生命科学関連特許情報
| タイトル： | 特許公報(B2)_試料中の総蛋白質測定試薬及び測定方法 |
| 出願番号： | 2004028139 |
| 年次： | 2007 |
| IPC分類： | G01N 33/68,G01N 21/78,G01N 33/52 |
特許情報キャッシュ
金野 弘靖 JP 3965433 特許公報(B2) 20070608 2004028139 20040204 試料中の総蛋白質測定試薬及び測定方法 株式会社シノテスト 000131474 金野 弘靖 JP 2003067313 20030204 20070829 G01N 33/68 20060101AFI20070809BHJP G01N 21/78 20060101ALI20070809BHJP G01N 33/52 20060101ALI20070809BHJP JPG01N33/68G01N21/78 ZG01N33/52 A Ｇ０１Ｎ ３３／６８ Ｇ０１Ｎ ２１／７８ Ｇ０１Ｎ ３３／５２ 14 2004258025 20040916 17 20060904 竹中 靖典 本発明は、試料中の総蛋白質を測定するための総蛋白質測定試薬及び測定方法に関するものである。 本発明は、特に、化学、生命科学、分析化学及び臨床検査等の分野において有用なものである。 蛋白質は、生体組織を構成する主要な物質であり、細胞の主要構成成分である。また、血中蛋白質には、生体の膠質浸透圧の維持、酸塩基平衡の維持、代謝、栄養素や微量金属等の輸送、筋肉運動、生体防御に働く抗体作用、血液凝固作用など種々の機能のものがあり、生命の維持や活動に重要な役割を果たしている。これら蛋白質の集合体が、総蛋白質であり、血清成分の約７％を占めている。血液中の蛋白質濃度は、蛋白質の吸収異常、腎障害、肝障害、悪性腫瘍等により変動し、その測定は臨床上極めて重要とされている。 総蛋白質の測定方法として使用されている方法としては、Ｋｊｅｌｄａｈｌ法、屈折計法、比重から算出する方法、ビウレット法がある。Ｋｊｅｌｄａｈｌ法は窒素量を測定して総蛋白質量を算出する方法であり、従来から標準法とされているが、操作が繁雑であり蛋白質の種類による差が大きいという問題がある。また、屈折計法は簡便に使用できるが正確度に問題がある。 ビウレット法は、アルカリ溶液中で蛋白質のポリペプチド鎖を形成しているペプチド結合の窒素原子４個が銅イオンと錯体を形成し、赤紫色に発色する反応（ビウレット反応）を利用した方法であり、蛋白質の種類による発色反応に差が少ないため、日常的に広く使用されている。しかしながら、このビウレット法は、試料と１種類の試薬のみを混合して測定を行う１試薬系の方法であるため、溶血試料の影響を受け測定値に正誤差を生じるという問題があった。 このため、最近では、測定に必要な成分を第１試薬と第２試薬に分割して含有させることにより、上記の問題点を解消した２試薬系２波長測定のビウレット法が提案されている。 例えば、試料を銅イオンを含有する試薬（第１試薬）と反応させた後にアルカリ性の試薬（第２試薬）と反応させ、銅イオンと試料中の蛋白質との錯体を形成させ発色させる方法や（例えば、特許文献１参照。）、試料をアルカリ性の試薬（第１試薬）と混合した後に銅イオンを含有する試薬（第２試薬）と反応させ、銅イオンと試料中の蛋白質との錯体を形成させ発色させる方法等が提案されている（例えば、非特許文献１参照。）。特開平１０−１９８９８号公報「ユニメイト プロテイン」添付文書、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社、１９９５年１０月改訂 本発明者は、２試薬系のビウレット法において、総蛋白質の測定範囲を広げるために、銅イオンを含有する試薬中の銅イオン濃度を増加させた場合、アルカリ性下では長期保存中に黒色沈殿や濁りが生じ、試薬の劣化が起きてしまうことを確認した。これを回避し長期安定化するためには、銅イオンを含有する試薬を弱アルカリ性〜酸性とすることが必要である。 しかし、ビウレット法においては、アルカリ性下で銅イオンと試料中の蛋白質との錯体を形成させ発色させるため、このように銅イオンを含有する試薬を弱アルカリ性〜酸性とした場合には、もう一方の試薬をアルカリ性にすることが必要となる。 ところで、本発明者が銅イオンを含有する弱アルカリ性〜酸性の試薬とアルカリ性の試薬を調製し、これらの試薬を用いて試料中の総蛋白質の測定について検討を行ったところ、測定値に正誤差を生じる場合があることが分かった。 この正誤差が生じた場合の最終反応液を目視で確認すると、沈殿の生成が認められた。この沈殿は、銅イオンを含有する試薬がアルカリ性の試薬と混合された際に形成された、不溶性の銅水酸化物〔Ｃｕ（ＯＨ）２〕であることが分かった。 したがって、本発明の課題は、ビウレット反応を利用した２試薬系の総蛋白質の測定系において、総蛋白質の測定範囲が広く、そして、測定における第１試薬と第２試薬の混合時にも沈殿が生成して正誤差が生じることを防ぐことができ、再現性を向上させることができ、更に保存時にも測定試薬が劣化することのない、試料中の総蛋白質測定試薬及び試料中の総蛋白質測定方法を提供することである。 