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| タイトル： | 特許公報(B2)_多糖類の分離方法 |
| 出願番号： | 2003422292 |
| 年次： | 2008 |
| IPC分類： | C08B 37/04,G01N 33/00,A23L 2/52 |
特許情報キャッシュ
杉浦 陽子 塩屋 靖 JP 4164444 特許公報(B2) 20080801 2003422292 20031219 多糖類の分離方法 花王株式会社 000000918 特許業務法人アルガ特許事務所 110000084 有賀 三幸 100068700 高野 登志雄 100077562 中嶋 俊夫 100096736 的場 ひろみ 100101317 村田 正樹 100117156 山本 博人 100111028 杉浦 陽子 塩屋 靖 20081015 C08B 37/04 20060101AFI20080925BHJP G01N 33/00 20060101ALI20080925BHJP A23L 2/52 20060101ALN20080925BHJP JPC08B37/04G01N33/00 BA23L2/00 F Ｃ０８Ｂ １／００−３７／１８ ＪＳＴＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍＩＩ） ＪＭＥＤＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍＩＩ） ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩ） 特開平１０−２７３５０１（ＪＰ，Ａ） 特開２００２−１７９７０３（ＪＰ，Ａ） 特表平１０−５０６９５４（ＪＰ，Ａ） 特開昭６０−０９９１０１（ＪＰ，Ａ） 特開昭５６−１０４９０２（ＪＰ，Ａ） 7 2005179495 20050707 9 20040914 福井 悟 本発明は、酸性多糖類及び中性多糖類を含有する多糖類混合水溶液からそれぞれの多糖類を高回収率で分離する方法及び分別定量法に関する。 食物繊維や難消化性オリゴ糖はヒトの消化管内で消化吸収を受けず、大腸まで到達する難消化性の多糖類である。近年、食生活の欧米化やライフスタイルの変化により日本人の食物繊維摂取量は減少しており、健康意識の高まる中、不足がちな食物繊維を効果的に摂取するための手段が要望されている。多量の食物繊維を無理なく摂取するには飲料形態が望ましく、さらに多量の食物繊維を配合しても飲みやすい飲料とするためには、粘性の低い食物繊維素材を用いることが望ましい。そのような粘性の低い食物繊維素材としては、ウロン酸を構成糖とする水溶性酸性多糖類である低分子化アルギン酸ナトリウム、低分子化ペクチン、ならびに、水溶性中性多糖類であるグアーガム分解物、水溶性コーンファイバー、低分子化ヘミセルロース、難消化性デキストリンなどが代表的である。さらに最近では、個々の食物繊維がその物理化学的性質や生物学的性質の違いによって、生体に対する機能が異なることが明らかとなってきており、性質の異なる食物繊維を複数組み合せてより高い機能を発現させた組成物の開発がなされている（特許文献１）。 このように複数種類の食物繊維を配合した飲料中の食物繊維を個別に分離、定量することは、特に個々の食物繊維の機能と有効量を明確にした飲料においては、品質管理上必要不可欠である。また、栄養表示に関する厚生労働省通知「食新発第0217001号」や「食新発第0217002号」で示されたように、食品中に含まれる複数種類の食物繊維を個別に分離、定量することは、食品や飲料のエネルギー量の表示値に影響を与える。しかしながら、有機溶媒や塩類を用いる沈殿法や、高速液体クロマトグラフィー法等の定法をそのまま用いても、分子量分布の類似した個々の食物繊維を正確に分離、定量することは困難であり、個々を高回収率で分離し得る簡便な分離方法の開発が望まれていた。