生命科学関連特許情報
| タイトル： | 特許公報(B2)_キト−オリゴマーを含む医薬組成物 |
| 出願番号： | 2003530312 |
| 年次： | 2011 |
| IPC分類： | A61K 31/722,A61K 31/715,A61P 19/02,A61P 29/00 |
特許情報キャッシュ
エイナーソン，ジョン，エム ジスラソン，ヨハネス ピーター，マーティン バーケ，スヴェン JP 4613008 特許公報(B2) 20101022 2003530312 20020926 キト−オリゴマーを含む医薬組成物 ジェニス イーエイチエフ． 505432555 Ｇｅｎｉｓ ｅｈｆ． 野河 信太郎 100065248 エイナーソン，ジョン，エム ジスラソン，ヨハネス ピーター，マーティン バーケ，スヴェン IS 6085 20010926 20110112 A61K 31/722 20060101AFI20101216BHJP A61K 31/715 20060101ALI20101216BHJP A61P 19/02 20060101ALI20101216BHJP A61P 29/00 20060101ALI20101216BHJP JPA61K31/722A61K31/715A61P19/02A61P29/00 101 A61K31/33-31/80 A61P1/00-43/00 JSTPlus(JDream2) JMEDPlus(JDream2) JST7580(JDream2) PubMed 欧州特許出願公開第０１１２７５７４（ＥＰ，Ａ１） 国際公開第９７／０４２９７５（ＷＯ，Ａ１） 国際公開第０１／０６８７１４（ＷＯ，Ａ１） 特開昭５３−０４７４７９（ＪＰ，Ａ） 特開昭６３−１５６７２６（ＪＰ，Ａ） 国際公開第９８／０２５６３１（ＷＯ，Ａ１） 9 IS2002000016 20020926 WO2003026677 20030403 2005507891 20050324 17 20050920 澤田 浩平 本発明は、医薬分野、特にリウマチ関節炎や変形性関節炎のような関節障害の治療のための発明である。 キチンとキトサンは、一般に甲殻類の殻の廃棄物から得られるバイオポリマーであるが、特定の菌から得ることもできる。キトサンはキチンから化学的脱アセチル化によって製造することができる。これは、一般にキチン中のＮ−アセチル結合を濃縮アルカリ（４０〜５０％のＮａＯＨまたはＫＯＨ）で加水分解することにより行われる。 定義上、キトサンは一般にＤ-グルコサミン（ＧｌｃＮ）とＮ-アセチル-Ｄ-グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃまたはＮＡＧ）のコポリマーとして記載されており、遊離アミン基の等電点であるｐＨ６.２より上では水に不溶であるが、ｐＨ６.２より下では溶解する（スキーム１および２参照）。キトサン中、モノマー単位の６５〜１００％はＤ-グルコサミンであり、このものは通常、６５〜１００％の脱アセチル化キチンとして記載されている。キトサンの化学的および生物学的性質は、脱アセチル化度（ＤＤＡ）および重合度（ＤＰ）、すなわちポリマーの鎖長により直接的に影響を受ける。 ｐＨ６.２より下の溶液中で、Ｄ-グルコサミン残基のアミン基がプロトン化されているとき、キトサンは正電荷をもつポリマーである。アミンであるキトサンは弱塩基であり、カルボン酸や無機酸のような酸と塩を形成することができる。これら塩の大半は水溶性である。 その本来の形態では、キチンは水に不溶である。しかしながら、アルカリ処理を通して部分的に脱アセチル化することにより、それを水溶性にすることが可能である［１］。ＤＤＡが３５〜５０％の部分脱アセチル化キチンは、pＨの広い範囲で水に溶解する。この形態の水溶性キチンは、キチン変換酵素にとって優れた基質であることを示している[２,３]。 さらに、不溶性キチンがキチナーゼで非常にゆっくり加水分解されるので、水溶性キチンの生成はキチナーゼを用いるキト−オリゴマーの高収率を維持するために必要な工程であることを示している［１］。 スキーム１：完全アセチル化キチン（ポリＮ-アセチル−Ｄ−グルコサミン）の構造 スキーム２：完全脱アセチル化キトサン（ポリＤ-グルコサミン、低いｐＨにおけるプロトン化フォーム）の構造 モノマーに連結するベータ−（１,４）−結合の加水分解により、高分子量のポリサッカリドから製造されるキト−オリゴマー（ＣＯｓ）ならびに、低分子量のキチンおよびキトサンは、より短いセグメントである。ここで、キト−オリゴマーとは、短〜中の長さのポリマー、好ましくは２〜５０の範囲の重合度（ＤＰ）をもち、約３６０〜約１０,０００Ｄａの分子量に相当するものを言う。