(6), 1760-1771, 2001Biochem. Soc. Trans., 30(4),685-687, 2002Advances in Protetin Chemistry, Volume 48, Enzymes and Proteins from Hyperthermophilic Microorganisms (M.Adams ed.), Academic Press (1996)Suzuki, T. et al., Extremophiles, 2002 Feb;6(1):39-44Kawarabayashi,Y. et al., “Complete genome sequence of an aerobic thermoacidophilic crenarchaeon, Sulfolobus tokodaii strain7”, DNA Res. 8 (4), 123-140 (2001) 本発明は、このような事情に鑑みなされたものであり、アコニット酸ヒドラターゼ活性を持つ新規耐熱性タンパク質の提供を、その目的とする。 前記目的を達成するために、超好熱性古細菌であるスルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（JCM１０５４５）のゲノム情報について調べたところ、この細菌が、アコニット酸ヒドラターゼを産生する可能性があることを突き止めた。この知見に基づき、さらに研究を重ねたところ、この細菌の遺伝子から、アコニット酸ヒドラターゼ活性を持つ新規耐熱性タンパク質を発現させることに成功し、本発明に到達した。 すなわち、本発明のタンパク質は、下記の（ａ）または（ｂ）のタンパク質である。（ａ） 配列番号１のアミノ酸配列からなる耐熱性タンパク質。（ｂ） 配列番号１のアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、アコニット酸ヒドラターゼ活性を有する耐熱性タンパク質。 なお、スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（JCM１０５４５）は、理化学研究所生物基盤研究部微生物系統保存施設に保存されており、第三者の要求により分譲可能である。 スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（JCM１０５４５）の生育温度は８０℃であり、生育限界温度が８７℃であるから、本発明のタンパク質は、８０〜８７℃の高温であっても活性がある。 前記アコニット酸ヒドラターゼ活性は、クエン酸に作用して、シスアコニット酸を生成する機能である。 前述のように、本発明の新規耐熱性タンパク質は、超好熱性古細菌由来であり、具体的には、スルホロブス・トコダイイ(Sulfolobus tokodaii)（JCM１０５４５）由来である。但し、本発明のタンパク質は、この菌が産生するものに限定されず、遺伝子工学的手法により、他の生物が産生するものであってもよい。 つぎに、本発明の発現ベクターは、前記本発明のタンパク質をコードするＤＮＡまたは配列番号２に記載のＤＮＡを含むベクターである。 つぎに、本発明の形質転換体は、前記本発明のベクターにより形質転換された形質転換体である。なお、宿主は特に制限されず、例えば、大腸菌等がある。 つぎに、本発明のタンパク質の製造方法は、前記本発明の形質転換体を培養する工程と、前記培養工程において発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む製造方法である。 以下、本発明について、さらに詳細に説明する。 本発明者らは、海洋底から採取された超好熱性古細菌であって、好気性thermoacidophilic crenarchaeonの１種であるスルホロブス・トコダイイ(Sulfolobus tokodaii)種７（JCM１０５４５）の遺伝子配列からアコニット酸ヒドラターゼ活性を示すと推定される遺伝子（配列番号２）をクローニングし、これを大腸菌を用いて発現させることにより、本発明の新規耐熱性タンパク質を得るに至った。遺伝子のクローニング方法は、後記した実施例１に記載した通り実施した。クローニングされた遺伝子の塩基配列は配列番号２に示す通りとおりであり、また、その推定アミノ酸配列は配列番号１に示す通りである。なお、本発明の耐熱性タンパク質は、アコニット酸ヒドラターゼ活性を有していれば、配列番号１のアミノ酸配列において、一つ以上若しくは数個のアミノ酸残基が、欠質、置換、付加若しくは挿入されていてもよい。このアミノ酸配列における「アミノ酸の欠失、置換、付加若しくは挿入」は、当業者に公知の方法（例えば、突然変異誘発法）に従って実施することができる。 本発明のタンパク質は、前述の本発明のタンパク質の製造方法により製造可能であるが、これに限定されず、他の製造方法で製造されてもよい。例えば配列番号１に示すように、そのアミノ酸配列が決定されているタンパク質については、その配列を元に当業者に公知の手法、例えば、個々のアミノ酸を化学的に重合してタンパク質を合成する方法に従って調製することができる。