本発明者は、上記課題の解決を目指して鋭意検討を行った結果、ビウレット反応を利用した２試薬系の総蛋白質測定試薬及び測定方法において、アルカリ性の第１試薬、並びに銅イオン及び銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有するｐＨ１０以下の第２試薬、という組み合わせにすることにより、試料中の総蛋白質を精度良く正確に測定することができることを見出し、本発明を完成するに至った。 すなわち、本発明は、以下の発明を提供する。（１） アルカリ性の第１試薬、並びに銅イオン及び銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有するｐＨ１０以下の第２試薬からなる、試料中の総蛋白質測定試薬。（２） 第２試薬のｐＨが３〜７である、前記（１）記載の試料中の総蛋白質測定試薬。（３） 銅イオンにキレート能力を持つ物質が、オキシカルボン酸、ポリアミノカルボン酸若しくはエタノールアミン又はその塩よりなる群から選択される物質であることを特徴とする、前記（１）又は前記（２）記載の試料中の総蛋白質測定試薬。（４） オキシカルボン酸又はその塩が、クエン酸又はその塩であることを特徴とする、前記（３）記載の試料中の総蛋白質測定試薬。（５） 第１試薬に銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有させることを特徴とする、前記（１）〜前記（４）のいずれか１項に記載の試料中の総蛋白質測定試薬。（６） 銅イオン及び銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有し、ｐＨ１０以下である試料中の総蛋白質測定試薬の第２試薬。（７） ｐＨが３〜７である、前記（６）記載の試料中の総蛋白質測定試薬の第２試薬。（８） 銅イオンにキレート能力を持つ物質が、オキシカルボン酸、ポリアミノカルボン酸若しくはエタノールアミン又はその塩よりなる群から選択される物質であることを特徴とする、前記（６）又は前記（７）記載の試料中の総蛋白質測定試薬の第２試薬。（９） オキシカルボン酸が、クエン酸又はその塩であることを特徴とする、前記（８）記載の試料中の総蛋白質測定試薬の第２試薬。（１０） 試料中の総蛋白質を測定する方法であって、ａ）該試料と、アルカリ性の第１試薬とを混合させる工程、ｂ）前記試料と第１試薬との混合物に、銅イオン及び銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有するｐＨ１０以下の第２試薬を混合し反応させ、試料中の蛋白質と銅イオンの錯体を形成させる工程、及びｃ）前記蛋白質と銅イオンの錯体を比色測定する工程よりなる、試料中の総蛋白質測定方法。（１１） 第２試薬のｐＨが３〜７である、前記（１０）記載の試料中の総蛋白質測定方法。（１２） 銅イオンにキレート能力を持つ物質が、オキシカルボン酸、ポリアミノカルボン酸若しくはエタノールアミン又はその塩よりなる群から選択される物質であることを特徴とする、前記（１０）又は前記（１１）記載の試料中の総蛋白質測定方法。（１３） オキシカルボン酸又はその塩が、クエン酸又はその塩であることを特徴とする、前記（１２）記載の試料中の総蛋白質測定方法。（１４） 第１試薬に銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有させることを特徴とする、前記（１０）〜前記（１３）のいずれか１項に記載の試料中の総蛋白質測定方法。 本発明の測定試薬及び測定方法は、ビウレット反応を利用した２試薬系の総蛋白質の測定系において、アルカリ性の第１試薬、並びに銅イオン及び銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有するｐＨ１０以下の第２試薬、という組み合わせにすることにより、総蛋白質の測定範囲を広くすることができ、そして、測定における第１試薬と第２試薬の混合時にも沈殿が生成して正誤差が生じることを防ぐことができ、再現性を向上させることができ、更に保存時にも測定試薬が劣化することがないので、試料中の総蛋白質を精度良く正確に測定することができるものである。 そして、これにより、疾患の診断等の場において、誤差を含まない、かつ正確な総蛋白質の測定値を提供することができるものである。〔１〕 測定試薬 本発明は、アルカリ性の第１試薬、並びに銅イオン及び銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有するｐＨ１０以下の第２試薬からなる、試料中の総蛋白質測定試薬である。１． 第１試薬 本発明の測定試薬の第１試薬は、アルカリ性の第１試薬である。なお、本発明の測定試薬は、アルカリ性下で銅イオンと試料中の蛋白質との錯体を形成させ発色させるビウレット反応を利用した測定試薬であり、本発明の測定試薬の第２試薬はｐＨ１０以下のものであるので、第１試薬のｐＨは、試料と第１試薬と第２試薬を混合させた最終反応液のｐＨが、ビウレット反応を起こすようなｐＨ範囲にする必要がある。通常、ビウレット反応はｐＨ１３以上で起こるものであるので、本発明の試料中の総蛋白質測定試薬の第１試薬は、ｐＨ１３以上とするのが好ましい。 本発明の測定試薬の第１試薬は、例えば、水酸化ナトリウム等の塩基性物質等を水等の水系溶媒に溶解する等により行うことができる。 