水溶性キチン（ＤＤＡ３５〜５０％）から製造されるＣＯｓは、それらの水溶性を維持している。ＣＯｓは、塩酸のような強酸を用いて、高温でベータ-（１,４）-結合の加水分解に触媒作用を及ぼして化学的に、あるいは酵素的加水分解により製造される［４,５］。酵素的加水分解は、コントロールがより容易であり、条件が非常に緩和であり、物質の化学的修飾をもたらす副反応の危険性がより低いため好ましい。 関節炎は、関節部の炎症ための一般的な用語であり、時にはすべての関節障害を含むのに用いられる。変形性関節炎は、関節の表面に対するダメージと、基礎をなす骨に異常な反応が見られる、関節疾患の最も一般的な形態である。骨関節症、関節症および変形性関節症といったようなその他の用語もこの疾患を示すのに用いられる。この疾患は、主に膝、臀部および手（最も一般的）に、ならびに足、首および背中に影響を及ぼす。リウマチ性関節炎は、関節部の一般的な炎症性疾患であり、関節部の内面膜（滑膜）の炎症を引き起こす。これは、通常の骨関節症よりひどい腫れと他の徴候を生じ、関節部に深刻なダメージを引き起こし得る。キト-オリゴサッカライドの生物学的作用キチンおよびキトサンの生物学的作用は、文献にて数多く立証されている。生物学的作用の研究は、脱アセチル化度（ＤＤＡ）と同様に、重合度（ＤＰ）の重要性を明瞭に証明している［６］。植物中では、ＤＰ５〜７オリゴマーは、ＤＰ１〜４よりも活性である［７］。 その理由は、キト−オリゴマーを結合させるいわゆるキチナーゼ様のプロテイン（ＣＬＰｓ）の能力と関係している。これらのプロテインは、高い配列相同性およびファミリー１８キチナーゼとの構造的関連性を共有している［８］。それらの触媒領域における単独点突然変異のために、ＣＬＰｓは触媒作用が欠落しているが、通常５〜７キト−オリゴサッカライド単位を含むオリゴサッカライドの結合能力を維持している。 Ｎ-アセチル-グルコサミン、キト−オリゴサッカライドおよびヒアルロナン： グルコサミン（ＧＮまたはＧｌｃＮ）は、糖分子における炭素２上のＯＨ基をＮＨ2で置換して修飾されたグルコースである。動物の細胞中で、グルコサミンは、グルコサミン６−ホスフェート（ＧＮ-６-Ｐ）およびＮ−アセチルグルコサミン（ＮＡＧまたはＧｌｃＮＡｃ）として、２つの形態のみが見出されている。 アミノ糖ＧＮ-６-Ｐは、グルタミンとフルクトース-６-ホスフェート（Ｆ−６−Ｐ）から合成される。この反応は、グルコサミンシンターゼにより触媒作用を受け、これがアミノ糖生合成における律速工程である。ＧＮ-６-Ｐは、あらゆるヘキソサミンおよびヘキソサミン誘導体への前駆体である。ＧＮ-６-Ｐは、引き続き、アセチル補酵素Ａでアセチル化されてＮ-アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）になり得る。 次いで、ＮＡＧはＮ-アセチルガラクトサミンまたはＮ-アセチルマンノサミンに変換され得る。これら３つのアミノ糖は、プロテインのグリコシル化ならびに糖脂質、グリコサミノグリカン（ＣＡＧ）、ヒアルロナンおよびプロテオグリカンのためのブロック形成に重要である。多くのプロテオグリカンのバックボーンであるヒアルロナン（ＨＡ）は、ＮＡＧとグルクロン酸（ＧｌｃＡ）のジサッカライドくり返し単位（２５,０００糖単位までの）からなるポリサッカライドである。 ＨＡはＧＡＧの最も初期の進化形態であると考えられている。 ＨＡは、単に軟骨、滑膜液、眼のガラス体液や脊椎動物の皮膚における重要なポリサッカライドであるだけでなく、組織編成、形態形成、ガン転移、創傷治療および炎症においても重要な役割を果たし得る［９］。 それは創傷修復の間に大量に生成され、潤滑液として作用する滑液（滑流流体）の不可欠な構成物質でもある［１０］。ＮＡＧは、中皮細胞および繊維芽細胞によるヒアルロナンの合成を用量依存的に増進させる［１１］。 ＨＡは、プラズマ膜組織中に埋め込まれたＨＡシンターゼ（ＨＡＳ）という酵素錯体により細胞から分泌される［９］。これらの酵素は、キチンシンターゼまたはセルロースシンターゼから進化したと考えられている［９］。マウスＨＡシンターゼ（ＨＡＳ１）は、ＵＤＰ-ＧｌｃＡおよびＵＤＰ-ＮＡＧと共に供給されるとき、インビトロでＨＡを合成することができる［１２］。ＨＡＳ１がＵＤＰ-ＮＡＧのみと培養されると、それはキト−オリゴサッカライド（ＣＯｓ）を合成する［１２］。生体内真核ＨＡシンターゼの類似作用の立証は、哺乳動物におけるＣＯｓのための新規な機能を示唆している［９］。 ＣＯｓは、脊椎動物（爪蛙、ゼブラフィッシュやネズミ）の発達の間に生体内で生成される。そこで、キチナーゼ様のＤＧ４２/ＨＡＳサブファミリーは、細胞分化の間にＣＯｓとＨＡの両方を合成し、ＣＯｓは後期原腸胚中での通常の前後軸形成にとってきわめて重要であることが示されてきた［９,１２〜１６］、［８］により再検討。 