かかる観点から、本出願人は酸性多糖類と中性多糖類を含有する多糖類混合水溶液に酸を加えて酸性多糖類を沈殿させる工程と、さらに二価以上の金属塩を加えて酸性多糖類を沈殿させる工程とを併用することにより、酸性多糖類を選択的に沈殿させて分離する方法を開発し、特許出願した（特許文献２）。特開２０００−２３２８５５号公報特開２００２−１７９７０３号公報 しかしながら、上記の多糖類の分離方法では、酸性多糖類を沈殿させる工程を２回行うため、操作が煩雑であるとともに、沈殿回収のための濾過操作が２回行われることから沈殿の回収率の低下が生じ、その結果定量性が十分でないという問題、ならびに、分子量の比較的小さい中性多糖の（平均分子量２万以下）定量精度が低いといった問題があった。 従って、さらに簡便で回収率の良好な多糖類の分離方法及び定量方法が望まれていた。 そこで本発明者は、さらに検討した結果、酸性多糖類は酸解離定数が酸性領域にあるため、常識的にはアルカリ等を加えpHを高くすれば酸解離平衡は解離側に偏り、水溶性が向上するはずであるにもかかわらず、全く予想外に、二価以上の金属の水溶性塩および／または二価以上の金属のアルカリを加え、かつpHを１０以上にすると水に溶解していた酸性多糖類が選択的かつ高率に沈殿し、酸性多糖類を簡便かつ効率良く回収できるとともに、正確な定量が可能になることを見出した。また、酸性多糖類と中性多糖類を含有する水溶液を原料として用いた場合には、これらの多糖類が効率良く分別でき、それぞれ分別定量できることも見出した。 すなわち、本発明は、酸性多糖類を含有する多糖類混合水溶液に、二価以上の金属の水溶性塩および／または二価以上の金属のアルカリを加え、pHを１０以上に調整して酸性多糖類を沈殿させる酸性多糖類の分離方法を提供するものである。 また、本発明は、酸性多糖類を含有する多糖類混合水溶液に、二価以上の金属の水溶性塩および／または二価以上の金属のアルカリを加え、pHを１０以上に調整して酸性多糖類を沈殿させ、分離した酸性多糖類量を測定する酸性多糖類の定量方法を提供するものである。 さらに本発明は、酸性多糖類及び中性多糖類を含有する多糖類混合水溶液に、二価以上の金属の水溶性塩および／または二価以上の金属のアルカリを加え、pHを１０以上に調整して酸性多糖類を沈殿させる中性多糖類の分離方法を提供するものである。 さらにまた本発明は、酸性多糖類及び中性多糖類を含有する多糖類混合水溶液に、二価以上の金属の水溶性塩および／または二価以上の金属のアルカリを加え、pHを１０以上に調整して生じた沈殿を除去し、得られた溶液中の中性多糖類量を測定する中性多糖類の定量方法を提供するものである。 本発明によれば、酸性多糖類及び中性多糖類等の食物繊維を含有する水溶液から、簡便な操作で効率良く、酸性多糖類及び中性多糖類を分離し、また分離定量できる。従って、食物繊維その他の多くの成分を含む各種飲料等から、酸性多糖類及び中性多糖類を分離し、また分離定量できることから、これら飲料の品質管理精度が向上するとともに、定量値に基づいたエネルギー量の表示が可能になる。 本発明の多糖類の分離方法は、少なくとも酸性多糖類を含有する多糖類混合水溶液から酸性多糖類を分離する方法；及び酸性多糖類及び中性多糖類の混合水溶液（これをあわせて多糖類混合水溶液という）から、それぞれの多糖類を分離する方法である。 本発明に用いられる酸性多糖類は、その１質量％溶液１mLに０．０２Ｎの硫酸ナトリウム水溶液１mLと１質量％のセチルトリメチルアンモニウムクロリド水溶液１mLを添加すると白色沈殿が認められるものである。このような酸性多糖類としては、例えばペクチン、カラギーナン、フコイダン、アガロペクチン、ポルフィラン、カラヤガム、ジェランガム、キサンタンガム、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、アルギン酸類等の酸性多糖類のカルボキシル基、硫酸基又はリン酸基等の酸性極性基を有する多糖類が挙げられる。