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林 利光 渡辺 泰雄 鷲見 亮 JP 4411523 特許公報(B2) 20091127 2004061033 20040304 抗ウイルス剤 株式会社日健総本社 399127603 辻本 一義 100072213 林 利光 渡辺 泰雄 鷲見 亮 20100210 A61K 36/02 20060101AFI20100121BHJP A61P 31/12 20060101ALI20100121BHJP JPA61K35/80A61P31/12 Ａ６１Ｋ ３６／０２ Ａ６１Ｐ ３１／１２ ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ） ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩ） 日本癌学会総会記事，２００３年，Vol.62，p.374 3 2005247757 20050915 8 20051207 田村 聖子 この発明は、コッコミクサ藻体より抽出した抗ウイルス剤に関するものである。 従来、藻類は、食品、飼料等に用いられているが、その効能は食品の範疇、飼料の範疇でしか見出されておらず、その免疫活性、抗腫瘍性、抗癌性等の有用性についての開発はほとんど行われていなかった。 藻類の有用性については、そのまま乾燥させたものや、熱水で抽出したエキス、そのエキスを粉末にしたものを用いて、動物実験や臨床試験は行われているが、そのほとんどが糖尿病、高血圧症等の血糖値、血圧値を下げる程度の水準であった。 ところが、近年、藻類の熱水抽出物に抗癌活性が見出されるに至っており、その活性本体としては多糖類であるとされている。藻類の中でもクロレラに含まれる多糖類であるβ−グルカンは、椎茸やヒメマツタケ等に見られる菌類にも多く含まれ、その効果が明らかになっている。 そこで、本出願人においても、藻類の中でもクロレラまたはコッコミクサから抽出した酸性多糖が、免疫系や癌細胞に直接影響を与え、強い抗癌活性を有することを見出すに至っている（特許文献１）。 また、本出願人は、ガラス製、アクリル製等の透明体からなる水槽に、コッコミクサ藻体を接種して、第一、二、三工程を通じて、培養温度を５〜３０°Ｃに保持し、炭酸ガス含有空気を通気しつつ、前記水槽の上面や側面などから蛍光灯または白熱灯を照射し、培養することを三工程に別けて行う培養法を提供している。この培養法によれば、コッコミクサ藻体の大量培養が容易にできる（特許文献２）。特開２００１−２８８１０２号公報（第２頁）特開平１１−２９００９３号公報（第２頁） そこで、この発明は、藻類の中でも上記培養法により大量培養されるコッコミクサ藻体に注目し、このコッコミクサ藻体の抽出物が、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトコロナウイルス等のＤＮＡ型ウイルス、ＲＮＡ型ウイルスに対して高い抗ウイルス活性を示すことを見出し、本抗ウイルス剤を提供するに至ったものである。 この発明の抗ウイルス剤は、緑色植物門(Chlorohta) 、緑藻綱(Chlorophyeae)、クロロコッカム目(Chlorococcales)、クロロコッカム科(Chlorococcaceae) に属するコッコミクサ・ミノール(Coccomyxa minor) 又はコッコミクサ・グロエオボトリディフォルミス(Coccomyxagloeobotrydiformis)としたコッコミクサ藻体の熱水抽出物から得られた多糖体画分を有効成分としてなり、単純ヘルペスウイルス１型、Ａ型インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトコロナウイルスに対する抗ウイルス活性を有するものとしている。 そして、前記多糖体画分は、前記コッコミクサ藻体の抽出物の蒸留水による溶出画分としている。