最近の研究は、グルコサミンの投与による関節炎の治療方法を提案している。これらの研究は、グルコサミンの投与が軟骨代謝を正常化する傾向があり、劣化を防ぎ、プロテオグリカンの合成を促進し、関節機能の修復をもたらすことを示している。 グルコサミンを用いることによる治療効果は、多数の動物およびヒトでの研究で立証されている。 米国特許第６，１１７，８５１号［１７］は、（ポリ）−Ｎ−アセチルグルコサミン（ポリ-ＮＡＧ）、すなわちキチンが関節炎の治療および／またはそれらの症状の緩解のために用いられ得ることを教示している。 しかしながら、内臓中で不溶性繊維のように作用するキチンは、消化・吸収されにくいようである。また、内臓環境では溶解性が乏しいために、キチンは最近発見された酸性の哺乳類キチナーゼ（ＡＭＣａｓｅ）［１８］、または吸収可能な低分子キチンフラグメントを生成する腸内細菌によって、効果的に加水分解されにくいようである。 しかしながら、部分的に脱アセチル化されたキチンは、いずれのｐＨでも水溶性であり、ＡＭＣａｓｅまたは腸内細菌のための基質としてすぐに利用できる。免疫応答および炎症反応に対するキト−オリゴマーの作用−軟骨細胞およびマクロファージ： 哺乳動物類において、キチンおよびキトサンは免疫賦活作用を有することが示唆されている［１９〜２２］。 また、キチンおよびキトサンは、創傷治療や人工皮膚代替物において数年間にわたり研究されてきた［１９〜２２］。これらの研究で、キチンおよびキトサンは、活性マクロファージによる酸化窒素（ＮＯ）の生成に対して顕著な阻害効果を示している。 ヘキサ−Ｎ−アセチルキトヘキサオース （ＧｌｃＮＡｃ）6 およびペンタ−Ｎ−アセチルキトペンタオース（ＧｌｓＮＡC）5も、ＮＯの生成を阻害したが、その効能は低い。 これらの結果は、創傷治療に対するキチン物質の効能が活性化されたマクロファージによるＮＯ生成の阻害に少なくとも部分的には関係していることを示している［２３］。 また、グルコサミンおよびＮ-アセチルグルコサミンの両方が、正常なヒトの関節軟骨細胞におけるＮＯ生成を阻害し、Ｎ-アセチルグルコサミンが炎症プロセスの阻害のための新しいメカニズムを有することが示されている［２４］。 ヒト軟骨グリコプロテイン-３９（ＨＣgｐ-３９）とも呼ばれているキチナーゼ様のプロテインＹＫＬ-４０は、ファミリー１８キチナーゼの一種である［２５］。ＹＫＬ-４０は、軟骨細胞、滑膜細胞およびマクロファージにより分泌される［２６］。ＨＣgｐ-３９（ＹＫＬ-４０）は、高齢者および若年の関節炎患者において誘発されると思われる［２８］。ＹＫＬ-４０は、リウマチ性関節炎（ＲＡ）において自己抗原としての役割を有することが報告されており［２９−３１］、非病変組織においてではなく、病人の変形性関節症軟骨および骨増殖体において発現している。 参照文献 発明の要約 われわれは、キト−オリゴマー（２〜５０ｍｅｒｓ）を含む組成物が、関節炎のような関節障害の症状を和らげるのに著しく良好な結果をもたらすことを見出した。結果は、特にオリゴマーの投与が炎症を実質的に抑えるので、この点においてキト−オリゴマーがモノマーグルコサミンよりも驚くほど有効であると思われることを示している。 われわれはキチンのリガンド、すなわちキト−オリゴサッカライド（ＣＯｓ）がＹＫＬ-４０または同様のキチナーゼ様プロテインに結合することによって、それらの発現を低減させ、そして／またはそれらのエピトープをマスクするか、または変化させることにより自己抗原活性を低減させることを示唆する。 われわれは、キト−オリゴマーを３〜４週間投与した後、リウマチ性関節炎を患う被験者における抗炎症効果を観察した。 これらの抗炎症効果は、ＹＫＬ-４０を介して軟骨細胞、マクロファージおよびおそらく骨芽細胞に影響を与え得るだろう。 予備的な結果は、キト−オリゴマーと共に培養したとき、インビトロでヒト軟骨細胞成長の誘発を示している（未公開データ）。 ここに提示の仮説によると、本発明のオリゴマー組成物は、キチナーゼ様プロテインをブロックする有益なオリゴマー基質を提供するとともに、オリゴマーが減成するにつれて、モノマーＮＡＧおよびＧｌｃＮの公知の有益な効果を与える。 さらに、ここで、そのような水溶性ポリマーが酸性キチナーゼおよび腸内細菌叢によって与えられるキトリティック酵素による分解をいくらか許容するように、部分的に脱アセチル化されたポリマー水溶性キチンは、そのままで水溶性キト−オリゴマーおよびＮＡＧおよびグルコサミンモノマーを供給して、同様に抗炎症効果および関節障害に対する治療効果を与えるであろうと仮定される。 