その中でもペクチン、アルギン酸類等のウロン酸を構成糖中に含有する酸性多糖類が好ましい。アルギン酸類としては、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、低分子化アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム等のアルギン酸塩、アルギン酸プロピレングリコールエステル等のアルギン酸エステルが挙げられる。その中でもアルギン酸塩が好ましい。 本発明に用いられる中性多糖類は、その１重量％溶液１mLに０．０２Ｎの硫酸ナトリウム水溶液１mLと１重量％のセチルトリメチルアンモニウムクロリド水溶液１mLを添加すると白色沈殿が認められるものである。そのような中性多糖類としては、分子中に酸性基、塩基性基を持たないものであって、グアーガム、低分子グアーガム、ヘミセルロース、低分子ヘミセルロース、アラビアガム、コンニャクマンナン、ローカストビーンガム、プルラン、キサンタンガム、ジェランガム、難消化性デキストリン、ポリデキストロース、寒天等が挙げられ、低分子グアーガム、低分子ヘミセルロース、難消化性デキストリン等が好ましい。 これらの酸性多糖類及び中性多糖類は、いずれも水溶性であって0.１質量％の水溶液が室温で流動性を有するものが好ましい。ここで流動性を有するとは、ビーカー内で調整した0.１質量％の水溶液が室温でビーカーを逆さにしたとき当該水溶液が流れ出る性質を有することをいう。さらに、本発明の分離、定量方法を適用するにあたり、これら酸性多糖類及び中性多糖類の多糖類混合水溶液中の濃度は、分離性、定量性の点から、それぞれ０．０２〜０．２質量％に調整することが好ましい。 本発明の分離方法は、前記多糖類水溶液に、二価以上の金属の水溶性塩および／または二価以上の金属のアルカリを加え、pHを１０以上に調整することにより、酸性多糖類を選択的、かつ効率的に沈殿させることにより行われる。生じた沈殿を回収すれば、酸性多糖類のみが得られる。一方、原料として酸性多糖類と中性多糖類を含有する水溶液を用いた場合には、沈殿を除去した水溶液から中性多糖類が得られる。 本発明に用いられる二価以上の金属塩や二価以上の金属のアルカリとしては、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、アルミニウム、銅等の金属等の水溶性の無機塩やアルカリ等が挙げられる。このうち、カルシウム塩、マグネシウム塩、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等の二価金属の水溶性塩や二価以上の金属のアルカリが好ましく、さらに安定な沈殿生成が容易なカルシウム塩、特に塩化カルシウムや水酸化カルシウム等が好ましい。二価以上の金属の水溶性塩および／または二価金属のアルカリは、多糖類混合水溶液中に含まれる酸性多糖類の濃度にもよるが、水溶液中の多糖類混合物量をＢ（質量％）とした場合、水溶液１００ｇ当たりのモル数として１×Ｂ／１８０〜１５×Ｂ／１８０、さらに２×Ｂ／１８０〜８×Ｂ／１８０、特に２×Ｂ／１８０〜４×Ｂ／１８０となるように添加するのが好ましい。 また、多糖類混合水溶液のpHを１０以上に調整するには、通常アルカリを加えることにより行われる。ただし、二価以上の金属のアルカリを加えることにより、すでに多糖類混合水溶液のpHが１０以上になっている場合は、更なるアルカリの添加は必要ない。アルカリとしては、アルカリ金属水酸化物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが好ましい。pHが１０未満では、酸性多糖類の沈殿効率が十分でない。pHはさらに１１〜１２．５、特に１１．３〜１２．５が沈殿効率及び定量性の点で好ましい。 また、これらの二価以上の金属の水溶性塩および／または二価以上の金属のアルカリの添加とpHの調整の両者を行う場合、これらはいずれの操作を先に行ってもよい。 