ここで、塩基性物質としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カリウム等を挙げることができる。 また、本発明の測定試薬の第１試薬には、ビリルビンの影響を回避する目的のため、ビリルビンをあらかじめビリベルジンに変化させる物質を含有させても良い。２． 第２試薬 本発明の測定試薬の第２試薬は、銅イオン及び銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有するｐＨ１０以下のものである。（１） 銅イオン 本発明において銅イオンとしては、Ｃｕ２＋等を挙げることができる。本発明の測定試薬の第２試薬には、この銅イオンを含有させる。 この銅イオンを含有させることであるが、例えば、硫酸銅、塩化銅、硝酸銅、ＥＤＴＡ銅等の銅塩を含有させることにより達成できる。 この銅イオンの濃度は、第２試薬中において、４〜３００ｍＭの範囲にあることが好ましく、２０〜１５０ｍＭの範囲が特に好ましい。 また、この銅イオンの濃度は、試料、第１試薬及び第２試薬を混合した最終反応液中において、１〜８０ｍＭの範囲にあることが好ましく、５〜４０ｍＭの範囲が特に好ましい。（２） 銅イオンにキレート能力を持つ物質 本発明において、銅イオンにキレート能力を持つ物質とは、銅イオンに配位する多座配位子であって、銅イオンへの配位により銅を含んだ環状構造（キレート環）を形成する物質をいう。 本発明の測定試薬の第２試薬には、銅イオンに加えて、この銅イオンにキレート能力を持つ物質をも含有させる。 ここで、銅イオンにキレート能力を持つ物質としては、例えば、オキシカルボン酸、ポリアミノカルボン酸、若しくはエタノールアミン又はその塩等を挙げることができる。 ここで、オキシカルボン酸又はその塩としては、例えば、クエン酸、イソクエン酸、酒石酸、乳酸、若しくはリンゴ酸又はその塩等を挙げることができる。 また、ポリアミノカルボン酸又はその塩としては、例えば、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジアミノプロパン四酢酸（Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ）、ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、ジアミノプロパノール四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）、ジエチレン（トリアミン）五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン二酢酸（ＥＤＤＡ）、エチレンジアミン二プロピオン酸（ＥＤＤＰ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡ−ＯＨ）、ビス（ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン二酢酸（ＨＢＥＤ）、ヘキサメチレンジアミン四酢酸（ＨＤＴＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、ニトリロ三プロピオン酸（ＮＴＰ）、若しくはトリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）等及びその塩が挙げられる。 更に、エタノールアミンとしては、例えば、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、又はトリエタノールアミン等を挙げることができる。 なお、本発明の測定試薬の第２試薬は、総蛋白質の測定範囲を広げるために銅イオンの含有濃度を増加させた場合でも、保存中に黒色沈殿や濁りが生じないように、ｐＨ１０以下に設定している。 従って、本発明の測定試薬の第２試薬に含有させる、銅イオンにキレート能力を持つ物質としては、このｐＨ１０以下において銅イオンと容易かつ充分にキレート形成できるものが好ましい。 それは、銅イオンにキレート能力を持つ物質が、充分に銅イオンに配位することにより、銅イオンが安定化し、これにより測定の際の第１試薬と第２試薬の混合時に沈殿が生じることを防ぐことができるからである。 このような理由により、銅イオンにキレート能力を持つ物質として、クエン酸、イソクエン酸、酒石酸、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジアミノプロパン四酢酸（Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ）、ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、若しくはトリエタノールアミン又はその塩等が好適であり、特にクエン酸又はその塩が好適である。 また、銅イオンにキレート能力を持つ物質の濃度は、キレート環を形成するときの銅イオンとの最適な結合比率によって異なるので、一概には言えないものの、銅イオンにキレート能力を持つ物質を当量以上含有させるのが望ましい。 例えば、銅イオンと銅イオンにキレート能力を持つ物質の比は、通常１：１、１：２又は１：３であるので、前記（１）に記載した銅イオン濃度に対する銅イオンにキレート能力を持つ物質の濃度としては、第２試薬中において、４〜９００ｍＭの範囲にあることが好ましく、２０〜４５０ｍＭの範囲が特に好ましい。 