第一の観点では、本発明は、少なくとも５０％のキト−オリゴマーが約ＤＰ２〜５０の範囲の鎖長を有し、オリゴマーの脱アセチル化度が約０〜７０％の範囲にあるＮ-アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）およびグルコサミンのオリゴマーを含む組成物を提供する。 さらなる観点では、それを必要とする対象者の関節障害治療のために、キチンの部分脱アセチル化および部分解重合によって得られる医薬組成物が提供される。 さらなる本発明の観点は、関節障害治療用医薬品の製造に用いるキト−オリゴマーの使用を提供する。ここで、キト−オリゴマーはＮ-アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）とグルコサミンのオリゴマーを含み、キト−オリゴマーの鎖長はおよそ１〜５０の範囲にあり、少なくとも６０重量％のキト−オリゴマーは２以上の鎖長を有し、グルコサミンの脱アセチル化度は約０〜５０％の範囲にある。 もう一つの観点では、本発明はヒトにおける炎症作用の治療用医薬品を製造するためのキト−オリゴマーの使用を提供する。 図面の説明 図１：サンプル１のバイオゲルＰ４ ＧＰＣ分析。ＤＰ（ポリマー鎖長）および各鎖長のホモログが表１に挙げられている。 図２：全サンプルのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより測定されたサンプル１およびサンプル２中のキト−オリゴマーホモログ分布。分析からの相対シグナルは、ＤＰ２〜ＤＰ１０からの全ホモログに対するシグナルを加え、１００％に調節することにより計算される。各ホモログのシグナルは相対シグナル（％）で表される。 図３：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより判断された、サンプル１およびサンプル２からのキト−オリゴマーの合わされたＤＰ分布。図２に示されたＤＰ２〜ＤＰ１０からの各ＤＰに対するホモログを加え、合わせた相対シグナル（％）で表す。 詳細な説明 本発明の組成物は、少なくとも５０％のキト−オリゴマーが約２〜５０の範囲の鎖長を有し、オリゴマーの脱アセチル化度が約０〜７０％（ＦA＝０．３−１．０）の範囲にある、Ｎ-アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）およびグルコサミンのオリゴマーを含む。 ここで用いられるキト−オリゴマーという用語は、Ｎ-アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）およびグルコサミンの一方、または両方のオリゴマーおよびポリマー、すなわち最短鎖長が２（二量体）であるオリゴマー鎖を意味する。この説明と実施例に記載の通り、本組成物はとりわけ医薬品としての使用のために有用である。 ホモログという用語は、異なる配列を有していてもよい、同じモノマー比を有する同じ長さのオリゴマー鎖を規定する。すなわち、ホモログＡ３Ｄ２は例えばオリゴマー配列Ａ-Ａ-Ａ-Ｄ-ＤおよびＡ-Ａ-Ｄ-Ａ-Ｄ（ＡおよびＤは、それぞれＮ-アセチルグルコサミンおよびグルコサミンを意味する）を含み得る。 好ましくは、キト-オリゴマーの脱アセチル化度は、約０〜５０％の範囲にあり、より好ましくは約３０〜５０％、さらに好ましくは約４０％または約５０％を含み、約４０〜５０％のような、約３５〜５０％の範囲にある。脱アセチル化度ＤＤＡは、アセチル化因子ＦAとして表すこともでき、ここで例えばＤＤＡ３０％はＦA=０.７に相当する。 好ましくは、キト-オリゴマーの少なくとも約６０％が、より好ましくは少なくとも約７５％が、さらに好ましくは少なくとも約８５％が約２〜５０の範囲の鎖長を有する。 本発明の組成物は、海老の殻のようなキチン質の原料から好適に得ることができる。キチンは、約７０〜９０℃、例えば約７０℃、約８０℃、または約９０℃のような、約７０〜９５℃の範囲を含む、約７０〜１００℃の範囲にある温度で、実質的に乾燥したキチンを塩基の濃縮溶液（例えば、４０〜６０％のＮａＯＨまたはＫＯＨ）中、溶解することにより、強塩基で有利に脱アセチル化され得る。 反応時間およびキチンの濃度は、所望の脱アセチル化度によって変動してよく、個々の処理装置および個々の所望の脱アセチル化度にも、容易に最適化できる。この反応は、得られたキチン／キトサンを冷水で洗浄することにより中断され、得られた溶解性キチンの溶液は、キト−オリゴマーを得るために加水分解に付してもよく、あるいはその物質を次の処理または保存のために適当な乾燥手段によって乾燥してもよい。 上記の通り、キト−オリゴマーを得るには、キチン／キトサンの酵素加水分解が好ましいが、解重合のための適当な鉱酸（例えば、塩酸あるいは亜硝酸）の使用も本発明に包まれる。