生命科学関連特許情報
| タイトル： | 特許公報(B2)_顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）受容体結合ペプチド |
| 出願番号： | 2003398466 |
| 年次： | 2010 |
| IPC分類： | C12N 15/09,C07K 14/00 |
特許情報キャッシュ
藤井 郁雄 JP 4394932 特許公報(B2) 20091023 2003398466 20031128 顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）受容体結合ペプチド 第一三共株式会社 307010166 田村 恭生 100068526 鮫島 睦 100100158 品川 永敏 100126778 森本 靖 100150500 山中 伸一郎 100156111 藤井 郁雄 20100106 C12N 15/09 20060101AFI20091210BHJP C07K 14/00 20060101ALI20091210BHJP JPC12N15/00 AC07K14/00 Ｃ１２Ｎ １５／００ Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００ ＣＡ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ） ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ ＰｕｂＭｅｄ ＷＰＩ 特開２０００−３１９２９８（ＪＰ，Ａ） ZENITANI, Y. et al.，"Alanine scanning of a binding peptide for G-CSF receptor and its affinity optimization."，PEPTIDE SCIENCE 2002，２００３年 ３月，p.443-444 TAKAOKA, Y. et al.，"Isolation of cytokine receptor antagonists from a helix-loop-helix peptide library."，PEPTIDE SCIENCE 2001，２００２年 ３月，p.309-312 ZENITANI, Y. et al.，"Construction of de novo peptide libraries on a phage surface."，PEPTIDE SCIENCE 2001，２００２年 ３月，p.351-352 4 2005151921 20050616 6 20060912 （出願人による申告）国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１５年度新エネルギー・産業技術総合開発機構 基盤技術研究促進事業（民間基盤技術研究支援制度）プロテインネットワーク／超分子複合体機能構造の解析と制御による創薬等産業基盤技術の開発）委託研究、産業活力再生特別措置法 第３０条の適用を受けるもの 野村 英雄 本発明は、サイトカインの一種である顆粒球コロニー刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor; 以下で「Ｇ−ＣＳＦ」と呼ぶことがある）の受容体に結合するヘリックス・ループ・ヘリックス構造を有するペプチドに関する。 顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は、骨髄好中球前駆細胞の分化・増殖を制御するサイトカインである。現在、癌化学療法の副作用で生じる顆粒球減少症の治療薬として臨床の場で使用されており、Ｇ−ＣＳＦと同様な作用をもつ医薬品の開発が望まれている。 近年、ペプチド・ライブラリーを用いるリード化合物探索法が、医薬品開発の有用な方法になってきている。種々のペプチド・ライブラリーが作製され、受容体アンタゴニストなどが見出されてきている。しかし、従来のペプチドライブラリーでは、個々のペプチドがフレキシブルな構造を持つため、エントロピーの損失が大きく高い結合活性や生物活性を期待するのが難しい。また、フレキシブルなペプチドからはファーマコファアの３次元情報が得られず、低分子化合物の分子設計に繋がらない。 そこで、このような問題点を解決するために、本発明者は立体構造をもつペプチド・ライブラリーを作製した。