また、この銅イオンにキレート能力を持つ物質の濃度は、試料、第１試薬及び第２試薬を混合した最終反応液中において、１〜２４０ｍＭの範囲にあることが好ましく、５〜１２０ｍＭの範囲が特に好ましい。（３） ｐＨａ）第１試薬のｐＨ 本発明の測定試薬の第１試薬は、最終反応液においてビウレット反応が起こるｐＨ範囲にする必要があり、前述の通り第２試薬のｐＨとの関係でｐＨ１３以上であることが好ましい。より具体的には、試料、第１試薬及び第２試薬を混合した最終反応液のｐＨがｐＨ１３以上となるよう、第１試薬のｐＨを、第２試薬のｐＨに応じて適宜調整すればよい。ｂ）第２試薬のｐＨ 本発明の測定試薬の第２試薬のｐＨは１０以下であり、この範囲のｐＨであれば、第２試薬中の銅イオンを長期間安定に保存することができる。また、同じ理由により、本発明の測定試薬の第２試薬は、ｐＨ３〜７の範囲にあることが好ましい なお、この第２試薬のｐＨは、銅イオンにキレート能力を持つ物質が銅イオンと容易かつ充分にキレート形成できるｐＨとすることが好ましい。（前記「（２）銅イオンにキレート能力を持つ物質」の項で述べた理由と同じ理由による。） また、前記のｐＨ範囲となるように使用する緩衝剤としては、前記のｐＨ範囲に緩衝能がある従来公知の緩衝剤を適宜使用することができる。 このような緩衝剤として第２試薬に使用できるものとしては、例えば、リン酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、イミダゾール、グリシルグリシン、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、若しくはＴＡＰＳ又はこれらの塩等の各緩衝剤を挙げることができる。ｃ）最終反応液のｐＨ 本発明の測定試薬は、アルカリ性下で銅イオンと試料中の蛋白質との錯体を形成させ発色させるビウレット反応を利用した測定試薬であり、この発色は通常ｐＨ１３以上で起こるものであるため、試料、第１試薬及び第２試薬を混合した最終反応液のｐＨが１３以上であることが必要となる。３． 銅イオンにキレート能力を持つ物質の第１試薬への含有 本発明の第１試薬には、銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有させてもよい。ここで、銅イオンにキレート能力を持つ物質は、第２試薬に含有させる物質と同じものであっても、異なるものであってもよい。 なお、アルカリ性下で銅イオンにキレート能力を持つ物質であれば、最終反応液中でも銅水酸化物が生じず安定的に測定が行えるので好適である。 ここで、アルカリ性下で銅イオンにキレート能力を持つ物質としては、例えば、酒石酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、エチレンジアミン二酢酸（ＥＤＤＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、若しくはニトリロ三プロピオン酸（ＮＴＰ）又はその塩等を挙げることができる。４． 測定試薬等の構成成分 本発明の測定試薬において、第１試薬及び／又は第２試薬には前記の成分の他に、公知の防腐剤、安定化剤、又は界面活性剤等を必要に応じて適宜使用することができる。５． 試料 本発明において、試料とは、試料中の総蛋白質濃度の測定を行おうとするもののことであり、このようなものであれば特に限定されない。 このような試料としては、例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、汗等の体液、ヒト若しくは動物の腎臓、心臓、肺、脳等の臓器等の抽出液；骨格筋、骨髄、皮膚、又は神経組織等の抽出液；毛髪等の抽出液、ヒト又は動物の糞便の抽出液又は懸濁液；細胞の抽出液等が挙げられる。〔２〕 測定方法１． 試料中の総蛋白質測定 本発明の試料中の総蛋白質測定方法は、ａ） 試料と、アルカリ性の第１試薬とを混合させる工程、ｂ） 前記試料と第１試薬との混合物に、銅イオン及び銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有するｐＨ１０以下の第２試薬を混合し反応させ、試料中の蛋白質と銅イオンの錯体を形成させる工程、及びｃ） 前記蛋白質と銅イオンの錯体を比色測定する工程よりなるものである。 なお、本発明の試料中の総蛋白質測定方法における、第１試薬及び第２試薬は前記「〔１〕測定試薬」に記載したとおりである。 本発明の試料中の総蛋白質測定方法により試料中の総蛋白質を測定する場合の一例をより具体的に説明すると、例えば、試料とアルカリ性の第１試薬とを混合し、この試料とアルカリ性の第１試薬との混合物を、前記銅イオン及び銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有するｐＨ１０以下の第２試薬と混合すると、アルカリ性下において試料中に含まれる蛋白質と銅イオンが接触し錯体が形成される。 この蛋白質と銅イオンの錯体が吸収を示す任意の波長において、分光光度計を用いて吸光度などを測定すること等により、蛋白質の量を求め、これより試料中の総蛋白質濃度の算出を行うことができる。 