いくつかのキチナーゼ活性酵素、例えばＳｉｇｍａ−ＡｌＤｒｉｃｈから得られるキチナーゼ（ＥＣＮｏ．３.２.１.１４）が入手可能であり、この点において採用することができる。また、リゾチーム（ＥＣＮｏ．３.２.１.１７）もキチナーゼ作用のあることが見出されている（例えば、米国特許第５,２６２,３１０号参照）。 酵素培養条件（酵素／基質比、温度、ｐＨ、反応時間）は、採用される酵素の個々の活性および至適反応条件により変動し得る。実施例２で行われているように（サンプル１およびサンプル２参照；製造）、小〜中サイズのオリゴマーの所望の比を得るように、条件を最適化することができる。 より長いオリゴマーおよびポリマー（ＤＰ３０以上）は、分離用クロマトグラフィーによって、あるいは高いｐＨ（約ｐＨ９以上）での沈殿によって、所望の短および中の長さを有するオリゴマーから任意に分離することができる。 キト−オリゴマー組成物は、カプセル充填あるいは摂取用の水溶液中に溶解または懸濁できる粉末、フレークまたは繊維性材料を含む実質的に乾燥した形態で都合よく供給され得る。 そのような組成物は、実質的に前記のオリゴマー、すなわち約８０〜１００重量％の範囲のキト−オリゴマーのみからなっていてもよい。有用な具体例では、該組成物は約５０〜９０重量％のように、約２５〜９５重量％を含む２０〜１００重量％の範囲で該オリゴマーを含む。製造方法によっては、組成物は、オリゴマー塩例えばＮａＣｌまたはＫＣl以外の塩を相当量含み得るが、そのような余分な塩の含量は最小限に維持されるのが好ましい。 原料ポリマーの加水分解の際に適用される方法および条件によっては、全サッカライドの約５０重量％未満のような、約０〜６０重量％であるような量で、若干量のグルコサミンおよびＮＡＧのモノマーが本発明の組成物中に存在する。しかし、該モノマーは全サッカライドの２０重量％未満を含む約２５重量％未満のような、約４０重量％未満であるのが好ましい。 しかしながら、われわれの試験結果は、本発明の組成物中に存在する、ある量のモノマー、特にＮＡＧは好ましい相乗効果を有することを示している。 さらに、この組成物は、医薬的に受け入れられる賦形剤、希釈剤、着香剤、栄養剤あるいは着色剤を含み得る。 より短いオリゴマーは、本発明の組成物の活性にとって極めて重要であると思われる。有用な具体例では、組成物の少なくとも約１０重量％のオリゴマーが２〜１２の鎖長を有し、より好ましくは少なくとも２５重量％を含んで少なくとも１５重量％、さらに好ましくはオリゴマーの少なくとも５０重量％が２〜１２の鎖長を有する。 ある具体例では、オリゴマーの約５０重量％のような約１５〜７５重量％が２〜１２の鎖長を有し、オリゴマーの約１５〜７５重量％が２〜９の鎖長を有することが好ましい。ある具体例では、オリゴマーの少なくとも７０％または少なくとも約８０％を含んで、少なくとも６０重量％のような、少なくとも５０重量％が２〜１５の範囲の鎖長を有する。 本発明のもう一つの観点においては、本発明のオリゴマー組成物を含む医薬組成物が、ここに記載のように供給される。 医薬組成物は、例えばグラス１杯の水に容易に溶ける乾燥形態のような、経口投与に適した形態にあるのが好ましい。 そのような形態は、粉末、顆粒、フレーク、繊維状やペースト形態を含む。 しかしながら、本組生物はピルまたはカプセル中に包まれることも可能である。 その他の有用な具体例では、本発明の組成物は、筋肉内、皮下または静脈内投与のような、全身投与に適した形態にある。そのような好適な形態は、標準的な医薬の実務に従って、医薬的に受け入れられる担体または賦形剤と共に溶液の形態である。この溶液の形態は、無菌で、そのｐＨは適切に調整され、緩衝されている。静脈内に用いるためには、溶質の全濃度は製剤を等張化するために調節されるべきである。 添付の実施例に示されるように、医薬組成物は、それを必要とする対象者のリウマチ性関節障害の治療に有用であることが見出されており、とりわけ変形性関節炎およびリウマチ性関節炎を含む群から選ばれる関節障害の治療に有用であることが見出されている。 このことから、治療は、組成物が投与される対象者において関節障害の症状を緩和することを含む。 さらなる観点において、本発明は、それを必要とする対象者の関節障害治療のための医薬組成物を提供する。該組成物は、キチンの部分脱アセチル化および部分解重合により得られる。そのような組成物は、上記のようなものが好ましい。 さらなる観点では、脱アセチル化度が約３５〜約５０％の範囲にある水溶性の部分脱アセチル化キチンを含む組成物が、抗炎症治療および関節障害の治療に提供される。ポリマーの水溶性は、腸内細菌叢により生成されるキトリテック酵素によるポリマーの分解をいくらか許容する。