このライブラリーより顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）受容体結合ペプチドを見いだし先に報告した（非特許文献１参照）。 即ち、本発明者は、立体構造を持つペプチド・ライブラリーとしてαヘリックス・ペプチドのライブラリーの構築に成功している。α−ヘリックスはタンパク質中に最もよくみられる二次構造であり、立体構造をもった機能分子として最小限の単位である。しかしながら、タンパク質中にみられるαヘリックスは、周囲の疎水的、静電気的な環境等によって維持されており、水溶液中において一本鎖のα−ヘリックスを設計することは困難である。そこで、安定なヘリックス‐ループ‐ヘリックス構造を持つように、以下のアミノ酸配列を有するペプチド(YT1)をde novo設計した。 AELAALEAELAALEGGGGGGGKLAALKAKLAALKAY（YT1と略す）（配列番号５） ペプチド（ＹＴ１）は水溶液中において、両ヘリックスを構成するロイシン残基が、疎水的作用によってヘリックス‐ループ‐ヘリックスの内側に規則正しく並び、ロイシンジッパーを形成することによってα−ヘリックス構造をとる。また、Ｎ−末端ヘリックス側面のグルタミン酸残基と、Ｃ−末端ヘリックス側面のリジン残基が形成する静電気的な架橋で安定化されている。上記のように本ペプチドは内部の疎水相互作用により立体構造が安定化されており、ヘリックス他のアミノ酸残基を種々のアミノ酸残基で置換してもヘリックス‐ループ‐ヘリックス構造が保持される。そこで、側面アミノ酸残基をランダム化し、ヘリックス‐ループ‐ヘリックス構造を持つペプチドのライブラリーを作製することができる。 本発明者はＹＴ１において２４、２５、２８、３０、３１、３２位のアラニン残基を他のアミノ酸で置換したペプチドライブラリーを作製し、その中から顆粒球コロニー刺激因子の受容体に対し結合活性を有する、次のアミノ酸配列 AELAA LEAEL AALEG GGGGG GKLSD LKLKL AELKA Y（1AAと略す）（配列番号６）を有するもつペプチドを得たPeptide Science, 351-352, 2001 本発明は顆粒球コロニー刺激因子の受容体に対し従来のペプチドよりさらに強い結合活性を有するペプチドを提供することを目的とする。 本発明は、以下のアミノ酸配列： AELAA LEAEL AALEG GGGGG GKLAM LVLKL HELKR Y（P8-2と略す）（配列番号１）を有するペプチドを要旨とする。 本発明は、以下のアミノ酸配列： AELAA LEAEL AALEG GGGGG GKLAM LKLKL HELKR Y（P8-2Kと略す）（配列番号２）を有するペプチドをも要旨とする。 本発明は、以下のアミノ酸配列： AELAA LEAEL AALEG GGGGG GKLAM LVLKL AELKR Y（P8-2Aと略す）（配列番号３）を有するペプチドをも要旨とする。 本発明は、以下のアミノ酸配列： AELAA LEAEL AALEG GGGGG GKLAM LKLKL AELKR Y（P8-2KAと略す）（配列番号４）を有するペプチドをも要旨とする。 本発明のペプチドは、Ｆｍｏｃ法によるの固相ペプチド合成法で製造できる。この方法では合成しようとするペプチドのカルボキシ末端アミノ酸の９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）誘導体を、Ｒｉｎｋアミド樹脂に導入する。次にＦｍｏｃ基を除去して得られる樹脂上のアミノ酸の遊離となったアミノ基に第２のＦｍｏｃ−アミノ酸を導入する。この操作を繰り返し、目的とするペプチド鎖が構築できたら全保護基を除くと共にペプチド樹脂から切り離す。今日では自動合成機が市販されているのでこれを用いれば簡単にペプチドを合成できる。 本発明のポリペプチドは、表１に示すように公知のポリペプチド（１ＡＡ）にくらべてはるかに強く顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）受容体に結合して複合体を形成する。従って顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとして用いることができる。