本発明のタンパク質をコードする遺伝子の一例としては、配列番号２に示す遺伝子がある。前記遺伝子は、例えば、後記する実施例２に示すように超好熱性古細菌スルホロブス・トコダイイ(Sulfolobus tokodaii)（JCM１０５４５）のゲノムから、例えば配列番号２で示される塩基配列の一部をプライマーとして用いるＰＣＲ法あるいは該ＤＮＡ断片をプローブとして用いるハイブリダイゼーション法により調製することができる。また、その塩基配列をもとに、当業者に公知である核酸化学合成法等に従って前記遺伝子を得ることもできるが、これらに限定されない。 本発明の発現ベクターは、前記遺伝子もしくは配列番号２のＤＮＡを適当なベクターに挿入することによって得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば、特に制限されるものではなく、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ＡｃＭＮＰＶなどのバキュロウイルスなどが挙げられる。プラスミドＤＮＡは、大腸菌やアグロバクテリウムからアルカリ抽出法またはその変法などにより調製することができる。また、市販プラスミドとして、例えばｐＥＴ-１１ａ（Novagen社製）あるいはバチルス属の宿主を用いた分泌型のプラスミドなどを用いてもよい。これらのプラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子などが含まれていてもよい。 ベクターへの遺伝子等の挿入は、例えば、精製された遺伝子の塩基配列を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などを用いることができるが、これらに限定されない。また、本発明の遺伝子の機能が発揮されるように、本発明の発現ベクターには本発明の遺伝子のほか、プロモーター、ターミネーター、リボソーム結合配列などを組み込んでいてもよい。さらに、本発明の遺伝子も他のタンパク質のコードする配列を融合したものを挿入してもよい。 前記発現ベクターで宿主生物を形質転換すれば、本発明の形質転換体が得られる。宿主生物としては、本発明の遺伝子を発現できるものであれば、特に制限されるものではなく、例えば、大腸菌などの原核生物細胞などの原核細胞が挙げられるが、これらに限定されない。形質転換法としては、既に公知である塩化カルシウム法などを使用することができるが、これらの方法に限定されない。 本発明のタンパク質の製造方法は、前記形質転換体を培養する工程と、前記培養工程において発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む製造方法である。前記培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。大腸菌等の微生物を宿主とした形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを含有し、形質転換体の培養を効率的に行えるものであれば、天然培地、合成培地などのいずれを用いてもよい。本発明のタンパク質の回収は、特に制限されない。前記タンパク質が菌体内または細胞内に生産される場合には、菌体または細胞を破砕することによって前記タンパク質を回収する。また、本発明の前記タンパク質が菌体外または細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離などにより菌体または細胞を除去した後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを単独でまたは適宜組み合わせて用いることにより、培養物中から本発明のタンパク質を単離精製することができる。なお、培養液をそのまま使用する場合、熱処理をすることにより、他のタンパク質が失活するので、実質上、本発明のタンパク質のみの酵素液として使用できる。 以下に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されない。染色体ＤＮＡの調製 スルホロブス・トコダイイ(Sulfolobus tokodaii(ＪＣＭ１０５４５))をＬ培地中で37℃にて一晩培養して集菌したものに、ＳＳＣ溶液(０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム)１０ｍＬ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ、１００ｍｇ／ｍｌ ニワトリ卵白リゾチーム０．１ｍｌおよび１０％非イオン性界面活性剤Ｂｒｉｊ-５８を０．５ｍＬ加え、０℃で３０分間放置した後、プロテイナーゼＫ(Ｍｅｒｃｋ社製)５ｍｇを１０％ＳＤＳ ０．２ｍＬに溶かした溶液を加え、３７℃で２、３日間放置した。この溶液に水飽和フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコールの混合溶液を加えて、３７℃で１時間放置した後、水層を分取し、そこへエタノールを加えてＤＮＡを沈殿濃縮した。