したがって、組成物が摂取されると、上記の加水分解されたキト−オリゴマーと同程度までではあるが、その場で水溶性のキト−オリゴマーおよびグルコサミンモノマーを提供する。さらなる観点によれば、本発明は、キト−オリゴマーの鎖長が約２〜５０の範囲にあり、オリゴマーの脱アセチル化度が約３０〜５０％の範囲を含む約０〜７０％（ＦA=０.３-１０）の範囲、好ましくは約０〜５０％の範囲にある、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）およびグルコサミンのオリゴマーの治療的に活性な量を、それを必要とする対象者に投与することからなる、関節障害および炎症性障害の治療方法を提供する。好ましい具体例では、この方法は、ここに記載のような組成物の投与を含む。 本発明の方法で有利に治療できる関節障害は、変形性関節炎、リウマチ性関節炎、炎症性障害、およびその他のリウマチ性症状を含む。 さらなる観点によれば、本発明は、変形性関節炎およびリウマチ性関節炎のような関節障害の治療用医薬の製造のための、上記のようなキト−オリゴマーの使用を提供する。 その他の観点によれば、ヒトにおける炎症性作用に対する治療のための上記組成物の使用、ならびに骨および肉組織における炎症性作用に対する治療用薬剤の製造用組成物の使用を提供する。実施例１ キト−オリゴマーの特徴づけ：分析方法１Ａ：水分および灰分含量の測定 噴霧乾燥したキト−オリゴマーのサンプル４〜５ｇを、１０５℃で３時間培養の前後に、重量測定分析により水分含量のために分析した。８００℃で３時間の完全燃焼により灰分含量を測定し、乾燥重量に基づく無機残渣の重量％として計算した。１Ｂ：直接摘定による脱アセチル化度の測定 キト−オリゴマー（５００ｍｇ、水分および灰分修正済）を、密封エルレンマイヤーフラスコ中で１２５ｍｌの０.０６０Ｎ ＨＣｌと混合し、回転式振とう機（１５０ｒｐｍ）中、２２℃で一夜溶解した。続いて、１２５ｍｌの蒸留水を加え、溶液をさらに少なくとも１５分間振とうした。５０.０gの溶液をビーカーに移し、１．００ｍｌ／分（ＨＰＬＣポンプ）の流速で、０.５００Ｎ ＮａＯＨ溶液で滴定した。ｐＨをｐＨ１.８〜９の間でモニターし、ｐＨ３.７５〜ＰＨ８.０の滴定曲線の変曲点間で消費されたＮａＯＨの量に基づいて、等式ＤＤＡ=ＶＯl（ｍｌ）ＮａＯＨ＊１６１１６*０.０５００/１００ｍｇキトサンを用いてＤＤＡを計算した。各サンプルをそれぞれ３回滴定した。１Ｃ：平均重合度（ＤＰ）測定のためのＤＮＳ検定 ０．５０％のオリゴマー溶液の平均重合度（ＤＰ値）を、３,５-ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）を試薬として、グルコースをスタンダードとして用いて、糖還元末端基分析により測定した。この方法は、ミラーにより最初に記載された［３４］。キトサンオリゴマー溶液（５.００ｍｇ/ｍｌ 、０.５％酢酸中で水分と灰分を修正）１.００ｍｌの量を、ＤＮＳ試薬２.００ｍｌと混合し、８分間沸騰させ、冷却し、２０００×ｇで３分間遠心分離した。上清の光学密度を５４０ｎｍで分光光度計で測定し、グルコース１００ｍｇ/ｍｌ（５.５５ｍＭ）の吸光度を基準として用いて、平均ＤＰ値を計算した。水（２.００ｍｌのＤＮＳ溶液中１.００ｍｌ）を、５４０ｎｍでブランクとして供給した。ＤＰ計算に用いられる平均分子量は２００Ｄａであった。各サンプルそれぞれ２回分析した。１Ｄ：バイオゲルＰ４ゲル浸透クロマトグラフィー分析（ＧＰＣ） 高級のバイオゲルＰ４を備えた２つの連結カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（ＢｉｏＲａＤ、ミュンヘン、ドイツ）を、０．０５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液を用い、流動相として０．２３Ｍ酢酸でｐＨ４．２に調整した。流速は２７.７ｍｌ/時間であった。島津製作所製ＲＩＤ６Ａ屈折インデックス検出器を用いて検出を行った。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析に先立って、フラクションを集め、適当に組み合わせ、凍結乾燥した。１Ｅ：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ 質量分析 サンプルの調製： Ｈ2Ｏ（lμＬ）中のサンプルの溶液を標的上に置き、ＭｅＯＨ中のＴＨＡＰまたはＤＨＢの５％溶液１μＬと混合した。室温で乾燥後、ＭｅＯＨ１μＬ中にサンプルを再度溶解して、室温乾燥したとき、非常に微細な結晶の薄層を得た。