さらに、前記多糖体画分は、前記コッコミクサ藻体の抽出物の蒸留水による溶出後の無機塩溶液による溶出画分とすることができる。 この発明の抗ウイルス剤は、以上に述べたように構成されており、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトコロナウイルス等のＤＮＡ型ウイルス、ＲＮＡ型ウイルスに対して高い抗ウイルス活性を示すものとなった。 以下、この発明の抗ウイルス剤を実施するための最良の形態を、実施例に基づいて詳細に説明する。 この発明の抗ウイルス剤は、コッコミクサ藻体の抽出物を有効成分としてなるものとしている。このコッコミクサ藻体の抽出物は、熱水抽出物とするのが好ましい。 この発明で用いるコッコミクサ藻体は、緑色植物門(Chlorohta) 、緑藻綱(Chlorophyeae)、クロロコッカム目(Chlorococcales)、クロロコッカム科(Chlorococcaceae) に属するコッコミクサ・ミノール(Coccomyxa minor) 、コッコミクサ・グロエオボトリディフォルミス(Coccomyxa gloeobotrydiformis)とした。 さらに、この発明の抗ウイルス剤は、コッコミクサ藻体の抽出物から得られた多糖体画分を有効成分としてなるものとしている。 前記多糖体画分は、コッコミクサ藻体の抽出物の蒸留水による溶出画分としたり、この蒸留水による溶出後の無機塩溶液による溶出画分とすることができる。すなわち、前記多糖体画分は、コッコミクサ藻体の抽出物をカラムクロマトグラフィーに付し、蒸留水で溶出した画分としたり、この溶出画分を続いて無機塩溶液で溶出した画分とすることができる。 そこで、この発明の抗ウイルス剤におけるコッコミクサ藻体抽出物の抽出法およびこの抽出物から得られた多糖体の分画法について、詳細に説明する。 （コッコミクサ藻体の抽出と分画） コッコミクサの乾燥藻体（１０ｇ）にイオン交換水（２００ｍＬ）を加え、還流下で１時間、加熱抽出を行った。抽出液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）し、上清を減圧濃縮しコッコミクサ藻体の抽出物（以下、ＣＥという）７０ｍＬを得た。 前記ＣＥ（１５ｍＬ：１１３ｍｇ相当）を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）し、上清をカラムクロマトグラフィー（ＤＥＡＥ Ｔoyopearl 650Ｍ column(φ２．５×６ｃｍ）：東ソー株式会社製）に付した。最初、蒸留水２００ｍＬで溶出を行い（この溶出画分を以下、ＣＥ-1という）、続いて０〜２Ｍ−ＮａＣｌの濃度勾配をかけて溶出させ（この溶出画分を以下、ＣＥ-2という）、最後に４Ｍ−ＮａＣｌで溶出させた（この溶出画分を以下、ＣＥ-3という）。各試験管に約４ｍＬずつ分取し、２５６ｎｍにおける吸光度、およびフェノール硫酸法による呈色反応後の４８０ｎｍにおける吸光度を測定し、それぞれの溶出曲線をもとに分画した。 得られた画分は、減圧濃縮後、イオン交換水に対して透析した後、凍結乾燥した。その結果、収量はＣＥ-1が７４ｍｇ、ＣＥ-2が１２ｍｇ、ＣＥ-3が６ｍｇであった。なお、残りのＣＥ（５５ｍＬ：４１３ｍｇ相当）は凍結乾燥した。 （単糖組成分析） ＣＥ-1〜ＣＥ-3の各画分を２Ｎ−トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に溶解し、１２１°Ｃで１時間、加水分解した。窒素ブローによりＴＦＡを除去した後、濃縮した。これに、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ4)を加え、生成した単糖類をアルジトールに還元し、過剰のＮａＢＨ4 を１０％ＡｃＯＨ／ＭｅＯＨに加え分解し、濃縮乾固した。さらに、ＭｅＯＨを加え、濃縮乾固を５回行うことでホウ酸イオンを除去した。