このＤＮＡの沈殿をＴＥ溶液(１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１ｍＭ ＥＤＴＡ(ｐＨ８．０))１０ｍＬに溶解し、リボヌクレアーゼ０．２５ｍＬ(最終濃度０．２５ｍｇ／ｍＬ)を加えて、３７℃で一晩放置した後、エタノールで沈殿させた。次いで、ＤＮＡをＴＥ溶液５ｍＬに溶解した後、２６０ｎｍの吸光度より、ＤＮＡ濃度を決定した（Clarke,L.& Carbon,J.(1979) Methods Enzymol.68,396-408）。発現プラスミドの構築と遺伝子発現１．発現プラスミドの構築 耐熱性アコニット酸ヒドラターゼ遺伝子の翻訳領域の前後に制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩサイトを含むＤＮＡを構築する目的で下記のDNAプライマーを合成し、このプライマーを用いたＰＣＲで耐熱性アコニット酸ヒドラターゼ遺伝子の翻訳領域の前後に制限酵素サイトを導入した。用いたＤＮＡポリメラーゼはＫＯＤ Ｄａｓｈ（東洋紡社製）であった。Forward primer（配列番号３）：5'-ATATCATATGGTAGACTTGTTTATGAAATTTCAGATTTCT-3'Reverse primer（配列番号４）：5'-ATATGGATCCGCGGCCGCTTATTAACTTTCATATAATAATTT-3' ＰＣＲ反応後、Ｅｘ Ｔａｑ(宝酒造社製)を用いて増幅断片の３’末端側にデオキシアデノシンを付加した後、ｐＧＥＭ-Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ(Promega社製)と、Ｔ４リガーゼで１５℃、３０分間反応させ連結した。連結したＤＮＡを大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセルに導入し、形質転換体のコロニーを得た。得られた形質転換体をアンピシリンを含むＬＢ培地(１８ｍＬ)で２４時間培養し、その培養液からプラスミドを改変アルカリＳＤＳ法で精製した。プラスミド中に期待される大きさのインサートが存在することを、アガロース電気泳動で確認した。精製プラスミドのインサートの塩基配列は、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｋｉｔ(登録商標：Applied Biosystems社製)とＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ(登録商標：Applied Biosystems社製)を用いて決定し、インサートの塩基配列が、耐熱性アコニット酸ヒドラターゼ遺伝子の正しい配列であることを確認した。正しい配列を有するプラスミドの一部を制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで完全分解(３７℃で２時間)した後、アガロース電気泳動により、耐熱性アコニット酸ヒドラターゼ遺伝子を精製した。ｐＥＴ-１１ａ(Novagen社製)を制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切断・精製した後、上記の構造遺伝子とＴ４リガーゼで反応させ連結した。連結したＤＮＡの一部を大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセルに導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに適量まき、３７℃で一晩培養し、形質転換体のコロニーを得た。得られた形質転換体をアンピシリンを含むＬＢ培地(１８ｍＬ)で２４時間培養し、その培養液から発現プラスミドを改変アルカリＳＤＳ法で精製した。２．組換え遺伝子の発現 大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ-ｇａｍｉ(ＤＥ３)(Novagen社製)のコンピテントセルを融解して、ファルコンチューブに０．１ｍＬ移した。その中に上記１．の精製発現プラスミドの溶液０．００２ｍＬを加え氷中に２０分間放置した後、４２℃でヒートショックを９０秒間行い、氷中に1分間放置した後、クロラムフェニコールとアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに適量まき、３７℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をアンピシリンを含むＬＢ培地(５ｍＬ)で18時間培養し、耐熱性アコニット酸ヒドラターゼ遺伝子を発現した。培養後、遠心分離（１３，０００Ｇ、１０分）で集菌した。集菌した菌体に、破砕液(２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、１００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．