ファージ表層ペプチドライブラリーの作製 アミノ酸配列、AELAA LEAEL AALEG GGGGG GKLXX LKLXL XELXX Y（式中Ｘは任意の天然のアミノ酸を表わす）を有する、２０６のペプチドからなるファージ表層ペプチドライブラリーを次のように作製した。 Ｎ末プライマー：5’-GAACTGGCAGCTCTGGAAGCGGAACTGGCGGCACTCGAAGGTGGCGGCGGTGGTGGCGGCAAGCTG-3’およびランダムプライマー：5’-ACCTGCGCTCGAGCCGCCMNNMNNCAGTTCMNNCAGCTTCAGMNNCAGMNNMNNCAGCTTGCCGCCACC-3’を用い、オーバラップＰＣＲによりライブラリーＤＮＡ断片を作製した。得られたＤＮＡ断片を鋳型として、再度ＰＣＲ（Ｎ末プライマー：5’-ATGGCGGAGCTCGCAGCTCTGGAAGCG-3’、Ｃ末プライマー: 5’-ACCTGCGCTCGAGC-3’）を行い、制限酵素部位（ＳａｃＩ， ＸｈｏＩ）を導入したライブラリーＤＮＡ断片を作製した。得られたライブラリーＤＮＡ断片を制限酵素（ＳａｃＩ， ＸｈｏＩ）で処理し、これを制限酵素（ＳａｃＩ， ＸｈｏＩ）で処理したファージミドベクターとライゲーションした。精製したライゲーション溶液を、エレクトロポレーション法によりＸＬ１−Ｂｌｕｅコンピテントセルに形質転換し、ファージライブラリー溶液を得た。ファージディスプレイ法によるペプチドの選択 Ｇ−ＣＳＦ受容体のサイトカイン結合領域（配列番号７）を固定化したマイクロタイタープレートを用い、受容体に結合するペプチドを提示したファージの選択を行った。 ＰＢＳに溶解した１ｍｇ／ｍｌ 塩化シアヌル５０μｌをタイタープレート（Ｃ８ ＣＯＶＡＬＩＮＫ ＮＨ２： ＮＵＮＣ）の各ウェルに分注し、室温で５分間反応させた。ＰＢＳ ３００μｌを用いて３回洗浄した後、２０ｍＭ炭酸バッファー（ｐＨ８．８）に溶解した４μｇ／ｍｌレセプター溶液５０μｌを各ウェルに分注し、室温で一晩反応させた。反応終了後ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ３００μｌで３回洗浄した後、ブロッキング溶液（ＰＢＳ， １％（ｗ／ｖ）ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）２００μｌを加えた。室温で１時間反応させた後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ３００μｌで２回洗浄し、レセプター結合プレートを作製した。 レセプター結合プレートの１〜４ウェルに調製したファージ溶液５０μｌを加え、室温で２時間穏やかに撹拌しレセプターに結合させた。上清を捨てた後、洗浄液３００μｌを加え軽くピペッティングにより撹拌し、レセプターに結合していないファージを洗い出し、レセプターに結合するファージを選択した。レセプターに結合したファージを解離させるために、０．２Ｍグリシン塩酸（ｐＨ２．５）５０μｌを加えた。室温で１０分間穏やかに撹拌した後、１．５ｍｌチューブにファージ溶出液を移した。ファージ溶出液は酸性であるため、溶出液５０μｌに対して１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）７５μｌを加え中和した。 中和したファージ溶出液はあらかじめ３．５ｍｌ ＳＢ＋ｔｅｔ培地で培養しておいたＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ＯＤ６００＝０．３〜０．６）に加え、３７℃、２００ｒｐｍで３０分間振盪しファージを大腸菌に感染させた。アンピシリンを終濃度１００μｇ／ｍｌとなるように加え１時間培養した後、ヘルパーファージ１００μｌを加え１時間振盪し感染させた。その後室温、１５００ｘｇで１５分間遠心分離し菌体を回収した。回収した菌体は２０ｍｌのＳＢ＋ａｍｐ、ｔｅｔ、ｋａｎ培地に懸濁し、３７℃、１６０ｒｐｍで１時間培養した後、温度を３０℃に下げて一晩培養し、ファージを精製した。このようにしてＧ−ＣＳＦ受容体に結合するペプチドを提示した２０個のファージを得た。その中の４つについてそのＤＮＡの配列決定を行い、Ｇ−ＣＳＦ受容体に結合するペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号１〜４）を決定した。