以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこの実施例により限定されるものではない。（本発明の測定試薬及び測定方法の正確性の確認） 本発明の試料中の総蛋白質測定試薬及び総蛋白質測定方法の測定の正確性を確かめた。１． 測定試薬の調製（１） 第１試薬の調製 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを１３．５（２０℃）に調整し、総蛋白質測定試薬の第１試薬を調製した。 水酸化ナトリウム ７５ｍＭ 酒石酸ナトリウムカリウム ４２．５ｍＭ エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩 １１ｍＭ 界面活性剤（２） 本発明・第２試薬の調製 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを５．８（２０℃）に調整し、総蛋白質測定試薬の第２試薬（本発明・第２試薬）を調製した。 硫酸銅五水和物 １００ｍＭ クエン酸一水和物 ３００ｍＭ（３） 対照・第２試薬の調製 前記（２）の本発明・第２試薬のクエン酸一水和物を含有させないこと以外は、前記（２）の試薬成分及び濃度の通りに第２試薬の調製を行った。（対照・第２試薬）２． 試料の測定 日立製作所社製７１７０Ｓ形自動分析装置にて測定を行った。生理食塩水５μＬを試料とし、これに前記１の（１）で調製した第１試薬２４０μＬを添加して、混和後３７℃で５分間反応させた後、前記１の（２）で調製した本発明・第２試薬８０μＬを添加し、３７℃で５分間反応させた。第２試薬添加直前と添加５分後の主波長５４６ｎｍ及び副波長７００ｎｍにおける吸光度を測定し、その差を求めた。この測定を連続して３００回繰り返して行った。また、第２試薬を前記１の（３）で調製した対照・第２試薬に変えて同様に測定を行った。３． 測定結果 生理食塩水を３００回連続して測定した時の測定結果を図１及び図２に示した。なお、図１は第２試薬として本発明・第２試薬を用いたときのものであり、図２は第２試薬として対照・第２試薬を用いたときのものである。 そして、これらの図において、横軸は測定回数を表し、縦軸は測定値（吸光度差）を１０，０００倍した値を示した。 図１及び図２から明らかなように、第２試薬にクエン酸一水和物を含有させていない対照・第２試薬を用いた場合は、測定値（吸光度差）に正誤差が生じていることが分かる。また、この時の最終反応液を目視で確認したところ、最終反応液中に銅水酸化物と思われる青白色の沈殿が生成していることが確認された。 これに対し、第２試薬にクエン酸一水和物を含有させた本発明・第２試薬を用いた場合は、測定値（吸光度差）に正誤差は生じておらず、測定が正確に行われていることが分かる。 ところで、前記１の（１）で調製した第１試薬には、最終反応液中における銅水酸化物〔Ｃｕ（ＯＨ）２〕の発生を防止する目的で、銅イオンにキレート能力を持つ物質である酒石酸ナトリウムカリウムを含有させている。しかしながら、対照・第２試薬を用いた場合には、最終反応液中に銅水酸化物が形成されており、これが原因となり測定値（吸光度差）に正誤差が生じてしまっている。 このことは、銅イオンを含有する第２試薬とアルカリ性でありかつ酒石酸ナトリウムカリウムを含有する第１試薬が混合された際に、瞬間的に（酒石酸イオンと銅イオンの錯体が形成されるよりも圧倒的に速く）、不溶性の銅水酸化物が形成されたであろうことを示しており、第１試薬に含有された酒石酸ナトリウムカリウムでは瞬間的な銅水酸化物の形成を防止できていないことが分かる。 これに対し、本発明の測定試薬及び測定方法では、第２試薬にクエン酸一水和物を含有させることで、銅イオンを含有する第２試薬とアルカリ性の第１試薬が混合された際に、不溶性の銅水酸化物が形成するのを防止できていることが分かる。 これらのことより、銅イオンを含有する第２試薬に銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有させた本発明の測定試薬及び測定方法は、試料中の総蛋白質を精度良く正確に測定できることが確かめられた。（試料中の総蛋白質の測定） 本発明の試料中の総蛋白質測定試薬及び総蛋白質測定方法により、試料中の総蛋白質濃度を測定した。１． 測定試薬の調製（１） 第１試薬の調製 実施例１の１の（１）で調製した第１試薬をそのまま使用した。（２） 本発明・第２試薬の調製 実施例１の１の（２）で調製した本発明・第２試薬をそのまま使用した。（３） 対照・第２試薬の調製 実施例１の１の（３）で調製した対照・第２試薬をそのまま使用した。２． 試料（１） ヒト血清〔試料１〕（２） 市販ヒト由来コントロール血清（アールトコントロール・レベル２Ｈ）〔試料２〕３． 試料中の総蛋白質の測定 前記２の２種類の試料中の総蛋白質濃度を、前記１で調製した第１試薬及び第２試薬にて測定した。 総蛋白質濃度の測定は、日立製作所社製７１７０Ｓ形自動分析装置にて行い、試料５μＬに前記１の（１）で調製した第１試薬２４０μＬを添加して、混和後３７℃で５分間反応させた後、前記１の（２）で調製した本発明・第２試薬８０μＬを添加し、３７℃で５分間反応させた。第２試薬添加直前と添加５分後の主波長５４６ｎｍ及び副波長７００ｎｍにおける吸光度を測定し、その差を求めた。この測定を連続して２０回繰り返して行った。