減圧下で乾燥後、無水酢酸を加え、１００°Ｃで２時間、加熱することでアルジトールアセテートを得た。得られたアルジトールアセテートは、ガスクロマトグラフ／質量分析計により分析した。 ＣＥ-1〜ＣＥ-3の各画分についての構成単糖を分析した結果を、表１に示した。 表１より、ＣＥ-1、ＣＥ-3はＲibを多く含み、ＣＥ-2は6-Ｏ-methylhexose を含むことが判った。 この発明の抗ウイルス剤は、ウイルス感染前またはウイルス感染後において、予防的または治療的処置に有用である。この抗ウイルス剤の適用可能なウイルスとしては、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）、Ａ型インフルエンザウイルス（ＩＦＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）、ヒトコロナウイルス（ＨＣｏＶ）等のＤＮＡ型ウイルス、ＲＮＡ型ウイルスが挙げられる。 以下、この発明の抗ウイルス剤のこれらウイルスに対する活性の測定を行った。 （実施例１）単純ヘルペスウイルス１型に対する活性の測定 ＨＳＶ−１に対する活性は、アフリカミドリザル腎臓由来のＶｅｒｏ細胞を宿主細胞として用いた。このＶｅｒｏ細胞を４８穴プレートに培養し、０．１ＰＦＵ（プラーク形成単位）／細胞で感染後、この発明の抗ウイルス剤（ＣＥおよびＣＥ-1〜ＣＥ-3）の０．８〜５００μｇ／ｍｌの存在下で処理した。２４時間後に収穫して、凍結、溶解処理を３回行った。この検体を適宜希釈して、３５ｍｍディッシュに別に培養したＶｅｒｏ細胞に感染させ、翌日に染色後、プラークを計数した。無添加対照区のプラーク数を１００％として、５０％ウイルス増殖阻止濃度（ＩＣ50）を算出した。 （実施例２）Ａ型インフルエンザウイルスに対する活性の測定 ＩＦＶに対する活性は、イヌ腎臓由来のＭＤＣＫ細胞を宿主細胞として用いた。このＭＤＣＫ細胞を４８穴プレートに培養し、０．１ＰＦＵ／細胞で感染後、この発明の抗ウイルス剤（ＣＥおよびＣＥ-1〜ＣＥ-3）の０．８〜５００μｇ／ｍｌの存在下で処理した。以下、プラークアッセイはＨＳＶ−１と同様の方法で行った。 （実施例３）ヒト免疫不全ウイルスに対する活性の測定 感染力のあるウイルスそのものは用いない細胞間融合アッセイを行った。すなわち、ＨＩＶの糖蛋白質であるｇｐ１６０（ｇｐ１２０／ｇｐ４１）を発現しているＨｅＬａ細胞（ｇｐ１６０+ ＨｅＬａ細胞）と、宿主側のレセプターであるＣＤ４を発現しているＨｅＬａ細胞（ＣＤ+ ＨｅＬａ細胞）とを一定の割合で混合培養することによって、両者の細胞間で融合（多核巨細胞の形成）が起こることを利用して、この融合に対する阻止効果を検討した。この発明の抗ウイルス剤（ＣＥおよびＣＥ-1〜ＣＥ-3）の０．８−５００μｇ／ｍｌの存在下で２４時間の混合培養を行った後、ギムザ染色し、顕微鏡下で多核巨細胞数を測定した。無添加対照区の巨細胞数を１００％として、５０％細胞融合阻止濃度（ＩＣ50）を算出した。 （実施例４）ヒトコロナウイルスに対する活性の測定 ＨＣｏＶに対する活性は、ヒト胎児肺由来のＭＲＣ−５細胞を宿主細胞として用いた。このＭＲＣ−５細胞を４８穴プレートに培養し、０．００１ＴＣＩＤ50（５０％培養細胞感染量）／細胞で感染後、この発明の抗ウイルス剤（ＣＥおよびＣＥ-1〜ＣＥ-3）の０．８〜５００μｇ／ｍｌの存在下で処理した。３日後に収穫して、この検体を適宜希釈して、９６穴プレートに別に用意したＭＲＣ−５細胞に感染させ、５日間培養する。細胞変性効果（ＣＰＥ）の有無を判定して、Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法によって、５０％ＣＰＥ阻止濃度（ＩＣ50）を算出した。 一方、上記抗ウイルス活性の測定に伴い、この発明の抗ウイルス剤の細胞毒性試験を行った。 