質量スペクトルを［３４］中にさらに詳細に記載されているようにＢｒｕｋｅｒ ＲｅｆｌｅｘII装置（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ ブレーメン、ドイツ）で記録した。実施例２関節炎に対する経口投与に用いられるキト−オリゴマー（ＣＯｓ）の製造サンプル１（Ｇ０００８２３-１Ｋ）の製造： ２５kgの水酸化ナトリウムを８０Ｌのブレンダー中で２５kgの水に溶解し、７０℃に加熱した。２.５kgのエビのキチン（Ｐｒｉｍｅｘ ｅｈｆ.）を加え、１５ｒｐｍで２０分間撹拌した。次いで、スラリーを水で冷却し、チーズ・クロス袋（２００×４０ｃｍ）で濾過し、１０〜１５分間洗浄した。キチンゲルをブレンダー中に戻し、３０％ＨＣｌを加えてｐＨ４に調節し、水を加えて８０Ｌにした。３８０g（７５０Ｕ/g）のキチナーゼ溶液を加え、ゲルを３０℃で１６時間撹拌した。ｐＨを７に調節し、溶液を１０分間で７０℃に加熱することによって、酵素を変性させた。冷却後、オリゴマー溶液をメッシュの大きさが２８０μｍの濾し器を通して注入した。回転式噴霧乾燥機を用いて、吸気温度１９０℃、排気温度８０℃で、溶液を噴霧乾燥に付した。噴霧ローター速度は２０，０００ｒｐｍであった。２.０kgの微細な白色のキトサン粉末を集め、室温に維持した。サンプル１と言う。サンプル１の分析 噴霧乾燥したキト−オリゴマーサンプルを灰分と水分含量について分析した。灰分含量は５３.７％（Ｗ／Ｗ）であり、水分は５.４％（Ｗ／Ｗ）であった。キト−オリゴマーおよびモノマーは４０.９％（Ｗ／Ｗ）であった。脱アセチル化度（ＤＤＡ）は４２.３％+/-０.１％（ＳＤ）であった。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析（表１）後のバイオゲルＰ４ＧＰＣ（図１）は、モノマー（ＤＰ１）が主にＮ-グルコサミン（ＧｌｃＮ）がわずかに見られるＮ-アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）であることを示した。二量体（ＤＰ２）は、（ＧｌｃＮＡｃ）2と（ＧｌｃＮＡｃ）（ＧｌｃＮ）との混合物であった。三量体（ＤＰ３）は、（ＧｌｃＮＡｃ）2（ＧｌｃＮ）を主な物質として含み、（ＧｌｃＮＡｃ）3をマイナーな物質として含んでいた。 主な三量体物質の配列は、ＧｌｃＮ-ＧｌｃＮＡｃ-ＧｌｃＮＡｃ、すなわちＤ-Ａ-Ａであると決定された。バイオゲルＰ４分析で判定されたように、より長いオリゴマー（ＤＰ４〜ＤＰ２０）が少量検出された。中間の長さのオリゴマーの存在を、バイオゲルＰ４およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析の両方によって確認した。表１ 図１に示されたのサンプル１からのバイオゲルＰ４ＧＰＣピークのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ それぞれ番号の付いたピークを回収し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析した。表は、フラクション番号および各フラクションの算出したオリゴマーおよびホモログを示す。Ａ=ＧｌｃＮＡｃおよびＤ=ＧｌｃＮサンプル２（Ｇ０１０４３０-１Ｋ）の製造： このサンプルは、酵素の不活性化（１０％ＮａＯＨによりｐＨ８.０に調節）および篩過後、溶液をＡｌｆａ−Ｌａｖａｌフロー遠心機（ＬＡＰＸ型）を用いて９８００ｒｐｍで清浄化したことを除いては、サンプル１のために記載したものと実質的に同じプロトコルで製造された。液体の流速は５２０ｍｌ/分であり、ローターを３〜５分毎に空にした。ペレットを処分し、清澄なオリゴマー溶液を実施例２のようにして噴霧乾燥した。製品の収量は粉末で１.７４kgであった。サンプル２の分析このサンプルの灰分含量は４８.３％（Ｗ／Ｗ）と測定された。ＮａＣｌ含量は４７.０％であった。水分含量は５.０％（Ｗ／Ｗ）であった。キト−オリゴマーおよびモノマーは、４６.７％（Ｗ／Ｗ）であった。脱アセチル化度（ＤＤＡ）は３８.７％+/-０.９であった。 サンプル１および２のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析を図２および３に示す。図２は、ＤＰ２〜ＤＰ１０のキト−オリゴマーのホモログ分布を表す。ホモログ分布は、２つのサンプル間で多少異なっている。図３に示すように、同じＤＰに異なるホモログを加えると、２つのサンプルについてＤＰ分布が類似していることが明らかである。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析における異なったオリゴマーに対する強度シグナルは、定量的ではなくて定性的シグナルであり、特により高いオリゴマーのピークはより低いオリゴマーのピークよりも強度が比較的弱く現れるかもしれないことを、念頭に置くことが重要である。