また、第２試薬を前記１の（３）で調製した対照・第２試薬に変えて同様に測定を行った。４． 測定結果 試料を２０回連続して測定した時の測定結果を表１及び表２に示した。なお、表１は試料１を使用した時の測定結果であり、表２は試料２を使用した時の測定結果である。また、表１及び表２に示した値は、測定で得られた吸光度差を１０，０００倍した値である。 表１及び表２から明らかなように、第２試薬にクエン酸一水和物を含有させていない対照・第２試薬を用いた場合の変動係数（Ｃ．Ｖ．）は、試料１を試料とした場合は、２．４８％であり、試料２を試料とした場合は、２．３０％であった。 これに対し、第２試薬にクエン酸一水和物を含有させた本発明・第２試薬を用いた場合の変動係数は、試料１を試料とした場合で１．２２％、試料２を試料とした場合も、１．６２％であり、総蛋白質測定値（吸光度差）のばらつきを示す変動係数が明らかに小さくなっている。 このように、第２試薬にクエン酸一水和物を含有させることで、測定値（吸光度差）に正誤差が生じることを防止し、再現性を向上させることができることが分かる。 これらのことより、銅イオンを含有する第２試薬に銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有させた本発明の測定試薬及び測定方法は、試料中の総蛋白質を精度良く正確に測定できることが確かめられた。（試料中の総蛋白質測定における測定範囲の確認） 本発明の試料中の総蛋白質測定試薬及び総蛋白質測定方法において、測定範囲を確かめた。１． 測定試薬の調製（１） 第１試薬の調製 実施例１の１の（１）で調製した第１試薬をそのまま使用した。（２） 本発明・第２試薬の調製 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを２．０、３．０、４．０又は５．０（２０℃）に各々調整し、５種類の総蛋白質測定試薬の第２試薬（本発明・第２試薬）を調製した。 硫酸銅五水和物 １００ｍＭ クエン酸一水和物 １００ｍＭ（３） 対照試薬 １試薬系総蛋白質測定試薬である和光純薬工業社製、ＨＡテストワコー・総蛋白ＩＩ−ＨＡテストワコーを使用した。２． 試料の調製 生理食塩水にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）濃度１１．７ｇ／ｄＬの高濃度蛋白溶液を調製した。これを生理食塩水で１／１０、２／１０、３／１０、４／１０、５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、又は９／１０となるように希釈した９種類の試料及び上記高濃度蛋白質溶液（１０／１０）を試料とした。３． 試料中の総蛋白質の測定 前記２の試料中の蛋白質濃度を、前記１で調製した第１試薬及び４種類のｐＨの本発明・第２試薬、並びに対照試薬の各々の試薬にて測定した。 本発明の測定試薬における総蛋白質の測定は、日立製作所社製７１７０Ｓ形自動分析装置にて行い、試料５μＬに前記１の（１）で調製した第１試薬２４０μＬを添加して、混和後３７℃で５分間反応させた後、前記１の（２）で調製した本発明・第２試薬８０μＬを添加し、３７℃で５分間反応させた。第２試薬添加直前と添加５分後の主波長５４６ｎｍ及び副波長７００ｎｍにおける吸光度を測定し、その差を求めた。この測定を連続して２回繰り返して行い、その平均値を求めた。そして、蛋白質濃度が既知の試料について、前記の通り測定を行い、この測定値（吸光度差）と前記の１０種類の試料の測定値（吸光度差）を比較することにより、前記１０種類の試料中の総蛋白質濃度を求めた。 また、対照試薬における総蛋白質の測定は、日立製作所社製７１７０Ｓ形自動分析装置にて行い、試料２．５μＬに前記１の（３）の対照試薬２００μＬを添加して、混和後３７℃で１０分間反応させた。混和１０分後の主波長５４６ｎｍ及び副波長７００ｎｍにおける吸光度を測定した。この測定を連続して２回繰り返して行い、その平均値を求めた。そして、蛋白質濃度が既知の試料について、前記の通り測定を行い、この測定値（吸光度差）と前記の１０種類の試料の測定値（吸光度差）を比較することにより、前記１０種類の試料中の総蛋白質濃度を求めた。４． 測定結果 試料の測定結果を表３及び図３に示した。なお、表３において、かっこ内の数値は、希釈倍率１／１０の試料の測定値を１００％とした時の各試料の測定値の相対比率（百分率）を求めたものである。 表３及び図３から明らかなように、対照試薬を用いた場合は、試料中の総蛋白質濃度が高くなるにつれて、本来の総蛋白質濃度（理論値）よりも、得られる測定値（実測値）が低くなっていき、各希釈試料の測定値を示したグラフ（図３）では、総蛋白質濃度が高くなるほど曲がってくることが分かる。 これに対し、第２試薬にクエン酸一水和物を含有させた本発明・第２試薬を用いた場合は、いずれのｐＨの試薬においても、試料中の総蛋白質濃度が高くなっても得られる総蛋白質測定値が低下することなく、高濃度域までの測定範囲が得られていることが分かる。 例えば、対照試薬を用いた場合、希釈倍率１０／１０試料の測定値は、理論値（１／１０の試料の測定値の１０倍の値）に対して、９３．６％と６．４％低下している。 これに対し、本発明・第２試薬を用いた場合の希釈倍率１０／１０の試料の測定値は、理論値に対して、ｐＨ２で１０１．