これらの操作により生じた酸性多糖類の沈殿は、濾過、遠心分離、透析、デカンテーション等により回収することができるが、濾過が好ましい。濾過膜は、細孔径が１μｍ以下、好ましくは０．５μｍ以下のものがよく、例えば、メンブランフィルター、透析膜等限外濾過膜が好ましい。特に細孔径０．５μｍ以下のナイロン製メンブランフィルターが好ましい。また、原料として酸性多糖類と中性多糖類を含有する水溶液を用いた場合には、沈殿を回収した後の溶液（濾液など）には、中性多糖が存在するので、中性多糖が回収できる。 このように本発明の分離方法によれば、酸性多糖類含有水溶液、又は酸性多糖類と中性多糖類を含有する水溶液から、酸性多糖類が沈殿として効率良く回収できるので、回収した沈殿量を直接測定するか、あるいは回収した沈殿を溶解させてその量を測定すれば、酸性多糖類が定量できる。ここで、沈殿量を直接測定する手段としては、乾燥重量を測定する方法が挙げられる。一方、回収した沈殿を溶解させてその量を測定する方法としてはＨＰＬＣや比色、滴定、酵素反応を単独あるいはそれらを組み合わせた方法が挙げられる。 分離した酸性多糖類の沈殿を溶解する方法としては、当該沈殿に炭酸アルカリ金属塩を加えて酸性多糖類を溶解し、得られた溶液中の酸性多糖量を測定する方法が好ましい。沈殿の溶解に用いられる炭酸アルカリ金属塩としては、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等が挙げられ、このうち炭酸ナトリウムが特に好ましい。炭酸アルカリ金属塩の添加量は、酸性多糖類が二価以上の金属塩として沈殿しているので、当該沈殿をすべてアルカリ金属塩として溶解させ、二価以上の金属を炭酸塩として沈殿させるのに必要な量であればよく、最大量としては、加えた二価以上の金属塩と同量でよい。 炭酸アルカリ金属塩の添加により酸性多糖類は、アルカリ金属塩として水中に溶解するので、炭酸の二価以上の金属塩を濾過、遠心分離などにより除去し、水溶液中の酸性多糖類量を常法、例えばＨＰＬＣ法、沈殿法、分光法、滴定法、酵素反応法等を単独あるいはそれらを組み合わせた方法等により定量すればよい。 また、酸性多糖類と中性多糖類を含有する水溶液から、沈殿した酸性多糖類を回収した後の水溶液中の中性多糖類量を測定すれば、中性多糖類が定量できる。中性多糖類量の定量法としては、ＨＰＬＣ法、沈殿法、分光法、滴定法、酵素反応法等が挙げられる。 本発明方法によれば、酸性多糖類及び中性多糖類を含む水溶液、例えば複数種類の食物繊維を含有する飲料から酸性多糖類及び中性多糖類を分別して定量することができる。従って、これら飲料の品質管理精度が向上するとともに、食物繊維の定量値に基づいたエネルギー量の表示が可能になる。実施例１（アルギン酸の沈殿回収まで） アルギン酸ナトリウム３質量％を含有する水溶液２mLに、２〜８mol／Ｌの塩化カルシウム１．５mL、１mol／Ｌの水酸化ナトリウム（pH調整量）及び水を加え全量を５０mLとし、混合したところ白色沈殿が生じた。３０分静置後白色沈殿を孔径０．４５μｍのメンブランフィルターで濾過し、濾液を回収した。濾液中のアルギン酸量をＨＰＬＣにより定量した結果を表１に示す。ＨＰＬＣ測定条件： カラム ：ＧＰＣカラム２種［Super AW4000，Super AW2500；東ソー株式会社］ カラム温度：４０℃ 検出器 ：示差屈折計 移動相 ：０．２mol／Ｌ硝酸ナトリウム 流速 ：０．６mL／min 注入量 ：１００μＬ 表１から明らかなように、塩化カルシウムの添加に加えてpHを１０以上に調整したときにはじめて、アルギン酸が高率で分離されることがわかる。実施例２ アルギン酸ナトリウム２．４質量％、および水溶性コーンファイバー２．４質量％を含有する水溶液２mLに、２mol／Ｌの塩化カルシウム１．５mL、１mol／Ｌの水酸化ナトリウム（pH調整量）及び水を加え全量を５０mLとし、混合したところpHは１１となり白色沈殿が生じた。約３０分静置後白色沈殿を孔径０．２２μｍのメンブランフィルターで濾過し、濾過残渣ａと濾液ｂを回収した。