実施例３キト−オリゴマー（ＣＯｓ）の経口投与 関節炎を患う対象者が、水に溶かしたサンプル１の噴霧乾燥キト−オリゴマー粉末を１日用量３.０g（小さじ１杯;５.０ｍｌ, １２２３ｍｇのＣＯｓ）で、最長２年間、少なくとも５週間服用した。これらの患者の２人は連続投与後に５〜６週間投与を中止し、その後２.９gのサンプル２（小さじ１杯；５.０ｍｌ、１３３１ｍｇのＣＯｓ）の服用を再開した。投与の結果対象者１： リウマチ性関節炎の治療 ５５歳の女性被験者はリウマチ性関節炎を患っていた。両手の関節の腫れがひどく、指は硬直し、動かすと痛みが走った。この被験者はサンプル１キト−オリゴマー粉末を毎日３g服用した。この被験者は４〜５週間後に顕著な改善を報告した。症状が顕著に軽減され、炎症が治まり、指の関節が正常に戻った。痛みが緩和され、この被験者は緻密な作業が再びできるほどに指をより自由に動かすことができるようになった。約２ヶ月で、彼女はキト−オリゴマー粉末の服用を５〜６週間中止した。３〜４週間のうちに、関節炎の症状が徐々に再発した。服用中止後２〜３週間で、２.９gのサンプル２（１３３１ｍｇのＣＯｓ）を用いて毎日の服用を再開し、２回目の投与開始後４〜５週間で緩和したと報告されている。この被験者は、およそ２１ヶ月間、炎症も痛みも伴わずに、サンプル１、２および類似のキト−オリゴマー製品を１日用量で服用している。被験者２−４：リウマチ性関節炎の治療 この被験者らはリウマチ性関節炎を患っていた。彼らは３.０gのサンプル２キト−オリゴマー粉末を毎日服用した。１ヵ月後、被験者らはＲＡ症状が顕著に緩和したことを報告した。炎症（関節の腫れ）が治まり、関節の硬直は和らいだ。被験者５−１４：変形性関節炎の治療 変形性関節炎を患う１０人の被験者が、３.０gのサンプル１、２.９gのサンプル２および類似のキト−オリゴマー製品をそれぞれ毎日服用した。２〜４週間後、８人の被験者が炎症および痛みが軽減したという好結果を報告した。２人の被験者は、症状の軽減がないと報告した。 試験を受けた被験者全員について、サンプル１と２の間で症状の軽減に明白な差異は見られなかった。被験者が判断した通り、サンプル１および２（より高いＤＤＡ、より高いＤＰ）とは異なって、サンプルの製造における変更は、抗関節炎活性における向上をもたらさなかった。試験は引き続き進行中である。図１は、サンプル１のバイオゲルＰ４ ＧＰＣ分析。ＤＰ（ポリマー鎖長）および各鎖長のホモログが表１に挙げられている。図２は、全サンプルのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより測定されたサンプル１およびサンプル２中のキト−オリゴマーホモログ分布。分析からの相対シグナルは、ＤＰ２〜ＤＰ１０からの全ホモログに対するシグナルを加え、１００％に調節することにより計算される。各ホモログのシグナルは相対シグナル（％）で表される。図３は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより判断された、サンプル１およびサンプル２からのキト−オリゴマーの合わされたＤＰ分布。図２に示されたＤＰ２〜ＤＰ１０からの各ＤＰに対するホモログを加え、合わせた相対シグナル（％）で表す。 キト−オリゴマーの鎖長が２〜５０の範囲にあり、脱アセチル化度が３０〜５０％の範囲にある、変形性関節炎およびリウマチ性関節炎を含む関節障害の治療用医薬製造のための、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）およびグルコサミンのキト−オリゴマーの使用。 キト−オリゴマーの少なくとも１０重量％が２〜１２の鎖長をもつ請求項１の使用。 キト−オリゴマーの１５〜７５重量％が２〜１２の鎖長をもつ請求項１の使用。 変形性関節炎およびリウマチ性関節炎を含む群から選択される関節障害の治療用医薬製造のための請求項１の使用。 治療が対象者の関節障害の症状を緩和する請求項１の使用。 医薬品が経口投与用である請求項１の使用。 キト−オリゴマーの鎖長が２〜５０の範囲にあり、脱アセチル化度が３０〜５０％の範囲にあるＮ−アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）およびグルコサミンのキト−オリゴマーを含む、変形性関節炎およびリウマチ性関節炎を含む関節障害の治療用医薬組成物。 キト−オリゴマーの少なくとも１０重量％が２〜１２の鎖長をもつ請求項７の医薬組成物。 キト−オリゴマーの１５〜７５重量％が２〜１２の鎖長をもつ請求項７の医薬組成物。