９％、ｐＨ３で９９．５％、ｐＨ４で９９．９％、ｐＨ５で９７．１％であり、ほぼ理論値通りであり、ほとんど低下は見られず、グラフ（図３）においても直線性が得られており、高濃度域までの測定範囲が得られていることが分かる。 これらのことより、銅イオンを含有する第２試薬に銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有させた本発明の測定試薬及び測定方法は、第２試薬に高い濃度の銅イオンを含有させることができるため、試料中の総蛋白質の測定範囲を広くすることができることが確かめられた。（試料中の総蛋白質測定における沈殿生成防止効果の確認） 本発明の試料中の総蛋白質測定試薬及び総蛋白質測定方法において、第２試薬に銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有させることによる、第１試薬と第２試薬混合時の沈殿生成防止効果を確かめた。１． 測定試薬の調製（１） 第１試薬の調製 実施例１の１の（１）で調製した第１試薬をそのまま使用した。（２） 本発明・第２試薬Ａの調製 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを５．９（２０℃）に調整し、本発明・第２試薬Ａを調製した。 硫酸銅五水和物 １００ｍＭ クエン酸一水和物 ２００ｍＭ（３） 本発明・第２試薬Ｂの調製 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを９．４（２０℃）に調整し、本発明・第２試薬Ｂを調製した。 硫酸銅五水和物 １００ｍＭ 酒石酸ナトリウムカリウム ２００ｍＭ（４） 本発明・第２試薬Ｃの調製 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを８．３（２０℃）に調整し、本発明・第２試薬Ｃを調製した。 硫酸銅五水和物 １００ｍＭ エチレンジアミン四酢酸二カリウム塩（ＥＤＴＡ） ２００ｍＭ（５） 本発明・第２試薬Ｄの調製 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを６．０（２０℃）に調整し、本発明・第２試薬Ｄを調製した。 硫酸銅五水和物 １００ｍＭ トリエタノールアミン ２００ｍＭ（６） 本発明・第２試薬Ｅの調製 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを９．４（２０℃）に調整し、本発明・第２試薬Ｅを調製した。 硫酸銅五水和物 ５０ｍＭ ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ） ５０ｍＭ（７） 本発明・第２試薬Ｆの調製 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを９．０（２０℃）に調整し、本発明・第２試薬Ｆを調製した。 硫酸銅五水和物 ５０ｍＭ ジアミノプロパン四酢酸（Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ） ５０ｍＭ（８） 本発明・第２試薬Ｇの調製 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを３．６（２０℃）に調整し、本発明・第２試薬Ｇを調製した。 硫酸銅五水和物 ５０ｍＭ ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＣｙＤＴＡ） ５０ｍＭ（９） 本発明・第２試薬Ｈの調製 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを４．７（２０℃）に調整し、本発明・第２試薬Ｈを調製した。 硫酸銅五水和物 ５０ｍＭ グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ） ５０ｍＭ（１０） 本発明・第２試薬Ｉの調製 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを６．９（２０℃）に調整し、本発明・第２試薬Ｉを調製した。 硫酸銅五水和物 ５０ｍＭ ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ） ５０ｍＭ（１１） 対照・第２試薬の調製 前記（２）の本発明・第２試薬Ａのクエン酸一水和物を含有させないこと以外は、前記（２）の試薬成分及び濃度の通りに第２試薬の調製を行った。（対照・第２試薬）２． 実験方法 試験管に前記１の（１）で調製した第１試薬３６００μＬを分注し、ここに前記１の（２）で調製した本発明・第２試薬Ａ１２００μＬを、急激な混合が起こらないように静かに滴下した。また、第２試薬を前記１の（３）〜（１０）で調製した本発明・第２試薬Ｂ〜Ｉ及び前記１の（１１）で調製した対照・第２試薬にそれぞれ変えて同様に実験を行い、試験管内の変化をみた。３． 沈殿生成の確認 前記２の第１試薬と第２試薬の混合液中に沈殿が生成しているか否かを目視で確認した。また、沈殿の生成状況を表４に示した。 