５)を０．２ｍＬ加え、超音波発生器で細胞を破砕し、その懸濁液を０．１ｍＬずつ２本のサンプルチューブに分けた。一方のサンプルチューブは遠心分離(１３，０００Ｇ、１０分)して上清と沈殿に分け、沈殿は破砕液０．１ｍＬで懸濁した。もう一方のサンプルチューブは、熱処理（７０℃、１０分）を施した後、遠心分離（１３，０００Ｇ、１０分）して上清と沈殿に分け、沈殿は破砕液０．１ｍＬで懸濁した。これらの試料の一部をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分析し、発現を確認できた。この結果を、図１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真に示す。 耐熱性アコニット酸ヒドラターゼの発現が見られた試料についてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、エレクトロブロッティングによりＰＶＤＦ膜に転写し、染色によって可視化された耐熱性アコニット酸ヒドラターゼのバンドを切り出し、プロテインシーケンサーＭｏｄｅｌ４９２Ｐｒｏｃｉｓｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、アミノ末端配列を解析した結果、配列番号５に示すように７残基のアミノ末端配列が決定できた。この配列により、発現タンパク質が耐熱性アコニット酸ヒドラターゼであることを確認できた。このタンパク質は、８５５アミノ酸残基より構成されており、その推定分子量は９５．８ｋＤであり、図１の結果とほぼ一致した。 本発明により、アコニット酸ヒドラターゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質が提供できる。本発明のタンパク質は、高温下で使用することが可能であり、工業的用途が広がると共に、基質濃度の増加、反応効率の向上、混入微生物の除去、保存期間および耐用期間の延長などの多くの利点がもたらされる。図１は、本発明の一実施例における組換えタンパク質のＳＤＳ-ＰＡＧＥ写真である。配列番号１：耐熱性アコニット酸ヒドラターゼのアミノ酸配列配列番号２：耐熱性アコニット酸ヒドラターゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列配列番号３：耐熱性アコニット酸ヒドラターゼの構造遺伝子の末端に制限酵素部位ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩを導入するための順方向プライマー配列番号４：耐熱性アコニット酸ヒドラターゼの構造遺伝子の末端に制限酵素部位ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩを導入するための逆方向プライマー配列番号５：Ｎ末端アミノ酸配列下記の（ａ）または（ｂ）の耐熱性タンパク質（ａ） 配列番号１のアミノ酸配列からなる耐熱性タンパク質。（ｂ） 配列番号１のアミノ酸配列において、１つ若しくは数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、アコニット酸ヒドラターゼ活性を有する耐熱性タンパク質。前記アコニット酸ヒドラターゼ活性が、クエン酸に作用して、シスアコニット酸を生成する機能である請求項１記載のタンパク質。超好熱性古細菌由来である請求項１または２記載のタンパク質。超好熱性古細菌が、スルホロブス・トコダイイ(Sulfolobus tokodaii)（JCM１０５４５）である請求項３記載のタンパク質。請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡまたは配列番号２に記載のＤＮＡを含むベクター。請求項５記載のベクターにより形質転換された形質転換体。請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質の製造方法であって、請求項６記載の形質転換体を培養する工程と、前記培養工程において発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む製造方法。 【課題】アコニット酸ヒドラターゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるタンパク質は、アコニット酸ヒドラターゼ活性を有する。このタンパク質は、超好熱性古細菌であって、好気性thermoacidophilic crenarchaeonの１種であるスルホロブス・トコダイイ(Sulfolobus tokodaii)種７（JCM１０５４５）の遺伝子配列から、アコニット酸ヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードすると推定される遺伝子をクローニングし、これを大腸菌を用いて発現させることにより得た。【選択図】 図１配列表