本発明のペプチドの製造 Ｇ−ＣＳＦ受容体に結合能を有するファージが提示していた、配列番号１〜４のアミノ酸配列を有するペプチドを固相合成した。ペプチドはModel 433A Peptide Synthesizer (Applied Biosystems)を用い、Ｆｍｏｃ法、０．１ｍＭスケールで合成した。目的のアミノ酸を縮合させた後、樹脂をジエチルエーテルですすぎ、乾燥させた樹脂を５０ｍｌファルコンチューブに移した。クリベージ溶液１０ｍｌを加え、撹拌し１〜３時間反応させた。反応終了後、氷冷したジエチルエーテル３０ｍｌを加え、氷上で１０分間静置しペプチドを析出させた。４℃、３０００ｘｇで１０分間遠心分離し、ペプチドを沈殿させた。ペプチドを洗浄するため、上清を除去した後、冷ジエチルエーテル３０ｍｌを加え、撹拌した。４℃、３０００ｘｇで５分間遠心分離し再び沈殿を得た。沈殿を乾燥させた後、１５ｍｌ程度のＨ２Ｏに溶解し、綿栓濾過によってレジンを除去した後、凍結乾燥した。凍結乾燥したペプチドを１０ｍｌ程度のＨ２Ｏに溶解し、逆相高速液体クロマトグラフィー(L-6200 Intelligent Pump: HITACHI)を用い、精製した。本発明のペプチドと顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）受容体の結合試験 表面プラズモン共鳴法(BIAcore（登録商標） 2000 system: BIACORE)により、配列番号１〜４のアミノ酸配列を有する４つのペプチドのＧ−ＣＳＦ受容体への結合を調べた。比較のため配列番号６のアミノ酸配列を有するペプチド（１ＡＡ）についても同様に測定した。 アミンカップリング法を用い、センサーチップ(CM5 research grade: BIACORE)にＧ−ＣＳＦ受容体のサイトカイン結合領域（配列番号７）を固定化した。センサーチップのフローセル２にＥＤＣ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸）とＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド）の当量混合液を流速１０μｌ／ｍｉｎ．で２０分間反応させ、センサーチップ上のカルボキシル基を活性化した。その後、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に１０ｍｇ／ｍｌとなるように調製したレセプター溶液を流速５μｌ／ｍｉｎ．で２０分間反応させ、固定化した。その後、エタノールアミンを流速１０μｌ／ｍｉｎ．で２０分間させ、未反応のカルボキシル基を不活性化した後、５０ｍＭ ＮａＣｌで、センサーチップを洗浄した。ブランクとして、フローセル１はＮＨＳ／ＥＤＣによる活性化と、エタノールアミンによるキャッピング、チップの洗浄のみを行った。反応は全て２５℃で行い、溶媒にはＨＢＳ−ＥＰ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４， １５０ｍＭ ＮａＣｌ，３ｍＭ ＥＤＴＡ， ０．００５％ 界面活性剤 Ｐ２０）（ＢＩＡＣＯＲＥ）を用いた。 種々の濃度のペプチドを溶液を調製し，流速１０μｌ／分で１分間反応させ、表面プラズモン共鳴を測定した。得られた結果はＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて解析し、以下のＳｃａｔｃｈａｒｄプロットにより以下の関係式から解離定数Ｋｄを求めた。Ｒｅｑ＝ＫａＣ／（１＋ＫａＣ），Ｋｄ＝１／Ｋａここで、Ｒｅｑは平衡状態におけるペプチドの結合量（ＲＵ）、Ｋａは親和定数（Ｍ−１）、Ｃはペプチドの濃度（Ｍ）、Ｋｄは解離定数（Ｍ）を表す。結果を表１に示す。 以下のアミノ酸配列： AELAA LEAEL AALEG GGGGG GKLAM LVLKL HELKR Y（P8-2）（配列番号１）からなるペプチド。 以下のアミノ酸配列： AELAA LEAEL AALEG GGGGG GKLAM LKLKL HELKR Y（P8-2K）（配列番号２）からなるペプチド。 以下のアミノ酸配列： AELAA LEAEL AALEG GGGGG GKLAM LVLKL AELKR Y（P8-2A）（配列番号３）からなるペプチド。 以下のアミノ酸配列： AELAA LEAEL AALEG GGGGG GKLAM LKLKL AELKR Y（P8-2KA）（配列番号４）からなるペプチド。配列表