表４から明らかなように、第２試薬に銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有させていない対照・第２試薬を用いた場合は、第１試薬に第２試薬を滴下した後に、試験管内の第１試薬と第２試薬の混合液を目視で確認したところ、混合液中に銅水酸化物と思われる青白色の沈殿が生成していることが確認された。 これに対し、第２試薬に銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有させた本発明・第２試薬を用いた場合は、いずれにおいても試験管内の第１試薬と第２試薬の混合液中に沈殿が生成していないことが確認された。 ここで、前記１の（１）で調製した第１試薬には、最終反応液中における銅水酸化物〔Ｃｕ（ＯＨ）２〕の発生を防止する目的で、銅イオンにキレート能力を持つ物質である酒石酸ナトリウムカリウムを含有させている。しかしながら、対照・第２試薬を用いた場合には、第１試薬と第２試薬の混合液中に銅水酸化物が生成してしまっている。 このことから、銅イオンを含有する第２試薬とアルカリ性でありかつ酒石酸ナトリウムカリウムを含有する第１試薬が混合された際に、瞬間的に（酒石酸イオンと銅イオンの錯体が形成されるよりも圧倒的に速く）、不溶性の銅水酸化物が形成されたであろうことを示しており、第１試薬に含有された銅イオンにキレート能力を持つ物質（酒石酸ナトリウムカリウム）では瞬間的な銅水酸化物の形成を防止できていないことが分かる。 これに対し、本発明の測定試薬及び測定方法では、第２試薬に銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有させることで、銅イオンを含有する第２試薬とアルカリ性の第１試薬が混合された際に、不溶性の銅水酸化物が形成するのを防止できていることが分かる。 これらのことより、銅イオンを含有する第２試薬に銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有させた本発明の測定試薬及び測定方法は、測定における第１試薬と第２試薬の混合時に沈殿が生成して正誤差が生じることを防ぐことができ、試料中の総蛋白質を精度良く正確に測定できることが確かめられた。本発明の総蛋白質測定試薬及び測定方法で、測定の正確性を確認した図である。対照の総蛋白質測定試薬及び測定方法で、測定の正確性を確認した図である。本発明及び対照の総蛋白質測定試薬及び測定方法で、測定範囲を確認した図である。 アルカリ性の第１試薬、並びに銅イオン及び銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有するｐＨ１０以下の第２試薬からなる、試料中の総蛋白質測定試薬。 第２試薬のｐＨが３〜７である、請求項１記載の試料中の総蛋白質測定試薬。 銅イオンにキレート能力を持つ物質が、オキシカルボン酸、ポリアミノカルボン酸若しくはエタノールアミン又はその塩よりなる群から選択される物質であることを特徴とする、請求項１又は２記載の試料中の総蛋白質測定試薬。 オキシカルボン酸又はその塩が、クエン酸又はその塩であることを特徴とする、請求項３記載の試料中の総蛋白質測定試薬。 第１試薬に銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有させることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の試料中の総蛋白質測定試薬。 銅イオン及び銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有し、ｐＨ１０以下である試料中の総蛋白質測定試薬の第２試薬。 ｐＨが３〜７である、請求項６記載の試料中の総蛋白質測定試薬の第２試薬。 銅イオンにキレート能力を持つ物質が、オキシカルボン酸、ポリアミノカルボン酸若しくはエタノールアミン又はその塩よりなる群から選択される物質であることを特徴とする、請求項６又は７記載の試料中の総蛋白質測定試薬の第２試薬。 オキシカルボン酸又はその塩が、クエン酸又はその塩であることを特徴とする、請求項８記載の試料中の総蛋白質測定試薬の第２試薬。 試料中の総蛋白質を測定する方法であって、ａ）該試料と、アルカリ性の第１試薬とを混合させる工程、ｂ）前記試料と第１試薬との混合物に、銅イオン及び銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有するｐＨ１０以下の第２試薬を混合し反応させ、試料中の蛋白質と銅イオンの錯体を形成させる工程、及びｃ）前記蛋白質と銅イオンの錯体を比色測定する工程よりなる、試料中の総蛋白質測定方法。 第２試薬のｐＨが３〜７である、請求項１０記載の試料中の総蛋白質測定方法。 銅イオンにキレート能力を持つ物質が、オキシカルボン酸、ポリアミノカルボン酸若しくはエタノールアミン又はその塩よりなる群から選択される物質であることを特徴とする、請求項１０又は１１記載の試料中の総蛋白質測定方法。 オキシカルボン酸又はその塩が、クエン酸又はその塩であることを特徴とする、請求項１２記載の試料中の総蛋白質測定方法。 第１試薬に銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有させることを特徴とする、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の試料中の総蛋白質測定方法。