前記Ｖｅｒｏ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＲＣ−５細胞の各細胞を９６穴プレートに培養し、この発明の抗ウイルス剤（ＣＥおよびＣＥ-1〜ＣＥ-3）を８０〜１００００μｇ／ｍｌの濃度範囲で添加した培地中で、７２時間処理した。生細胞数は、トリパンブルー染色によって測定する。無添加対照区の細胞数を１００％とした時のそれぞれの増殖率を求め、５０％細胞増殖阻止濃度（ＣＣ50）を算出した。 次に、ＣＣ50／ＩＣ50の値を計算して、抗ウイルス活性の強弱を比較した。この数値が大きいほど選択的なウイルス増殖阻害効果が強いと言える。結果を表２〜５に示した。なお、以下に示す表の中で、Ａ区はウイルス感染の時から収穫に至るまでの期間中にこの発明の抗ウイルス剤が存在することを、またＢ区はウイルス感染直後から収穫に至るまでの期間中にこの発明の抗ウイルス剤が存在することをそれぞれ意味する。 表２より、ＣＥに強い活性が認められ、Ｂ区に比べ、Ａ区の活性の方が高いことから、ウイルスの感染初期（宿主細胞への吸着、侵入段階）を阻害する可能性が考えられる。ＣＥ-1〜ＣＥ-3については、ＣＥ-3が最も強力な活性を示した。ＣＥ-3の活性は、ＣＥにほぼ匹敵するものであった。 表３より、ＨＳＶ−１に類似した傾向がみられた。これは、ウイルスの感染が、ＨＳＶ−１の場合には宿主細胞膜とウイルス膜（エンベロープ）との融合によって起こるのに対して、インフルエンザウイルスの場合には貧食（融合が起こらないで、ウイルス粒子が飲み込まれる）によって起こることが関係していると思われる。選択指数は約３０となり、一般的にかなり高い数値といえる。 表４より、ＣＥに強い活性が認められ、ＣＥ-3にもこれに匹敵する効果が認められた。エイズウイルスが細胞に感染する際に、ＨＳＶ−１と同様に膜間の融合を起こすが、この段階を効果的に阻止できる可能性がある。現行のエイズウイルス感染症の治療法は、逆転写酵素阻害剤とプロテアーゼ阻害剤を３〜５種類組み合わせる併用療法（ＨＡＡＲＴと呼ばれている）である。この感染症の性質上、投薬を開始した場合には生涯にわたって薬物治療の管理下におかれるため、長期投薬による深刻な副作用の出現と耐性ウイルスの発生とが大きな問題になっている。このような事情を背景にして、これまで以上に作用点の異なる治療薬の開発が求められているが、今回採用したアッセイ系は、逆転写酵素阻害剤やプロテアーゼ阻害剤とは異なるウイルス増殖段階である宿主細胞へのウイルスの吸着、侵入に対する阻害効果を評価できる。その点で、この発明の抗ウイルス剤が本アッセイ系において高い細胞融合阻止効果を示したことは、従来の治療薬とは違う作用メカニズムを有する可能性が期待できる。 表５より、ＣＥにはかなりの阻害作用がみられた。ＣＥ-2およびＣＥ-3においては、ＣＥに比べて強度は低下しているが、選択指数が１０を超える有望な結果が得られた。 緑色植物門(Chlorohta) 、緑藻綱(Chlorophyeae)、クロロコッカム目(Chlorococcales)、クロロコッカム科(Chlorococcaceae) に属するコッコミクサ・ミノール(Coccomyxa minor) 又はコッコミクサ・グロエオボトリディフォルミス(Coccomyxagloeobotrydiformis)としたコッコミクサ藻体の熱水抽出物から得られた多糖体画分を有効成分としてなり、単純ヘルペスウイルス１型、Ａ型インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトコロナウイルスに対する抗ウイルス活性を有することを特徴とする抗ウイルス剤。 前記多糖体画分が、前記コッコミクサ藻体の抽出物の蒸留水による溶出画分であることを特徴とする請求項１記載の抗ウイルス剤。 前記多糖体画分が、前記コッコミクサ藻体の抽出物の蒸留水による溶出後の無機塩溶液による溶出画分であることを特徴とする請求項１記載の抗ウイルス剤。

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