濾過残渣ａを１．５mol／Ｌの炭酸ナトリウム水溶液５０mL中で軽く振とう攪拌した後、約１時間静置したところ炭酸カルシウムの沈殿が生じアルギン酸ナトリウムは溶解した。この溶液中のアルギン酸ナトリウムをＨＰＬＣで測定した結果を表２に示す。さらに濾液ｂを脱塩し、含まれる水溶性コーンファイバー量をＨＰＬＣにより定量した結果を同じく表２に示す。 表２から明らかなように、酸性多糖類であるアルギン酸ナトリウムと中性多糖類である水溶性コーンファイバーを含有する多糖類混合水溶液に、塩化カルシウムの添加に加えてpHを１１に調整してアルギン酸を沈殿させた後、分離したアルギン酸を炭酸ナトリウム溶液でアルギン酸ナトリウム溶液とすることにより、９５質量％以上の精度でアルギン酸ナトリウムが定量できることがわかる。なおかつ、アルギン酸沈殿を分離することにより水溶性コーンファイバーを９５質量％以上の精度で定量可能なことがわかる。実施例３ 表３に示すように、酸性多糖類であるアルギン酸ナトリウム、および／または、中性多糖類である水溶性コーンファイバーを含有する飲料とこれらの多糖類を含まない飲料を調整した。これらの飲料２mLに、２mol／Ｌの塩化カルシウム１．５mL、１mol／Ｌの水酸化ナトリウム（pH調整量）及び水を加え全量を５０mLとし混合した。このときの溶液のpHは１１であった。約３０分静置後これらの溶液を孔径０．２２μｍのメンブランフィルターで濾過し、濾過残渣ａと濾液ｂを回収した。濾過残渣ａを１．５mol／Ｌの炭酸ナトリウム水溶液５０mL中で軽く振とう攪拌した後約１時間静置した。この溶液中のアルギン酸ナトリウムをＨＰＬＣで測定した結果を表４に示す。さらに濾液ｂを脱塩し、含まれる水溶性コーンファイバー量をＨＰＬＣにより定量した結果を同じく表４に示す。 表４から明らかなように、酸性多糖類であるアルギン酸ナトリウム、および／または、中性多糖類である水溶性コーンファイバーを含有する飲料に、本発明の分離方法および分別定量法を用いることにより、飲料中のアルギン酸ナトリウム、および／または、水溶性コーンファイバーを９５質量％以上の精度で定量可能なことがわかる。実施例４および比較例１ アルギン酸ナトリウム２．４質量％、およびグアーガム分解物１．６質量％を含有する飲料２mLに本発明の分離方法および分別定量法適用した結果、並びに、同飲料２mLに特開２００２−１７９７０３号記載の分離方法および分別定量法を適用した結果を表５に示す。 表５から明らかなように、特開２００２−１７９７０３号記載の方法に比較し、本発明の分離方法および分別定量法は酸性多糖であるアルギン酸ナトリウムとグアーガム分解物を同時に９５％以上の精度で定量可能であることがわかる。 アルギン酸塩を含有する多糖類混合水溶液にカルシウム塩を加え、アルカリ金属水酸化物を用いてpHを１１〜１２．５に調整してアルギン酸を沈殿させ、分離したアルギン酸量を測定するアルギン酸の定量方法。 多糖類混合水溶液が、アルギン酸塩及び中性多糖類を含有するものである請求項１記載の定量方法。 アルカリ金属水酸化物が、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムである請求項１又は２記載の定量方法。 分離したアルギン酸の沈殿に炭酸アルカリ金属塩を加えてアルギン酸を溶解し、得られた溶液中のアルギン酸量を測定するものである請求項１〜３のいずれか１項記載の定量方法。 アルギン酸塩及び中性多糖類を含有する多糖類混合水溶液にカルシウム塩を加え、アルカリ金属水酸化物を用いてpHを１１〜１２．５に調整して生じた沈殿を除去し、得られた溶液中の中性多糖類量を測定する中性多糖類の定量方法。 アルカリ金属水酸化物が、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムである請求項５記載の定量方法。 沈殿を除去した後の溶液を脱塩し、次いで得られた溶液中の中性多糖類量を測定する、請求項５又は６記載の定量方法。